Lysosomale profilering met LysoTracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten

Samenvatting

Dit artikel presenteert een levende-cel LysoTracker-protocol om lysosomale hervorming tijdens senescentie in IMR-90 menselijke fibroblasten te meten.

Samenvatting

Cellulaire senescentie is een stabiele celcyclusstoptoestand die geassocieerd wordt met karakteristieke fenotypen, waaronder vergrote celmorfologie, veranderde secretoire signalering en uitgesproken lysosomale remodellering. Senescente cellen vertonen vaak uitbreiding van het zure endo-lysosomale compartiment, gepaard met veranderingen in de luminale zuurgraad en afbraakcapaciteit, wat een mogelijkheid biedt voor eenvoudige levende-cel metingen van remodellering van senescentie-gekoppelde organel. Dit werk beschrijft een live-cell imaging-protocol dat LysoTracker Deep Red gebruikt, een acidotrope fluorescerende kleurstof, om een indirecte, pH-afhankelijke proxy te bieden voor het zure organelcompartiment als correat van de senescentiebelasting. De methode wordt aangetoond in IMR-90 menselijke longfibroblasten die replicatieve senescentie ondergaan tijdens seriële passaging. Het protocol beschrijft celkweek en passage-tracking, LysoTracker-kleuring, fluorescentiebeeldvorming en beeldgebaseerde kwantificering van lysosomale signaalintensiteit en signaalpositief gebied per cel. Senescence-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) kleuring op parallelle culturen is opgenomen als optionele bevestigende marker in plaats van als referentiestandaard. Representatieve uitkomsten tonen een hoger acidotrope fluorescerende kleurstofsignaal en grotere lyso-positieve gebieden in late-passage culturen dan bij vroege controles, wat consistent is met de uitbreiding van het zure organelcompartiment tijdens de senescentie. Omdat de uitlezing afhangt van het volume van het compartiment, protongradiënt en beschikbaarheid van kleurstoffen, kan deze het beste worden geïnterpreteerd als een indirecte correlatatie van lysosomale remodellering in plaats van als een directe maat voor het aantal lysooom of biogenese. Het protocol is eenvoudig toe te passen en kan worden aangepast aan andere celtypen of senescentie-inducerende stress, waardoor het een praktisch, kwantitatieve aanvulling biedt op conventionele eindpuntassays.

Inleiding

Cellulaire veroudering is een duurzaam celcyclusstopprogramma dat wordt geactiveerd door verschillende stressfactoren en verouderingsgerelateerde triggers 1,2,3,4. Senescente cellen worden klassiek geïdentificeerd door een constellatie van markers, aangezien geen enkele marker volledig specifiek is. Kenmerken zijn onder andere vergroot, afgeplatte celmorfologie, senescence-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) activiteit, vorming van DNA-beschadigingsfoci en een pro-inflammatories secretoir profiel (SASP)^2,4,5. Onder deze kenmerken is lysosomale remodellering naar voren gekomen als een opvallend en functioneel belangrijk kenmerk van senescence ^6,7. Senescente cellen vertonen ingrijpende lysosomale veranderingen, waaronder een dramatische uitbreiding van lysosomale grootte en aantal, samen met veranderde functie (vaak met gedeeltelijke neutralisatie van de lysosomale pH en ophoping van niet-afgebroken materiaal)6,7,8,9. Deze lysosomale expansie draagt bij aan verhoogde SA-β-Gal-activiteit, een gevestigde senescentiemarker die verhoogde lysosomale β-galactosidase-activiteit in senescente cellen 10,11,12 weerspiegelt. Inderdaad, SA-β-Gal kleuring maakt gebruik van dit fenomeen door een suboptimale pH (6,0) incubatie te gebruiken om selectief kleurstof neer te slaan in senescente-cellysosomen, die het enzym hebben opgebouwd en een hogere pH vertonen dan jonge cellen 10,12,13.

Lysosomen spelen een centrale rol in eiwitomzet en signalering, en hun ontregeling wordt nu beschouwd als een kenmerk van veroudering en senescentie 1,2,4,6. Senescente cellen vertonen vaak lysosomale disfunctie, wat blijkt uit een verhoogde luminale pH, veranderde enzymactiviteit en ophoping van lipofuscine (een autofluorescerend pigment van geoxideerde macromoleculen)^6,14. Lysosomale biogenese wordt vaak opgereguleerd of veranderd via het gecoördineerde lysosomale expressie- en regulatienetwerk (CLEAR) onder controle van transcriptiefactor EB (TFEB) en aanverwante factoren ^6,7,15. Dit proces kan de lysosomale massa in senescente cellen vergroten doordat ze zich aanpassen aan stress door het afbrekende compartiment ^6,7,10 uit te breiden. Omgekeerd kunnen senescente cellen ook een lysosomale functionele achteruitgang ervaren (bijvoorbeeld verminderde zuurgraad), wat processen zoals autofagie kan beïnvloeden en weerstand kan bieden tegen bepaalde stress, waaronder ferroptotische celdood ^6,8. Het meten van lysosomale inhoud en functie is daarom centraal voor het begrijpen en identificeren van senescence ^6,16.

LysoTracker Deep Red is een membraan-permeant fluorescerende sonde die zich selectief ophoopt in zure organellen door protonatie-gedreven vangst over het lysosomale membraan^16,17. Het resulterende signaal weerspiegelt het gecombineerde volume van het zure compartiment, de sterkte van de protongradiënt en de beschikbaarheid van lokale kleurstoffen in plaats van de lysosomale massa, en kan verschuiven met veranderingen in de lysosomale pH of membraantoestand die onafhankelijk van het totale lysosomgetal ^6,16 optreden. In de context van cellulaire senescentie vertonen cellen uitgebreide en intenser gelabelde LysoTracker-positieve compartimenten vergeleken met pre-senescent tegenhangers⁹, wat consistent is met de uitbreiding van het zure organelcompartiment en verhoogde lysosomale biogenese gerapporteerd door biochemische en ultrastructurele studies ^6,7,10. Deze live-cel benadering biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele eindpunt SA-β-Gal kleuring: het maakt kwantitatieve en ruimtelijk opgeloste analyse van individuele cellen mogelijk, kan worden gecombineerd met andere fluorescerende reporters, vereist geen fixatie en vangt heterogeniteit door continue kenmerken te rapporteren in plaats van een binair eindpunt ^6,16. Gedurende dit protocol wordt het LysoTracker-signaal gebruikt als uitlezing van het zure organelcompartiment in levende cellen, en worden conditie-afhankelijke veranderingen dienovereenkomstig geïnterpreteerd in plaats van behandeld als een absolute maat van het lysosoom^{getal 6,16}.

Dit protocol beschrijft het gebruik van LysoTracker Deep Red om lysosomale veranderingen in IMR-90 fibroblasten die replicatieve senescentie ondergaan, te profileren. IMR-90 is een normale menselijke diploïde fibroblastlijn (vrouwelijk, foetale longoorsprong) die veel wordt gebruikt in verouderingsonderzoek; net als andere primair-achtige fibroblasten (bijv. WI-38) gaan IMR-90-cellen in senescentie na ~50–60 populatieverdubbelingen (de Hayflick-limiet) als gevolg van telomeerverkorting en DNA-schadesignalering^18,19. Het protocol beschrijft hoe IMR-90-cellen kunnen worden gekweekt om senescentie te induceren via seriële passaging, veroudering te verifiëren via morfologie en SA-β-Gal kleuring, en levende culturen te kleuren met LysoTracker Deep Red voor fluorescentiebeeldvorming 5,10,12,13. Beeldverwerving en analyse zijn inbegrepen, met kwantitatieve metingen zoals het aantal lysosomen per cel, het totale lysosomale oppervlak per cel en de gemiddelde fluorescentieintensiteit. Experimentele controles en veiligheidsoverwegingen worden benadrukt, waaronder zorgvuldig omgaan met kleurstoffen en fixatieven, het minimaliseren van fototoxiciteit tijdens beeldvorming en het rekening houden met cellulaire autofluorescentie in verouderde cellen. De methode wordt aangetoond met replicatieve senescentie, maar kan worden aangepast aan andere modellen, waaronder door medicijnen geïnduceerde senescence (bijv. doxorubicine of etoposidebehandeling) of stress-geïnduceerde voortijdige senescentie (SIPS) door oxidanten 2,3,4,19,20. In elk geval moeten LysoTracker-gebaseerde uitlezingen worden vergeleken met geschikte controles (prolifererende of rustende cellen) en, indien mogelijk, worden gekruist gevalideerd met ten minste één traditionele senescentiemarker (zoals SA-β-Gal of p16INK4a-expressie)3,5,12,13.

Levende-cel lysosomale profilering vult een praktische kloof in senescentie-assays door een reproduceerbare, enkelcelresolutiemeting te bieden van een belangrijk organelfenotype—lysosomale expansie—direct gekoppeld aan de senescente celfunctie (bijv. verhoogde degradatiecapaciteit en secretorische activiteit)^2,3,4,6. Omdat LysoTracker-kleuring compatibel is met high-throughput imaging en flowcytometrie, kan het protocol worden opgeschaald voor toepassingen zoals geneesmiddelscreening (bijvoorbeeld het testen van senolytica of modulatoren van lysosomale functie)^2,3,6. Als toekomstige richting zijn per-cel lysosomale functies die door dit protocol worden gegenereerd, geschikt voor downstream classificatiemethoden, waaronder machine learning-modellen; Training en validatie van dergelijke classifiers vallen buiten de reikwijdte van dit protocol. Al met al maakt deze methode (Figuur 1) visualisatie en kwantificering van de lysosomale dimensie van de senescentiebiologie mogelijk, geeft inzicht in hoe lysosomale biogenese en morfologie veranderen tijdens veroudering of stress en biedt het een platform voor het testen van interventies gericht op lysosomen in senescente cellen. De beeldanalyseworkflow die wordt gebruikt om kernen te segmenteren, cel-geassocieerde regio's af te leiden, drempelfuncties te bepalen en LysoTracker-functies te kwantificeren, en de hier gepresenteerde per-well- en celanalyses te reproduceren, is geïmplementeerd als een open-source companion-pakket (SenTrackLite v0.5.0), geleverd als Supplementair Bestand 1 en gearchiveerd met een persistent DOI voor citatie en hergebruik²¹.

Figuur 1: Overzicht van de live-cell lysosomale senescentie-assay. (A) Experimentele workflow. Cellen worden levend gekleurd met LysoTracker Deep Red en een nucleaire kleurstof, gefotografeerd met standaard fluorescentiemicroscopie en optioneel parallel verwerkt voor SA-β-Gal kleuring voor validatie. (B) Beeldafgeleide metingen per cel. Het nucleaire kanaal wordt gebruikt om individuele cellen te identificeren, en nucleus-verankerde expansie definieert een percelgebied voor het extraheren van lyssosoom-geassocieerde metingen uit het LysoTracker-kanaal. Representatieve metingen per cel zijn onder andere het lysosomale gebied, de gemiddelde LysoTracker-intensiteit en het aantal lysosomen. SA-β-Gal kleuring kan worden gebruikt als optioneel validatielabel bij het genereren of bevestigen van referentiedatasets. (C) Kwantificatie en outputs. Per-cel lysosomale metingen worden gecombineerd tot een enkele percel senescence-score of kans, met behulp van een eenvoudige scoringsmethode. De resultaten omvatten waarden per cel en goed- of conditieniveau-samenvattingen van de senescentiebelasting, die kunnen worden vergeleken tussen senescentie-inductie- of senolytische behandelingscondities. Gemaakt met BioRender.com
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

IMR-90-cellen zijn een gevestigde menselijke fibroblastcellijn en vormen geen onderzoek van menselijke proefpersonen. Er was geen ethische goedkeuring of geïnformeerde toestemming vereist. Alle procedures werden uitgevoerd volgens de bioveiligheidsrichtlijnen van de University at Albany, State University of New York voor werk met mens-afgeleide cellijnen onder Biosafety Level 2 (BSL-2) omstandigheden.

1. Algemene voorbereiding en workflow overzicht

1. Definieer het experimentele doel als een live-cel lysosomale profileringsassay met behulp van LysoTracker Deep Red kleuring en een levende nucleaire kleurstof om lysosomale remodellering te kwantificeren als een continue uitlezing van de senescentiebelasting in IMR-90-cellen. Definieer de primaire biologische vergelijking als een van de volgende ontwerpen:
   1. Inductie van ouderdom versus gematchte niet-geïnduceerde controle.
   2. Senescence-hoog versus senescence-laag condities over een dosis of tijdreeks.
   3. Ouderdomshoge aandoening behandeld met een senolyticum versus voertuigbehandelde senescentie-hoge controle.
   4. Senolytische behandelingsreeksen omvatten zowel een senescence-low baseline groep als een senescence-high groep.
2. Stel de minimale controlestructuur vast voor alle experimenten.
   1. Neem een senescentie-lage controlegroep op die is gematcht op platingdichtheid, kleuringstiming en beeldvormingsinstellingen.
   2. Neem een senescentie-hoge groep op die wordt gegenereerd door een gedefinieerde senescentie-trigger of door late-passage replicatieve senescentie.
   3. Neem biologische replicaties per conditie op en voer kleuring en beeldvorming uit met identieke timing tussen de omstandigheden.
3. Definieer assay-uitlezingen als directe, beeldgebaseerde metingen van lysosomale remodeling:
   1. Meet de gemiddelde LysoTracker-intensiteit per cel binnen het lyso-positieve masker met een consistente intensiteitsdrempel als primaire assay-uitlezing. Op enkelcelniveau scheidt deze metriek senescentie-lage van senescentie-hoge condities met de grootste effectgrootte en is ongevoelig voor veld-niveau kerndichtheid (aanvullende figuur 1).
   2. Noteer de volgende als secundaire metingen, die compartimentuitbreiding documenteren maar gevoeliger zijn voor segmentatiekeuzes of kerndichtheid op veldniveau: lysooomverrijkt gebied per cel en geïntegreerde LysoTracker-intensiteit per kern op veldniveau. Geïntegreerde intensiteit per kern is informatief in goed bevolkte velden, maar wordt instabiel wanneer een veld een klein aantal kernen bevat, omdat normalisatie per kern wordt gedomineerd door individuele cellen.
   3. Noteer optionele lysosoomen, aantal en grootte van puncta's wanneer de beeldresolutie puncta-discriminatie ondersteunt.
4. Gebruik senescence-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) kleuring als optionele validatiestap uitgevoerd op parallelle putten of gematchte monsters, afhankelijk van experimentele beperkingen. Gebruik deze validatie om te bevestigen dat late-passage culturen een verhoogde SA-β-Gal positiviteit vertonen vergeleken met vroege passage-culturen.
5. Standaardiseer de assay over de voorwaarden door de volgende variabelen vast te stellen vóór de gegevensverzameling:
   1. LysoTracker werkconcentratie (75 nM) en kleuringsduur (30 min).
   2. Nucleaire kleurstofidentiteit en werkconcentratiebereik (bijv. Hoechst 33342 bij 1 μg/mL tot 2 μg/mL).
   3. Beeldparameters, waaronder objectiefvergroting, belichtingstijd, lichtintensiteit, binning en focusstrategie.
   4. Plaatformaat en beeldvormingsconfiguratie (beeldplaten met heldere bodem of glazen bodemschalen), inclusief het nabootsen van de putindeling.
   5. Drempelselectie en intensiteitsnormalisatie.
      1. Pas een enkele vaste intensiteitsdrempel toe op het LysoTracker-kanaal over alle putten binnen een experiment om het lyso-positieve masker te definiëren.
      2. Selecteer de drempel één keer tijdens de assay-opstelling met behulp van een kalibratieset van velden die het verwachte intensiteitsbereik overslaan (bijvoorbeeld twee senescence-low en twee senescence-high velden), en houd deze constant in alle putten binnen die sessie; Het toestaan dat de drempel per put varieert introduceert een circulaire afhankelijkheid tussen meting en uitkomst.
      3. Voor cross-experimentele vergelijkingen wordt alle condities in één sessie verworven onder identieke laservermogens-, belichtings- en versterkingsinstellingen en deze instellingen vermeld in de figuurlegende.
      4. Als absolute intensiteitsvergelijkingen tussen sessies vereist zijn, neem dan een fluorescerende referentiestandaard toe (bijvoorbeeld een referentiebeadplaat of vaste referentieput) en normaliseer de gemeten intensiteiten dienovereenkomstig.
         OPMERKING: Vergelijk geen ruwe intensiteitswaarden tussen sessies zonder identieke acquisitie-instellingen of referentiegebaseerde normalisatie.
   6. Normalisatie van nucleaire dichtheid.
      OPMERKING: Omdat senescente culturen doorgaans verminderde proliferatie en lagere kerndichtheid vertonen bij vergelijkbare zaaitijden7,10, kunnen veldniveau-metrieken gebaseerd op absolute pixeltellingen (bijv. totale lyso-positieve oppervlakte) worden beïnvloed door celaantal per veld.
      1. Rapporteer zowel ruwe als per kern genormaliseerde waarden (ruwe waarde gedeeld door het aantal Hoechst-gesegmenteerde kernen).
         OPMERKING: Per-kernnormalisatie controleert dichtheidsgerelateerde confounds en is de juiste vergelijking voor percelinterpretatie. Voor oppervlaktegebaseerde uitlezingen dient de genormaliseerde waarde als primaire metriek, terwijl het niet-genormaliseerde totaal wordt behouden voor volledigheid.
6. Maakt beelden onder omstandigheden die de kwaliteit van het live-celsignaal behouden en technische variabiliteit minimaliseren. Houd vroege en late passageplaten beschermd tegen licht tijdens het kleuren en transport, en minimaliseer de tijd buiten gecontroleerde kweekomstandigheden tijdens de beeldvorming.
7. Sla fluorescentiebeelden op als single-plane, single-channel, lossless TIFF-bestanden. Gebruik een consistent naamgevingsschema dat de koppeling tussen nucleaire en LysoTracker-beelden behoudt en de traceerbaarheid behoudt om te platen, putten, conditioneren en repliceren. Gebruik een gedeelde basisnaam met kanaalachtervoegsels (bijvoorbeeld _Hoechst.tif en _Lyso.tif). Sla afbeeldingen op in een aparte map die op experiment is georganiseerd, met submappen indien nodig.
   OPMERKING: Een praktisch pauzepunt is na het vaststellen van vroege en late passage-cohorten en het bevestigen dat late-passage culturen een tragere groei en een verouderingsachtige morfologie vertonen.
8. (Optioneel) Neem zuurstof op als experimentele variabele door gematchte IMR-90 cohorten te behouden onder omgevings- en lage zuurstofomstandigheden. Verwerk alle groepen identiek.

2. Celkweek en inductie van replicatieve senescentie

1. Ontdooi IMR-90 menselijke longfibroblasten volgens standaard celkweekpraktijken en breid cellen uit in Minimum Essential Medium (MEM), aangevuld met 10% foetaal rundserum. Voeg penicilline-streptomycine toe bij 1% als het overeenkomt met laboratoriumpraktijk en experimenteel ontwerp. Houd cellen op 37 °C in 5% CO₂.
2. Houd culturen in logaritmische groei en doorgang bij vóór 70% tot 80% confluenz. Gebruik consistente mediabehandelings- en voedingsschema's om variabiliteit tussen experimentele runs te verminderen. Vervang het volledige kweekmedium elke 2 tot 3 dagen tussen de passages.
   OPMERKING: Laat het medium niet langer dan 72 uur onveranderd blijven, omdat nutriëntenuitputting en ophoping van afgescheiden factoren stress-geïnduceerde fenotypes kunnen bevorderen die replicatieve veroudering in de problemen brengen.
3. Definieer de senescence-low baseline groep als actief prolifererende IMR-90-culturen die onder omstandigheden worden gehandhaafd die normaal groeigedrag behouden. Stem de dichtheid en behandeling van de plating af op alle experimentele groepen.
4. Genereer een groep met een hoge leeftijdsverhouding met een van de volgende benaderingen, gekozen op basis van experimentele doelen.
   1. Induceer replicatieve senescentie door seriële passaging met populatieverdubbeling totdat de proliferatie vertraagd is en de morfologie met veroudering geassocieerd is.
      OPMERKING: Het populatieverdubbelingsniveau (PDL) en het aantal passages zijn aparte maten en worden afzonderlijk gevolgd. PDL verwijst naar cumulatieve verdubbelingen na de dooi en wordt in elke passage berekend als:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂ (geoogste cellen / cellen gezaad)¹⁸,
      terwijl het aantal passages het aantal subculturen sinds het dooien telt. Omdat culturen doorgaans 1:4 zijn verdeeld bij ongeveer 70%–80% confluentie, draagt elke passage ongeveer twee populatieverdubbelingen bij, waardoor passagenummer en cumulatieve PDL niet uitwisselbaar zijn.
      OPMERKING: Oudssencentie-hoge culturen worden doorgaans waargenomen bij gevorderde populatieverdubbelingsniveaus, wanneer proliferatie vertraagt en senescence-geassocieerde morfologie duidelijk wordt. Exacte drempels moeten empirisch worden bepaald voor elke IMR-90 batch, aangezien PDL's per leverancier verschillen.
   2. Stress-geïnduceerde senescentie door het toepassen van een gedefinieerde senescentie-trigger en het toestaan van een passend fenotypisch ontwikkelingsvenster.
   3. Behandelingsgeïnduceerde senescentie door cellen bloot te stellen aan de onderzochte aandoening, terwijl het doel is te testen of die aandoening senescentie induceert.
5. Valideer dat de gekozen benadering een senescence-hoog fenotype produceert met ten minste één orthogonale uitlezing uitgevoerd op parallelle putten. Voer SA-β-Gal kleuring uit als optionele validatiemethode en documenteer het aandeel positieve cellen per conditie wanneer inbegrepen.
   1. Een kweek kwalificeert als senescence-hoog wanneer minstens 50% van de cellen ondubbelzinnige blauwe perinucleaire SA-β-Gal kleuring vertoont na 12 tot 16 uur incubatie bij pH 6,0, terwijl de gematchte senescentie-lage controle niet meer dan 10% positieve cellen toont onder identieke kleuringsomstandigheden¹³.
   2. Waarden buiten deze grenzen wijzen op onvolledige senescence-inductie of verhoogde achtergrond en rechtvaardigen heroptimalisatie voordat wordt overgestapt tot beeldvorming.
      OPMERKING: Pauze na het vaststellen van senescentie-lage en senescence-hoge cohorten en het bevestigen van een duidelijk fenotypisch verschil door morfologie en optionele validatiekleuring.
6. Optioneel: Senolytische behandelingsontwerp
   1. Plate senescence-low en senescence-high condities in replicatieputputten en stellen cellen in staat zich te hechten en te herstellen vóór de behandeling.
   2. Behandel senescence-high wells met senolytische verbindingen en neem een vehicle-behandelde senescentie-high control toe.
   3. Neem een senescentie-lage groep op die met hetzelfde voertuig wordt behandeld en, indien relevant, dezelfde verbindingsconcentratie(s) om de niet-senescente gevoeligheid te monitoren.
   4. Ga na behandeling na behandeling regelmatig live LysoTracker en nucleaire kleuring toe.
7. Monitor kweek tijdens de late passage/behandelingsprogressie en documenteer morfologie en groeipatronen. Identificeer senescente culturen door vertraagde proliferatie, vergrote en afgeplatte morfologie en verhoogde cytoplasmatische granulariteit. Zodra groeistop zichtbaar is, houd de kweek als de ouderdomshoge cohort voor kleuring en beeldvorming in plaats van verder te verspreiden.
8. Minimaliseer verstorende stressfactoren tijdens kweekonderhoud door consistente mediavoorbereiding, consistente voerschema's en consistente omwikkelingstijd buiten de broedmachine. Behandel temperatuurfluctuaties, langdurige tijd buiten gecontroleerde CO₂ en inconsistente mediaverwarming als bronnen van vermijdbare technische variabiliteit.
9. Optioneel: Houd gelijke culturen bij omgevingszuurstof en lage zuurstof. Houd culturen onder 21% O₂ en onder 5% O₂ als aparte cohorten en houd elke cohort onder de toegewezen zuurstofconditie tijdens routinematige kweekbehandeling waar mogelijk. Beperk de blootstelling aan omgevingszuurstof tijdens overdrachten en beeldvorming voor cohorten met weinig zuurstof.
   OPMERKING: Een praktisch pauzepunt is na het definiëren en stabiliseren van vroege en late-passage cohorten, en bevestigen dat late-passage culturen een consistente vertraagde groei en senescence-geassocieerde morfologie vertonen.

3. Levende-cel lysosomale en nucleaire kleuring met LysoTracker Deep Red en een nucleaire kleurstof

1. Plaat IMR-90-cellen voor alle experimentele omstandigheden in beeldvormende platen met heldere bodem of glazen bodemschalen. Neem een senescentie-lage controleconditie op en ten minste één senescence-hoge conditie die door de geselecteerde trigger wordt gegenereerd, en neem biologische replicaties toe voor elke conditie.
2. Zaadcellen om op de dag van het kleuren een subconfluente monolaag te bereiken. Noteer de zaaidichtheid en de tijd tussen platen en kleuring voor elk experiment om run-to-run vergelijkbaarheid te ondersteunen.
3. Verwarm het medium van complete cultuur tot 37 °C. Bereid een LysoTracker Deep Red werkende oplossing voor op 75 nM in het verwarmde medium en bescherm deze tegen licht. De werkoplossing wordt bereid door het 1 mM LysoTracker Deep Red kolf (geleverd door de fabrikant in DMSO) te verdunnen in verwarmd volledig cultuurmedium (bijvoorbeeld 0,75 μL 1 mM kolf per 10 mL verwarmd medium).
   OPMERKING: Late-passage en stress-geïnduceerde senescente cellen hopen lipofuscine en ander niet-specifiek autofluorescerende materiaal op dat over brede golflengtegebieden uitzendt en kan bijdragen aan het schijnbare LysoTracker-signaal in ongekleurde controles¹⁴. Om de bijdrage van autofluorescentie in een bepaald experiment te schatten, moet je per conditie ten minste één ongekleurde put opnemen en deze onder identieke beeldvormingsinstellingen verkrijgen. Trek het gemiddelde signaal van ongekleurde putjes af van metingen van gekleurde put, of rapporteer zowel ruwe als achtergrondafgetrokken waarden.
   OPMERKING: In de praktijk is het ongekleurde LysoTracker-kanaalsignaal in IMR-90-culturen klein ten opzichte van het gekleurde senescente signaal (ongeveer 5% tot 10% van het gekleurde senescent gemiddelde in de huidige dataset), maar de bijdrage neemt toe met het aantal passages en kan aanzienlijk worden (meer dan 20%) in diep senescente of oncogene-geïnduceerde senescente culturen ^6,14. Controleer altijd de autofluorescentie-magnitude bij het toepassen van dit protocol voor een nieuw celtype of een senescentie-inductiemodel.
4. Bereid voldoende LysoTracker-werkoplossing voor voor alle putten die tijdens de loop verkleurd zullen raken. Meng de werkoplossing door een zachte inversie en bescherm het tegen licht tot gebruik.
5. Aspireer het verbruikte medium uit elke put. Voeg de LysoTracker werkoplossing voorzichtig toe langs de wand van de put om te voorkomen dat de monolaag wordt verstoord en om een consistent kleurvolume over de putten te behouden.
6. Incubeer cellen met LysoTracker gedurende 30 minuten bij 37 °C in 5% CO₂. Houd alle experimentele groepen onder dezelfde incubatieduur en temperatuur.
7. Voeg een levende nucleaire kleurstof toe tijdens de laatste 10 minuten van de LysoTracker-incubatie. Voeg Hoechst 33342 direct toe aan het LysoTracker-bevattende medium bij de door de fabrikant aanbevolen werkconcentratie, bijvoorbeeld 1 μg/mL tot 2 μg/mL, en meng door zacht te wiegen van de plaat.
8. Verwijder het kleurmedium aan het einde van de incubatie. Spoel cellen één keer met voorverwarmde, fosfaatgeborde zoutoplossing om achtergrondfluorescentie te verminderen.
9. Voeg direct na de spoeling voorverwarmd fenolrood kweekmedium of een beeldvormingsbuffer toe. Ga direct over op live imaging en handhaaf een consistente tijd tussen bufferuitwisseling en beeldverwerving over alle putten in het experiment.
10. Bescherm platen tegen licht tijdens overdrachten en beeldvorming. Minimaliseer de tijd die buiten gecontroleerde temperatuur en CO₂-omstandigheden wordt doorgebracht tijdens het hanteren en beeldverwerven.
    VOORZICHTIG: Behandel fluorescerende kleurstoffen met handschoenen en oogbescherming. Verwijder vloeistoffen met kleurstof en besmette verbruiksartikelen volgens institutionele procedures voor chemische veiligheid.
    OPMERKING: Gebruik een pauzepunt na stap 3.9 als beeldvorming vereist dat meerdere platen worden gestaged. Houd platen beschermd tegen licht bij 37 °C en hervat zo snel mogelijk de beeldvorming om kleurafwijking te beperken.
    OPMERKING: Als het experimentele ontwerp zuurstof als variabele bevat, houd dan elke cohort onder de toegewezen zuurstofconditie tijdens kleuring en incubatie en noteer de verwerkingstijd buiten de toegewezen conditie.

4. SA-β-Gal kleuring voor validatie (optioneel)

1. Gebruik SA-β-Gal kleuring als optionele validatiestap om te bevestigen dat de ouderdomshoge conditie verhoogde SA-β-Gal activiteit vertoont ten opzichte van de senescentie-lage controle. Voer validatie uit op parallelle putten die in hetzelfde plaatformaat en onder dezelfde verwerkingstijdlijn als de beeldputten worden verwerkt.
2. Volledige live beeldvorming voor de validatieputten vóór fixatie. Wanneer gematchte pre- en postfixatievergelijkingen van hetzelfde veld gewenst zijn (Figuur 2), registreer dan de coördinaten van de fase bij de vernaming, plaats elk veld handmatig na fixatie en kleuring, en controleer visueel de nucleaire positie en celmorfologie om te bevestigen dat de gematchte velden overeenkomen voordat deze worden opgenomen in de downstream analyse.
3. Fixeer cellen met de fixatieoplossing die is geleverd in de SA-β-Gal kleuringsset, bereid bij de aanbevolen 1x werkconcentratie en bevat 2% formaldehyde en 0,2% glutaraldehyde. Incubeer 10 tot 15 minuten op kamertemperatuur. Ter referentie: de fixatieoplossing bevat 2% (w/v) formaldehyde en 0,2% (w/v) glutaraldehyde in fosfaatgeborrde zoutoplossing. De SA-β-Gal kleuringsoplossing bij pH 6,0 bevat 1 mg/mL X-gal (5-bromo-4-chlholo-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) opgelost in dimethylformamide direct voor gebruik, 40 mM citroenzuur / natriumfosfaatbuffer bij pH 6,0, 5 mM kaliumferrocyanide, 5 mM kaliumferricyanide, 150 mM NaCl en 2 mM MgCl^₂12,13. Commerciële kits die aan deze specificaties voldoen, kunnen door elkaar worden gebruikt, mits de pH van de kleuringsbuffer is geverifieerd op 6,0.
4. Verwijder het fixatiemiddel en spoel twee keer goed af met fosfaatgeborrelde zoutoplossing. Voeg SA-β-Gal kleuringsoplossing bij pH 6,0 met X-gal substraat aan elke put toe.
5. Sluit de plaat af om verdamping tijdens de incubatie te beperken. Plaats de plaat in een 37 °C, CO₂-vrije broedmachine gedurende 12-16 uur.
6. Inspecteer putten met brightfield-microscopie en documenteer het kleurpatroon. Maak representatieve beelden voor elke aandoening en rapporteer het aandeel SA-β-Gal-positieve cellen per put bij het valideren van resultaten.
   VOORZICHTIG: Formaldehyde en glutaraldehyde zijn giftig en vluchtig. Bereid fixatieoplossing voor en gebruik deze in een chemische dampkap en draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, oogbescherming en een labjas.
   OPMERKING: Als SA-β-Gal kleuring een hoge achtergrond vertoont in de senescentie-lage controle of zwakke kleuring in de senescence-hoge conditie, herhaal dan de validatie na aanpassing van de platingdichtheid, fixatieduur, incubatieduur en temperatuurconsistentie terwijl de buffer-pH op 6,0 blijft.

Resultaten

Het toepassen van dit protocol op IMR-90 fibroblasten onder senescence-low en senescence-high condities levert kwantitatieve lysosomale uitlezingen op die kunnen worden samengevat op single-cell niveau en, indien gewenst, op het hele veldniveau.

De representatieve dataset die in de figuren en tabellen wordt getoond, is afkomstig van een enkel biologisch experiment waarbij IMR-90-culturen bij passage 13 (P13; senescence-laag, ~PDL 26) en passage 23 (P23; senesc...

Discussie

Dit protocol beschrijft een live-cell imaging workflow die senescentie meet via lysosomale remodellering en levert kwantitatieve metingen per cel en perput van de senescentiebelasting. Verschillende stappen zijn bijzonder belangrijk om een betrouwbare assay te verkrijgen. Ten eerste moet het biologische model zelf goed worden gecontroleerd. Inductie van replicatieve senescentie bij IMR-90 fibroblasten vereist zorgvuldige tracking van populatieverdubbelingen en parallel onderhoud van vroe...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)	CellTreat Scientific Products	229124	Elke heldere-bodem multi-well kweekplaat die compatibel is met live-cel fluorescentie beeldvorming (bijv. 6-, 12-, of 24-well TC-behandelde polystyreen platen; glasbodem beeldvorming platen kunnen de voorkeur worden gegeven voor hogere resolutie beeldvorming).
Beta-galactosidase kleuringskit (senescentie assay)	Cell Signaling Technology	9860	Elke commerciële SA-β-galactosidase kit met geverifieerde kleuringsbuffer op pH 6.0. Ter referentie bevat de fixatieoplossing 2% formaldehyde en 0,2% glutaaraldehyde in PBS, en de kleuringsoplossing bevat 1 mg/mL X-gal in DMF, 40 mM citraat/fosfaat pH 6.0, 5 mM kaliumferrocyanide, 5 mM kaliumferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2.
BioRender (wetenschappelijke illustratie software)	BioRender	N/A — web applicatie	Gebaat om schematische figuren te maken (Figuren 1–3). https://www.biorender.com
Koolstofdioxide gas (CO2), gecomprimeerde cilinder	Airgas (of soortgelijke leverancier)	N/A	Medisch kwaliteits CO2 gebruikt om een 5% atmosfeer te handhaven in celkweek incubator en on-stage beeldvormingskamer.
Foetaal bovien serum (FBS), warmte-geïnactiveerd	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	Elk celkweek-kwaliteit FBS, warmte-geïnactiveerd bij 56 °C; gebruikt bij 10% v/v in compleet kweekmedium.
Fluorescentie microscoop met live-cel mogelijkheid	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	Elke widefield of confocale fluorescentie microscoop met live-cel temperatuur en CO2 controle, filtersets voor far-red (excitatie ~647 nm / emissie ~670 nm) en DAPI/Hoechst (excitatie ~405 nm / emissie ~460 nm) kanalen, en een 20×-40× objectief met voldoende NA voor het oplossen van lysosomale kenmerken. De EVOS M7000 Imaging System werd gebruikt in deze studie.
Hoechst 33342 nucleaire kleuring	Thermo Fisher Scientific	H3570	Cel-doorlaatbare DNA kleurstof voor live-cel nucleaire kleuring (blauwe fluorescentie, excitatie ~405 nm). Niet verwisselbaar met DAPI, dat niet cel-doorlaatbaar is onder fysiologische omstandigheden.
Beeldanalyse software	Python Software Foundation	N/A	Elke wetenschappelijke computing omgeving die nucleus segmentatie, nucleus-naar-cel gebiedsuitbreiding, intensiteitsdrempelstelling en basis beeld statistieken ondersteunt (bijv. Python met scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). De SenTrack pipeline (zie Aanvullend Bestand S1) werd ontwikkeld voor deze studie.
IMR-90 menselijke long fibroblasten (cel lijn)	ATCC	CCL-186	Normale humane foetale long diploïde fibroblasten cel lijn gebruikt om replicatieve senescentie te modelleren; elke soortgelijk gekarakteriseerde humane fibroblasten lijn mag worden vervangen.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	Acidotroop fluorescentie kleurmiddel voor live-cel kleuring van zure organellen; geleverd als 1 mM stock in DMSO. Werkconcentratie is 75nM in bereide celkweek media.  Far-red emissie (ex 647 nm / em 668 nm) minimaliseert overlap met lipofuscine autofluorescentie maar elimineert deze niet.
Minimum Essential Medium (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	Basmaal kweekmedium voor IMR-90 fibroblasten; aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Elke standaard formulering van Eagle's Minimum Essential Medium met Earle's zouten en L-glutamine mag worden vervangen.
Penicilline-streptomycine oplossing (100×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	Antibioticum supplement voor compleet kweekmedium; gebruikt bij 1% v/v (eindconcentratie 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine). Elke standaard pen-strep oplossing mag worden vervangen.
Fenol rood-vrij beeldvormingsmedium	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	Fenol rood-vrij DMEM of HBSS gebruikt voor live-cel beeldvorming om achtergrond fluorescentie tijdens acquisitie te verminderen. FluoroBrite DMEM is een veelgebruikte optie; elk fenol rood-vrij beeldvormingsbuffer aangevuld met 10% FBS mag worden vervangen.
Fosfaat-gebufferd zout (PBS), pH 7.4 (1×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	Isotone buffer voor cel wassen en reagens verdunning; elke steriele 1× PBS bij pH 7.4 mag worden vervangen.
SenTrackLite v0.5.0 (software)	Open-Source (Estrada / Melendez Lab)	v0.5.0	Open-source enkele-bestand Python / Tkinter applicatie voor lysosomale senescentie beeldanalyse. Gedistribueerd als Aanvullend Bestand S1. Gearchiveerd bij Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. MIT licentie. Bron: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
Stage-top omgevingskamer	Thermo Fisher Scientific	AMC2000	Omgevingskamer voor on-microscoop live-cel beeldvorming met temperatuur (37 °C) en CO2 (5%) controle. De EVOS Onstage Incubator werd gebruikt in deze studie; elke gelijkwaardige stage-top incubator mag worden vervangen.