Computerondersteunde screening van actieve ingrediënten en validatie van dong-medicatie voor koorts- en hoestonderzoek

Samenvatting

Hier hebben we een multidimensionaal netwerk van "component-target-pathway-disease" geconstrueerd, waarbij we netwerkfarmacologische screening, moleculaire koppeling en door LPS geïnduceerde muismodelvalidatie integreren. Door duidelijke kernparameters vast te stellen, maakt het de efficiënte identificatie van de actieve componenten van Tong-etnische geneeskunde, Lengyuxiao Tang, en de verificatie van een herhaalbaar proces mogelijk.

Samenvatting

Om systematisch de actieve bestanddelen in de Dong etnische geneeskunde te screenen en te verifiëren, Lengyuxiao Tang (LYXT; Sperma Pharbitidis, Verbena officinalis L. en Zingiber officinale Roscoe) voor de behandeling van koorts en hoest, stelde dit schema een methodologieproces vast dat netwerkfarmacologievoorspelling en experimentele verificatie integreert. Ten eerste werden met behulp van de traditionele Chinese geneeskundesystemen farmacologiedatabase en analyseplatform (TCMSP), met een orale biobeschikbaarheid (OB) ≥ 30% en geneesmiddelgelijkheid (DL) ≥ 0,18 als criteria, de belangrijkste actieve componenten van LYXT gescreend en werden de gerelateerde doelen voor koorts en hoest verzameld uit meerdere ziektedatabases. Vervolgens werd het "component-target-disease" interactienetwerk opgebouwd en door middel van topologische analyse en genontologie (GO) en de verrijking van de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routeverrijking werden de kernactiedoelen (CYP3A4, POR) en belangrijke signaalroutes (MAPK-route) geïdentificeerd. Moleculaire dockingtechnologie werd gebruikt om het bindingsvermogen van sleutelcomponenten aan kerndoelen te verifiëren. Ten slotte werd een chronisch bronchitis-muismodel vastgesteld door intranasale instillatie van lipopolysaccharide (LPS), en werd de in vivo ontstekingsremmende effectiviteit van de voorspelde hoofdactieve componenten geverifieerd. De resultaten toonden aan dat componenten zoals β-caroteen en saparenol, gescreend door netwerkfarmacologie, in dierproeven verschillende graden van ontstekingsremmende effecten vertoonden, en hun mechanismen kunnen betrekking hebben op remming van de MAPK/p38-signaalroute. Dit schema biedt een herhaalbaar voorbeeld voor screening en mechanismeonderzoek naar actieve componenten in traditionele etnische geneeskunde.

Inleiding

Dong-geneeskunde is een etnomedisch systeem binnen het kader van de Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM), beoefend door de Dong-etnische groep in Guizhou, Hunan en Guangxi. Het vertegenwoordigt hun cumulatieve empirische kennis, ontwikkeld over generaties. Dit systeem integreert kruidengeneeskunde, acupunctuur, botsetting, massage, dieettherapie en spirituele praktijken. De onderscheidende kenmerken ervan komen voort uit de historische geografische isolatie en mondelinge traditie van de groep, die een unieke, praktijkgerichte farmacopee bevorderde die is aangepast aan de lokale omgeving en culturele overtuigingen.

Aanhoudende koorts, een aandoening die ontstaat wanneer het lichaam zijn temperatuur niet kan beheersen, is een teken dat het lichaam disfunctioneel is en een essentiële zelfbeschermingsfunctie in menselijke cellen¹. Er bestaan veel verschillende methoden voor de behandeling van verwarmingsmedicijnen van de Dong-nationaliteit. Onder hen wordt koorts ingedeeld in interne koorts en externe koorts. Interne koorts verwijst naar warmte veroorzaakt door inwendige ziekten, en externe koorts verwijst naar de warmte die wordt opgewekt door kou of trauma². Exogene koorts beïnvloedt meestal de maag-darmfunctie³. Dong nationale artsen gebruiken koude koortsonderdrukkende therapie tegen koorts. Onder de verschillende Dong-medicijnen is Lengyuxiao Tang (LYXT) een standaard aftreksel voor koorts en pijn, bestaande uit sperma Pharbitidis, Verbena officinalis L. en Zingiber officinale Roscoe, die voortdurend worden geklopt en gemengd met water⁴. Het wordt vooral gebruikt bij koorts en hoofdpijn veroorzaakt door een verkoudheid.

De actieve componenten van LYXT en hun onderliggende moleculaire mechanismen zijn echter nog slecht begrepen. Om deze kloof te dichten, gebruikte de huidige studie een netwerkfarmacologische benadering om potentiële actieve ingrediënten en doelwitten te voorspellen. Om deze voorspellingen te valideren, werd een goed gevestigd door lipopolysaccharide (LPS) geïnduceerd muismodel van longontsteking geselecteerd, omdat het de belangrijkste ontstekingsreacties van koorts en hoest nabootst, waaronder leukocyteninfiltratie en pro-inflammatoire cytokinenproductie.

In het proces van geneesmiddelenontdekking hebben verschillende studies aangetoond dat verbindingen kunnen interageren met meerdere eiwitdoelwitten. Daarom verschuift het paradigma van "één medicijn, één biologisch doelwit" naar een systeemfarmacologieparadigma. Een verbinding die interageert met verschillende biologische doeleiwitten van virussen of bacteriën kan nuttige farmacologische^{effecten bieden}. Netwerkfarmacologieanalyse is een haalbare en krachtige manier om het dure en langdurige geneesmiddelenontdekkingsproces te beperken. Het kan ons helpen de interacties tussen geneesmiddelen beter te begrijpen, mechanismen die de ziekte veroorzaken te voorspellen, alternatieve geneesmiddelleden voor de beoogde farmacologische effecten zonder bijwerkingen aan te bewijzen, en de bioactiviteit van de traditionele geneeskunde voorspellen. Chemoinformatische benaderingen, moleculaire docking en data-afgeleide modellering zijn met succes toegepast om bioactiviteiten te voorspellen en mechanismen te analyseren. Deze methoden faciliteren de snelle ontdekking van antivirale en antibacteriële verbindingen met klinisch potentieel, en deze benaderingen worden ook gebruikt om de effectiviteit en bijwerkingen van geneesmiddelen te verklaren⁶. Zo is imatinib mesylaat, een klein molecuul, een remmer van het oorzakelijke verwekker bij chronische myelogeen leukemie, het fusie-eiwit Bcr-Abl, maar het blokkeert ook de activiteit van verschillende tyrosinekinasen zoals Abl, Kit en PDGFR⁷. Daarom is onderzoek naar het identificeren van geneesmiddelen en hun doelwitten nog steeds cruciaal voor de mogelijke behandeling van ziekten, wat ons helpt de mechanismen te begrijpen waarmee geneesmiddelverbindingen werken om ziekten op moleculair niveau te behandelen. Computationele modellering en netwerkanalysemethoden kunnen potentiële geneesmiddelen en doelwitten nauwkeurig screenen, en multiplicatieve interactieanalyse kan een theoretische basis en praktische richtlijnen bieden voor experimentele verificatie. In dit artikel werden door gebruik te maken van de zoektool voor de retrival van interacterende genen/eiwitten (STRING), de database voor annotatie, visualisatie en geïntegreerde ontdekking (DAVID), en andere databases, gecombineerd met dynamische genontologie (GO)-analyse en pathway-analyse, de gegevens over actieve ingrediënten en gerelateerde actie-eiwitten van Dong-medicijn LYXT voor koorts en hoest verzameld, en werd het mechanisme van de combinatie van de werkzame bestanddelen onderzocht. die een specifieke theoretische referentie kan bieden voor verder onderzoek naar het Dong-medicijn LYXT, een reproduceerbare strategie biedt voor het verkennen van de farmacologische mechanismen van etnomedicinale formules en inzichten biedt in de ontwikkeling van nieuwe ontstekingsremmers.

Protocol

Het dierproevenprogramma is beoordeeld door de Experimentele Dierenethiek Commissie van de Universiteit van Lanzhou (D2024-292). Het voldoet aan de principes van dierenbescherming, dierenwelzijn en ethiek, evenals de relevante bepalingen van de nationale ethiek voor experimenteel dierenwelzijn.

1. Voorbereiding van de database en software

1. Actieve ingrediëntenscreening en verzameling van doelgenen
   1. Toegang tot de farmacologiedatabase en analyseplatform (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) van het TCM-systeem en voer aparte zoekopdrachten uit met de Latijnse namen van elk kruid in de LYXT-formulering, namelijk Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. en Zingiber officinale Roscoe , als trefwoorden om alle chemische verbindingen die met elk kruid geassocieerd zijn, op te halen.
   2. Pas de screeningscriteria toe om de teruggewonnen verbindingen voor elk kruid als volgt te filteren: voor Verbena officinalis L., stel de orale biobeschikbaarheid (OB) ≥ 30,1% en geneesmiddelgelijkheid (DL) ≥ 0,12; voor Zingiber officinale Roscoe, zette OB ≥ 60% en DL ≥ 0,13; voor spermafarbitiden stel je OB ≥ 16,93% en DL ≥ 0,50. Vervolgens voeg je de gefilterde verbindingslijsten van alle drie de kruiden samen en verwijder je dubbele vermeldingen op basis van unieke TCMSP-identificaties om de definitieve lijst van actieve verbindingen in LYXT te genereren.
   3. Exporteer alle doeleiwitten die aan deze actieve verbindingen zijn gekoppeld uit de TCMSP-database als een tabel met verbindingsidentificaties en namen van doeleiwitten, en importeer vervolgens deze doeleiwitlijst in de UniProt-database (https://www.uniprot.org/).
   4. Gebruik de UniProtKB ID-mappingtool om alle doeleiwitnamen om te zetten naar officiële menselijke gensymbolen met de mapping direction set van eiwitnaam naar gennaam, en verwijder alle vermeldingen zonder geldig gensymbool om de uiteindelijke lijst van doelgenen te genereren die geassocieerd zijn met LYXT actieve componenten.
2. Verzameling en overlapanalyse van ziektedoelgenen
   1. Download koorts- en hoestgerelateerde genen uit de GeneCards-database (www.genecards.org) door afzonderlijk te zoeken met de trefwoorden "koorts" en "hoest", behoud genen met een relevantiescore ≥ 5 en voeg de resultaten van beide zoekopdrachten samen binnen de database.
   2. Download koorts- en hoestgerelateerde genen uit de therapeutische doeldatabase (TTD) (db.idrblab.net/ttd) door afzonderlijk te zoeken met de trefwoorden "koorts" en "hoest", download alle bijbehorende doelgenen en voeg de resultaten van beide zoekopdrachten samen binnen de database.
   3. Download koorts- en hoestgerelateerde genen uit de PharmGkb-database (www.pharmgkb.org) door afzonderlijk te zoeken met de trefwoorden "koorts" en "hoest", download alle bijbehorende genen en voeg de resultaten van beide zoekopdrachten samen binnen de database.
   4. Download koorts- en hoestgerelateerde genen uit de Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) database (www.omim.org) door afzonderlijk te zoeken met de trefwoorden "koorts" en "hoest", download alle bijbehorende genen en voeg de resultaten van beide zoekopdrachten samen binnen de database.
   5. Download koorts- en hoestgerelateerde genen uit de DrugBank-database (go.drugbank.com)⁸ door afzonderlijk te zoeken met de trefwoorden "koorts" en "hoest", download alle bijbehorende genen en voeg de resultaten van beide zoekopdrachten samen binnen de database.
   6. Voeg de genenlijsten die uit alle vijf databases zijn verkregen samen tot één uitgebreide lijst en verwijder dubbele gensymbolen om de definitieve lijst van koorts- en hoestgerelateerde ziektedoelgenen te genereren.
   7. Vergelijk de ziektedoellijst uit stap 1.2.6 met de LYXT actieve component doelgenlijst uit stap 1.1.4 om de overlappende genen te selecteren die voor beide lijsten voorkomen, en exporteer deze overlappende genenlijst als een CSV-bestand.
3. ID-conversie en dwarsdoorsnede-analyse
   1. Laad de overlappende genenlijst van stap 1.2.7 in de R-omgeving en bezoek de DAVID-website (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp).
   2. Upload de overlappende genenlijst naar DAVID met de soort ingesteld op Homo sapiens en het lijsttype op gensymbool, en voer vervolgens de functionele annotatietool uit om een dwarsdoorsnede-analyse uit te voeren.
   3. Converteer de symbool-ID's van de snijdende eiwitten naar ensemble-ID's met behulp van de gen-ID-conversiefunctie binnen DAVID, waarbij de conversierichting wordt gezet van gensymbool naar ensemble-ID.
   4. Exporteer de geconverteerde ensemble-ID-lijst samen met de originele gensymbolen als een CSV-bestand voor downstream verrijkingsanalyse.

2. Het screenen van de essentiële werkzame stoffen en doeleiwitten

1. Constructie van samengestelde doelen netwerken
   1. Laad de lijst met snijdende genen uit stap 1.2.7 en de LYXT actieve component-doelgenlijst uit stap 1.1.4 in de R-omgeving, en voer vervolgens een vergelijkingsanalyse uit om verbindingen te identificeren die geassocieerd zijn met zowel de doelgenen als de overlappende genen.
   2. Importeer de relatiegegevens tussen verbinding en doelwit in Cytoscape versie 3.8.1 en genereer het netwerkdiagram "LYXT-Fever and cough-target" om de interacties tussen actieve ingrediënten en hun bijbehorende doelwitten te visualiseren.
2. Eiwit-eiwitinteractie dataverzameling
   1. Importeer het gen-ID-bestand voor de kruising van LYXT-actieve ingrediëntdoelwitten en koorts- en hoestdoelen verkregen in stap 2.1.1 in de STRING-database op https://stringdb.org/, selecteer Homo sapiens als soort en meerdere eiwitten als gegevensverwerkingsmethode.
   2. Filter de eiwit-eiwitinteracties door de betrouwbaarheidsdrempel op ≥ 0,90 te zetten en eiwitten met zeer lage correlatie te isoleren, en genereer vervolgens een TSV-bestand met de gefilterde interactiegegevens voor downstream analyse.
3. Bevestiging van intersectieanalyse
   1. Gebruik de R-taal om de kruising te analyseren tussen de doeleiwitten van de actieve bestanddelen en de doeleiwitten koorts en hoest, waarmee de overlappende genenset bevestigd in stap 1.2.7 wordt bevestigd.
   2. Bereid deze bevestigde overlappende genset voor voor latere eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkanalyse.

3. Screening van belangrijke doeleiwitten

1. PPI-netwerkvisualisatie
   1. Importeer de gefilterde interactiegegevens uit stap 2.2.2 in Cytoscape versie 3.8.1 en gebruik de netwerkvisualisatietool om het PPI-netwerkdiagram te tekenen.
   2. Installeer en open de CytoNCA-plugin binnen Cytoscape, en gebruik deze plugin vervolgens om topologische analyses uit te voeren door de volgende parameters te berekenen voor elke knoop in het netwerk: graadcentraliteit (DC), tussenheidscentraliteit (BC), nabijheidscentraliteit (CC), eigenvectorcentraliteit (EC), netwerkcentraliteit (NC) en lokale gemiddelde connectiviteit (LAC).
2. Identificatie van belangrijke doeleiwitten met behulp van mediaan-gebaseerde screening
   1. Exporteer de berekende topologische parametertabel uit CytoNCA als een CSV-bestand met alle knooppuntidentificaties en hun bijbehorende DC-, BC-, CC-, EC-, NC- en LAC-waarden.
   2. Bereken de mediaanwaarde voor gradencentraliteit (DC) over alle knooppunten in het netwerk en identificeer alle knooppunten met DC groter dan het dubbele van de mediaanwaarde.
   3. Bereken de mediaanwaarden voor nabijheidscentraliteit (CC) en betweenness-centraliteit (BC) over alle knooppunten in het netwerk, en behoud vervolgens van de knooppunten die in stap 3.2.2 zijn geïdentificeerd alleen die knopen die gelijktijdig voldoen aan CC groter dan de mediaanwaarde en BC groter dan de mediaanwaarde, volgens de screeningsmethode beschreven door Kibble et ^al.9.
3. Definitieve compilatie van sleuteldoelen
   1. Compileer de identificaties van de behouden knooppunten uit stap 3.2.3 in een lijst van belangrijke doeleiwitten en exporteer deze lijst als een CSV-bestand.
   2. Pas deze mediaan-gebaseerde screeningsregel toe (DC groter dan twee keer de mediaan, CC groter dan de mediaan, en BC groter dan de mediaan) als het enige criterium voor de identificatie van het belangrijkste doelwit door het hele manuscript, zodat consistentie wordt gewaarborgd met de uniforme screeningsaanpak die in het protocol is vastgesteld.

4. GO-verrijkingsanalyse en KEGG-routeanalyse

1. Functionele verrijkingsanalyse met behulp van de DAVID-database
   1. Volgens de methode beschreven door Tanabe et ^al.10 upload je de kruisende genenlijst van stap 1.3.4 in gensymboolformaat naar de DAVID-database op https://david.ncifcrf.gov/, stel je de soort in op Homo sapiens en het lijsttype op gensymbool.
   2. Voer GO-verrijkingsanalyse uit door GOTERM_BP_DIRECT te selecteren voor biologisch proces, GOTERM_CC_DIRECT voor cellulaire componenten en GOTERM_MF_DIRECT voor moleculaire functie, en voer KEGG-padverrijkingsanalyse uit door KEGG_PATHWAY te selecteren.
   3. Stel de significantiedrempel in op p < 0,05 en pas de Benjamini-Hochberg false discovery rate (FDR) correctie toe voor meerdere tests, en download vervolgens de verrijkingsresultaten als CSV-bestanden met termnamen, gentellingen, p-waarden, FDR-gecorrigeerde p-waarden en bijbehorende genen.
2. Bubble chart generatie met het OmicShare cloudplatform
   1. Importeer de GO-verrijkingsresultaten uit stap 4.1.3 naar het OmicShare cloudplatform op https://www.omicshare.com/tools en selecteer de GO-verrijkingsbubbelgrafiektool.
   2. Upload het resultaatbestand met termnamen, gentellingen en p-waarden en configureer het hulpmiddel om de top 20 termen met de laagste p-waarden weer te geven.
   3. Stel de x-as in om de verrijkingsverhouding weer te geven, de y-as om de GO-termen te vermelden, de bubbelgrootte om genentelling weer te geven, en de kleur van de bubbel om de p-waarde weer te geven.
   4. Genereer de bubbelgrafiek en download deze als een afbeelding met hoge resolutie.
3. KEGG-padvisualisatie met behulp van KEGG mapper
   1. Sorteer de verrijkingsresultaten van de KEGG-paden op p-waarde in oplopende volgorde en selecteer de top 20 paden met de laagste p-waarden.
   2. Voor elke geselecteerde route raadpleeg je de KEGG-database op https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html om het paddiagram te verkrijgen.
   3. Identificeer de doeleiwitten uit de kruisende genenlijst die in elk pad aanwezig zijn door te vergelijken met de gensets van de routes uit de verrijkingsresultaten.
   4. Toegang tot de KEGG mapper-tool op https://www.kegg.jp/kegg/mapper/, selecteer de functie Kleurpad, voer de lijst van elkaar kruisende gensymbolen en de KEGG route-identificatie in, en genereer een kleurgecodeerd routediagram met de geïdentificeerde doeleiwitten rood gemarkeerd.
   5. Verzamel alle verrijkingsanalyse-uitkomsten, inclusief de GO verrijkings-CSV-bestanden voor drie categorieën, het KEGG-padverrijkings-CSV-bestand, de bubbelgrafiekafbeelding en de kleurgecodeerde paddiagrammen voor de top 20 paden, en exporteer deze bestanden vervolgens voor downstream analyse.

5. Moleculaire koppelverificatie

1. Download de 3D-structuren van vitale eiwitten (zoals CYP3A4 en POR, geïdentificeerd als belangrijke doelen in de netwerkanalyse) uit de RCSB PDB-database op https://www.rcsb.org/, selecteer structuren met resolutie ≤ 2,5 Å van Homo sapiens die een co-gekristalliseerde ligand bevatten om de actieve site te definiëren, en download de structuurdatabestanden van actieve verbindingen (inclusief bèta-caroteen, spathulenol en beta-sitosterol) uit de PubChem-database in SDF-formaat.
2. Bereid de eiwitstructuren voor met AutoDockTools door watermoleculen en de co-gekristalliseerde ligand te verwijderen, polaire waterstoffen toe te voegen en Gasteiger-ladingen toe te wijzen, sla vervolgens de voorbereide eiwitten op in PDBQT-formaat, converteer de SDF-bestanden van de verbinding naar PDB-formaat met Open Babel, detecteer roteerbare bindingen voor elke ligand in AutoDockTools en sla de liganden op in PDBQT-formaat.
3. Definieer de dockingroosterdoos met afmetingen van 60 × 60 × 60 Å gecentreerd op de coördinaten van de bindplaats van de co-gekristalliseerde ligand, voer vervolgens moleculaire koppeling uit met AutoDock Vina met exhaustiviteit ingesteld op 8 en num_modes ingesteld op 10 om 10 bindingsposities te genereren voor elk ligand-eiwitpaar.
4. Importeer de resulterende dockingbestanden en hun bijbehorende doelbestanden in PyMOL, identificeer en sla het dockingmodel met de laagste bindingsenergie (meest negatieve waarde) op als de representatieve pose.
5. Dien dit model vervolgens in bij de PLIP-database bij https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ om de interacties tussen de kleine moleculen en eiwitten te analyseren, waaronder waterstofbruggen, hydrofobe interacties, π-stapeling en zoutbruggen.
6. Bereken en complimeer de bindingsenergieën voor alle actieve componenten in LYXT met de doeleiwitten die geassocieerd worden met koorts en hoest, en genereer vervolgens een samenvattende tabel met verbindingsnamen, doeleiwitten, bindingsenergieën (kcal/mol) en belangrijke interactietypen voor presentatie in de resultatensectie.
   OPMERKING: Het R-recept dat wordt gebruikt voor netwerkfarmacologieanalyse is beschikbaar in Supplementair Dossier 1.

6. Dierproeven

1. Experimentele tijdlijn
   1. Acklimatiseer de dieren gedurende 1 week, voer vervolgens LPS of zoutoplossing toe op dag 0, geef dagelijkse medicatiebehandelingen van dag 7 tot dag 20 gedurende 2 weken, en voer euthanasie uit met monsterafname op dag 21.
2. Dierverwerving en -groepering
   1. Koop 60 volwassen mannelijke C57BL/6 muizen van 25 ±± 4 g, voed de muizen 1 week lang, en verdeel ze dan willekeurig in een normale zoutoplossingsgroep (6 muizen) en een LPS-geblesseerde groep (54 muizen).
   2. Op dag 7 vóór de start van de behandeling verdeel je de LPS-gewonde groep willekeurig verder in zeven subgroepen met elk 6 muizen: modelgroep, positieve groep (dexamethason, 50 mg·^kg-1·^d-1), LYXT-behandelgroep (200 mg·^kg-1·^d-1), bèta-caroteen groep (50 mg·^kg-1·^d-1), spathulenolgroep (50 mg·^kg-1·^d-1), en de bèta-sitosterolgroep (50 mg·^kg-1·^d-1).
      OPMERKING: Behandelingstoediening en uitkomstbeoordelingen waren geblindeerd.
3. LPS-geïnduceerde longontstekingsmodel
   1. Dien 2% pentobarbital natrium toe via intraperitoneale injectie in een dosis van 60 mg/kg voor anesthesie. Bevestig een matige diepte van de anesthesie door het ontbreken van een staart-knijprespons. Tot slot, op basis van het geregistreerde lichaamsgewicht, bereken je het benodigde injectievolume van LPS bij een concentratie van 10 mg/mL.
   2. Bereid je voor op de neustoediening door het nauwkeurig berekende volume LPS-oplossing in de pipet te trekken. Houd de muis stevig vast door de basis van zijn staart met de rechterhand vast te pakken, terwijl je met de duim en wijsvinger van de linkerhand de kop voorzichtig bij de oren vastzet.
   3. Stoot de vloeistof langzaam uit totdat er een klein druppeltje (ongeveer 2 μL) aan de pipetpunt ontstaat. Breng de druppel voorzichtig dicht bij het rechterneusgat van de muis totdat hij contact maakt. Til onmiddellijk en snel de linkerhand 30–40 cm omhoog en zet deze dan voorzichtig terug naar de beginpositie.
      OPMERKING: Het is noodzakelijk om op de neusgaten van de muis te letten om de opwaartse toestand te behouden.
   4. Gebruik dezelfde methode om kleine vloeibare druppels in het linker neusgat van de muis te injecteren en deze achtereenvolgens aan de linker- en rechterneusgaten toe te voegen totdat de vloeistofinfusie is voltooid.
   5. Laat dan de muis los, bevestig de muis met tape op het muisbord, en houd de positie met de buik omhoog en het hoofd omhoog gekanteld voor meer dan 4 uur. Nadat de muis wakker is, zet je hem terug in de kooi voor observatie, volgens de methode beschreven door Lorenz et ^al.11.
4. Bronchoalveolaire lavagevloeistofverzameling
   1. Verdeel de LPS-gewonde groep muizen willekeurig in zeven groepen: negatieve controlegroep, modelgroep, positieve groep (dexamethason, 50 ^{mg.kg-1.d-1), LYXT-behandelgroep} (200 ^mg.kg-1.d-1), Beta-caroteengroep (50 ^{mg.kg-1.d-1),} spathulenolgroep (50 ^mg.kg-1.d-1) en beta-sitosterolgroep (50 ^mg.kg-1.d-1), met zes muizen in elke groep.
      OPMERKING: Bereid LYXT als volgt voor: Meng Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L. en Zingiber officinale Roscoe-poeder in een massaverhouding van 5:3:2.  Meng het poeder met water bij 1:30 (g/mL) en laat het bij 80 °C 2 uur reflux geven. Filter en concentreer de oplossing (30 °C, 0,01–0,08 MPa) en los deze op in water om een oplossing van 2 g/mL te bereiden. Bèta-caroteen, bèta-sitosterol en spathulenol werden gebruikt als referentiestandaarden voor experimentele validatie. Geef de medicijnen één keer per dag aan elke groep gedurende 2 weken, beginnend 1 week na de LPS-behandeling. Euthanaser de dieren door een overdosis thiopental (100 mg/kg), volgens Jin et ^al.12.
   2. Intuber de ventrikel met een nr. 23 canule. Vervolgens injecteer je langzaam 10 mL PBS in het longweefsel onder een druk van 25 cm H₂O, en herhaal je deze spoeling ongeveer 6 keer om bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) te verkrijgen, volgens de methode beschreven door Pinheiro et ^al.13.
5. Leukocyten- en cytokineanalyse in BALF en serum
   1. Centrifugeer de verzamelde BALF op 500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Suspendeer de celpellet opnieuw in 1 mL PBS, verdun 1:10 met trypanblauw en tel het totaal aantal leukocyten met een hemocytometer onder een lichtmicroscoop met 400× vergroting.
   2. Verzamel de BALF-supernatant en serummonsters van een hartpunctie.
   3. Meet TNF-α, IL-1β en IL-18 concentraties met commerciële ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant, meet de absorptie bij 450 nm met een microplaatlezer en bereken concentraties uit standaardcurves. Bepaal de eiwitconcentratie in BALF met behulp van de BCA-assay.
6. Validatie van actieve componenten door HE- en WB-analyse
   1. Om actieve componenten te identificeren die bijdragen aan de effectiviteit van LYXT, wordt het door LPS veroorzaakte longontstekingsmodel opnieuw vastgesteld volgens sectie 6.3.
   2. Koop 60 muizen, acklimatiseer één week en verdeel willekeurig in vijf groepen (n = 12 elk): modelgroep, LYXT-groep (200 mg·^kg-1·^d-1), bèta-caroteengroep (50 mg·^kg-1·^d-1), spathulenolgroep (50 mg·^kg-1·^d-1) en combinatiegroep (25 mg·^kg-1·^d-1 elk).
   3. Dien LPS toe op dag 0 en behandelingen van dag 7 tot dag 20 zoals beschreven in stap 6.3. Op dag 21 verzamel je longweefsel¹⁴.
7. Histologische analyse
   1. Fixeer de linker long-superiore kwab in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, inbedding in paraffine, snijd 5 μm doorsneden en voer hematoxyline- en eosinekleuring (HE) uit.
   2. Onderzoek secties onder een lichtmicroscoop met vergroting van 200× en 400× om inflammatoire celinfiltratie en verdikting van de alveolaire wand te evalueren. Maak representatieve beelden.
8. Western blot-analyse
   1. Homogeniseer longweefsel in een radio-immunoprecipitatietest (RIPA) buffer met protease- en fosfataseremmers. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de bicinchoninezuur (BCA) assay.
   2. Laad 30 μg eiwit per put op natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) gels, overbreng naar polyvinylidienfluoride (PVDF) membranen en blokkeer met 5% magere melk.
   3. Incubeer met primaire antistoffen tegen p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 en β-actine 's nachts bij 4 °C, daarna met HRP-geconjugeerde secundaire antistoffen.
      OPMERKING: De verdunning van antilichamen wordt vermeld in de Materiaaltabel.
   4. Visualiseer banden met ECL-substraat, maak beelden en kwantificeer intensiteiten met ImageJ. Normaliseer de expressie van doeleiwitten tot β-actine of totaal p38.

Resultaten

De TCMSP-database werd gebruikt om 409 actieve LYXT-ingrediënten te verzamelen. Hiervan kwamen 58 ingrediënten van Verbena officinalis L., 86 van Sperma Pharbitidis, en 265 werkzame ingrediënten afkomstig van Zingiber officinale Roscoe. Zesentwintig belangrijke actieve ingrediënten werden gescreend volgens de index: OB ≥ 30,1% en DL ≥ 0,12 voor Verbena officinalis L., OB ≥ 60%, en DL ≥ 0,13 voor Zingiber officinale Roscoe, OB ≥ 16,93% en DL ≥ 0,50 voor...

Discussie

Dit artikel identificeerde met succes 26 actieve ingrediënten en 207 potentiële doelwitten van LYXT, een traditioneel Dong-medicatie-aftreksel dat wordt gebruikt tegen koorts en hoest. Belangrijke bevindingen zijn onder meer de identificatie van CYP3A4 als een cruciaal doeleiwit via netwerktopologieanalyse, en de experimentele validatie van LYXT, bètacaroteen en spathulenol als actieve verbindingen met significante ontstekingsremmende effecten in een door LPS geïnduceerd longontstekingsm...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-IL-18	Proteintech, Wuhan, China	27095-1-AP	Rabbit polyclonal, 1:500
Anti-IL-1β	Proteintech, Wuhan, China	66737-1-Ig	Mouse monoclonal, 1:500
Anti-p38	Proteintech, Wuhan, China	14064-1-AP	Rabbit polyclonal, 1:1000
Anti-p-p38	Proteintech, Wuhan, China	28796-1-AP	Rabbit polyclonal, 1:1000
Anti-TNF-α	Proteintech, Wuhan, China	80258-6-RR	Rabbit monoclonal, 1:500
Anti-β-actin	Proteintech, Wuhan, China	66009-1-Ig	Mouse monoclonal, 1:2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	Version 1.5.6	Moleculair docking software
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	Version 1.5.6	Moleculair docking voorbereidingstool
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	23225	Voor bepaling van eiwitconcentratie
Beta-caroteen	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	83-46-5	Hoge zuiverheidsstandaard, >95%
Beta-sitosterol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	83-46-5	Hoge zuiverheidsstandaard, >95%
C57BL/6 muizen	medisch diercentrum van Lanzhou universiteit	-	Volwassen mannetje, 25 ± 4 g
Cytoscape	https://cytoscape.org/	Versie 3.8.1	Netwerkvisualisatie- en analysesoftware
Dexamethason	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D4902	Positieve controle
ECL-substraat	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	WBKLS0500	Voor Western blot detectie
ELISA-kits
GraphPad Prism	https://www.graphpad.com/	Versie 8.0 of hoger	Statistische analyse- en grafieksoftware
Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuringskit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Beijing, China	G1120	Voor longweefselkleuring
Histologie
HRP-geconjugeerd anti-muis	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-7G	Secundaire antilichaam, 1:5000
HRP-geconjugeerd anti-konijn	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-7H	Secundaire antilichaam, 1:5000
IL-18 ELISA-kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Beijing, China	SEKH-0016	Voor het meten van IL-18 in BALF en serum
IL-1β ELISA-kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Beijing, China	SEKM-0004	Voor het meten van IL-1β in BALF en serum
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	Versie 1.53	Beeldanalysesoftware
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L2630	Van Escherichia coli O111:B4
LYXT-grondstoffen	Huaihua University	-	Poedermengsel van Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L., en Zingiber officinale Roscoe (5:3:2, w/w/w)
Overige materialen
Pentobarbital natrium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P3761	2% oplossing voor anesthesie
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	Proteïne-ligand interactieprofiler
PVDF-membranen	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	IPVH00010	Voor Western blot overdracht
PyMOL	https://pymol.org/	Versie 2.5	Moleculair visualisatiesoftware
R	https://www.r-project.org/	Versie 4.0 of hoger	Statistisch rekenen en grafieksoftware
Spathulenol	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N1205	Hoge zuiverheidsstandaard, >95%
STRING	https://stringdb.org/	-	Zoektool voor het ophalen van interacterende genen/eiwitten
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	Traditionele Chinese geneeskunde Systemen Farmacologie Database
Thiopental	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T102	Voor euthanasie
TNF-α ELISA-kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Beijing, China	SEKM-0034	Voor het meten van TNF-α in BALF en serum
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	Eiwitsequentie- en annotatiesdatabase