Senescentie geassocieerd met neurodegeneratie: gelijktijdige beoordeling van β-galactiviteit en nissl-kleuring in histologische secties van de hersenen van knaagdieren

Samenvatting

Dit protocol wordt gepresenteerd als een hulpmiddel om senescentie-geassocieerde β-galactosidase-activiteit te detecteren, om Nissl-kleuring uit te voeren voor de gelijktijdige beoordeling van senescentie en neuronale integriteit, en om verbanden tussen senescencebelasting en neurodegeneratie te onderzoeken.

Samenvatting

Cellulaire veroudering is een fysiologisch proces dat wordt gekenmerkt door onomkeerbare celcyclusstop die weefselregeneratie en -functie belemmert. Dit fenomeen is uitgegroeid tot een belangrijke oorzaak van neurodegeneratie, aangewakkerd door de ophoping van senescente cellen binnen het centrale zenuwstelsel (CZS). Senescente cellen verkrijgen een pro-inflammatoire, door senescentie geassocieerde secretorisch fenotype (SASP) dat chronische neuro-ontsteking in stand houdt en de neuronale micro-omgeving verstoort. Daardoor worden essentiële processen zoals neurogenese, synaptische plasticiteit en neuronale overleving aangetast. Een uitgebreide literatuur koppelt cellulaire senescentie aan verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer of multiple sclerose, en acute neuronale schade zoals cerebrale ischemie of traumatisch hersenletsel.

De gecombineerde beoordeling van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit en Nissl-kleuring in histologische secties biedt een uitgebreide benadering om cellulaire senescentie en neuronale integriteit gelijktijdig binnen dezelfde weefselcontext te evalueren. Deze strategie maakt een precieze ruimtelijke correlatie mogelijk tussen de ophoping van senescentie cellen in specifieke kwetsbare gebieden (bijv. de hippocampus of cortex) en neuronale verlies of weefselschade. Door een functionele marker van senescentie te integreren met een klassieke indicator van neuronale morfologie en dichtheid, versterkt deze aanpak de interpretatieve robuustheid van de analyse. Bovendien maakt het een nauwkeurigere karakterisering mogelijk van de relatie tussen senescent last en neurodegeneratieve veranderingen, waardoor de informatie uit beperkte weefselmonsters wordt gemaximaliseerd.

Bovendien kan dit protocol bepalen hoe senescent celaccumulatie plaatsvindt als reactie op interventies (farmacologisch, genetische manipulatie, enz.) in knaagdiermodellen van neurodegeneratieve ziekten, en biedt zo een krachtig hulpmiddel om deze bijdrage aan hun pathofysiologie te analyseren.

Inleiding

Cellulaire senescentie wordt gedefinieerd door een in wezen onomkeerbare stilstand van de celcyclus, gepaard met uitgebreide macromoleculaire veranderingen¹. Bovendien nemen senescente cellen een hypersecretorij fenotype (SASP) aan, gekenmerkt door de robuuste secretie van een diverse reeks pro-inflammatoire cytokines, groeifactoren en proteasen². Gezamenlijk dragen deze factoren bij aan het opzetten van een pro-inflammatoire microomgeving die de veroudering versterkt en de weefselhomeostase beïnvloedt. In het centrale centrale zenuwstelsel hopen senescente cellen zich geleidelijk op naarmate ze ouder worden, vooral binnen gebieden die kwetsbaar zijn voor leeftijdsgerelateerde^pathologie. Cellulaire senescentie speelt een belangrijke rol in de functionele veranderingen die samenhangen met veroudering en neurodegeneratieve aandoeningen, waarbij de last van senescente cellen geleidelijk toeneemt tijdens normale veroudering. Meerdere celtypen binnen het CZS zijn gevoelig voor senescentie, waaronder astrocyten, microglia, oligodendrocyten, neuronen en neurale^stamcellen. Steeds meer bewijs wijst op de veroudering van deze CZS-celpopulaties in de etiopathologie van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, frontotemporale dementie, amyotrofische laterale sclerose en multiple sclerose⁵. Neurodegeneratieve aandoeningen zijn in verband gebracht met cellulaire senescence⁶, en senescente cellen zijn aangetoond zich op te hopen in de nabijheid van amylooïde-β plaques en neurofibrillie-klitten. Leeftijdsgebonden toename in SA-β-gal activiteit is beschreven in knaagdierhersenen (bijv. 3, 8, 17 en 24 maanden), met statistisch significante verhogingen het meest zichtbaar in de oudste cohort (24 maanden)⁷.

Verschillende studies bieden belangrijke inzichten in de relatie tussen histologische veranderingen en functionele uitkomsten, zoals cognitieve achteruitgang en metabole ontregeling, in pathologische diermodellen die de functionele of gedragscorrelaten van hersenletsel behandelen ^8,9.

Ondanks uitgebreid onderzoek is er geen enkele universele marker die verouderde cellen betrouwbaar identificeert terwijl ze worden onderscheiden van andere niet-proliferatieve toestanden; de meest gebruikte marker van cellulaire senescentie is echter het lysosomale enzym senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal), dat wordt gedetecteerd bij pH 6, een hydrolase-enzym dat de hydrolyse van β-galactosiden katalyseert tot monosacchariden. Een belangrijk onderscheidend kenmerk is de pH. SA-β-gal vertoont optimale activiteit bij pH 6, in tegenstelling tot bacteriële β-galactosidase, die werkt bij pH 7,4, en endogene lysosomale β-galactosidase, die werkt bij zure pH-waarden variërend van 3 tot ^57,10.

Celdichtheid en cytoarchitectuur van de hersenen zijn fundamentele bepalende factoren van neurale organisatie en functie. De ruimtelijke verspreiding en overvloed van specifieke celpopulaties zijn cruciaal voor de werking van circuits, en hun nauwkeurige kwantificering is essentieel voor het bestuderen van neuropathologische aandoeningen met betrekking tot selectieve cellulaire kwetsbaarheid of verlies. Nissl-kleuring, een standaardmethode in de neurowetenschap, is een veelgebruikte histologische techniek om neuronale dichtheid en cytoarchitectuur in zenuwweefsel te beoordelen. Door Nissl-lichamen selectief te labelen binnen neuronale somata, maakt deze methode betrouwbare visualisatie en kwantificering van neuronale populaties over hersengebieden^{mogelijk 11}. Naast zijn robuustheid wordt Nissl-kleuring gekenmerkt door technische eenvoud, lage kosten en relatief korte verwerkingstijd, waardoor het een praktisch en toegankelijk hulpmiddel is voor routinematige neuroanatomische en neurodegeneratieonderzoeken.

De gecombineerde beoordeling van Nissl-kleuring en senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit binnen dezelfde histologische sectie biedt een robuust, ruimtelijk opgelost kader om tegelijkertijd neuronale integriteit en senescent cellast te onderzoeken. Deze integratieve benadering maakt het mogelijk om senescentie direct in kaart te brengen naar regio-specifieke neurodegeneratieve kenmerken, waaronder neuronaal verlies en cytoarchitecturale verstoring. Het koppelen van een klassieke structurele marker aan een functionele indicator van senescentie versterkt de data-interpretatie en onthult mechanistische verbanden tussen senescente celaccumulatie en weefseldisfunctie, terwijl de analytische opbrengst uit beperkte monsters wordt gemaximaliseerd.

Belangrijk is dat deze strategie bijzonder geschikt is voor studies met beperkte weefselbeschikbaarheid, longitudinale of interventiegerichte ontwerpen (bijv. senolytische of senomorfe behandelingen), en regio-specifieke analyses in complexe cerebrale structuren, waarbij het correleren van senescentie met neuronale kwetsbaarheid cruciaal is.

Protocol

Voer alle dierprocedures uit volgens de institutionele en nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, en verkrijg voorafgaande goedkeuring van de betreffende ethische commissie. Dit protocol voldoet aan de huidige Mexicaanse officiële standaard voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NOM-062-ZOO-1999 (Muñoz, 2001)), vooraf herzien en goedgekeurd door de ethische en onderzoekscommissies, en het Institutioneel Comité voor Dierenzorg en -gebruik (CICUAL) van de Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México (FM/DI/039/2023, CICUAL-009-2023). Dieren werden geleverd door het vivarium van de Unidad de Medicina Experimental, Facultad de Medicina.

OPMERKING: Om gelijktijdige beoordeling van senescence-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit en Nissl-kleuring in knaagdierhersenweefsel mogelijk te maken, gebruikt dit protocol 4% paraformaldehyde-gefixeerde knaagdierhersenen die worden cryosectie bij -20 ± 1 °C. Alle secties worden eerst geëvalueerd op SA-β-gal activiteit (stap 1), daarna Nissl-gekleurd (stap 2), en vervolgens gemonteerd met een antifade montagemedium (stap 3). Na verwerking worden de dia's onderzocht onder een helderveld-optische microscoop, waardoor hoogresolutiebeelden van de interessegebieden kunnen worden verworven voor verdere analyse.

1. Voorbereiding van weefseldoorsneden en detectie van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit

1. Voorbereiding van hersendoorsneden
   1. Verkrijg de hersenen door transcardiale perfusie met paraformaldehyde bij 4% volgens het eerder beschreven protocol door Wu et al., 2021¹². Overbreng de hersenen naar een fosfaatgeborde zoutoplossing (PBS) met 0,01% natriumazide voor langdurige opslag bij 4 °C.
   2. Om het protocol te volgen, plaats je de hersenen in een 30% sucroseoplossing, wacht tot ze naar de bodem zakken, en bewaar je het dan bij -20 tot -80 °C. Dit protocol kan worden gebruikt in verschillende hersenweefsels van knaagdieren (bijv. rat, muis, cavia) en worden ingevroren in 2-methylbutaan.
   3. Cryosectie van het weefsel bij -20 ± 1 °C om uniforme doorsneden te verkrijgen die zijn ingebed in optimale snijtemperatuur (O.C.T.) verbinding (20–40 μm dikte) en monteer op gelatine-gecoate glasglaas.
   4. Bevestig delen op glazen glijbanen en bewaar ze onder koude omstandigheden tot gebruik.
2. Detectie van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit.
   1. Bereid op de dag van gebruik de SA-β-gal kleuroplossing vers voor uit de oplossingen die in Tabel 1 worden weergegeven.
   2. Pas de oplossing aan op pH 6.0 om de specificiteit van SA-β-gal activiteit te waarborgen.
      OPMERKING: Bereid de SA-β-gal kleuringsoplossing voor vóór gebruik; Vermijd het voormengen in een waterige oplossing.
      5-bromo-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) is niet stabiel in waterige oplossing.
3. Evenwichtig de temperatuur van weefselsglaasjes.
   1. Haal de dia's uit de koelopslag.
   2. Plaats de glaasjes in een Coplin-pot en laat ze 5 minuten in evenwicht komen bij kamertemperatuur (RT).
   3. Hydrateer de secties door genoeg PBS toe te voegen om de glaasjes in de Coplin-pot te bedekken.
   4. Plaats de slides op een laag-snelheid orbitale shaker voor 5 minuten op RT.
   5. Herhaal de wash één keer.
4. Maak de preparaten klaar om te kleuren.
   1. Verwijder het overtollige PBS voorzichtig van de randen van de dia's met absorberend papier.
   2. Trek een hydrofobe barrière rond elk gedeelte met een waterafswerende barrièrepen, waarbij contact met het weefsel wordt vermeden.
5. Voer SA-β-gal kleuring uit
   1. Plaats de glaasjes in een vochtigheidskamer.
   2. Voeg met een micropipet ongeveer 200 μL kleuroplossing per sectie toe, zodat het weefsel volledig bedekt is.
   3. Bred 48 uur uit bij 37 °C.
   4. Na de incubatie verwijder je de kleuroplossing met absorberend papier.
   5. Plaats de glaasjes in een Coplin-potje en voeg PBS toe om de glaasjes af te dekken, en breng een zachte beweging in op een laag-snelheid orbitale shaker gedurende 5 minuten bij RT.
      OPMERKINGEN: Gebruik geen CO₂-incubator. Ga direct door naar Nissl beitsen.

2. Nissl-vlekken

1. Bereid Nissl werkende oplossing voor.
   1. Bereid voorraadoplossingen voor zoals beschreven in Tabel 2.
   2. Bereid uit de standaardoplossingen de Nissl werkoplossing door 15 mL cresyl violet oplossing te mengen met 85 mL acetaatbuffer.
   3. Filter de oplossing om neerslagen te verwijderen met filterpapier (graad 4, 20-25 μm poriegrootte).
   4. Na de filteroplossing verwarm je het voor op 37 °C gedurende minstens 30 minuten (of 40–43 °C in een waterbad).
   5. Voeg direct voor gebruik 10 druppels 0,1 M azijnzuur toe aan de werkoplossing van Nissl.
      OPMERKING: Gebruik de Nissl werkoplossing tot vier keer op dezelfde dag; Bewaar niet 's nachts.
   6. Bereid gezuurde ethanol voor door 95 ml absolute ethanol toe te voegen aan een volumetrische kolf en 15 druppels 0,1 M azijnzuur toe te voegen. Breng tot 100 mL met gedestilleerd water en meng grondig.
2. Bereid de slides voor.
   1. Plaats de glaasjes in een Coplin-pot en voeg PBS toe indien nodig om de glaasjes te bedekken en laat ze 5 minuten incuberen op 37 °C.
3. Beitssecties.
   1. Immerse glijdt voorzichtig in de voorverwarmde Nissl-oplossing, slide voor slide.
   2. Incubeer de slides 5–20 minuten in Nissl-oplossing.
      OPMERKING: De tijd hangt af van de weefseldikte. Controleer elke 5 minuten de kleuring totdat er een diepe paarse kleur verschijnt.
4. Was de secties.
   1. Spoel de glaasjes voorzichtig af in gedestilleerd water gedurende 1 minuut. Overbrengen naar de glaasjes in de Coplin-pot met vers gedestilleerd water voor nog eens 1 minuut.
   2. Beoordeel de kleur van de kleuring. Bekijk de preparaten onder een helderveldmicroscoop (10× objectief).
   3. Bevestig in een bright field-microscoop intense paarse puntkleuring met minimale achtergrond.
      OPMERKING: Als de achtergrond te veel is, dompel dan dia's in verzuurde 95% ethanol gedurende 10 seconden.
   4. Onmiddellijk overbrengen naar absolute ethanol voor 10 seconden om differentiatie te stoppen.
      OPMERKING: Bein indien nodig, en herhaal de kleuringsstappen (8.1-9.3) als de kleur zwak is.
5. Droog en ruim de dia's op.
   1. Dompel dia's minstens 5 minuten in xyleen (tot 2 uur indien nodig)
      OPMERKING: Werk snel, want weefsel droogt binnen ~2 minuten uit.

3. Montage

1. Bereid montagemedium voor
   1. Meng 8 ml montagemedium met 2 ml xyleen.
      OPMERKING: Bereid alleen het vereiste volume voor; Het montagemedium zal snel uitharden.
   2. Haal de slides van xyleen en dep de randen voorzichtig. Plaats de slides op een vlakke ondergrond.
   3. Breng ~120 μL van het montagemedium aan op het weefsel.
   4. Plaats de deklaag langzaam van één kant om belletjes te voorkomen.
2. Droog de dia's en maak beelden.
   1. Laat de dia's minstens 5 minuten drogen bij RT.
   2. Observeer onder een helderveldmicroscoop en maak beelden van interessegebieden.
   3. Na het monteren duurt het volledig drogen van het montagemedium een langere tijd (24 uur).
3. Bewaar de dia's.
   1. Bewaar de dia's bij RT voor langdurige bewaring (gedurende vele maanden).

4. Kwantificering van de senescentielast

OPMERKING: Deze benadering wordt toegepast als een kwalitatieve beoordeling; echter, wanneer vereist door het onderzoeksontwerp, kan het worden uitgebreid met kwantitatieve analyse.

1. Definieer senescentielast als de relatieve overvloed van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal)–positieve cellen binnen een gedefinieerd interessegebied (ROI). Druk deze metriek uit als een percentage positieve cellen ten opzichte van het totale celaantal, of als de dichtheid van positieve cellen per oppervlakte-eenheid (cellen/mm²).
2. Selecteer regio van belang (ROI). Bepaal ROI's op basis van gestandaardiseerde neuroanatomische herkenningspunten met behulp van een hersenatlas die geschikt is voor de soort en leeftijd. Aanbevolen gebieden zijn hippocampale subvelden (CA1, CA3, dentate gyrus) en corticale gebieden met gedefinieerde laminaire organisatie.
   1. Selecteer 3–5 niet-overlappende velden per ROI per sectie.
   2. Analyseer minstens 2–3 secties per dier, met vaste anatomische tussenpozen verspreid.
   3. Houd een identieke ROI-grootte en -vorm voor alle monsters.
   4. Maak de operator blind voor experimentele omstandigheden tijdens ROI-selectie om bias te minimaliseren.
3. Neem beelden.
   1. Neem beelden met een helderveldmicroscoop uitgerust met een digitale camera onder gestandaardiseerde omstandigheden:
      1. Gebruik consistente vergrotingen (bijv. 10× voor regionaal overzicht, 20× of 40× voor kwantificatie).
      2. Houd constante verlichting, belichtingstijd en witbalans over alle monsters heen.
      3. Vermijd verzadiging van het SA-β-gal signaal (blauw) en zorg voor een duidelijke zichtbaarheid van Nissl-vlekken (paars).
      4. Sla afbeeldingen op in een verliesloos formaat (bijvoorbeeld TIFF) voor downstream analyse.
4. Vooraf de beelden bewerken.
   1. Voer voorverwerking uit met beeldanalysesoftware (bijv. ImageJ/Fiji)¹³.
      1. Converteer afbeeldingen indien nodig naar RGB-formaat.
      2. Pas achtergrondaftrekking toe om ongelijkmatige verlichting te corrigeren.
      3. Normaliseer het contrast uniform over alle beelden zonder de relatieve signaalintensiteit te veranderen.
      4. Vermijd overbewerking die signaalgrenzen kan vervormen.
5. Identificeer SA-β-gal-positieve cellen.
   1. Definieer positieve cellen op basis van de aanwezigheid van een duidelijk blauw neerslag dat in het cytoplasma is gelokaliseerd. Gebruik kleurdrempel om het blauwe signaal te isoleren (bijvoorbeeld empirisch bepaalde tint/verzadiging/intensiteitsbereiken).
   2. Valideer drempels met negatieve controles (jong of onbehandeld weefsel) om achtergrondkleuring uit te sluiten.
6. Bevestig morfologische consistentie met cellulaire profielen waargenomen bij Nissl-kleuring.
7. Kwantificatiebenaderingen
   1. Celgebaseerde kwantificatie: Tel SA-β-gal-positieve cellen handmatig of met semi-geautomatiseerde tools. Bepaal het totale aantal cellen binnen dezelfde ROI met Nissl-kleuring.
   2. Expressresultaten als:
      Senescentielast (%) = (SA-β-gal-positieve cellen/Totaal aantal cellen) ' 100
   3. Dichtheidsgebaseerde kwantificatie: bereken het aantal SA-β-gal–positieve cellen per oppervlakte-eenheid:
      Celdichtheid = Positieve cellen/ROI-gebied (mm2)
   4. Drempel definitie en controle: Stel detectiedrempels empirisch vast:
   5. Gebruik negatieve regelaars om achtergrondsignaalniveaus te bepalen.
   6. Voeg positieve controles toe (bijv. verouderd hersenweefsel of stress-geïnduceerde modellen) om gevoeligheid te valideren.
   7. Pas identieke drempelinstellingen toe op alle monsters binnen een experiment. Documenteer alle drempelparameters om reproduceerbaarheid te waarborgen.

5. Datanormalisatie en statistische analyse

1. Normaliseer de senescentielast om regionale verschillen in celdichtheid te compenseren; gebruik Nissl-kleuring om het totale celaantal per ROI te schatten—gemiddelde metingen over ROI's, secties en dieren. Voer statistische analyses uit met behulp van geschikte tests (bijv. t-test, ANOVA) afhankelijk van het experimentele ontwerp.
2. Rapporteer gegevens als gemiddelde ± SEM of SD, waarbij het aantal biologische replicaten (n) wordt gespecificeerd.
3. Blinding en reproduceerbaarheid: Voer alle kwantificatieanalyses uit onder geblindeerde omstandigheden. Valideer reproduceerbaarheid door: (a) Onafhankelijke analyse door ten minste twee waarnemers, of (b) Heranalyse van een subset beelden om de variabiliteit binnen de waarnemer te beoordelen.
4. Beperkingen van de kwantificatiestrategie: Interpreteer kwantitatieve resultaten samen met complementaire markeringen waar mogelijk. Daarnaast kan variabiliteit in kleuringsintensiteit tussen secties invloed hebben op drempelkwantificatie en moet deze zorgvuldig worden gecontroleerd.

Resultaten

De gecombineerde toepassing van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) kleuring en Nissl-kleuring maakt gelijktijdige visualisatie van senescente celbelasting en neuronale cytoarchitectuur binnen hetzelfde hersengedeelte mogelijk.

Na de SA-β-gal kleuringsprocedure (stap 1) bekijk je de glaasglaasjes onder een helderveldmicroscoop. Succesvolle kleuring wordt aangegeven door de aanwezigheid van een duidelijk blauw neerslag, gelokaliseerd in cellen ...

Discussie

Momenteel blijft de beperkte beschikbaarheid van robuuste, specifieke instrumenten om senescente cellen in het CZS te identificeren, isoleren en selectief te verwijderen een grote belemmering voor mechanistische studies. Deze methodologische kloof beperkt ons vermogen om de causale bijdragen van cellulaire senescentie aan neuropathologie los te koppelen van louter correlatie met ziekteprogressie. De hier gepresenteerde workflow combineert SA-β-gal enzymatische detectie met Nissl-tegenkle...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-methylbutaan	SIGMA	M32631-500ML
5-broom-4-chloor-3-indolyl β-D-galactopyranosid (X-Gal)	PROMEGA	V394A	Bewaar bij -30 tot -10 °C
Citroenzuur	MERCK	251275-5G
Cresyl violet azijnaat	SIGMA	C5042-10G
DPX Monteermiddel voor histologie	SIGMA	06522-500ML
Filterpapier	Whatman	WHA1001929
IJsazijnzuur	SIGMA	695092-500ML
Hydrofobe pen	MERCK	Z672548
Xyleen van histologisch niveau	SIGMA	534056-500ML
Vochtigheidskamer	STAINTRAY	25501
Watervrij magnesiumchloride	SIGMA	M8266-100G	Pas de molariteit aan als er waterhoudend magnesiumchloride wordt gebruikt.
OCT	SAKURA FINE TEK	4583
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	SIGMA	P4417-50TAB	Er worden commerciële tabletten gebruikt.
Kaliumferricyanide (Kaliumhexacyanoferraat(III))	SIGMA	P8131-100G
Kaliumferrocyanide (Kaliumhexacyanoferraat(II) trihydraat)	SIGMA	P9387-100G
Watervrij natriumacetaat	SIGMA	S2889-250G	Pas de molariteit aan als er waterhoudend natriumacetaat wordt gebruikt.
Natriumchloride	SIGMA	S9888-2.5KG
Natriumfosfaat (Natriumfosfaat dibasisch dodecahydraat)	SIGMA	71649-500G