Identificatie van potentiële anti-TB-kandidaten: Een stapsgewijze gids voor synthese, MIC-bepaling en cytotoxiciteitsbeoordeling in zoogdiercellen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om potentiële anti-tuberculose-geneesmiddelkandidaten te identificeren via fenotypische screening, waaronder de chemische synthese van een 4-aminoquinolineverbinding, het bepalen van de minimale remmende concentratie tegen Mycobacterium tuberculosis en de beoordeling van de cytotoxiciteit in zoogdiercellijnen.

Samenvatting

Tuberculose (TBC) blijft wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken door één enkele infectieuze agent, waarbij stijgende resistentiecijfers voor medicijnen de ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen tot een wereldwijde gezondheidsprioriteit maken. Dit protocol beschrijft een fenotypische screeningsbenadering voor het identificeren van potentiële anti-TB-geneesmiddelkandidaten via drie geïntegreerde fasen. Ten eerste wordt een verbinding uit de 4-aminoquinolineklasse gesynthetiseerd via een driestapsmethode en volledig gekarakteriseerd door high-performance vloeistofchromatografie (HPLC), nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en high-resolution massaspectrometrie (HRMS). Ten tweede wordt de antimicrobiële activiteit van de verbinding geëvalueerd tegen Mycobacterium tuberculosis met behulp van de colorimetrische resazurine-reductiemicroplaatassay (REMA), die de minimale remmende concentratie (MIC) bepaalt via een eenvoudige visuele kleurverandering. Ten derde wordt de cytotoxiciteit van de verbinding beoordeeld in twee zoogdiercellijnen, Vero (Afrikaanse groene apennier) en HepG2 (humaan hepatocellulair carcinoom), met behulp van de MTT-test (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide) en de neutrale rode opname (NRU) assay. Deze twee complementaire assays meten verschillende cellulaire parameters, waardoor de resultaten van cytotoxiciteit kruisvalidatie kunnen worden gevalideerd. Samen maken de MIC- en cytotoxiciteitsgegevens het mogelijk om een selectiviteitsindex (SI) te berekenen om het therapeutisch potentieel van elke verbinding te beoordelen. Dit protocol biedt een reproduceerbaar, stapsgewijs kader voor vroege anti-TB-hitdetectie en preklinische evaluatie.

Inleiding

Voornamelijk veroorzaakt door de bacil Mycobacterium tuberculosis (Mtb), is tuberculose (TB) een infectieuze luchtwegaandoening bij mensen die zich voornamelijk richt op de longen, hoewel extrapulmonale varianten ook kunnen voorkomen. TB verspreidt zich via luchtgedragen Mtb-bacillen die worden vrijgegeven door personen met actieve ziekte¹. Afhankelijk van de ziekteprogressie kan een persoon die met tuberculose is besmet onmiddellijk actieve tuberculose krijgen. Meestal ontwikkelt een nieuw geïnfecteerd individu echter latente tuberculose, waarbij Mtb-cellen met lage metabole activiteit overleven in granulomen ^1,2. Iemand met latente tuberculose kan uiteindelijk de actieve vorm van de ziekte ontwikkelen, waarbij klinische symptomen optreden³. Momenteel wordt geschat dat een kwart van de wereldbevolking een latente tuberculose-infectie^heeft.

Ondanks vele vooruitgang blijft tuberculose wereldwijd een ernstig volksgezondheidsprobleem. Gegevens uit het meest recente Global Tuberculosis Report tonen aan dat 10,7 miljoen mensen de ziekte in 2024 ontwikkelden. In datzelfde jaar werden wereldwijd 1,23 miljoen sterfgevallen door tuberculose geregistreerd, waarmee tuberculose de belangrijkste doodsoorzaak is door één enkele infectieuze verwekking. Naast de pathologie en complexe biologie van de bergarts, maken sociaaleconomische aspecten zoals armoede en ondervoeding, samen met gezondheidsgerelateerde factoren zoals roken, diabetes en hiv-co-infectie, ziektebestrijding nog uitdagender⁵. Dit draagt bij aan de langdurige blijvende rol van tuberculose als wereldwijd gezondheidsprobleem.

Bovendien hebben de huidige TBC-behandelingen beperkingen die de strijd tegen de ziekte bemoeilijken. Tegen vatbare stammen van Mtb bestaat de standaardbehandeling uit een combinatietherapie van 4 medicijnen: isoniazide (INH), rifampicine (RIF), ethambutol (EMB) en pyrazinamide (PZA). Deze antibiotica worden minimaal 6 maanden toegediend en vereisen strikte naleving gedurende de hele behandeling. Dit therapeutische regime, ondanks dat het in de meeste gevallen efficiënt is en een succespercentage van ongeveer 85% heeft, kent nog steeds veel uitdagingen ^5,6. Een van de grootste problemen zijn de bijwerkingen en de langdurige duur, die vaak leiden tot een voortijdige onderbreking door de patiënt. Dit stopzetten, samen met onjuiste toediening van de antibiotica, bevordert de keuze voor resistente Mtb-stammen, die meer toxische, dure en uitgebreide behandelingen vereisen ^7,8.

Gezien dit scenario is de ontwikkeling van nieuwe, krachtige anti-TBC-medicijnen dringend. Dit protocol beschrijft de vroege fasen van het onderzoeken van nieuwe geneesmiddelkandidaten met fenotypische screening. Om de toepassing van dit protocol te illustreren, selecteerden we een 4-aminoquinolineverbinding afkomstig van LABIO-17 voor evaluatie. LABIO-17 werd eerder door onze onderzoeksgroep geïdentificeerd als een remmer van het enzym enoyl-ACP-reductase (InhA) in Mtb, dat hetzelfde moleculaire doelwit is als isoniazide (INH)^9,10. InhA is betrokken bij de biosynthese van mycolinezuur bij M. tuberculosis en is essentieel voor het overleven van de bacil, wat het belang ervan als veelbelovend moleculair doelwit^benadrukt

Protocol

1. Chemische synthese en karakterisering

OPMERKING: Synthese en karakterisering van de chemische verbinding worden uitgevoerd zoals eerder beschreven¹⁰. Alle stappen van 1.1 tot 1.4 moeten worden uitgevoerd in een goed geventileerde dampkap met nitrilhandschoenen.

1. Bereiding van reagentia
   1. Bereiding van MeOH/CH₃CN (1:1) met 0,1% mierenzuur
      1. Meet gelijke volumes methanol (MeOH) en acetonitril (CH₃CN) om een 1:1 (v/v) mengsel (HPLC-kwaliteit) te bereiden.
      2. Combineer de oplosmiddelen in een schone, droge container (bijvoorbeeld een volumetrische kolf). Voeg mierenzuur toe om een uiteindelijke concentratie van 0,1% (v/v) te bereiken (bijv. voeg 1 ml mierenzuur toe aan 1 L oplosmiddelmengsel).
      3. Meng goed door zachtjes te draaien of te roeren. Bewaar in een goed gesloten container op kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
   2. Bereiding van 1% (v/v) azijnzuur in ultrazuiver water
      1. Spoel de volumetrische fles af met ultrazuiver water en zet hem dan op de bank. Voeg ~80% van het uiteindelijke ultrazuivere watervolume toe aan de kolf (d.w.z. 80 mL voor een 100 mL kolf; 800 mL voor een 1 L kolf).
      2. Voeg met een gekalibreerde pipet glaciale azijnzuur toe om 1% (v/v) te bereiken: voor 100 mL eindvolume voeg → 1,0 mL azijnzuur toe; voor 1 L eindvolume voeg → 10,0 ml azijnzuur toe.
      3. Meng goed door te draaien of te roeren. Vul de fles tot het laatste punt bij met Ultrapure water en meng.
      4. Ontgass de oplossing door sonicatie met een ultrasone reiniger (tankfrequentie ~40 kHz) die op ontgassingsmodus staat voor 20 minuten bij omgevingstemperatuur.
      5. Overbrengen naar een gelabelde amberkleurige fles (etiket: inhoud, concentratie, oplosmiddelkwaliteit, datum, voorbereider). Bewaar het goed gesloten op kamertemperatuur.
   3. Bereiding van acetonitril: Methanol (1:1, v/v), HPLC-kwaliteit
      1. Meet gelijke volumes acetonitril en methanol: Voor 100 mL eindvolume → 50,0 mL acetonitril + 50,0 mL methanol; voor 1 L eindvolume → 500 mL acetonitril + 500 mL methanol.
      2. Combineer de oplosmiddelen in een schone volumetrische kolf of fles en meng door inversie of roeren. Filter het mengsel door een 0,45 μm filter in een schone container om deeltjes te verwijderen.
      3. Ontgass de oplossing door sonicatie met een ultrasone reiniger (tankfrequentie ~40 kHz) die op ontgassingsmodus staat voor 20 minuten bij omgevingstemperatuur.
      4. Overbrengen naar een gelabelde amberkleurige fles (etiket: samenstelling, oplosmiddelkwaliteit, datum, voorbereider). Bewaar het goed gesloten bij kamertemperatuur, weg van warmte en licht.
   4. Bereiding van hexaan/ethylacetaat 7:3 (v/v) oplossing voor kolomchromatografie
      1. Meet 70% van het uiteindelijke volume in hexaan. Voorbeeld: voor 100 mL eindvolume → 70 mL hexaan.
      2. Meet 30% van het uiteindelijke volume af in ethylacetaat. Voorbeeld: voor 100 mL eindvolume → 30 mL ethylacetaat.
      3. Combineer beide oplosmiddelen in een schone, droge container (bijvoorbeeld volumetrische kolf of fles).
      4. Meng grondig door om te keren of te roeren tot het homogeen is. Label de container met samenstelling, datum, oplosmiddelgehalte en voorbereider.
   5. Bereiding van hexaan/ethylacetaat 1:1 (v/v) oplossing voor kolomchromatografie
      1. Meet 50% van het uiteindelijke volume in hexaan. Voorbeeld: voor 100 mL eindvolume → 50 mL hexaan.
      2. Meet 50% van het uiteindelijke volume af in ethylacetaat. Voorbeeld: voor 100 mL eindvolume → 50 mL ethylacetaat.
      3. Combineer beide oplosmiddelen in een schone, droge container (bijvoorbeeld volumetrische kolf of fles). Meng grondig door om te keren of te roeren tot het homogeen is.
      4. Label de container met samenstelling, datum, oplosmiddelgehalte en voorbereider.
   6. Bereiding van een verzadigde natriumbicarbonaat (NaHCO₃) oplossing
      1. Weeg een overtollige hoeveelheid natriumbicarbonaat (NaHCO₃) (ongeveer 15–20 g per 100 mL water).
      2. Voeg het natriumbicarbonaat toe aan een schone beker met een bekend volume gedestilleerd water (bijvoorbeeld 100 mL). Roer het mengsel continu op kamertemperatuur (20–25 °C) met een magnetische roeraar of glazen staaf.
      3. Roer verder totdat er geen vaste stof meer oplost en er een kleine hoeveelheid onopgelost natriumbicarbonaat op de bodem overblijft — dit geeft aan dat de oplossing verzadigd is.
      4. Laat de suspensie 10–15 minuten rusten zodat het onopgeloste vaste stof kan zakken. Filter het mengsel door een papieren filter of gesinterde glazen trechter om het overtollige onopgeloste bicarbonaat te verwijderen.
      5. Verzamel het heldere filtrat, dat is de verzadigde natriumbicarbonaatoplossing.
      6. Bewaar de oplossing in een stevig gesloten fles, correct gelabeld met de naam van de verbinding, concentratie (verzadigd), datum van bereiding en je initialen.
      7. Bewaar de oplossing op kamertemperatuur en bereid het vers wanneer nodig, omdat CO₂ langzaam kan ontsnappen en de concentratie na verloop van tijd kan veranderen.
2. Synthese van 6-bromo-2-methylquinoline-4-ol (3)
   1. Bereid een oplossing voor met 4-bromoaniline (1,2 g, 7,3 mmol) en watervrij magnesiumsulfaat (1,08 g, 9,0 mmol) in ethanol (15 mL).
   2. Voeg glaciale azijnzuur (0,33 mL) en ethylacetoacetaat (1,8 mL, 14,1 mmol) toe aan de oplossing. Roer het reactiemengsel 16 uur op 90 °C.
   3. Filter het reactiemengsel via cellulose, 11 μm retentie, kwalitatief filterpapier om het gesuspendeerde magnesiumsulfaat te verwijderen.
   4. Verdamp de ethanol met een roterende verdamper om het acrylaat tussenin te verkrijgen.
   5. Verhit het tussenproduct met een geschikt oliebad met een hoogpresterende synthetische warmteoverdrachtsvloeistof (zie Materiaaltabel) (15 mL) tot 230–250 °C gedurende 15 minuten om de reactie te voltooien.
   6. Koel het mengsel tot kamertemperatuur. Filter het gevormde neerslag en was het met hexaan en chloroform.
   7. Concentreer het eindproduct onder verminderde druk met behulp van een roterende verdamper totdat alle resterende oplosmiddelen zijn verwijderd (zie Materiaaltabel).
3. Synthese van 6-bromo-4-chloor-2-methylquinoline (4)
   1. Bereid een oplossing van 6-bromo-2-methylquinoline-4-ol (0,65 g, 2,8 mmol) in tolueen (10 mL). Voeg fosfor(V) oxychloride (0,65 mL, 6,9 mmol) toe aan de oplossing.
   2. Roer het reactiemengsel 2 uur op 110 °C. Verwijder het overtollige fosfor(V)oxychloride met behulp van een roterende verdamper.
   3. Koel het residu af in een ijsbad. Neutraliseer het reactiemengsel met een verzadigde natriumbicarbonaatoplossing.
   4. Extraheren van het product met ethylacetat (3 x 50 mL). Combineer de organische fasen en droog ze boven watervrij natriumsulfaat.
   5. Verdamp het oplosmiddel met een roterende verdamper om een vast residu te verkrijgen. Droog het resulterende vaste stof met een roterende verdamper om het ruwe product te kunnen betalen.
   6. Zuiver de verbinding door flashchromatografie op silicagel (35–70 mesh) met hexaan:ethylacetaat (7:3) als eluent.
4. Synthese van 6-Bromo-2-methyl-N-(4-(piperidine-1-yl)fenyl)kinoline-4-amine (6)
   1. Bereid een reactiemengsel voor met 6-bromo-4-chloor-2-methylquinoline (0,53 g, 2 mmol), 4-(piperidine-1-yl)aniline (0,57 g, 3 mmol), pyridine (0,24 mL) en HCl 37% (0,2 mL) in isopropanol (20 mL).
   2. Roer het reactiemengsel 16 uur op 85 °C. Verwijder het oplosmiddel met een roterende verdamper.
   3. Behandel het residu met een verzadigde natriumbicarbonaatoplossing.
   4. Filter het resulterende vaste stof door een cellulose, 11 μm retentiefilterpapier en los het op in chloroform (50 mL).
   5. Was de chloroformoplossing met water (3 x 15 mL). Droog de organische fase boven watervrij natriumsulfaat.
   6. Verdamp het oplosmiddel met een roterende verdamper om een groene vaste stof te verkrijgen. Zuiver het product door opeenvolgende wasbeurten met hete hexaan (4 x 10 mL).
   7. Voer de laatste zuivering uit met flitschromatografie op silicagel (35–70 mesh) met hexaan:ethylacetaat (1:1) als eluent.
5. Dunne-laag chromatografie (TLC)
   1. Monitor de voortgang van de reactie met behulp van dunne-laag chromatografie (TLC) op TLC silicagel 60 F254 platen.
   2. Gebruik startmateriaal 4 als referentie om de reactie te monitoren en het verbruik ervan te beoordelen.
6. Smeltpunt (m.p.)
   1. Voeg een spatelpunt van de verbinding toe aan het smeltpuntapparaat. Noteer het smeltpuntbereik.
   2. Pas geen correcties toe op de gemeten waarden. Voer het experiment in drievoud uit.
7. Hoogprestatievloeistofchromatografie (HPLC)
   1. Weeg 1–2 mg van verbinding 6. Bereid een voorraadoplossing van de verbinding voor met 1,0 mg/mL in acetonitril/methanol (1:1, v/v).
   2. Verdun de voorraadoplossing tot 0,5 mg/mL voor analyse. Analyseer de monsters met een HPLC-systeem (zie Materiaaltabel) uitgerust met een dubbele pomp, automatische injector en UV-detector.
   3. Verzamel en verwerk data met behulp van chromatografie-dataverzamelingssoftware (zie Materiaaltabel).
   4. Stel de chromatografische voorwaarden als volgt in: gebruik een omgekeerde fase C18-kolom, 5 μm (250 x 4,6 mm) (zie Materiaaltabel). Stel de debiet in op 1,5 mL/min en monitor UV-detectie op 254 nm. Houd de mobiele fase op 100% water (0,1% azijnzuur) van 0 tot 7 minuten; breng een lineaire gradiënt aan van 100% water (0,1% azijnzuur) naar 90% acetonitril/methanol (1:1, v/v) van 7 tot 15 minuten; Ga over 5 minuten terug naar 100% water (0,1% azijnzuur) en houd het nog eens 10 minuten vast.
8. Kernmagnetische resonantie (¹H, ¹³C)
   1. Weeg 15–20 mg verbinding 6 in een NMR-buis. Voeg DMSO-d₆ toe als oplosmiddel.
   2. Verkrijg ¹H en ¹³C NMR-spectra op een NMR-spectrometer (zie Materiaaltabel) met behulp van standaard pulssequenties.
   3. Bedien het instrument op 400 MHz voor 1H-kernen en 100 MHz voor ¹³C-kernen. Gebruik tetramethylsilaan (TMS) als interne referentie.
   4. Druk chemische verschuivingen uit (δ) in delen per miljoen (ppm). Gebruik het FID-bestand dat uit het experiment is verkregen om de NMR-gegevens te visualiseren en te verwerken.
9. Hoogresolutie massaspectrometrie (HRMS)
   1. Weeg 1–2 mg van verbinding 6. Bereid het monster voor in een 1:1 mengsel van MeOH/CH₃CN met 0,1% mierenzuur.
   2. Voer de analyse uit op een hoogresolutie Orbitrap-massaspectrometer (zie Materiaaltabel), die een lineaire ionenval-massaspectrometer combineert met een Orbitrap-massa-analyzer.
   3. Introduceer het monster door directe infusie met een debiet van 10 μL/min in positieve ionenmodus met behulp van elektrosprayionisatie (ESI).
   4. Bepaal de elementaire samenstelling met behulp van het elementaire samenstellingshulpmiddel in de massaspectrometriedata-analysesoftware (zie Materiaaltabel).
10. Kolomchromatografie – Verbinding 4
    1. Bereid een silicagelkolom voor met silicagel 60 Å (70–230 mesh, 0,063–0,200 mm). Pak de kolom op de juiste manier in met de silicagel.
    2. Gebruik hexaan/ethylacetaat (7:3, v/v) als mobiele fase. Laad de ruwe compound 4 op de kolom. Eluteer de verbinding en verzamel fracties.
    3. Monitor de fracties met TLC en combineer die met het zuivere product.
11. Kolomchromatografie – Verbinding 6
    1. Bereid een silicagelkolom voor met silicagel 60 Å (70–230 mesh, 0,063–0,200 mm). Pak de kolom op de juiste manier in met de silicagel.
    2. Gebruik hexaan/ethylacetaat (1:1, v/v) als mobiele fase. Laad de ruwe compound 6 op de kolom. Eluteer de verbinding en verzamel fracties.
    3. Monitor de fracties met TLC en combineer die met het zuivere product.

Figuur 1. Reagentia en condities: i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 uur; ii = C₁₂U₁₀, C₁₂U₁₀O, 230-250 °C, 15 min; iii = POCl₃, Tolueen, 110 °C, 2 uur; iv = Pyridine, HCl, (CH₃)₂CHOH, 85 °C, 16 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bepaling van de minimale inhiberende concentratie

1. Experimenteel ontwerp en plaatindeling
   1. Evalueer de verbindingen op hun vermogen om de groei van M. tuberculosis te remmen met behulp van de colorimetrische resazurine reductie-microplaatassay (REMA) om de Minimum Inhibitory Concentration (MIC) te bepalen, zoals eerder beschreven 11,12,13.
   2. Voer drie onafhankelijke experimenten uit (drie biologische replicata) voor elke geteste verbinding zonder technische replicaties (één rij per verbinding en één plaat per experiment).
   3. Evalueer verbindingen die als positieve controles werken samen met testverbindingen om te waarborgen dat de assayomstandigheden groeiremmen toestaan.
   4. Test Isoniazide (INH) en Rifampicine (RIF) als positieve controles.
   5. Wijs rijen A en B toe voor controleverbindingen (respectievelijk INH en RIF).
   6. Wijs volgende rijen toe voor testverbindingen (verbindingen A tot F in Figuur 2).
   7. Bereid kolommen 1 tot 10 voor met tweevoudige seriële verdunningen van controle- en testverbindingen, waarbij elke verbinding één rij inneemt, met de hogere concentratie bij kolom 10 en de lagere concentratie bij kolom 1.
   8. Bereid kolom 11 voor als een levensvatbaarheidscontrole met groeimedium en bacteriën bij een uiteindelijke DMSO-concentratie van 2,5%, zonder toevoeging van controle- of testmiddelen.
   9. Bereid kolom 12 voor als steriliteitscontrole door controle- of testverbindingen toe te voegen bij de hogere concentratie van de seriële verdunning (hetzelfde als kolom 10) aan groeimedium zonder bacteriële cellen.
   10. Zie Figuur 2 voor een representatieve indeling van een MIC-plaat.
2. Bereiding van reagentia
   1. Bereiding van Middlebrook 7H9-bouillon aangevuld met oleïnezuur, albumine, dextrose en Catalase (OADC).
      1. Voeg aan een glazen fles van 200 ml met 90 ml ultrazuiver water 0,47 g 7H9-poeder, 0,24 ml 85% glycerol en 0,5 ml 10% Tween-80 toe.
      2. Autoclaveer het medium 10 minuten bij 121 °C en 98,07 kPa.
      3. Laat het medium afkoelen tot het warm aanvoelt (ca. 45–50 °C).
      4. Voeg 10 mL OADC toe (we gebruiken commercieel verkrijgbare OADC; zie Materiaaltabel voor details).
      5. Bewaar op 4 °C.
         OPMERKING: Bereid de juiste hoeveelheid voor het experiment, rekening houdend met de verhoudingen van de reagentia.
   2. Bereiding van Middlebrook 7H9 Bouillon met ADC
      1. Voeg 0,47 g 7H9-poeder toe aan een glazen fles van 200 ml met 90 ml ultrazuiver water. Autoclaveer het medium 10 minuten bij 121 °C en 98,07 kPa.
      2. Laat het medium afkoelen tot het warm aanvoelt (ca. 45–50 °C). Voeg 10 mL ADC toe. Bewaar op 4 °C.
         OPMERKING: Bereid de juiste hoeveelheid voor het experiment, waarbij de verhoudingen van de reagentia behouden blijven.
   3. Bereiding van samengestelde kolfoplossingen
      1. Bereid een voorraadoplossing van elke verbinding met 2 mg/mL opgelost in DMSO.
      2. Bewaar bij –20 °C.
         OPMERKING: Voorafgaand aan het experiment wordt de maximale testconcentratie vastgesteld op basis van een oplosbaarheidsbeoordeling. Om de oplosbaarheidsgrens te bepalen, inspecteer je de oplossingen visueel op de aanwezigheid van kristallen. Als kristallen worden waargenomen, verdunn dan de aliquot verder tot de helft van de vorige concentratie. Voer deze beoordeling uit met 5% DMSO.
   4. Bereiding van samengestelde werkoplossingen
      OPMERKING: Werkoplossingen moeten vers worden bereid op het moment van het experiment door de basisverbindingen te verdunnen in 7H9-bouillon aangevuld met 10% ADC. De uiteindelijke DMSO-concentratie in de werkoplossing moet 5% bedragen, en de samengestelde concentratie moet twee keer zo hoog zijn als de hoogste beoogde testconcentratie. Opmerkelijk is dat de uiteindelijke DMSO-concentratie waaraan bacteriën tijdens de assay worden blootgesteld 2,5% is, omdat het volume verdubbelt na toevoeging van de bacteriële suspensie (zie sectie 2.3, stap 2.3.8).
      OPMERKING: DMSO 2,5% wordt verdragen door de bacteriestammen die in ons laboratorium worden gebruikt (M. tuberculosis H37Ra, H37Rv en klinische isolaten). Als je met andere stammen of bacteriesoorten werkt, voer dan een voorlopig MIC-experiment uit met DMSO als testmiddel om de hoogste DMSO-concentraties te bepalen die gebruikt kunnen worden zonder groeiremmen te bevorderen.
   5. Bereiding van Resazurin-oplossing
      1. Bereid een 0,01% resazurin-oplossing door 1 mg resazurin op te lossen in 10 mL ultrazuiver water.
      2. Steriliseer de oplossing met een 0,22 μm filter.
         OPMERKING: Filtergesteriliseerde resazurine kan 1 week¹⁴ worden bewaard op 4 °C. Bereid deze oplossing echter direct voor gebruik voor als standaardpraktijk.
3. Bereiding van Mycobacteriën
   1. Inoculeer een enkele kolonie M. tuberculosis in een 50 mL centrifugebuis met 10 mL 7H9-bouillon, aangevuld met 10% OADC, 0,2% glycerol en 0,05% Tween-80.
   2. Incubeer met constant schudden (100 rpm) bij 37 °C totdat de cultuur een optische dichtheid bereikt bij 600 nm (OD₆₀₀) van 0,6 tot 0,8 (ongeveer 3 tot 4 weken).
      VOORZICHTIG: M. tuberculosis H37Rv wordt geclassificeerd als een Risicogroep 3-pathogeen, die in staat is tot luchtoverdracht en potentieel dodelijke ziekten bij mensen veroorzaakt. Voer alle manipulaties uit in een gecertificeerde bioveiligheidskast binnen een laboratorium van bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3), met gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
   3. Homogeniseer de bacteriecultuur door 3 minuten te vortexen met steriele glazen kralen (1 mm).
   4. Laat de suspensie 15 minuten rusten om de klonten te laten zakken.
   5. Meet de OD₆₀₀ van het supernatant en bewaar aliquots bij −80 °C.
      OPMERKING: Voor experimenten verdun je de bacteriële suspensie tot een theoretische OD₆₀₀ van 0,006 in verse 7H9-bouillon aangevuld met 10% ADC. Doseer 100 μL per put in 96-wellplaten tijdens de assay.
4. Voorbereiding van 96-put platen
   1. Voeg 100 μL 7H9-bouillon met 10% ADC toe aan kolom 12.
   2. Voeg 100 μL 7H9-bouillon toe, aangevuld met 10% ADC (met 5% DMSO), aan kolommen 11 en 9 tot en met 1.
   3. Voeg 200 μL van de verbindingsoplossing toe (bereid bij twee keer de hoogste testconcentratie) aan kolom 10 (wijs één rij toe per verbinding).
   4. Voeg 100 μL van de samengestelde oplossing toe aan kolom 12. Voer een tweevoudige seriële verdunning uit: verplaats 100 μL van kolom 10 naar kolom 9 en meng goed door te pipetteren.
   5. Ga verder met de seriële verdunning van kolom 9 naar kolom 1. Gooi de laatste 100 μL uit kolom 1 weg.
   6. Voeg 100 μL van de bacteriële suspensie (theoretisch OD₆₀₀ van 0,006) toe aan kolommen 11 tot en met 1.
   7. Bedek de plaat, sluit af met parafilm en incubeer 7 dagen bij 37 °C.
      OPMERKING: Figuur 2 toont een representatieve indeling van een MIC-plaat. Raadpleeg deze figuur om stappen 2.3.1 tot en met 2.3.9 te interpreteren.
5. Toevoeging van Resazurin en data-analyse
   1. Voeg 60 μL 0,01% resazurineoplossing toe aan elke put van de plaat. Bedek de plaat, sluit af met parafilm en incubeer bij 37 °C gedurende 48 uur.
   2. Let op de kleurverandering van blauw (groeiremmen) naar roze (bacteriële groei).
      OPMERKING: In sommige experimenten resulteert een onvolledige kleurverandering in een paarse put. Interpreteer dit als bacteriële groei.

Figuur 2. Schematische weergave van een bouillon-microverdunningsplaat gebruikt voor het bepalen van de Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Tweevoudige seriële verdunningen van de geteste verbindingen werden verdeeld over kolommen 1–10, de daaropvolgende verdunningen worden achtereenvolgens uitgevoerd van kolom 10 tot kolom 1, met de hoogste concentratie verbindingen in kolom 10. Rijen A en B komen overeen met positieve controles die respectievelijk de referentiegeneesmiddelen isoniazide en rifampicine bevatten. De rijen C–H komen overeen met de geteste verbindingen. Kolom 11 vertegenwoordigt levensvatbaarheidscontrole (medium dat 2,5% DMSO en bacteriële inoculum bevat), terwijl kolom 12 overeenkomt met de steriliteitscontrole (medium dat de verbindingen bevat zonder bacteriële inoculum). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Cytotoxiciteitsbeoordeling in zoogdiercellijnen

OPMERKING: Voer alle celkweekmanipulaties uit onder steriele omstandigheden in een gecertificeerde Klasse II biologische veiligheidskast.

1. Bereiding van zoogdiercellijnen
   1. Kweek menselijke levercarcinoom (HepG2) en Afrikaanse groene apenniercellijnen (Vero) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
   2. Vul het medium aan met 1,8 g/L natriumbicarbonaat, 10% Fetaal Bovine Serum (FBS), 1% penicilline/streptomycine en 0,1% amfetericine B (aangeduid als volledig medium).
   3. Incubeer de celculturen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5%_CO2.
   4. Oogst subconfluente cellen (70%–80%) door ze te behandelen met een 0,25% trypsine-EDTA-oplossing gedurende 5–10 minuten.
   5. Neutraliseer de trypsine door een gelijk volume volledig medium toe te voegen. Plaats de celsuspensatie in een 15 mL conische buis en centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten.
   6. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 10 mL vers volledig medium.
   7. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller of een hemocytometer met trypanblauwe uitsluiting.
      OPMERKING: Voor trypanblauwe uitsluiting meng je 10 μL celsuspensie met 10 μL 0,4% trypanblauwe oplossing en laad je op de hemocytometer (of telglaas). Dode of door membraan aangetaste cellen lijken blauw, terwijl levensvatbare cellen ongekleurd blijven. Bereken levensvatbaarheid als % levensvatbaarheid = (ongekleurde cellen / totaal aantal cellen) x 100. Ga alleen door met zaaien als de levensvatbaarheid ≥ 90% is.
   8. Verdunn de celsuspensie tot de beoogde zaaidichtheid. Zaad 100 μL celsuspensatie in elke put van kolommen 2 tot 12 van een 96-put platbodemplaat.
      Zaaddichtheden: 4.000 cellen/put voor Vero-cellen; 5.000 cellen per put voor HepG2-cellen.
      OPMERKING: Optimaliseer deze dichtheden om ervoor te zorgen dat cellen in de logaritmische groeifase blijven en niet 100% confluentie bereiken vóór het 48-uurs assay-eindpunt.
   9. Vul kolom 1 met 100 μL volledig medium (zonder cellen) om als blanco te dienen voor absorptiemetingen.
   10. Bereid vier identieke platen voor elke cellijn: twee voor de MTT-test en twee voor de NRU-test.
   11. Incubeer de platen 24 uur bij 37 °C, 5% CO₂ om celhechting mogelijk te maken.
2. Compoundverdunning en celbehandeling
   1. Bereid voor elke testverbinding voorraadoplossingen voor in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) of een geschikt oplosmiddel (bijv. dimethylsulfoxide; DMSO).
      OPMERKING: Controleer dat de verbinding oplosbaar is in het celkweekmedium en dat de oplosmiddelconcentratie niet-toxisch is (bijvoorbeeld <0,1% v/v voor DMSO) vóór de assay.
   2. Ontwerp de plaatindeling met blanks, passende bedieningselementen en technische replica's. Een representatieve lay-out voor het testen van maximaal 9 verbindingen over 8 concentraties is weergegeven in Figuur 3.
   3. Bereid seriële verdunningen van de testverbinding(en) voor in een volledig medium om het beoogde concentratiebereik te dekken. Zorg ervoor dat er voldoende volume is voorbereid voor alle replicatieplaten.
      OPMERKING: Als je een oplosmiddel gebruikt (bijv. DMSO), vul dan het verdunningsmedium aan zodat de uiteindelijke concentratie van het oplosmiddel constant blijft gedurende de gehele serie seriële verdunningsreeks.
      OPMERKING: Oplosmiddelbehandelde putten (voertuigcontrole) dienen als functionele negatieve controle, waarmee de 100% levensvatbaarheid van de cellen wordt gedefinieerd waartegen door compound behandelde putten worden genormaliseerd. Voor assayvalidatie moet je een cytotoxische referentieverbinding toevoegen (bijv. 0,1% Triton X-100 of 1 mM natriumdodecylsulfaat) in een concentratie waarvan bekend is dat deze volledige celdood veroorzaakt (0% levensvatbaarheid). De absorptiewaarden in deze positieve controleputten mogen niet significant verschillen van blanke putten, wat 0% levensvatbaarheid bevestigt.
   4. Na de celhechtingsperiode van 24 uur wordt de platen visueel onder een omgekeerde microscoop geïnspecteerd om te bevestigen dat cellen gehecht zijn, verspreid en ongeveer 70%–80% van het putoppervlak bedekken met een homogene confluentie. Verwijder platen die verontreiniging of onvoldoende bevestiging tonen.
   5. Aspireer het kweekmedium voorzichtig met een pipetpunt, waarbij je de punt naar de zijkant van elke put kantelt om de celmonolaag niet te verstoren. Verwerk platen in secties om uitdroging te voorkomen.
   6. Voeg onmiddellijk 100 μL van de juiste teststofverdunningen of controlemedia toe aan de bijbehorende putten.
   7. Incubeer de behandelde platen 48 uur bij 37 °C, 5%_CO2.
3. MTT Assay Protocol
   1. Bereid een 0,5 mg/mL MTT-oplossing voor in serumvrije DMEM. Filter door een 0,22 μm spuitfilter en bescherm tegen licht.
   2. Na de 48 uur durende behandeling inspecteer je de cellen visueel om de verwachte behandelingseffecten te bevestigen.
   3. Aspireer het medium voorzichtig van de MTT-platen. Voeg 50 μL van de 0,5 mg/mL MTT-werkoplossing toe aan elke put.
   4. Incubeer 3 uur bij 37 °C, 5%_CO2, beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Hoewel 2–4 uur gebruikelijk is, is een incubatie van 3 uur doorgaans voldoende voor Vero- en HepG2-cellen. Optimaliseer indien nodig.
   5. Voeg 100 μL 100% DMSO toe aan elke put om de formazankristallen op te lossen. Plaats de platen op een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 15 minuten, beschermd tegen licht. Controleer controleputten om volledige kristaloplossing te garanderen. Meet de absorptie bij 570 nm met een microplaatlezer. Indien beschikbaar, stel een referentiegolflengte in van 630–690 nm.
4. Neutraal Rood Opname (NRU) Assay Protocol
   1. Bereid een 40 μg/mL Neutraal Rood (NR) oplossing voor in serumvrije DMEM en filter. Bereid de NR Desorptieoplossing voor: 1% (v/v) glaciale azijnzuur, 49% (v/v) ethanol en 50% (v/v) ultrazuiver water.
      VOORZICHTIG: Gletsjerazijnzuur is corrosief; Handle in een dampkap.
   2. Na de 48 uur durende behandeling inspecteer je de cellen visueel. Aspireer voorzichtig het medium van de NRU-platen.
   3. Voeg 100 μL van de 40 μg/mL NR-werkoplossing toe aan elke put. Incubeer 2 uur bij 37 °C, 5%_CO2.
      OPMERKING: Een incubatie van 2 uur is voldoende voor maximale kleurstofopname in deze cellijnen.
   4. Aspireer de NR-werkoplossing. Spoel elke keer voorzichtig goed af met 150 μL steriele PBS.
   5. Voeg 150 μL van de NR-desorptieoplossing toe aan elke put. Plaats het op een orbitale shaker op 150 rpm gedurende 15 minuten om de kleurstof eruit te halen.
   6. Controleer controleputten om volledige kleurstofextractie te garanderen. Meet de absorptie bij 540 nm met een microplaatlezer.
5. Data-analyse
   1. Voer achtergrondaftrekking uit door de gemiddelde absorptie van de lege kolommen te berekenen en deze waarde van alle putten af te trekken.
   2. Voer een toxiciteitscontrole uit door oplosmiddelcontroleputten te vergelijken met onbehandelde controles. Als de levensvatbaarheid onder een gedefinieerde drempel ligt (bijvoorbeeld 80%), overweeg dan cytotoxiciteit van oplosmiddel.
   3. Bereken de levensvatbaarheid in verhouding tot oplosmiddelcontroleputten:
      % levensvatbaarheid = (absorptie van behandelde put / gemiddelde absorptie van oplosmiddelcontrole) x 100.
   4. Plot % levensvatbaarheid (y-as) tegen log₁₀ van de samengestelde concentratie (x-as). Gebruik een niet-lineair regressiemodel (sigmoïdale dosisrespons, variabele helling) om CC₅₀ te bepalen.
   5. Bereken de Selectiviteitsindex (SI) door CC₅₀ te delen door MIC.

Figuur 3. Plaatontwerp voorbeeld voor MTT/NRU cellevensvatbaarheidstest vroege screeningsopstelling voor het testen van cytotoxiciteit van maximaal 9 verbindingen. (A) Plaatontwerpschema. Kolom 1 is toegewezen aan "leeg", zonder cellen, en gevuld met DPBS of volledig medium. Kolommen 2 en 12 worden bezaaid met cellen en behandeld met volledig medium ("onbehandelde controle") of volledige media met oplosmiddel ("oplosmiddelcontrole"). Kolommen 3 tot en met 11 worden bezaaid met cellen en behandeld met seriële verdunningen van de te testen verbindingen, tot 9 verbindingen met één replicaat per geteste concentratie per verbinding. (B) Representatieve foto's van een Vero NRU-plaat (boven) en een Vero MTT-plaat (hieronder) na de 48 uur behandeling en de laatste teststappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

De synthese leverde de doelverbinding 6 op als een lichtgroene vaste stof (0,53 g, 67% opbrengst). De verbinding vertoont een smeltpunt van 227–229 °C en een UHPLC-zuiverheid van 99% (t_R = 14,11 min) (Figuur 4). De chemische structuur werd bevestigd door nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en hogeresolutie massaspectrometrie (HRMS). Het ^1HNMR-spectrum (Figuur 5) toonde signalen die overeenkwamen met de piperidine-moietie tussen 1,50 en 3,13 ppm. De methylgroep op de 2-positie verscheen als een typische singlet bij 2,38 ppm. De waterstof op de 3-positie verscheen als singlet bij 6,56 ppm. De fenylring toonde twee dubbelen van 6,97 en 7,17 ppm, met een koppelingsconstante van 8,9 Hz. De waterstoffen op de 7- en 8-posities genereerden een multiplet van 7,63–7,75 ppm, terwijl de waterstof op de 5-positie van de quinolinekern een doublet produceerde van 8,59 ppm (J = 2,0 Hz). Het aminewaterstof werd waargenomen als singlet bij 8,66 ppm. Het ¹³C NMR-spectrum (Figuur 6) vertoonde een signaal van 23,81 ppm dat werd toegeschreven aan de methylgroep op de 2-positie, terwijl signalen tussen 24,85 en 49,70 ppm overeenkwamen met de piperidine-groep. De koolstof op de 3-positie leek 100,52 ppm te zijn. Overige downfield-signalen werden toegeschreven aan de quinolinekern en fenylringcarbons. HRMS bevestigde de moleculaire formule van verbinding 6, met een [M+H]⁺ ion op m/z 396,1063 (calcd voor C₂₁H₂₃BrN₃: 396,1070).

Figuur 4. HPLC-chromatogram en UV-spectra van verbinding 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) spectra van verbinding 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d6) spectra van verbinding 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De remmende activiteit van de verbinding tegen M. tuberculosis werd geëvalueerd door het bepalen van de MIC, gedefinieerd als de laagste concentratie van een verbinding die zichtbare bacteriegroei volledig voorkomt. In de REMA-test duidt een gebrek aan kleurverandering (het blijvende blauw) op groeiremming, terwijl een verschuiving naar roze op bacteriële groei wijst. Isoniazide (INH) en rifampicine (RIF) dienden als drugscontrole. De resultaten zijn te zien in Figuur 7. Elke plaat bevatte een groeicontrole (kolom 11, zonder medicijnen) en een steriliteitscontrole (kolom 12, zonder mycobacteriën). Verbindingen werden seriëel verdund van kolom 10 (hoogste concentratie) tot kolom 1 (laagste concentratie). Zoals weergegeven in Figuur 7, wordt de MIC-waarde voor de verbinding in rij A (isoniazide) geobserveerd in kolom 4, terwijl de MIC-waarden voor de verbindingen in rijen B (rifampicine) en C (gesynthetiseerde verbinding) in kolom 5 worden geobserveerd. In onze handen zijn MIC-waarden voor INH 0,31 μg/mL voor H37Rv-rek en 0,16 μg/mL voor H37Ra, terwijl we voor RIF 0,08 μg/mL voor H37Rv en 0,01 μg/mL voor H37Ra-rek krijgen.

Figuur 7. Bepaling van de minimale inhiberende concentratie (MIC) bij Mycobacterium tuberculosis met behulp van de resazurine-microplaatassay (REMA). Rijen A–C, kolommen 1–10: Tweevoudige seriële verdunningen van isoniazide (rij A), rifampicine (rij B) en de gesynthetiseerde verbinding (rij C). Kolom 11: Levensvatbaarheidscontrole (medium met 2,5% DMSO + bacteriën). Kolom 12: Steriliteitscontrole (medium + verbinding). Een blauwe kleur duidt op remming van bacteriegroei, terwijl een roze kleur de levensvatbaarheid van bacteriën aangeeft door de reductie van resazurine tot resorufine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een representatieve 96-well-plaat voor zowel de NRU (Vero, boven) als MTT (Vero, onder) assays is weergegeven in Figuur 3B. In de MTT-plaat is een duidelijke kleurverloop zichtbaar, dat verschuift van doorschijnend (geen levensvatbare cellen) bij hoge verbindingsconcentraties naar een diep paars (hoge cellevensvatbaarheid) bij lage concentraties. Evenzo vertoont de NRU-plaat een gradiënt van doorschijnend naar dieproze, wat wijst op de opname van de neutrale rode kleurstof in de lysosomen van levensvatbare cellen.

De microscopie geeft een visuele bevestiging van de assaystatus na de incubatietijd van 48 uur (Figuur 8). Figuur 8A vergelijkt gezonde, onbehandelde controlecellen (Vero en HepG2) met cellen behandeld met een cytotoxische concentratie van de verbinding. De behandelde cellen lijken afgerond, losgelaten en niet-levensvatbaar. Figuur 8B biedt een kritisch visueel controlepunt voorafgaand aan de laatste oplosbaarheidsstap. Het toont de verwachte vorming van donkerpaarse formazankristallen in levensvatbare cellen (MTT-assay) en de ophoping van rode kleurstof in de lysosomen (NRU-assay) in beide celtypen.

Ruwe absorptiegegevens werden genormaliseerd naar de voertuigcontrole en geanalyseerd via niet-lineaire regressie om dosis-responscurves te genereren, zoals beschreven in protocol stap 3.5. Voor de doelverbinding 6 (afgeleid van LABIO-17) leverde deze analyse een CC₅₀ op van 12,2 μM (Vero) en 18,3 μM (HepG2) in de NRU-assay, en een CC_{van 50} >20 μM voor beide cellijnen in de MTT-assay. Dit resulteerde in een Selectiviteitsindex (SI) variërend van 30,5 tot >50, zoals eerder gerapporteerd¹⁰.

Figuur 8. Representatieve microscopiebeelden van cytotoxiciteitsassays in Vero- en HepG2-cellen. Alle beelden zijn genomen met 100x vergroting. (A) Vergelijking van celmorfologie na 48 uur behandeling. Onbehandelde controleputten voor Vero (boven) en HepG2 (onder) cellen vertonen een gezonde, confluente monolaag. Daarentegen lijken cellen die met een cytotoxische concentratie van een verbinding zijn behandeld afgerond, gekrompen en losgekoppeld van het plaatoppervlak. (B) Kritieke visuele controlepunten na toevoeging van reagens en vóór oplosbaarheid. In de MTT-test (linker panelen voor elke cellijn) bevatten levensvatbare cellen zichtbare donkerpaarse formazankristallen. In de NRU-assay (rechterpanelen voor elke cellijn) tonen levensvatbare cellen een ophoping van rode kleurstof binnen intacte lysosomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Een fenotypische screeningsmethode, die vertrouwt op volledige celactiviteit in plaats van geïsoleerde enzymen, is een effectieve strategie om actieve verbindingen tegen M. tuberculose te identificeren. Hier beschreven we de eerste stappen van deze benadering, waaronder de chemische synthese van een kandidaatverbinding, de evaluatie van de remmende activiteit via minimale inhibitorische concentratie (MIC) bepaling, en de beoordeling van de cytotoxiciteit in zoogdiercellen (Vero en HepG2) met behulp van MTT- en NRU-assays.

De synthetische route bestond uit drie hoofdstappen (Figuur 1), die de doelverbinding in hoge zuiverheid leveren met operationeel eenvoudige transformaties. Verschillende kritieke stappen werden geïdentificeerd als bepalend voor reproduceerbaarheid en efficiëntie. De initiële condensatie vereist nauwkeurige stoichiometrische controle en aanhoudende reflux om volledige intermediaire vorming te garanderen. Onvolledige verwijdering van oplosmiddelen vóór thermische cyclisatie kan de efficiëntie van de ringsluiting negatief beïnvloeden. De cyclisatiestap zelf vereist strikte temperatuurregeling, omdat onvoldoende verwarming leidt tot onvolledige aromatisatie, terwijl overmatige of langdurige verwarming de vorming van bijproducten kan bevorderen. Tijdens chlorering wordt een zorgvuldige controle van de reactietemperatuur en geleidelijke toevoeging van fosforylchloride aanbevolen om nevenreacties te minimaliseren en selectieve activatie op de 4-positie te waarborgen. Tijdens methodeoptimalisatie verbeterden kleine procedurele aanpassingen de robuustheid. In gevallen van onvolledige neerslag na cyclisatie verbeterde geleidelijke afkoeling in plaats van snel afkoelen het herstel van het vaste bestand. Als er verminderde opbrengsten werden waargenomen in de nucleofiele substitutiestap, bleek het verlengen van de reactietijd of het verifiëren van de aminezuiverheid voordelig.

De belangrijkste beperkingen van de methode zijn de noodzaak van hogetemperatuurcyclisatie en corrosieve chlorerende reagentia zoals fosforylchloride, wat specifieke laboratoriuminfrastructuur en veiligheid vereist. Substituente elektronische effecten kunnen heroptimalisatie voor verschillende anilines of amines vereisen, waardoor brede diversificatie van het scaffold zonder aanpassing wordt beperkt. De Conrad–Limpach-benadering is echter operationeel eenvoudiger dan Skraup-type syntheses (harde oxidatoren) of overgangsmetaal-gekatalyseerde protocollen (gespecialiseerde katalysatoren/inerte atmosferen). Deze metaalvrije methode levert efficiënt gefunctionaliseerde quinoline-intermediairen op voor medicinale chemie.

Het protocol dat wordt gebruikt om de MIC te bepalen is een colorimetrische assay die gebaseerd is op visuele inspectie. Een mogelijke uitdaging bij deze methode is een onvolledige kleurverandering, wat resulteert in een paarse put in plaats van duidelijk blauw (inhibitie) of roze (groei). Als dit gebeurt, moet het worden geïnterpreteerd als een gebrek aan het remmen van mycobacteriële groei. Bovendien wordt de maximale testbare concentratie bepaald door de löselijkheid van de verbinding, wanneer de verbinding wordt beoordeeld door seriële verdunning. Als gevolg hiervan kan de uitkomst in sommige gevallen niet doorslaggevend zijn als er geen remming wordt waargenomen bij de maximale oplosbare concentratie. Bovendien is het belangrijk te erkennen dat andere laboratoria bepaalde stappen van het protocol kunnen aanpassen aan hun specifieke omstandigheden, wat kan leiden tot variaties in de verkregen resultaten. Om de doorvoersnelheid te verhogen, kan dit protocol worden aangepast voor automatisering. Het implementeren van vloeistofbehandelingssystemen voor de voorbereiding van 96-putten platen zou pipetfouten verminderen, waardoor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid verbeteren.

Het cytotoxiciteitsevaluatieprotocol maakt gebruik van twee verschillende zoogdiercellijnen (Vero en HepG2) en twee complementaire levensvatbaarheidstests (MTT en NRU). Verschillende stappen binnen dit protocol zijn cruciaal om de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van de data te waarborgen, en elk laboratorium moet zijn eigen validatie uitvoeren. Zo moet de initiële celzaaidichtheid zorgvuldig worden geoptimaliseerd, omdat over-confluentie kan leiden tot contactremming en veranderde metabole toestanden, wat de resultaten verstoort, terwijl onderzaaiing cellen vatbaarder kan maken voor kleine beledigingen, wat mogelijk de toxiciteit¹⁵ overschat. Bovendien wordt de hoogst geteste concentratie vaak beperkt door de oplosbaarheid van verbindingen, en neerslag kan leiden tot onnauwkeurige resultaten. Ook is de voorgestelde plaatindeling (Figuur 3A) ontworpen voor primaire screening, waarbij het aantal geteste verbindingen wordt gemaximaliseerd door technische replicaties te vermijden en randeffecten te negeren ten gunste van validatie via onafhankelijke biologische replicaten.

Een belangrijke kracht van dit protocol is de parallelle implementatie van zowel MTT- als NRU-assays. Hoewel beide goed zijn vastgesteld, meten ze verschillende cellulaire parameters. De MTT-assay kwantificeert de metabole activiteit van mitochondriale dehydrogenasen, wat over het algemeen correleert met cellevensvatbaarheid¹⁶. Deze test is echter gevoelig voor interferentie door verbindingen met reducerende of oxiderende eigenschappen of die de mitochondriale ademhaling verstoren, wat kan leiden tot mogelijke valse resultaten¹⁵. Het parallel uitvoeren van de NRU-assay helpt om dergelijke artefacten op te lossen. De NRU-assay meet het vermogen van levensvatbare cellen om de lysosomale integriteit te behouden en de pH-gradiënten die nodig zijn voor kleurstofopname¹⁷. Verschillen tussen MTT- en NRU-resultaten kunnen specifieke toxiciteitsmechanismen aan het licht brengen, zoals mitochondriale disfunctie, wat verder onderzoek vereist.

Samenvattend beschrijft dit protocol de fundamentele stappen voor het identificeren van potentiële anti-tuberculaire medicijnkandidaten. Verbindingen met veelbelovende selectiviteit en potentie kunnen vervolgens worden doorgewerkt naar complexere infectiemodellen, zoals in vivo-studies .

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CEL LINES
HepG2 (human hepatocellular carcinoma)	ATCC	HB-8065	Human liver carcinoma cell line
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (African green monkey kidney)	ATCC	CCL-81	Primate kidney epithelial cell line
CHEMICALS – SYNTHESIS
4-(Piperidin-1-yl)aniline	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	Amine precursor for compound 5/6
4-Bromoaniline	Sigma-Aldrich	108-67-8	Starting material for quinoline synthesis
Acetic acid (glacial)	Sigma-Aldrich	695092	Reagent in synthesis and mobile phase preparation
Acetonitrile (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34967	HPLC mobile phase component and NMR solvent
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	Solvent for product extraction
DMSO-d6 (deuterated)	Sigma-Aldrich	175641	NMR solvent
Dowtherm A (heat transfer fluid)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	High-boiling solvent for thermal cyclization (230–250 °C); formerly listed as Dowtherm® A
Ethanol (absolute)	Sigma-Aldrich	459836	Reaction solvent for Conrad–Limpach step
Ethyl acetate (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270989	Column eluent component
Ethyl acetoacetate	Sigma-Aldrich	E12806	β-ketoester reagent for quinoline ring formation
Formic acid (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	F0507	0.1% additive in mobile phase for HPLC and HRMS
Glass beads (1 mm, sterile)	Sigma-Aldrich	G8772	For homogenization of M. tuberculosis culture
HCl (hydrochloric acid, 37%)	Sigma-Aldrich	320331	Acid catalyst in nucleophilic substitution
Hexane (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34859	Non-polar eluent for column chromatography
Isopropanol	Sigma-Aldrich	278475	Reaction solvent for synthesis of compound 6
Magnesium sulfate (MgSO4, anhydrous)	Sigma-Aldrich	M7506	Drying agent and reaction catalyst
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860	HPLC mobile phase and NMR solvent component
Phosphorus(V) oxychloride (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	Chlorination reagent for intermediate 4
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	Base catalyst in nucleophilic substitution
Silica gel (35–70 mesh) for flash chromatography	Macherey-Nagel	815349	Stationary phase for flash chromatography steps
Silica gel 60 Å (70–230 mesh) for column chromatography	Macherey-Nagel	815381	Stationary phase for column chromatography
Sodium sulfate (Na2SO4, anhydrous)	Sigma-Aldrich	239313	Drying agent for organic phase
TLC Silica gel 60 F254 plates	Merck	1.05554	Thin-layer chromatography monitoring
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Solvent for chlorination step
Ultrapure water	Millipore / equivalent	N/A	Used in mobile phase preparation; formerly referenced as Milli-Q water in text
EQUIPMENT & INSTRUMENTS
0.22 µm syringe filter	Millipore / any	SLGP033RS	Sterilization of resazurin solution (2.1.4); filtration of MTT working solution (3.3); filtration of Neutral Red working solution (3.4)
0.45 µm syringe filter	Millipore / any	SLHA033SS	Filtration of mobile phase solutions
15 mL conical tube (sterile)	Falcon / any	352097 or equivalent	Collection and centrifugation of cell suspension after trypsinization
96-well plate (flat bottom, tissue culture treated)	Corning / any	3596	For cytotoxicity and MIC assays
Aluminum foil	Any	—	Light protection of plates during MTT and NRU incubation and shaking steps
Autoclave	Any	—	Sterilization of media (121 °C, 98.07 kPa, 10 min)
Biosafety cabinet (Class II, certified)	Any (BSL-3 certified)	—	Required for M. tuberculosis manipulations (BSL-3)
Cell counter (automated) or hemocytometer	e.g., Bio-Rad TC20 / Neubauer	TBD	For cell concentration and viability determination
Centrifuge (capable of 200 × g)	Any	—	Cell pelleting step
CO2 incubator (37 °C, 5% CO2, humidified)	Any	—	Cell culture and treatment incubation
Heating mantle	Fisotom	12M	Temperature-controlled heating mantle with Dowtherm® A
HPLC system (Dionex UltiMate 3000)	Thermo Fisher Scientific	5035.9200	Dual pump, automatic injector, UV detector; for purity analysis of compound 6
Inverted microscope (or equivalent)	Any	—	Visual inspection of cells at attachment (3.2), during treatment checkpoint (3.3, 3.4), and for assay status verification
Magnetic stirrer / hotplate	Any	—	Solution preparation and reaction mixing
Mass spectrometer (LTQ Orbitrap Discovery)	Thermo Fisher Scientific	—	High-resolution Orbitrap combined with LTQ XL; for HRMS of compound 6
Melting point apparatus	Any (e.g., Stuart SMP10)	—	Melting point determination of compound 6
Microplate reader (absorbance)	Any (e.g., BioTek Epoch)	—	Reads absorbance at 570 nm (MTT) and 540 nm (NRU)
NMR spectrometer (Avance III HD, 400 MHz)	Bruker Corporation	N/A	1H and 13C NMR acquisition; located at PUCRS facility
Orbital shaker	Any	—	100 rpm (MTT crystal dissolution); 150 rpm (NRU extraction)
Parafilm M	Bemis / Sigma-Aldrich	P7793	Sealing of 96-well plates during incubation
Qualitative filter paper	UNIFIL	50,11,250	Whatman Grade, cellulose; 11 µm retention; ~80 g/m²