Semi-geautomatiseerde integratie van motorische gezondheidsduur- en levensduuranalyse met behulp van de FlyTrDT-pipeline in Drosophila melanogaster

Samenvatting

Drosophila melanogaster dient als een krachtig modelorganisme voor verouderingsonderzoek. Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om een reproduceerbare, populatiegebaseerde meting van zowel de levensduur als de functionele gezondheidsduur te genereren.

Samenvatting

Veroudering wordt gekenmerkt door progressieve functionele achteruitgang en een verkorte levensduur; deze twee parameters worden in experimentele studies vaak onafhankelijk van elkaar geëvalueerd. Bij Drosophila melanogaster worden levensduuranalyzes en op negatieve geotaxis gebaseerde locomotorische metingen veelvuldig gebruikt om veroudering en neurodegeneratie te bestuderen. Er is echter een gebrek aan gestandaardiseerde kaders die vroege motorische prestaties kwantitatief integreren met overleving op lange termijn. Hier beschrijven we een reproduceerbare, semi-geautomatiseerde workflow die levensduuranalyse combineert met objectieve kwantificering van de motorische gezondheidsspanne bij verouderende vliegen.

Het protocol integreert gecontroleerde kweekomstandigheden voor vliegen, mortaliteitsboekhouding en op video gebaseerde assays voor negatieve geotaxis met gebruik van gestandaardiseerde MP4-opnamen (minimale resolutie 1280 × 720, 30 frames/s). Locomotieve prestaties worden gekwantificeerd met een op maat gemaakte Python-gebaseerde pipeline, geïmplementeerd in Python 3.12.1 met OpenCV 4.9.0, NumPy 1.26.4, Pandas 2.2.0 en Matplotlib 3.5.2. De workflow voert frame-voor-frame centroiddetectie uit en extraheert de actieve klimhelling (pixels/s) als een continue maatstaf voor de motorische functie. Overlevingstrajecten worden geanalyseerd door de overlevingsfractie te berekenen en trapeziale numerieke integratie uit te voeren om de oppervlakte onder de curve (AUC) van de overleving te verkrijgen. Normalisatie van de vroege motorische prestaties maakt een directe vergelijking mogelijk tussen functionele achteruitgang en de algemene levensduur.

De workflow werd geëvalueerd door semi-geautomatiseerde metingen van de klimhelling te vergelijken met conventionele handmatige eindpuntscoren bij controlevliegen en vliegen die amyloïd-β tot expressie brachten, waarbij beide methoden een leeftijdsafhankelijke motorische achteruitgang detecteerden. Representatieve datasets toonden reproduceerbare levensduurtrajecten aan bij Canton S-controles en meetbare vroege motorische beperkingen in het neurodegeneratieve model. Deze methode minimaliseert waarnemersbias, verbetert de reproduceerbaarheid en blijft compatibel met goedkope video-acquisitiesystemen. De workflow kan eenvoudig worden aangepast aan genetische modellen, farmacologische interventies en neurodegeneratieve paradigma's, waardoor een schaalbaar platform ontstaat voor geïntegreerde fenotypering van veroudering in Drosophila.

Inleiding

Veroudering wordt niet alleen gekenmerkt door een verkorte levensduur, maar ook door een progressieve achteruitgang van de fysiologische en gedragsmatige functies¹. Bij neurodegeneratieve aandoeningen treden vroege stoornissen in de motorische coördinatie vaak op vóór aanzienlijke mortaliteit en weerspiegelen deze een onderliggende neuronale dysfunctie^2,3. De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een krachtig modelsysteem geworden voor het bestuderen van veroudering en neurodegeneratie vanwege de korte levensduur, genetische hanteerbaarheid en goed gevestigde gedragstests⁴. Analyse van de levensduur bij Drosophila biedt een robuuste maat voor de overleving van het organisme, terwijl tests voor negatieve geotaxis op grote schaal worden gebruikt om de locomotorische functie en de leeftijdsafhankelijke motorische achteruitgang te beoordelen^5,6. Deze twee uitkomatmetingen worden echter vaak onafhankelijk van elkaar geanalyseerd, wat de mogelijkheid beperkt om vroege functionele stoornissen kwantitatief te relateren aan langetermijntrajecten van overleving. Geïntegreerde analyse van de motorische gezondheidsspanne en de levensduur kan mechanistisch inzicht bieden in de vraag of interventies de verouderingssnelheid, de ziekteprogressie of specifieke fysiologische systemen beïnvloeden. Deze benadering is bijzonder geschikt voor genetische, farmacologische en neurodegeneratieve modellen waarin vroege locomotorische tekorten voorafgaan aan aanzienlijke mortaliteit, waardoor een gevoelige detectie van functionele achteruitgang mogelijk is voordat er observeerbare verschillen in overleving optreden.

Traditionele assays voor negatieve geotaxis zijn afhankelijk van scoring op basis van eindpunten, zoals de proportie vliegen die een gedefinieerde hoogte bereikt binnen een vast tijdsinterval. Hoewel handmatige scoring eenvoudig en goedkoop is, kan het waarnemersbias introduceren en subtiele verschillen in motorische kinetiek over het hoofd zien. Continue metingen afgeleid van trajecten kunnen de gevoeligheid voor het detecteren van subtiele locomotorische beperkingen verbeteren ten opzichte van conventionele scoringmethoden op basis van eindpunten. Op soortgelijke wijze vereisen assays voor levensduur een strikte mortaliteitsadministratie en omgevingsstandaardisatie om reproduceerbaarheid te waarborgen⁷. Er blijft een behoefte aan toegankelijke, reproduceerbare benaderingen die functionele metrics voor de gezonde levensspanne integreren met overlevingsgegevens binnen dezelfde cohort.

Hier beschrijven we een semi-geautomatiseerde workflow die gestandaardiseerde levensduuranalyse combineert met videogebaseerde kwantificering van de motorische prestaties bij verouderende Drosophila. Met behulp van open-source computationele tools wordt frame-voor-frame centroiddetectie uitgevoerd om de klimhelling (pixels/s) te extraheren als een continue maatstaf voor de motorische functie. Overlevingsgegevens worden verwerkt door de overlevingsfractie te berekenen en trapezioïdale numerieke integratie uit te voeren om de overlevingsoppervlakte onder de curve (AUC) te verkrijgen. Door vroege motorische prestaties te normaliseren en deze te integreren met de overlevings-AUC, maakt dit protocol een directe vergelijking mogelijk tussen functionele achteruitgang en de totale levensduur. Deze aanpak biedt een objectief en kosteneffectief kader om de motorische gezondheidsspan te koppelen aan uitkomsten van de levensduur en maakt een uitgebreide fenotypering van verouderingstrajecten bij Drosophila mogelijk (Afbeelding 1).

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd met Drosophila melanogaster en werden verricht in overeenstemming met de institutionele laboratoriumrichtlijnen . Ethische goedkeuring was niet vereist omdat de studie ongewervelde organismen betrof. Voer alle procedures uit volgens de institutionele richtlijnen voor dierenwelzijn voor onderzoek naar ongewervelden.

OPMERKING: Bewaar experimenteel voeder bij 4 °C en gebruik dit binnen 1 week, mits het droog blijft. Handhaaf standaard omgevingscondities door de vliegen te incuberen bij 25 °C onder een licht-donkercyclus van 12:12 h en een relatieve vochtigheid van ongeveer 60%.

1. Bereiding van standaardvliegenvoedsel

1. Basisbereiding van het voedsel
   1. Combineer 6 g maïzena, 5 g gist, 4 g D-glucose, 3 g sucrose, 1 g gistextract, 1 g agar en 0,25 g maltextract in een houder met 100 mL gedestilleerd water.
   2. Meng de inhoud grondig met een spatel totdat er een uniforme suspensie ontstaat.
   3. Verwarm het mengsel gedurende 12–15 min bij ongeveer 85–100 °C op een inductiekookplaat bij het bereiden van volumes ≥500 mL, of gedurende 5–10 min bij volumes tussen 100–400 mL. Roer continu tijdens het verwarmen.
   4. Autoclaveer het verwarmde mengsel volgens de standaard laboratoriumprocedures voor sterilisatie.
   5. Laat het geautoclaveerde medium afkoelen. Controleer de temperatuur met een thermometer totdat deze 50–55 °C bereikt.
   6. Voeg 600 µL propionzuur en 100 mg benzoëzuur in 1 mL 100% ethanol toe aan het afgekoelde medium en meng grondig.
   7. VOORZICHTIG: Propionzuur en ethanol moeten in een goed geventileerde ruimte worden gehanteerd terwijl handschoenen en een beschermbril worden gedragen, omdat beide chemicaliën vluchtig zijn en irritatie kunnen veroorzaken bij inademing of huidcontact.
   8. Verdeel 5 mL voedsel over elk steriel flaconnetje met een lengte van 10 cm en een diameter van 20 mm.
   9. Laat de flaconnetjes ten minste 5–6 u ongeopend bij kamertemperatuur. Bedek ze met vloeipapier om te voorkomen dat er vliegen binnendringen. Gebruik deze stap om variabiliteit in levensduurmetingen, voortvloeiend uit verschillen in de bereiding van het medium en de bewaarcondities, te minimaliseren.
2. Bereiding van het drug-voedsel
   1. Bereid een kleine batch voedsel voor volwassenen zoals beschreven in stappen 1.1.1–1.1.5.
   2. Laat het voedsel afkoelen tot 50–55 °C.
   3. Bereid een stamoplossing van de testverbinding in de gewenste concentratie met gebruik van een geschikt oplosmiddel, zoals gedestilleerd water of dimethylsulfoxide (DMSO). Los de testverbinding op in het gekozen oplosmiddel om een geconcentreerde stamoplossing te maken, en voeg de stamoplossing toe aan het afgekoelde voedsel (50–55 °C) om de gewenste eindconcentratie te bereiken, waarbij identieke concentraties van het oplosmiddel in zowel de behandelings- als controlegroepen worden gehandhaafd.
   4. Meng grondig om een uniforme distributie te waarborgen.
   5. Verdeel 2 mL van het drug-bevattende voedsel over elk experimenteel flaconnetje door het in een laag over het oppervlak van het reeds gestolde basisvoedsel aan te brengen.
   6. Bereid controleflaconnetjes voor door een equivalent volume van alleen het oplosmiddel (bijv. gedestilleerd water of DMSO in dezelfde eindconcentratie als gebruikt in de behandelingsgroepen) toe te voegen aan het voedsel dat over het basisvoedsel is aangebracht.
   7. Laat het aangebrachte voedsel volledig stollen bij kamertemperatuur voordat de vliegen worden geïntroduceerd.
      OPMERKING: Hanteren en bewaren van voedsel: Als het voedsel 's avonds wordt bereid, laat de flaconnetjes dan 's nachts bedekt met vloeipapier bij kamertemperatuur staan en plaats de volgende ochtend de wattenpluggen. Was, decontamineer en autoclaveer flaconnetjes altijd voor gebruik. Autoclaveer wattenrollen afzonderlijk voordat u ze als plug plaatst. Plaats de wattenpluggen pas nadat het voedsel ten minste 5–6 u volledig is gestold.

2. Genereren van amyloid-β-expresserende D. melanogaster

1. Verzameling en validatie van maagdelijke driver-vrouwtjes
   1. Houd de driver-vliegenlijn op 25 °C onder een 12 u:12 u licht-donkercyclus vóór de verzameling van maagdelijke vliegen.
   2. Verzamel tweemaal daags, eenmaal in de ochtend en eenmaal laat in de middag, pas uitgekomen vrouwelijke vliegen van de driver-lijn met behulp van korte koolstofdioxide-anesthesie.
   3. Breng verzamelde vrouwtjes direct na verzameling over naar verse vials voor één geslacht om paring te voorkomen.
   4. Incubeer de vials nog 48 u bij 25 °C voor de validatie van de maagdelijkheid.
   5. Inspecteer de vials dagelijks op de aanwezigheid van larven.
   6. Bevestig de maagdelijke status door de afwezigheid van eieren of larvale nakomelingen te verifiëren.
   7. Behoud alleen vrouwtjes die geen tekenen vertonen van larvale productie voor gebruik in genetische kruisingen.
2. Opzet van de genetische kruising
   1. Verzamel op de dag van de kruisingsopzet pas uitgekomen volwassen UAS-APPE693G mannetjes met behulp van korte koolstofdioxide-anesthesie.
   2. Zet kruisingen op door 20 maagdelijke elav-GAL4 vrouwtjes samen met 10 UAS-APPE693G mannetjes in een verse voedingsvial te plaatsen.
   3. Incubeer de kruisingsvials op 25 °C onder gecontroleerde vochtigheid en een 12 u:12 u licht-donkercyclus.
   4. Laat de vliegen 48 u paren en eieren leggen.
   5. Breng de volwassenen over naar verse vials als er extra nakomelingen nodig zijn.
   6. Verwijder de ouderlijke vliegen na de eiafzetting om overbevolking en overlappende generaties te voorkomen.
   7. Laat de nakomelingen onder standaardcondities uitgroeien tot volwassen vliegen tot aan het uitkomen.
   8. Gebruik F1 volwassen vliegen die amyloid-β in neuronen tot expressie brengen voor daaropvolgende experimenten naar levensduur en gezondheidsspanne.
      OPMERKING: De elav-GAL4 driver maakt pan-neuronale expressie mogelijk van het menselijke amyloïd-precursorproteïne dat de E693G Arctic-mutatie draagt. Expressie vindt plaats gedurende de ontwikkeling en volwassenheid onder standaard kweekcondities. Gebruik voor verouderingsexperimenten consistente genetische achtergronden en passende controles. Houd consistente temperatuuromstandigheden aan binnen elk
      experiment. Lagere incubatietemperaturen, zoals 18 °C, kunnen tijdens de ontwikkeling worden gebruikt om
      transgeen-geassocieerde pathologie vóór de volwassenheid te vertragen.

3. Collectie van vliegen

1.  Vliegcollectie voor de assay voor negatieve geotaxis
   1. Houd alle vliegenstammen vóór de experimentele opzet op standaard vliegenvoedsel bij 25 °C, ongeveer 60% relatieve vochtigheid en een licht-donkercyclus van 12 u:12 u.
   2. Verzamel pas uitgekomen volwassen mannelijke vliegen binnen een venster van 2–3 dagen met behulp van korte koolstofdioxide-anesthesie.
   3. Breng de mannelijke vliegen over naar vloeitjes met voedsel dat geneesmiddelen bevat of naar controlevloeitjes met voedsel, afhankelijk van de experimentele conditie.
   4. Vervang het voedsel elke 3 dagen of eerder als de kwaliteit van het voedsel verslechtert.
   5. Houd de vliegen onder deze omstandigheden tot de vastgestelde leeftijd voor de beoordeling van de negatieve geotaxis.
      OPMERKING: Alleen mannelijke vliegen worden gebruikt voor de assay voor negatieve geotaxis om variabiliteit te voorkomen die voortvloeit uit sekse-specifieke verschillen in locomotorische prestaties en veroudering.
2. Vliegcollectie voor de levensduurassay
   1. Anestheseer kleine groepen vliegen kort op een anesthesiepad.
   2. Identificeer de mannelijke vliegen met behulp van een zacht penseel.
   3. Minimaliseer de blootstelling aan koolstofdioxide tijdens het sorteren om langdurige fysiologische effecten te voorkomen die de levensduurmetingen kunnen beïnvloeden.
   4. Plaats 10 mannelijke vliegen en 10 vrouwelijke vliegen, met een sekseverhouding van 1:1, in elk vers voedselvloeitje, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
   5. Voltooi het sorteren en verdelen binnen 3–4 min per batch.
   6. Zorg ervoor dat de totale blootstelling aan anesthesie 9–10 min niet overschrijdt.
   7. WAARSCHUWING: Koolstofdioxide-anesthesie moet worden toegediend met geschikte regelaars en adequate laboratoriumventilatie om blootstelling van de operator te minimaliseren en langdurige door anesthesie geïnduceerde fysiologische stress bij de vliegen te voorkomen.
   8. Herhaal stappen 3.2.1–3.2.6 totdat er 4–6 replica-vloeitjes zijn vastgesteld voor elke experimentele conditie.

4. Levensduurexperiment

1. Overdracht en onderhoud van vliegen
   1. Houd de vliegen onder standaardomstandigheden.
   2. Breng vliegen met regelmatige tussenpozen over naar vials met vers voedsel om overbevolking, larvale contaminatie en degradatie van het voedsel te voorkomen.
   3. Breng de vliegen elke 3 dagen over naar vers voedsel.
   4. Gebruik deze overdrachtsfrequentie om verstoring van de voedingsomstandigheden te minimaliseren door larvale groei in het vial te voorkomen.
   5. Voer alle overdrachten uit zonder anesthesie.
      OPMERKING: Vermijd anesthesie tijdens levensduurexperimenten, omdat dit acute mortaliteit kan induceren, vooral bij oudere vliegen.
2. Beoordeling van mortaliteit tijdens overdrachten
   1. Noteer bij elke overdracht de leeftijd van de cohort in dagen.
   2. Inspecteer het oude vial zorgvuldig.
   3. Tel en noteer het aantal dode vliegen dat in het oude vial is achtergebleven.
   4. Tel en noteer het aantal dode vliegen dat is meegenomen naar het nieuwe vial.
   5. Noteer deze waarden afzonderlijk om dubbeltellingen te voorkomen.
   6. Bereken het totale aantal sterfgevallen voor elke overdracht met de volgende vergelijking:
      Totaal aantal sterfgevallen = dode vliegen in oud vial + dode vliegen meegenomen naar nieuw vial.
   7. Bepaal het aantal nieuwe sterfgevallen sinds de vorige overdracht door het aantal vliegen dat bij de vorige overdracht als "meegenomen" is genoteerd, af te trekken van het totaal aantal sterfgevallen bij de huidige overdracht.
   8. Gebruik deze berekening om ervoor te zorgen dat vliegen die tussen vials worden verplaatst niet meerdere keren worden geteld.
3. Identificatie van levende maar inactieve vliegen
   1. Tik voorzichtig tegen de zijkant van het vial voordat een vlieg als dood wordt aangemerkt wanneer oudere vliegen immobiel lijken of op hun rug liggen.
   2. Observeer of er beweging optreedt.
   3. Beschouw vliegen die beweging vertonen na stimulatie als levend.
   4. Noteer vliegen die beweging vertonen na stimulatie niet als dood.
   5. Tik voorzichtig tegen het vial om levende vliegen die aan het voedseloppervlak in het oude vial kleven los te maken.
   6. Breng de losgemaakte levende vliegen over naar het nieuwe vial.
   7. Merk losgemaakte levende vliegen niet aan als dood.
      OPMERKING: Nauwkeurig onderscheid tussen dode en inactieve vliegen is cruciaal in late levensstadia. Voor het toekennen van de doodsstatus moet altijd een zachte mechanische stimulatie worden gebruikt.
4. Censureringscriteria
   1. Beschouw een vlieg als rechts-gecensureerd als deze het experiment verlaat vóór de natuurlijke dood vanwege ontsnapping uit het vial, accidentele verwonding of problemen bij de hantering.
   2. Noteer gecensureerde vliegen in een aparte kolom op de dag dat de vlieg het experiment verlaat.
   3. Noteer gecensureerde vliegen niet als dood.
   4. Sluit gecensureerde vliegen uit van de mortaliteitstellingen in de overlevingsanalyse.
   5. Pas censurering conservatief toe, omdat overmatige censurering experimentele bias kan introduceren.
      OPMERKING: Het scheiden van "dode" en "meegenomen" vliegen tijdens de gegevensinvoer voorkomt inflatie van de mortaliteitstellingen en waarborgt een correcte reconstructie van de overlevingscurve.
5. Voortzetting van de assay
   1. Herhaal stappen 4.1–4.4 gedurende het gehele experiment.
   2. Zet de assay voort totdat de laatste overlevende vlieg sterft.

5. Experiment naar negatieve geotaxis

1. Voorbereiding van de vliegen
   1. Verzamel vliegen uit experimentele voedingsbuisjes zonder CO₂-anesthesie.
   2. Breng de vliegen voorzichtig over naar een schone klimbuis, of negatieve geotaxisbuis, met behulp van een kleine trechter om ontsnapping te voorkomen.
   3. Laat de vliegen 5 min acclimatiseren in de testkamer voordat de assay wordt gestart.
   4. Voer alle klimassays uit op hetzelfde tijdstip van de dag, bijvoorbeeld in de middag, om circadiane variabiliteit te minimaliseren.
      OPMERKING: Vermijd direct zonlicht tijdens het testen, aangezien lichtintensiteit het locomotorisch gedrag kan beïnvloeden.
2. Opstelling van de klimbuis
   1. Gebruik een transparante cilindrische klimbuis met een hoogte van 12 cm en een diameter van 2 cm.
   2. Markeer een horizontale lijn op 10 cm vanaf de basis van de buis.
   3. Plaats de buis verticaal tegen een egale witte achtergrond om videotracking te vergemakkelijken.
   4. Monteer een smartphone of digitale camera op een stabiel statief.
   5. Zorg ervoor dat de gehele buis binnen het kader valt.
3. Assayprocedure
   1. Tik drie keer stevig tegen de buis op een schuimrubberen mat of muismat die op een hard oppervlak is geplaatst, zodat alle vliegen gelijktijdig naar de bodem vallen.
   2. Start onmiddellijk de video-opname voor 10–12 s bij ongeveer 30 frames/s.
   3. Laat de vliegen 10 s vrij klimmen.
   4. Registreer ten minste drie onafhankelijke pogingen per buisje.
   5. Houd een rustinterval van 10 min aan tussen de pogingen.
   6. Voer de assay uit voor elke experimentele conditie, zoals de controlegroep, de met geneesmiddelen behandelde groep en de oplosmiddelcontrolegroep.
   7. Tel het aantal vliegen dat binnen 10 s de markering van 10 cm bereikt of passeert.
   8. Noteer E als het aantal vliegen dat 10 cm bereikt.
   9. Noteer T als het totaal aantal geteste levende vliegen.
   10. Bereken de procentuele klimactiviteit als (E/T) × 100.
   11. Bereken het gemiddelde van de waarden over drie pogingen.
   12. Rapporteer de waarden als gemiddelde ± SD.
4. Semi-geautomatiseerde klimanalyse met behulp van een Python-script
   1. Videoacquisitie
      1. Registreer negatieve geotaxis-assays met een smartphonecamera die loodrecht op een transparante klimbuis van 12 cm hoog en 2 cm in diameter is geplaatst. Neem video's op met een smartphone of digitale camera bij ongeveer 30 frames/s en een minimale resolutie van 1280 × 720 pixels. Positioneer de camera op een vaste afstand van ongeveer 15–20 cm van de klimbuis en hanteer dezelfde acquisitiegeometrie voor alle opnames. Gebruik de bekende buishoogte (12 cm) als interne ruimtelijke kalibratiereferentie voor pixelgebaseerde metingen.
      2. Plaats de buis tegen een egale witte achtergrond.
      3. Neem video's op van 10–12 s.
      4. Houd de lichtomstandigheden constant voor alle opnames.
      5. Houd de cameradistantie constant voor alle opnames.
      6. Houd de positionering van de buis constant voor alle opnames.
      7. Minimaliseer variabiliteit in centroiddetectie.
      8. Sla opgenomen video's op in .mp4-formaat.
      9. Overdraag de opgenomen video's naar een desktopcomputer voor analyse.
   2. Python-gebaseerde videoverwerking
      1. Analyseer video's met een eigen intern Python-script, verstrekt als Supplementary File 1. Voer alle analyses uit met Python 3.12.1 met OpenCV (cv2) versie 4.9.0, NumPy versie 1.26.4, Pandas versie 2.2.0, Matplotlib versie 3.5.2 en Scikit-learn versie 1.4.2.
         1. Specificeer het pad naar de inputvideo en de outputmap in Supplementary File 1 voordat u het script uitvoert vanuit een Python-omgeving of opdrachtregelinterface.
         2. Voer het script uit met python climbing_analysis.py nadat de variabelen VIDEO_PATH en OUTPUT_CSV zijn bewerkt.
      2. Gebruik OpenCV, of cv2, voor frameverwerking en objectdetectie.
      3. Gebruik NumPy voor numerieke berekeningen.
      4. Gebruik Pandas voor data-export.
      5. Gebruik Matplotlib voor visualisatie.
      6. Verwerk elke video frame voor frame.
      7. Lees de video uit met de VideoCapture-functie van OpenCV.
      8. Verwerk individuele frames sequentieel.
      9. Zet frames om naar grijswaarden.
      10. Pas Gaussische vervaging toe om achtergrondruis te verminderen.
      11. Pas Otsu-thresholding toe in binaire inverse modus om vliegen van de achtergrond te scheiden.
      12. Voer morfologische opening- en sluitingsoperaties uit om kleine artefacten te verwijderen en contouren te vullen.
      13. Identificeer contouren die een minimale drempelwaarde voor het contourareaal van 60 pixels² overschrijden om achtergrondartefacten en kleine ruisdeeltjes uit te sluiten.
      14. Bereken ruimtelijke momenten voor elke geldige contour.
      15. Bepaal de centroidcoördinaten, x en y, voor elke geldige contour.
      16. Bereken het gemiddelde van de centroidcoördinaten wanneer meerdere vliegen in een frame worden gedetecteerd.
      17. verkrijg één enkele gemiddelde cohortpositie per frame.
   3. Kwaliteitscontrolebeoordeling
      1. Verifieer de succesvolle vliegsegmentatie door te bevestigen dat de gedetecteerde contouren overeenkomen met zichtbare vliegen gedurende de hele opname.
      2. Zorg voor voldoende contrast tussen de vliegen en de achtergrond door gebruik te maken van een egale witte achtergrond en stabiele verlichtingsomstandigheden.
      3. Sluit video's uit die overmatige schittering, schaduwen, beweging van de buis, ernstige overlap van vliegen of onvolledige zichtbaarheid van de buis bevatten.
      4. Beschouw video's als ongeschikt voor analyse wanneer centroidtracking faalt voor aanzienlijke delen van de opname of wanneer thresholding aanhoudende achtergrondartefacten produceert.
   4. Extractie van klimmetrieken
      1. Bereken de klimscore handmatig zoals beschreven in stap 5.3.7.
      2. Bereken de klimhoogte in pixels als het verschil tussen de initiële en finale verticale centroidposities.
      3. Bereken de gemiddelde snelheid in pixels/s als de totale trajectlengte gedeeld door de duur van de opname.
      4. Bereken de piekversnelling in pixels/s als de maximale onmiddellijke verplaatsing tussen opeenvolgende frames.
      5. Bereken de trajectlengte in pixels als de cumulatieve afgelegde afstand over de frames.
      6. Bereken het trajectoppervlak in pixels² als het oppervlak van de convexe huls die alle centroidposities omsluit.
      7. Bereken het aantal draaiingen als het aantal veranderingen in horizontale richting.
      8. Bereken het aantal stops als het aantal frames waarin de centroidverplaatsing onder een stopafstanddrempel van 3 pixels tussen opeenvolgende frames blijft.
      9. Zet de verticale positie uit als functie van de tijd om een objectieve maatstaf van de actieve klimprestatie te verkrijgen.
      10. Bereken de klimhelling in pixels per seconde met behulp van een rollend lineair regressievenster van 1 seconde tijdens de actieve klimfase van de opname.
      11. Gebruik de hellingswaarde als de primaire motorische prestatiemetriek voor integratie met overlevingsanalyse.
      12. Exporteer gekwantificeerde locomotorische metrieken, waaronder klimhoogte, gemiddelde snelheid, pieksnelheid, trajectlengte, trajectoppervlak, aantal draaiingen, aantal stops en klimhelling, als .csv-bestanden. Sla visualisatieplots van de helling op als .png-afbeeldingsbestanden voor kwaliteitsverificatie en verdere analyse.

6. Integratie van vroege motorische gezondheid en overlevingsanalyse

1. Exporteer de overlevingsgegevens als een .csv-bestand met kolommen voor groep, dag en het aantal levende vliegen.
2. Bereken de overlevingsfractie voor elke groep op elk tijdstip door het aantal levende vliegen te delen door de initiële cohortgrootte.
3. Bereken de overlevingsvraag onder de curve, of AUC, met behulp van trapeziale numerieke integratie van de overlevingsfractie ten opzichte van de tijd.
4. Exporteer de motorische prestatiegegevens als een .csv-bestand met de klimhelling van Dag 7 voor elke groep.
5. Normaliseer de motorische prestaties van Dag 7 ten opzichte van de controlegroep, Canton S, door de hellingwaarde van Dag 7 van elke groep te delen door de overeenkomstige helling van de controle.
6. Voeg de genormaliseerde motorische waarden van Dag 7 samen met de overeenkomstige overlevings-AUC-waarden voor elk genotype.
7. Voer een beschrijvende vergelijking uit van de genormaliseerde motorische prestaties van Dag 7 en de overlevings-AUC om de relatie tussen vroege motorische achteruitgang en overlevingsuitkomsten te evalueren.
8. Genereer een grafische visualisatie van de genormaliseerde motorische prestaties van Dag 7 en de overlevings-AUC-waarden (Aanvullend Bestand 2).
   OPMERKING: Voer alle integratieanalyses van overleving en motoriek uit met het aangepaste Python-script dat is geleverd als Aanvullend Bestand 2. Gebruik Pandas voor gegevensverwerking en het samenvoegen van datasets, NumPy voor trapeziale numerieke integratie en Matplotlib voor grafische visualisatie.

7. Statistische analyse

1. Presenteer locomotorische en overlevingsmetingen als representatieve datasets verkregen uit biologische replica-buisjes.
2. Rapporteer locomotorische metingen als gemiddelde waarden, berekend over onafhankelijke klimproeven.
3. Gebruik grafische visualisatie van de klimhelling (pixels/s) en survival AUC-waarden om representatieve relaties tussen motorische prestaties en overlevingsuitkomsten aan te tonen.

Resultaten

Reproduceerbare levensduurprofielen onder gestandaardiseerde kweekomstandigheden
Wanneer vliegen werden gehouden onder gecontroleerde omgevingscondities (25 °C, 60% luchtvochtigheid, 12 h:12 h licht-donkercyclus) met gebruik van vers bereid gestandaardiseerd voer, vertoonden controlecohorten consistente overlevingstrajecten over onafhankelijke experimenten heen. Canton S controlevliegen vertoonden een mediane levensduur van ongeveer 65–72 dagen, met een maximale overleving tot 75 dagen (Figuur 2). Levensduurexperimenten werden uitgevoerd met 2 biologische replica's per conditie, bestaande uit elk 20 vliegen. Representatieve overlevingstrajecten verkregen onder gestandaardiseerde omgevings- en voedercondities toonden reproduceerbare levensduurprofielen in de controlecohorten.

Daarentegen vertoonden pan-neuronaal amyloid-β-expresserende vliegen een verminderde overleving ten opzichte van Canton S-controles, wat consistent is met eerder gerapporteerde neurodegeneratieve fenotypes in Drosophila-modellen voor de ziekte van Alzheimer^4,5,6.

Suboptimale resultaten voor de levensduur kunnen optreden wanneer de voedingskwaliteit verslechtert of wanneer de afhandelingscondities inconsistent zijn. Onder deze omstandigheden werden vroege sterftepieken binnen de eerste 7–10 dagen en een toegenomen variabiliteit tussen de vials (>25%) vastgesteld, wat wijst op een aangetaste experimentele reproduceerbaarheid en verminderde consistentie tussen biologische replica's.

Leeftijdsafhankelijke motorische achteruitgang gedetecteerd door semi-geautomatiseerde klimanalyse
Conventionele handmatige scoring van negatieve geotaxis detecteerde een leeftijdsafhankelijke locomotorische achteruitgang in vliegen die amyloid-β tot expressie brachten in vergelijking met Canton S-controles (Figuur 3). Op dag 7 bleven de klimprestaties over het algemeen vergelijkbaar tussen de groepen, terwijl amyloid-β-expresserende vliegen op dag 28 een verminderde klimactiviteit vertoonden ten opzichte van de controlevliegen. Controlecohorten behielden een relatief stabiele klimprestatie over de verschillende tijdspunten van veroudering. Deze handmatig gescoorde gedragstrends kwamen overeen met afnames in de waarden van de klimhelling uit de semi-geautomatiseerde FlyTrDT-pipeline, wat leeftijdsafhankelijke trends liet zien die vergelijkbaar waren met die van conventionele eindpuntscoring en de computationele tracking-workflow (Figuur 4). De waargenomen locomotorische achteruitgang in amyloid-β-expresserende vliegen is consistent met de vastgestelde leeftijdsafhankelijke gedragsstoornissen die zijn gerapporteerd in Drosophila-modellen voor neurodegeneratie met behulp van conventionele assays voor negatieve geotaxis^6,7.

Semi-geautomatiseerde klimanalyse met behulp van FlyTrDT onthulde behouden vroege motorische functies bij controlevliegen. Op dag 7 vertoonden de controlevliegen een gemiddelde klimhelling van 86,64 pixels/s, wat wijst op aanhoudende opwaartse verplaatsing tijdens de actieve klimfase (Figuur 4). Op dag 28 naderde de helling nul (−1,50 pixels/s), wat consistent is met ouderdomsgerelateerde vertraging.

Daarentegen vertoonden vliegen die amyloid-β tot expressie brachten vroege motorische beperkingen. Op dag 7 was de klimhelling afgenomen tot 34,25 pixels/s, wat na normalisatie ongeveer 39% van de prestaties van de controlegroep vertegenwoordigt. Tegen dag 28 daalde de klimhelling aanzienlijk naar −72,25 pixels/s, wat duidt op een verslechterde opwaartse locomotorische prestatie.

De op de helling gebaseerde metriek legt het actieve klimsegment vast en vermindert de bijdragen van de initiële schriklatentie, plateau-fasen en stochastische bewegingsartefacten. Positieve hellingen duiden op een netto opwaartse voortbeweging, hellingen nabij nul duiden op een beperkte verticale verplaatsing en negatieve hellingen duiden op een netto neerwaartse verplaatsing. Deze representatieve trajecten illustreren de progressieve motorische achteruitgang bij vliegen die amyloid-β tot expressie brengen, in vergelijking met leeftijdsgenoot-controles.

Onder optimale opnamecondities genereerde de FlyTrDT-pipeline continue centroïde-trajecten met stabiele contoursegmentatie en consistente verticale verplaatsingsprofielen (Figuur 4A). Verminderde locomotorische prestaties bij vliegen die amyloïd-β tot expressie brachten, vertaalden zich in minder aanhoudende opwaartse trajecten en lagere hellingswaarden (Figuur 4B–D). Video's die waren opgenomen met overmatige schittering, onstabiele buispositionering, inconsistente verlichting of onvoldoende achtergrondcontrast produceerden discontinue centroïde-trajecten en intermitterende tracking-artefacten en werden uitgesloten tijdens de kwaliteitscontrolebeoordeling.

Associatie tussen vroege motorische prestaties en overlevingsuitkomsten
Om de associaties tussen vroege motorische prestaties en overlevingsuitkomsten te onderzoeken, werden genormaliseerde waarden van de klimhelling op dag 7 vergeleken met de AUC (oppervlakte onder de curve) voor overleving over verschillende genotypen (Figuur 5). Controlevliegen met behouden vroege motorische prestaties (genormaliseerde motorische index = 1,0) vertoonden hogere survival AUC-waarden (48,2), terwijl amyloid-β-expresserende vliegen met verminderde vroege motorische prestaties (genormaliseerde motorische index = 0,395) lagere survival AUC-waarden vertoonden (24,65). Representatieve locomotorische datasets werden gegenereerd uit 2 biologische replica-vials per conditie. Deze representatieve datasets suggereren een associatie tussen verminderde vroege motorische prestaties en een verkorte overleving in het amyloid-β ziektemodel. Omdat slechts twee representatieve genotypen werden geanalyseerd, worden deze bevindingen beschrijvend gepresenteerd in plaats van als een statistisch onderbouwde voorspellende correlatie.

Figuur 1: Overzicht van de workflow van de semi-automatische FlyTrDT-pipeline waarin metrics voor de locomotorische gezondheidsspanne worden geïntegreerd met overlevinganalyse. De workflow omvat gestandaardiseerde kweek van vliegen en levensduuranalyse, handmatige en semi-automatische beoordeling van negatieve geotaxis, framegewijze centroid-extractie uit klimvideo's, berekening van de klimhelling (pixels/s), analyse van de oppervlakte onder de curve (AUC) voor overleving, en integratie van motorische prestaties met overlevingsuitkomsten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Kaplan-Meier overlevingsanalyse van Canton S-controle en amyloïd-β-expresserende vliegen. Overlevingscurven illustreren de levensduurtrajecten onder gestandaardiseerde omgevings- en dieetomstandigheden. Canton S-controlevliegen vertoonden een verlengde overleving in vergelijking met pan-neuronaal amyloïd-β-expresserende vliegen, die een verkorte levensduur vertoonden over de verschillende tijdspunten van veroudering. De gegevens vertegenwoordigen representatieve overlevingstrajecten verkregen uit 2 biologische replica-flesjes per conditie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Handmatige beoordeling van de negatieve geotaxis bij controlevliegen en vliegen die amyloïde-β tot expressie brengen op dag 7 en dag 28. Boxplots tonen representatieve metingen van de klimactiviteit, uitgedrukt als het percentage vliegen dat binnen 10 s de drempel van 10 cm overschreed. Canton S (CS) controlevliegen vertoonden een relatief stabiele klimactiviteit over de verschillende tijdspunten van veroudering, terwijl vliegen die amyloïd-β tot expressie brachten een verminderde klimprestatie vertoonden op dag 28. Elk punt representeert een individuele meting per flacon. Representatieve datasets werden gegenereerd uit 2 biologische replica-flacons per conditie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Semi-automatische extractie van klimtrajecten en actieve klimhelling in controle- en amyloid-β-expresserende vliegen. Representatieve gemiddelde trajecten van de verticale positie werden geëxtraheerd uit video's van negatieve geotaxis met behulp van de FlyTrDT-trackingpipeline. Blauwe lijnen vertegenwoordigen de frame-voor-frame gemiddelde verticale centroidpositie van gedetecteerde vliegen over de tijd, en rode segmenten geven een representatief actief klimsegment aan dat is geïdentificeerd met een rollend lineair regressievenster. Hellowaarden worden uitgedrukt in pixels/s. (A) Dag 7 Canton S controlevliegen. (B) Dag 7 amyloid-β-expresserende vliegen. (C) Dag 28 Canton S controlevliegen. (D) Dag 28 amyloid-β-expresserende vliegen. Representatieve trajecten werden gegenereerd uit 2 biologische replica-flesjes per conditie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Associatie tussen vroege motorische prestaties en overlevingsuitkomsten in een Drosophila-model van amyloid-β toxiciteit. Genormaliseerde waarden voor de klimhelling op dag 7 zijn uitgezet tegen de oppervlakte onder de curve (AUC) voor de overleving van Canton S (CS) controlevliegen en amyloid-β-expresserende (AD) vliegen (n = 2). Controlevliegen vertoonden een hogere vroege motorische prestatie en verhoogde AUC-waarden voor overleving in vergelijking met de amyloid-β-expresserende vliegen. Deze representatieve datasets illustreren een associatie tussen vroege locomotorische prestaties en overlevingsuitkomsten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Op Python gebaseerd FlyTrDT-script voor klimanalyse, gebruikt voor semi-geautomatiseerde kwantificering van locomotorische activiteit vanuit video's van negatieve geotaxis. Het script voert frame-voor-frame beeldverwerking, centroïdedetectie, trajectextractie en berekening van klimmetrieken uit, waaronder klimhelling, snelheid, trajectlengte, trajectoppervlak, aantal stops en aantal draaiingen.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Python-script voor de integratie van gegevens over de motorische gezonde levensduur en de totale levensduur. Het script voert de berekening van de overlevingsfractie uit, een trapeziumvormige analyse van de oppervlakte onder de curve (AUC), normalisatie van de klimhellingswaarden van dag 7, het samenvoegen van datasets en de grafische visualisatie van motorische prestaties en overlevingsresultaten.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier presenteren wij een protocol dat levensduuranalyse integreert met semi-geautomatiseerde kwantificering van de motorische gezondheidsspanne bij Drosophila melanogaster. Een betrouwbare integratie van levensduur- en locomotorische metingen is sterk afhankelijk van omgevingsconsistentie, voedselkwaliteit en gestandaardiseerde hanteringsprocedures over biologische replica's heen⁷. Variabiliteit in de droogte van het voedsel, vertraagde overplaatsingen of inconsistente sterfterekeningen kunnen vroege sterftepieken en verhoogde variatie tussen flacons veroorzaken, wat de reconstructie van overlevingscurven en de daaropvolgende interpretatie van verouderingsfenotypen beïnvloedt.

Tijdens de negatieve geotaxis-assay zijn consistente lichtomstandigheden, camerapositionering en buisuitlijning vereist om een betrouwbare centroiddetectie tijdens de videoverwerking te garanderen. Overmatige blootstelling aan CO₂ tijdens het sorteren moet worden geminimaliseerd, aangezien anesthesie zowel de levensduur als de locomotorische prestaties kan beïnvloeden. Bij het uitvoeren van herhaalde gedragsmetingen bij dezelfde cohort moeten de assays op hetzelfde tijdstip van de dag worden uitgevoerd om circadiane variabiliteit te verminderen. Onvoldoende achtergrondcontrast of inconsistente verlichting kan de drempelwaardeinstelling en contourdetectie tijdens de geautomatiseerde analyse belemmeren. Indien er tijdens de videoverwerking contourfragmentatie of onstabiele centroidtrajecten worden waargenomen, dient het achtergrondcontrast te worden verbeterd, schittering te worden verminderd, de camerapositionering te worden gestabiliseerd en een uniforme verlichting over alle opnames te worden gehandhaafd. Aanhoudende artefacten bij de drempelwaardeinstelling kunnen worden geminimaliseerd door de opnamehoek aan te passen, schaduwen te verminderen of ervoor te zorgen dat de volledige klimbuis continu zichtbaar blijft binnen het beeldkader. Overmatige clustering van vliegen in de buis kan een nauwkeurige schatting van het centroid belemmeren en moet worden geminimaliseerd door consistente cohortgroottes in alle experimenten aan te houden.

Traditionele assays voor negatieve geotaxis kwantificeren gewoonlijk de proportie vliegen die binnen een vast tijdsinterval een vooraf gedefinieerde hoogte bereiken en worden veelvuldig gebruikt om de afname van de locomotorische functie tijdens veroudering en neurodegeneratie te beoordelen^5,6. In tegenstelling hiermee extraheert de huidige semi-geautomatiseerde workflow een actieve klimfase van opwaartse beweging en berekent deze de actieve klimhelling (pixels/s) op basis van frame-gewijze centroid-trajecten. Omdat de centroid-posities worden gemiddeld over alle gedetecteerde vliegen binnen elk frame, worden individuele locomotorische trajecten en gedragsmatige heterogeniteit tussen vliegen niet onderscheiden. Deze aanpak vermindert de invloed van schriklatentie, kortstondige pauzes en clustergedrag, welke de handmatige scoring op basis van eindpunten beïnvloeden. In tegenstelling tot conventionele scoring op basis van eindpunten, levert de huidige workflow ook continue metingen van de stijgende helling (pixels/s) op, waardoor een kwantitatieve vergelijking van de motorische achteruitgang over verschillende leeftijden en genotypen mogelijk wordt. Vergelijkbare computationele tracking-benaderingen worden in toenemende mate toegepast om de objectiviteit en consistentie bij de gedragsanalyse van Drosophila te verbeteren middels geautomatiseerde platforms voor locomotorische kwantificatie^8,9,10,11,12.

Er moeten nog enkele aanvullende beperkingen in overweging worden genomen. Pixelgebaseerde metingen van de klimhelling (pixels/s) zijn afhankelijk van een consistente camerakalibratie en opnamegeometrie over de verschillende experimenten heen. Verschillen in camerieafstand of resolutie kunnen de absolute hellingswaarden beïnvloeden, waardoor normalisatie ten opzichte van interne controles noodzakelijk is. Bovendien was er in het hier gepresenteerde amyloïd-β model weliswaar een kwalitatief verband tussen vroege motorische achteruitgang en een verminderde overleving, maar een bredere validatie over aanvullende genotypen, interventies of farmacologische behandelingen zou de interpretatie van de relatie tussen motorische prestaties en overlevingsuitkomsten versterken. De hier gepresenteerde representatieve datasets zijn bedoeld om de implementatie en interpretatie van de workflow te demonstreren, en niet om een gegeneraliseerd voorspellend model over verschillende ziektecontexten vast te stellen.

Ondanks deze beperkingen biedt dit protocol een reproduceerbaar en kosteneffectief kader voor het koppelen van functionele gezondheidsduurmetrieken aan overlevingsuitkomsten in verouderingsstudies. De methode is gemakkelijk aanpasbaar voor genetische manipulaties, drugscreening-paradigma's en neurodegeneratiemodellen waarin functionele achteruitgang voorafgaat aan mortaliteit. Door objectieve kwantificering van de klimhelling (pixels/s) te integreren met gestandaardiseerde overlevingsanalyse, faciliteert deze aanpak een uitgebreide fenotypering van verouderingstrajecten in Drosophila. Toekomstige studies waarin aanvullende neurodegeneratieve genotypen, farmacologische interventies en longitudinale gedragsdatasets worden opgenomen, kunnen het nut van de workflow voor geïntegreerde analyse van de gezondheidsduur verder versterken^13,14.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	Himedia	GRM666	Stollingsmiddel
Benzoëzuur	Himedia	GRM488	Antimicrobiële conserveermiddel
Canton-S	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC #1	Wildtype-referentiestam
Klimbuis	Op maat gemaakt	Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling uitvoeren. Voer a.u.b. de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben.	Transparante cilindrische buis, 12 cm hoogte × 2 cm diameter, transparant plastic of glas
Maïsmel*	Lokale leverancier	N/A	Bereiding van vliegenvoedsel
Desktop-/laptopcomputer	Elke fabrikant	Gebruikersgedefinieerd	Minimaal een dual-core processor, ≥8 GB RAM, Python 3.x compatibel besturingssysteem
D-glucose	Himedia	MB037	Component van vliegvoedsel
elav-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC #458	Pan-neuronaal GAL4-driver
Matplotlib	Open-source bibliotheek	Versie 3.5.2	Plotten en visualisatie
NumPy	Open-source bibliotheek	Versie 1.26.4	Numerieke berekeningen
OpenCV	Open-source bibliotheek	Versie 4.9.0	Videoverwerking
Pandas	Open-source bibliotheek	Versie 2.2.0	Gegevensverwerking
Propionzuur	Himedia	GRM3658	Antischimmelconserveermiddel
Python	Python Software Foundation	Versie 3.12.1	Analysemilieu
Scikit-learn	Open-source-bibliotheek	Versie 1.4.2	Lineaire regressieanalyse
Smartphonecamera / Digitale camera	Elke fabrikant	Gebruikersgedefinieerd	Opname met minimaal 30 frames/s, stabiele focus, loodrechte positionering, minimum 1280 × 720p-resolutie
Sucrose	Himedia	GRM601	Component voor vliegvoedsel
UAS-APP.Aβ.E693G	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC #33774	Menselijk APP Arctic-mutatiemodel
Gist	Himedia	RM027	Voedingssupplement