Aggregaten van Pseudomonas aeruginosa tonen een verhoogde tolerantie voor antibiotica en immuuncellen. De rol van membraanintegriteit in het overleven van aggregaten is momenteel onderbelicht. Deze studie demonstreert een methode om veranderingen in celmembraandynamiek binnen P. aeruginosa-aggregaten te kwantificeren om te begrijpen hoe cellulaire integriteit de algehele aggregaatbaarheid kan beïnvloeden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Real-time beeldvorming van de respons op door de gastheer geïnduceerde stress in Pseudomonas aeruginosa-aggregaten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Chronische infecties zoals die bij taaislijmziekte (CF) worden in stand gehouden door kleine, zeer tolerante Pseudomonas aeruginosa-aggregaten die blijven bestaan ondanks immuun- en therapeutische druk. In tegenstelling tot klassieke biofilms vormen deze aggregaten een aparte pathogene eenheid - microschaal, ruimtelijk georganiseerde gemeenschappen die structurele integriteit en fysiologische homeostase behouden onder door de gastheer veroorzaakte stress. De mechanismen die het mogelijk maken dat aggregaten onder deze omstandigheden intact blijven, en of deze homeostatische processen selectief kunnen worden verstoord, blijven echter slecht gedefinieerd. Een belangrijke belemmering om deze kloof te overbruggen is het gebrek aan hulpmiddelen die in staat zijn de dynamische, ruimtelijk opgeloste processen vast te leggen die fysiologische stress koppelen aan structurele stabiliteit en inzinking in realtime. Deze studie presenteert een geïntegreerde beeldvormings- en analyseworkflow om geaggregeerde reacties op gastheer-relevante stressoren te kwantificeren. Met behulp van de spanningsgevoelige kleurstof DiBAC4(5) werd membraandepolarisatie gemonitord als een vroege indicator van fysiologische verstoornis binnen aggregaten gevormd in synthetisch cystisch fibrose-sputummedium (SCFM2). High-resolution time-lapse confocale microscopie maakt visualisatie van aggregaten mogelijk in zowel stabiele als stress-geïnduceerde toestanden, terwijl beeldsegmentatie en voxel-gebaseerde analyse kwantitatieve mapping bieden van ruimtelijke heterogeniteit in membraanintegriteit en aggregate disassembly bij single-cell resolutie. Deze workflow creëert een reproduceerbaar en aanpasbaar platform om fysiologische stress te koppelen aan structurele uitkomsten in meercellige bacteriële aggregaten. Door kwantitatieve ontleding mogelijk te maken van de processen die de integriteit van aggregate behouden – of in gevaar brengen – mogelijk te maken, biedt deze aanpak een cruciale basis voor het identificeren en richten van de homeostatische mechanismen die de aggregate veerkracht ondersteunen, en stimuleert nieuwe strategieën om deze klinisch significante vorm van bacteriële persistentie te verstoren.
Inleiding
Chronische bacteriële infecties worden vaak niet in stand gehouden door grote, aan het oppervlak gehechte biofilms, maar door kleine, meercellige aggregaten die zich vormen binnen gastheer-geassocieerde omgevingen. Bij cystische fibrose (CF) en andere chronische luchtwegaandoeningen komt Pseudomonas aeruginosa meestal voor als suspende aggregaten ingebed in slijm of sputum, in plaats van als klassieke biofilms die aan epitheeloppervlakken zijn gehecht. Deze aggregaten vertegenwoordigen een onderscheidende groeiwijze, gekenmerkt door ruimtelijke organisatie op microschaal, uitgesproken fysiologische heterogeniteit en uitzonderlijke tolerantie voor immuun- en antimicrobiële stressoren 1,2,3,4. Ondanks hun klinische relevantie blijven de mechanismen die de aggregatestabiliteit beheersen, die in dit protocol wordt gedefinieerd als het vermogen om membraanintegriteit en ruimtelijke organisatie onder dergelijke stressoren te behouden, slecht begrepen, waarbij eerdere studies zich meer richtten op matrixcomponenten die de vorming van aan het oppervlak ondersteunen 5,6.
Een grote belemmering voor het bestuderen van gebeurtenissen die bijdragen aan aggregate-destabilisatie, zoals veranderingen in membraandepolarisatie en aggregatearchitectuur, is het ontbreken van experimentele workflows die dynamische fysiologische en structurele veranderingen in realtime vastleggen 7,8. Traditionele bulkassays en eindpuntbeeldvormingsmethoden kunnen niet vaststellen hoe stressreacties binnen aggregaten ontstaan, hoe deze reacties ruimtelijk verdeeld zijn, of hoe fysiologische verzwakking, zoals membraandepolarisatie en verlies van ionenhomeostase, zich vertaalt in vroege tekenen van cellulaire stress en uiteindelijke fysieke instorting. Hoewel confocale microscopie op grote schaal is toegepast op aan het oppervlak gehechte biofilms, integreren minder benaderingen tijdsopgeloste beeldvorming met kwantitatieve analyse die cellulaire fysiologie direct koppelt aan de aggregate-architectuur en membraanactiviteit.
Veranderingen in het potentiaal van het bacteriële membraan geven een vroege en gevoelige indicator van cellulaire stress en verlies van homeostase. Spanningsgevoelige kleurstoffen zoals bis-(1,3-dibutylbarbiturzuur) pentamethineoxonol (DiBAC4(5)) hopen zich op in gedepolariseerde cellen en bieden een niet-destructieve, fluorescentie-gebaseerde weergave van membraanintegriteit. Hoewel DiBAC-kleurstoffen zijn gebruikt om membraandepolarisatie in planktonische culturen en aan het oppervlak gehechte biofilms 9,10 te beoordelen, is hun toepassing op meercellige aggregaten, vooral onder fysiologisch relevante groeiomstandigheden en time-lapse beeldvorming, beperkt.
Hier presenteren we een geïntegreerde beeldvormings- en analyseworkflow die realtime visualisatie en kwantificering van membraandepolarisatie en structureel falen in P. aeruginosa-aggregaten mogelijk maakt. Aggregaten worden gevormd in synthetisch cystische fibrose sputummedium (SCFM2), een chemisch gedefinieerd medium dat belangrijke voedings- en ionische kenmerken van de CF-luchtweg recapituleert en spontane aggregatievorming ondersteunt zonder opgelegde oppervlakken of stroming11,12. Onder deze omstandigheden vormt P. aeruginosa suspendeerde aggregaten van grootte en structurele heterogeniteit vergelijkbaar met die waargenomen in CF-sputum- en luchtwegmonsters, wat een fysiologisch relevant platform biedt voor het bestuderen van aggregaatgedrag13.
Met behulp van timelapse confocale laserscanningmicroscopie onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheid legt deze workflow zowel stabiele aggregate toestanden als stress-geïnduceerde toestanden vast die gekenmerkt worden door verhoogde membraandepolarisatie en verlies van cellulaire homeostase over langere beeldvormingsperioden. Door DiBAC-gebaseerde membraanpotentiaalrapportage te combineren met hoogresolutie z-stack beeldvorming, maakt deze methode kwantificering van DiBAC₄(5)-fluorescentie op enkelcelniveau mogelijk, waarbij waarden worden in kaart gebracht en geanalyseerd binnen de ruimtelijke context van individuele aggregaten. Downstream beeldsegmentatie en voxel-gebaseerde oppervlakteanalyse maken het mogelijk om veranderingen in aggregatearchitectuur en membraandepolarisatie parallel te kwantificeren.
Belangrijk is dat, hoewel dit protocol wordt aangetoond met P. aeruginosa-aggregaten gevormd in SCFM2, de workflow globaal is te generaliseren. De beeldvormingsstrategie, op kleurstof gebaseerde fysiologische uitlezing en het analytisch kader kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere bacteriesoorten, aggregatebevorderende media en stressfactoren, waaronder antimicrobiële middelen, immuuneffectoren of omgevingsverstoringen. Als zodanig biedt deze aanpak een overdraagbaar en reproduceerbaar platform om de stabiliteit van bacteriële gemeenschappen in diverse experimentele contexten te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle werkzaamheden met P. aeruginosa moeten plaatsvinden onder de juiste BSL-2 containmentvoorwaarden en institutionele bioveiligheidsgoedkeuringen. De reagentia en de gebruikte apparatuur in deze studie zijn vermeld in de Materiaalkunde.
1. Vorming van aggregaten van Pseudomonas aeruginosa in synthetische cystische fibrose sputummedium (SCFM2)
OPMERKING: Deze stap beschrijft de bereiding van P. aeruginosa-culturen en de vorming van suspente meercellige aggregaten onder fysiologisch relevante omstandigheden die de CF-luchtweg nabootsen.
- Bereiding van bacteriële culturen
- De dag voor het experiment inoculeert u het wildtype Pseudomonas aeruginosa PAO1 met plasmide pMRP9-1 (GFP)14 uit bevroren glycerolvoorraden in 5 mL lysogeniebouillon (LB).
- Voeg carbenicilline (300 μg/mL) toe om de plasmideselectie te behouden.
- Kweek culturen 's nachts op 37 °C met schudden bij 200 rpm.
- Terugverdunning en voorbereiding voor aggregatevorming
- Op de dag van het experiment wordt nachtkweken met 1:5 terugverdund (1 mL 's nachts: 4 mL LB. Antibiotica worden in dit stadium niet opnieuw toegevoegd; de restoverlap is minimaal en beïnvloedt de groei niet).
- Kweek culturen gedurende ~2 uur bij 37 °C met schudden (200 rpm) om de logaritmische fase te bereiken.
OPMERKING: Cellen bevinden zich meestal in de vroege exponentiële fase na ~2 uur onder deze omstandigheden. Daarnaast worden cellen vervolgens gewassen vóór de inoculatie in SCFM2 om eventuele resterende antibioticaoverdracht te minimaliseren.
- Bereiding en evenwicht van SCFM2
- Ongeveer 30 minuten voor het einde van de terugverdunningsperiode werd SCFM2 vooraf voorbereid in steriele buizen en verwarmd tot 37 °C.
- Voor beeldvorming in een optische schotel met 4 putten en glasbodem, wees 500 μL SCFM2 per put toe. Bereid overtollig volume voor om rekening te houden met pipettefouten.
OPMERKING: SCFM2 wordt opgeslagen bij 4 °C. Voorverwarming minimaliseert temperatuurschok en verbetert de reproduceerbaarheid van aggregatievorming.
- Wassen en standaardisatie van inoculum
- Pelletculturen door centrifugatie op 4200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Als berekeningen naar het toerental nodig zijn, is de rotorradius van de schanderende emmerrotor 172 mm. - Verwijder supernatant en suspendeer pellets opnieuw in 3 mL steriele PBS (pH 7,0).
- Herhaal de wasstappen nog twee keer (in totaal drie wasbeurten).
- Meet OD₆₀₀ en bereken het volume dat nodig is om SCFM2 te inoculeren op een beginnende OD₆₀₀₀ van 0,05.
- Vortex kort om cellen te homogeniseren en elke put met 500 μL SCFM2 te inoculeren.
- Pelletculturen door centrifugatie op 4200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Aggregatevorming onder statische omstandigheden
- Incubeer SCFM2 statisch bij 37 °C gedurende 4 uur om aggregatievorming mogelijk te maken.
OPMERKING: Een 4-uur incubatie levert reproduceerbaar suspente aggregaten op met groottes en heterogeniteit vergelijkbaar met die waargenomen in CF-sputum- en luchtwegmonsters, terwijl latere biofilmrijpingminimaal wordt 1,15.
- Incubeer SCFM2 statisch bij 37 °C gedurende 4 uur om aggregatievorming mogelijk te maken.
2. Bereiding van immuun-geassocieerde stressor (humane neutrofiele elastase)
OPMERKING: Deze stap beschrijft de bereiding van een door de gastheer afgeleide stressor die wordt gebruikt om cellulaire stress en destabilisatie van bacteriële aggregaten te induceren.
- Reconstructie en opslag van menselijke neutrofiele elastase (HNE)
- Reconstrueren menselijke neutrofiele elastase volgens de aanbevelingen van de fabrikant met 50 mM natriumacetaat, 200 mM NaCl en steriel water.
- Bereid een 50 μg/L voorraadoplossing voor en filter steriliseer met een 0,2 μm filter.
- Aliquot in 50 mL volumes en opslag bij −20 °C.
- Ontdooi een aliquot de avond voor gebruik op 4 °C.
OPMERKING: Aliquotering minimaliseert vries-dooi-cycli, wat de enzymatische activiteit kan verminderen en variabiliteit kan introduceren. Aliquots zijn ongeveer 1 maand stabiel bij 4 °C.
3. Voorbereiding en toepassing van DiBAC4(5) om membraandepolarisatie te rapporteren
OPMERKING: Deze stap beschrijft de bereiding en het gebruik van een spanningsgevoelige kleurstof om membraandepolarisatie binnen aggregaten te visualiseren.
- Bereiding en opslag van DiBAC4(5)
- Begin met het bereiden van een voorraadoplossing van DiBAC4(5). Reconstitueer DiBAC4(5)-poeder in watervrij DMSO tot 1 mg/mL.
OPMERKING: DiBAC4(5) reconstitutie in DMSO volgt de standaardaanbevelingen van de fabrikant. - Aliquot in 100 μL volumes en opslaan bij −20 °C, beschermd tegen licht.
- Gebruik elke aliquot niet meer dan twee keer.
OPMERKING: DiBAC4(5) is functioneel equivalent aan DiBAC4(3), maar hier geselecteerd om overeen te komen met GFP-excitatie-/emissiespectra. In dit protocol wordt DiBAC4(3) alleen gebruikt voor een extra kleuring die in het resultaatgedeelte wordt besproken. De primaire kleurstof die gedurende dit protocol wordt gebruikt is DiBAC4(5).
- Begin met het bereiden van een voorraadoplossing van DiBAC4(5). Reconstitueer DiBAC4(5)-poeder in watervrij DMSO tot 1 mg/mL.
4. Time-lapse confocale beeldvorming van membraandepolarisatie in P. aeruginosa-aggregaten
OPMERKING: Deze stap beschrijft het verkrijgen van hoogresolutie, tijdsopgeloste confocale beelden om dynamische fysiologische en structurele veranderingen in aggregaten vast te leggen.
- Microscoop- en milieukamervoorbereiding
- Installeer een verwarmde microplaat-insert of omgevingskamer op het confocale microscooppodium.
- Zet temperatuur- en luchtvochtigheidsregeling minstens 1 uur voor de beeldvorming aan en stel het in op 37 °C.
- Vind in het tabblad Acquisitie het tabblad Laser en schakel ongeveer 1 uur voor gebruik de benodigde lasers in om voldoende opwarming mogelijk te maken (argonlaser voor GFP; DPSS 561-10 voor DiBAC4(5)) (Aanvullende Figuur 1A).
OPMERKING: Stabiele omgevingscontrole vermindert focusdrift en behoudt de integriteit van het aggregate tijdens lange time-lapse-experimenten.
- Toepassing van de immuunstressor
- Na 4 uur aggregatevorming wordt HNE toegevoegd aan experimentele putten tot een uiteindelijke concentratie van 20 μg/L16.
- Laat controlewells onbehandeld.
- Breng de schotel met vier putjes over naar de microscoopfase.
OPMERKING: HNE werd bereid bij fysiologisch relevante concentraties (μg/L), gebaseerd op gerapporteerde niveaus in geïnduceerd sputum, in plaats van als geconcentreerde voorraad. Concentraties die voor deze studie zijn gebruikt, zijn te vinden bij McGarvey et al.16 onder IS (geïnduceerd sputum), NE-AAT (NE/a1-anti-trypsinecomplex), HV (gezonde vrijwilliger).
- Identificatie van geaggregeerde interessegebieden
- Met het tabblad Locate en een 20× objectief schakel je het Doorgegeven Licht in om aggregate-rijke gebieden te identificeren met brightfield imaging (Aanvullende Figuur 1B).
- Terwijl je nog steeds brightfield imaging gebruikt, ga je naar het tabblad Acquisitie en sla x-, y- en z-coördinaten op met de Posities-module (Aanvullende Figuur 1C).
- Herhaal dit voor meerdere technische replica's per put.
- Hoogwaardige z-stack en tijdreeksverwerving
- Ga naar een opgeslagen positie en schakel over naar een 63× olie-onderdompelingsobjectie.
- Breng dompelolie aan voordat je het gerecht plaatst.
- Configureer in het tabblad Acquisitie kanalen met Smart Setup (Aanvullende Figuur 1D): GFP (488/509 nm) – wijs groen toe, DiBAC4(5) (591/615 nm) – wijs rood toe.
- Navigeer naar Live view, gebruik vervolgens de Z-stack module, identificeer de onderkant van de coverslip door de fijne focus aan te passen en stel deze vervolgens in als de eerste z-positie door op Set First te klikken (Aanvullende Figuur 1E).
- Beweeg omhoog tot het bereik 60 μm aangeeft en stel de uiteindelijke z-positie in door op Set Last te klikken (Aanvullende figuur 1E).
- Schakel Live View uit en activeer Definite Focus. Selecteer Find Surface en selecteer vervolgens Focus opslaan alleen wanneer de status Reflex Found aangeeft (Aanvullende Figuur 1F).
- Herhaal de focuskalibratie voor elke opgeslagen positie met behulp van de Z-stack en Definite Focus modules.
- Configureer tijdreeks-verwerving om elke 3 minuten gedurende 6 uur elke positie te fotograferen (Aanvullende Figuur 1G).
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd om DiBAC4(5) kleurstof te ontdooien, toe te voegen en te incuberen, en kan na de incubatieperiode worden hervat. - Selecteer Start Experiment.
OPMERKING: Drie-minutenintervallen balanceren de temporele resolutie met fototoxiciteit en fotobleek.
- DiBAC4(5) toevoeging en incubatie
- Voeg DiBAC4(5) toe aan elke put tot een uiteindelijke concentratie van 5 μg/mL9.
- Incubeer 30 minuten in het donker voordat je time-lapse imaging start.
OPMERKING: Deze incubatie maakt kleurstofevenwicht mogelijk terwijl achtergrondfluorescentie wordt geminimaliseerd.
5. Kwantitatieve beeldanalyse van aggregatestructuur en DiBAC4(5) co-lokalisatie
OPMERKING: Deze stap beschrijft een kwantitatieve workflow om membraandepolarisatie te koppelen aan aggregatearchitectuur en destabilisatie.
- Beeldimport en kanaalscheiding
- Upload afbeeldingsbestanden (.czi of gelijkwaardig) in Imaris x64 software versie 10.2.0 of hoger.
- Controleer de voxelkalibratie door te controleren of de x-, y- en z-pixelafmetingen (voxelgrootte) in de beeldmetadata nauwkeurig de confocale acquisitieparameters (objectief, zoom, z-stapgrootte) weergeven. Onjuiste kalibratie leidt tot fouten in ruimtelijke en volumetrische metingen.
- Oppervlakteweergave van bacteriële aggregaten en DiBAC4(5)-signaal
- Gebruik de Surfaces-module om P. aeruginosa-aggregaten weer te geven:
- Selecteer onder Segmentatie-opstelling het GFP-kanaal (Aanvullende Figuur 2A).
- Selecteer Split Touching Objects (Region Growing) inschakelen en de intensiteitsdrempel aanpassen om aggregaten volledig vast te leggen (Aanvullende figuur 2B).
- Onder de module Filter Seed Points verander je het filtertype naar Aantal Voxels Img = 1 en stel je dit in op 90% (Aanvullende Figuur 2C).
- Na het verwerken van het renderen stel je de oppervlakken in op 100% (Aanvullende Figuur 2D).
- Voltooi de rendering en ken groene kleuren toe aan bacteriële oppervlakken (Aanvullende Figuur 2E).
- Herhaal rendering voor het DiBAC4(5)-kanaal en wijs rode kleuring toe.
- Gebruik de Surfaces-module om P. aeruginosa-aggregaten weer te geven:
- Co-lokalisatie en volumegebaseerde kwantificatie
- Selecteer de DiBAC4(5) oppervlakterendering (Aanvullende Figuur 3A) en bepaal op welke tijdpunt(en) co-lokalisatieanalyse zal worden uitgevoerd.
- Navigeer naar Statistieken > Gedetailleerde tab > Specifieke Waarden (Aanvullende Figuur 3B).
- Definieer co-lokalisatie door objecten te selecteren met een Kortste Afstand tot Bacteriële Oppervlakken van 0,00 (Aanvullende Figuur 3B).
- Zoek Bewerken en dupliceer vervolgens deze objecten om een DiBAC-overlappend met cellen oppervlak te genereren (Aanvullende Figuur 3C). Zorg ervoor dat je dit oppervlak hernoemt om de overlappende eigenschappen aan te geven.
- In het tabblad Gedetailleerd onder Gemiddelde Waarden registreer je opgetelde volumewaarden op elk geselecteerd tijdstip voor: (1) Totaal DiBAC4(5) signaal (Aanvullende Figuur 3D); (2) Co-gelokaliseerd DiBAC4(5) signaal (Aanvullende Figuur 3E).
- Bereken procentuele overlap als:
OPMERKING: Percentage overlap weerspiegelt het aandeel celgeassocieerd DiBAC₄(5)-signaal binnen aggregaten, wat de membraandepolarisatie op een bepaald tijdstip weerspiegelt.
OPMERKING: Hoewel aangetoond met P . aeruginosa-aggregaten in SCFM2 en benadrukt met HNE, is deze workflow grotendeels aanpasbaar aan andere bacteriesoorten, aggregate-bevorderende media, fluorescerende reporters en stressoren, waaronder antimicrobiële middelen of omgevingsverstoringen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In het hierboven beschreven protocol is een methode om veranderingen in de membraandynamiek van aggregaten van P. aeruginosa te volgen, gemodelleerd in een longomgeving met cystische fibrose (Figuur 1). Met behulp van een wildtype PAO1-stam met een pMRP9-1 (GFP) plasmide (Figuur 1A), HNE om immuunstress te simuleren, en DiBAC4(5) membraankleurstof (Figuur 1C), we...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Membraanpotentiaal dient als een gevoelige, vroege uitlezing van cellulaire stress en verstoorde homeostase. Binnen meercellige bacteriële aggregaten vinden deze fysiologische veranderingen plaats voorafgaand aan, en kunnen ze leiden tot, daaropvolgende structurele destabilisatie. Hier presenteren we een beeldvormingsgebaseerde workflow die gebruikmaakt van de langzame, potentieelgevoelige kleurstof bis-(1,3-dibutylbarbiturzuur) pentamethineoxonol (DiBAC4(5)) om depolarisatie ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs geven geen belangenconflicten aan.
Dankbetuigingen
S.E.D wordt ondersteund door startkapitaal van de afdeling Moleculaire Geneeskunde van de University of South Florida, evenals onderzoekssubsidies van de Cystic Fibrosis Foundation (CFF) (DARCH19G0, DARCH22P0, DARCH25G0).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1,3-dibutylbarbituurzuur) pentamethine oxonol (DiBAC4(3)) | AAT Bioquest | 21411 | lipofiel, anionisch molecuul |
| 1,3-dibutylbarbituurzuur) pentamethine oxonol (DiBAC4(5)) | AAT Bioquest | 21410 | lipofiel, anionisch molecuul |
| Carbenicilline | Research products international | C46000-5.0 | gebruikt voor selectie van GFP-expresserende stammen van PAO1 |
| Cellvis 4-kamer 35mm glazen bodemschaal | Fisher | NC0600518 | glazen bodemschaal laat toe om gesuspendeerde aggregaten in groeimedia te onderhouden tijdens beeldvorming |
| Centrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | B06320 | gekoppeld aan Beckman Coulter Life Sciences SX4400 zwenkrotor (onderdeelnummer B01425) |
| Confocale laserscanningmicroscoop (CLSM) | Zeiss | LSM 880 | het model van CLSM dat voor de experimenten in dit protocol werd gebruikt, is niet langer beschikbaar, maar de LSM 900 is een bijgewerkte equivalent optie |
| Kweekbuizen | Genesee | 21-130 | steriele; polypropyleen |
| DAPI | Thermo Fisher | 62248 | gebruikt voor voorgestelde toekomstige toepassingen, het kleuren van neutrofielen met DiBAC4(5) |
| Weggeef cuvettes | Brand Tech | 759086D | 1,5ml, semi-micro |
| DMSO | Millipore-Sigma | 276855-100ML | gebruikt voor de reconstitutie van DiBAC4(3,5) |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 65-0880-92 | gebruikt voor voorgestelde toekomstige toepassingen, het kleuren van neutrofielen met DiBAC4(3) |
| Omgevingskamer voor CLSM | PECON | LSM 880 | dit systeem is exclusief gemaakt voor Zeiss producten en wordt over het algemeen aangeduid als het "Incubatiesysteem S" en alle componenten kunnen worden besteld via Zeiss als aanvulling op het LSM 880 (of soortgelijk) systeem |
| Gentamycine sulfaat | Fisher | BP918-1 | gebruikt voor selectie van RFP-expresserende stammen van PA1633 |
| Glycerol | Genesee | 18-205 | gebruikt om stammen te bevriezen voor langdurige opslag bij -80 °C |
| Human Neutrophil Elastase (HNE) | Millipore-Sigma | 324681-50UG | eenmaal gereconstitueerd is het 1 maand stabiel bij 4 °C of 1 jaar bij 20 °C |
| Imaris x64 software | Oxford Instruments | Versie 10.2.0 | |
| Immersieluis | Electron Microscopy Sciences | 16919-12 | niet-drogend; gestandaardiseerd bij 37 °C |
| Incubator | Benchmark Scientific | H1001-M | geschikt voor schudden |
| Lysogeny Broth (LB) | Genesee | 11-118 | miller mix |
| mCherry plasmid | verkregen van een medewerker | ||
| PA1633 transposon mutantenstam | verkregen van een medewerker | ||
| Fosfaat Gebufferd Saline (PBS) | Thermo Fisher | 3002 | pH 7.0 |
| Natrium Acetaat | Thermo Fisher | AM9740 | 3M; pH 5.5; RNase-vrij |
| Natrium Chloride | Fisher | S271-500 | gebruikt voor de reconstitutie van HNE |
| Spectrofotometer | VWR | 634-0882 | gebruikt om celdichtheid te meten voor inoculatie van PAO1/PA1633 in SCFM2 |
| Steriele.22µm Filter | Genesee | 25-244 | gebruikt om gereconstitueerd HNE te zuiveren |
| Steriele Microcentrifugebuizen | Genesee | 24-272LR | 0,6ml |
| Steriele Spuit | Fisher | 14955459 | gebruikt om gereconstitueerd HNE te zuiveren |
| SX4400 zwenkrotor | Beckman Coulter Life Sciences | B01425 | gekoppeld aan Beckman Coulter Life Sciences centrifuge (onderdeelnummer B06320) |
| Synthetisch Cystic Fibrosis Sputum Medium (SCFM2) | SyntheBiome | 10002-500 | Batch #: 001-CF2-0724 |
| Ultra Puur Water | Genesee | 18-195 | gebruikt voor de reconstitutie van HNE |
| Wild type Pseudomonas aeruginosa PAO1 met pMRP9-1 Plasmid | Dit pMRP9-1 plasmid bevat GFP en drukt carbencilineweerstand uit | ||
| ZEN Black Edition 2.3 Zeiss Beeldvormingssoftware | Zeiss | compatibel met de LSM 880 |
Referenties
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. mBio. 8 (2), e00240-17(2017).
- Rada, B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 6 (1), 10(2017).
- Kragh, K. N., Tolker-Nielsen, T., Lichtenberg, M. The non-attached biofilm aggregate. Commun Biol. 6 (1), 898(2023).
- Gannon, A. D., Matlack, J., Darch, S. E. Exploring aggregation genes in a P. aeruginosa chronic infection model. J Bacteriol. 207 (1), e00429-24(2025).
- Melaugh, G., et al. Distinct types of multicellular aggregates in Pseudomonas aeruginosa liquid cultures. npj Biofilms Microbiomes. 9 (1), 52(2023).
- Letizia, M., Diggle, S. P., Whiteley, M. Pseudomonas aeruginosa: Ecology, evolution, pathogenesis and antimicrobial susceptibility. Nat Rev Microbiol. 23, 701-717 (2025).
- Andersen, J. B., et al. Identification of small molecules that interfere with c-di-GMP signaling and induce dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 59(2021).
- Andersen, J. B., et al. Induction of native c-di-GMP phosphodiesterases leads to dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 65 (4), e02431-20(2021).
- Lee, W., Woo, E. R., Lee, D. G. Phytol exhibits antibacterial activity by inducing oxidative stress in Pseudomonas aeruginosa. Free Radic Res. 50 (12), 1309-1318 (2016).
- Shirazi, F., et al. Biofilm filtrates of Pseudomonas aeruginosa inhibit preformed Aspergillus fumigatus biofilms via apoptosis. PLoS One. 11 (3), e0150155(2016).
- Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. Cystic fibrosis sputum supports growth and key physiological traits of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).
- Turner, K. H., et al. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for real-time assessment of a Pseudomonas aeruginosa infection model. J Vis Exp. (170), e62420(2021).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- McGarvey, L. P. A., et al. Cytokine concentrations and neutrophil elastase activity in bronchoalveolar lavage and sputum in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 1 (4), 269-275 (2002).
- Adams, D. S., Levin, M. Measuring resting membrane potential using fluorescent voltage reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 459-464 (2012).
- Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
- Lagendijk, E. L., et al. Genetic tools for tagging Gram-negative bacteria with mCherry for visualization. FEMS Microbiol Lett. 305 (1), 81-90 (2010).
- Meylan, S., et al. Carbon sources tune antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa via TCA cycle control. Cell Chem Biol. 24 (2), 195-206 (2017).
- Wickremasinghe, H., et al. Polymyxin B and meropenem synergistically kill multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and reduce biofilm formation. Antibiotics (Basel). 10 (4), 405(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.