Cultuurgebaseerde No-Deecttable-Growth Assessment en Antioxidantprofiel van Verse Aloë Vera Gelextract

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de aseptische bereiding van vers Aloe vera binnengel-extract, potentiometrische pH-meting, beoordeling van de totale antioxidantcapaciteit door een geautomatiseerde ABTS-gebaseerde colorimetrische assay, cultuurgebaseerde no-detecteerbare-groeibeoordeling onder gedefinieerde incubatiecondities, en een voorlopige antimicrobiële screening van een 70:30 (v/v) Aloë vera./N-acetyl-L-cysteïne testmengsel door schijfdiffusie en kwalitatieve tweevoudige buisverdunning.

Samenvatting

Aloë vera (Aloe barbadensis Miller) wordt veel gebruikt in topische en complementaire geneesmiddelen. Gestandaardiseerde laboratoriumworkflows voor gelijktijdige evaluatie van totale antioxidantcapaciteit (TAC), pH-gedrag, cultuurgebaseerde niet-detecteerbare groeistatus onder bepaalde omstandigheden en voorlopige antimicrobiële screening blijven echter beperkt. Verse binnengel-aloë vera-extract werd aseptisch bereid en geformuleerd op 5%, 10%, 15% en 20% (w/v). pH werd potentiometrisch gemeten en TAC werd bepaald door een geautomatiseerde ABTS-radicaal kation-gebaseerde colorimetrische assay. Een kweekgebaseerde test van niet detecteerbare groei werd uitgevoerd door het extract te inoculeren op bloedagar, eosine, methyleenblauw agar en Sabouraud-dextrose agar, gevolgd door aerobe incubatie en visuele inspectie om 24 uur, 48 uur en 72 uur. Antimicrobiële screening van een 70:30 (v/v) aloë vera/N-acetyl-L-cysteïne testmengsel werd uitgevoerd tegen standaard referentiestammen door middel van schijfdiffusie en kwalitatieve tweevoudige buisverdunningsassays. TAC verschilde significant tussen groepen (Kruskal-Wallis, p = 0,014), met de hoogste waarden waargenomen in de 20%-formulering. Er werd geen zichtbare bacteriële of schimmelgroei waargenomen onder de geteste kweekomstandigheden tijdens de observatieperiode van 72 uur. Het Aloe vera/N-acetyl-L-cysteïne testmengsel produceerde inhibitiezones variërend van 11 mm tot 17 mm, waarbij de grootste zone werd waargenomen tegen Pseudomonas aeruginosa. Deze workflow biedt een praktische laboratoriumaanpak voor het bereiden en voorlopig karakteriseren van verse aloë vera.-gebaseerde formuleringen voor onderzoek in de vroege fase van complementaire geneeskunde.

Inleiding

Aloë vera blijft aanzienlijke wetenschappelijke aandacht trekken vanwege het langdurige gebruik in de traditionele geneeskunde en zijn groeiende relevantie in farmaceutisch, biomedisch, cosmetisch en voedselonderzoek ^1,2,3. Deze medicinale plant bevat een divers scala aan biologisch actieve bestanddelen, waaronder polysacchariden, fenolverbindingen, anthraquinonen, vitaminen, mineralen, enzymen en andere laagmoleculaire metabolieten die kunnen bijdragen aan zijn therapeutische en functionele eigenschappen ^1,2,3. Onder deze componenten is acemannan benadrukt vanwege zijn biomaterialpotentieel en gerapporteerde rollen in weefselreparatie, immunomodulatie en regeneratieve toepassingen ^4,5. Parallel zijn fenolische en andere antioxidant-actieve verbindingen in verband gebracht met de vrije-radicalen opruimende, beschermende en biologisch ondersteunende effecten van Aloë vera. Preparaten ^2,3.

De afgelopen jaren is er een groeiende interesse in de opname van aloë vera in geavanceerde formuleringssystemen en bioactieve materialen. Aloë vera-gebaseerde hydrogels, biomateriaalinkten, nanocomposieten en driedimensionale geprinte steigers zijn onderzocht voor wondgenezing en weefselondersteunende toepassingen vanwege hun hoge hydratatiecapaciteit, biocompatibiliteit en multifunctionele biologische eigenschappen 4,6,8,9,10,11. Experimentele studies hebben aangetoond dat materialen die aloë vera bevatten wondbeheer kunnen ondersteunen door bij te dragen aan een vochtige omgeving, de fysisch-chemische eigenschappen van de formulering te verbeteren en antioxidante of antimicrobiële ondersteuning te bieden onder geselecteerde in vitro, in vivo en formuleringsafhankelijke aandoeningen ^{4,7,8,9,10,11}. Daarnaast is Aloë vera onderzocht in voedselconservering en formuleringen, waarbij gel-gebaseerde coatings en gerelateerde systemen in verband worden gebracht met verbeterde oxidatieve stabiliteit, betere sensorische kwaliteit en verbeterde microbiologische prestaties^12,13. Deze ontwikkelingen geven aan dat Aloë vera. steeds meer wordt beschouwd niet alleen als een traditioneel kruidenproduct, maar ook als een multifunctioneel natuurlijk materiaal met een breed formuleringsgericht potentieel ^2,3,12,13.

De biologische relevantie van aloë vera strekt zich ook uit tot antimicrobiële en microbiologisch georiënteerde toepassingen. Recente studies hebben remmende effecten beschreven van Aloe vera of preparaten die Aloe vera bevatten tegen klinisch belangrijke micro-organismen, waaronder Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, Candida-soorten en klinische isolaten geïsoleerd uit wondinfecties 14,15,16,17. Eerder in vitro bewijs heeft ook activiteit aangetoond van inner-gel Aloe vera tegen Helicobacter pylori referentiestammen en klinische isolaten¹⁸. Bovendien zijn hybride systemen met Aloe vera gerapporteerd die gecombineerde antimicrobiele, antioxidante en wondgenezingsmogelijkheden vertonen, wat de multifunctionele aard van dit plantaardige^{materiaal verder} ondersteunt. De biologische prestaties van Aloë vera. worden echter beïnvloed door verschillende methodologische variabelen, waaronder de gebruikte plantfractie, extractieprocedure, concentratie, hanteeringsomstandigheden, versheid van de gel en of de geteste preparaat alleen binnengel bevat of latex-gerelateerde componenten^{bevat 2,20}. Deze factoren zijn vooral belangrijk omdat de binnenste gel- en buitenbladfracties verschillen in zowel samenstelling als toxicologisch profiel²⁰.

Ondanks de groeiende hoeveelheid literatuur blijven er belangrijke methodologische hiaten bestaan. In veel gepubliceerde studies worden antioxidantgedrag, fysisch-chemische eigenschappen, microbiologische beoordeling en antimicrobiële prestaties vaak afzonderlijk geëvalueerd in plaats van binnen één geïntegreerde workflow. Voor formuleringsgericht onderzoek zijn deze parameters echter nauw met elkaar verbonden. Een preparaat kan gunstige antioxidantactiviteit vertonen, maar vereist nog steeds een zorgvuldige microbiologische beoordeling en fysisch-chemische karakterisering voordat deze geschikt kan worden beschouwd voor verdere experimentele ontwikkeling. Daarom kunnen laboratoriumworkflows die redoxgerelateerde beoordeling, pH-evaluatie, kweekgebaseerde no-detecteerbare groeitesten onder bepaalde voorwaarden combineren en voorlopige antimicrobiële screening een meer praktische en informatieve basis bieden voor de vroege karakterisering van verse Aloë vera-formuleringen .

Daarom was deze studie bedoeld om verse binnengel-aloë vera-extractformuleringen te evalueren, bereid bij verschillende concentraties, op basis van pH-eigenschappen, totale antioxidantcapaciteit, cultuurgebaseerde niet-detecteerbare groeistatus onder gedefinieerde laboratoriumomstandigheden, en voorlopige antimicrobiële screening door schijfdiffusie en kwalitatieve tweevoudige buisverdunning. Door deze beoordelingen te integreren binnen één experimentele workflow, was de studie ontworpen om een praktische basisbenadering te bieden voor de voorlopige karakterisering van Aloë vera.-gebaseerde formuleringen bedoeld voor onderzoek naar complementaire geneeskunde.

Protocol

1. Bereiding van aloë vera. Extract- en verdunningsreeks

1. Oogst de volwassen bladeren van een aloë vera-plant die op kamertemperatuur is gekweekt en spoel ze grondig af onder stromend water om eventuele resten te verwijderen.
2. In een biosafety level 2 (BSL-2) kast desinfecteer je het bladoppervlak met 70% ethanol met steriele handschoenen. Na het aanbrengen van 70% ethanol laat je het bladoppervlak minstens 2 minuten volledig aan de lucht drogen voordat de aseptische incisie plaatsvindt.
3. Verwijder met een steriel scalpel de distale punt en randen van het blad, laat het gele latex exsudaat ongeveer 30 minuten volledig afvoeren en fileer het blad vervolgens in de lengte. Verwijder en verzamel zorgvuldig alleen de transparante binnenste gel, vermijd de buitenste schil en de resterende latexlaag.
4. Breng de Aloe vera binnengel voorzichtig over in een steriele container en homogeniseer door intermitterende vortex gedurende ongeveer 5-10 minuten bij ongeveer 2.500 rpm (of een vergelijkbare medium-hoge vortexinstelling); voer de procedure uit bij kamertemperatuur, tenzij temperatuurregeling vereist is voor het specifieke instrument.
5. Onder aseptische omstandigheden bereid je verse Aloë vera. binnengel-extractformuleringen op 5%, 10%, 15% en 20% (w/v) met steriel gedestilleerd water; bijvoorbeeld bereid 5% (W/V) als 5 g gel voor tot een eindvolume van 100 mL, en pas de resterende concentraties analog aan.

2. pH-meting

1. Voer driepunts pH-meter kalibratie uit met standaard pH 4.01, 7.00 en 10.01 bufferoplossingen met NIST-traceerbaarheid vóór elke meetreeks.
2. Meet de pH voor elke concentratie bij kamertemperatuur (20–25 °C); registreer minstens drie technische replica's per concentratie.

3. Meting van de totale antioxidantcapaciteit (TAC)

1. Gebruik de aloë vera-extractformuleringen die in Stap 1 zijn bereid (5%, 10%, 15% en 20%) voor TAC-meting.
2. Breng alle reagentia en monsters vóór de analyse op kamertemperatuur (20–25 °C) om analytische consistentie te waarborgen.
3. Kalibrer de geautomatiseerde biochemische analyzer (Rel Assay, Turkije) volgens de standaardprocedures van de fabrikant voordat de test wordt gestart.
4. Laad de reagentia van de totale antioxidantcapaciteit (TAC) op basis van de Erel-methode in de compartimenten van de analyzer.
5. Pipetteer de aloë vera. Haal monsters uit in de juiste monsterbekers of reactieputten met gekalibreerde micropipetten. (Monstervolume: 5 μL)
6. Start de TAC-assay met behulp van het geprogrammeerde protocol van de analyzer voor de ABTS-radicaal kation-gebaseerde methode, volgens de door de fabrikant gespecificeerde reagensvolumes en incubatie-instellingen.
7. Laat de reactie automatisch verlopen, waarbij antioxidanten in het monster de gekleurde ABTS-radicaal kation verminderen, wat resulteert in een afname van de absorptie.
8. Meet de verandering in absorptiespectrofotometrisch bij de gespecificeerde golflengte die door de TAC-methode is gedefinieerd. (Golflengte: 660 nm)
9. Bereken de totale antioxidantcapaciteitswaarden met behulp van de software van de analyzer door veranderingen in monsterabsorptie te vergelijken met de Trolox-equivalente kalibratiecurve.
10. Express TAC-resultaten zijn mmol Trolox-equivalenten / L per volume-eenheid extract.
11. Voer alle metingen dubbel uit om analytische betrouwbaarheid te waarborgen.

4. Kweekgebaseerde no-detecteerbare groeibeoordeling van aloë vera. Binnenste gel

1. Inoculeer 10 μL van elk extract op bloedagar, eosine, methyleenblauw agar en Sabouraud-dextroseagar met behulp van een gekalibreerde lus (10 μL) (kolonie-tellingsmethode).
2. Voor kweekgebaseerde no-detecteerbare-groeibeoordeling doseer aseptisch een gestandaardiseerde 50 μL aliquot met een gekalibreerde micropipette op bloedagar, eosine, methyleenblauwe agar en Sabouraud dextrose agarplaten en verspreid deze voorzichtig met een steriele wegwerplus (10 μL) (cultuurgebaseerde voortplantingsbeoordeling met de directe dripmethode).
3. Incubeer bloedagar- en eosine-methyleenblauwe agarplaten aeroob bij 37 °C en Sabouraud-dextroseagarplaten aeroob bij 25–28 °C, en inspecteer vervolgens de platen visueel op groei bij 24, 48 en 72 uur. Incubeer één niet-geïnëntificeerde plaat van elk medium parallel als negatieve controle.

5. Beoordeling van de antimicrobiële activiteit van het aloë vera-testmengsel

1. Onder steriele omstandigheden bereid je een homogene testoplossing door 70% steriel Aloë vera binnengel-extract te mengen met 30% N-acetyl-L-cysteïne oplossing (10% w/v in steriel water).
   OPMERKING: Dit mengsel vermindert de hoge viscositeit van de gel die van het blad wordt geschraapt en verkrijgt een vloeibaardere consistentie. Beschouw deze samengestelde formulering als een voorlopige screeningsmengsel. Interpreteer daarom de antimicrobiële bevindingen als een weerspiegeling van de gecombineerde activiteit van beide componenten.
2. Draai het gehomogeniseerde mengsel grondig in vortex totdat een uniforme oplossing is verkregen.
3. Subcultuur van de voorheen gecryopreserveerde standaard bacteriële voorraden van Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 en Escherichia coli. ATCC 25922, opgeslagen bij -80 °C, op standaard bloedagar (voor grampositieve bacteriën) en standaard eosinemethyleenblauwe agar (voor gramnegatieve bacteriën), en incubeer bij 37 °C gedurende 18-24 uur.
4. Aan het einde van de incubatie bereid je bacteriële suspenties voor die zijn aangepast tot 0,5 McFarland-troebelheid met steriele zoutoplossing uit de gegroeide kolonies, volgens de standaard inoculumvoorbereidingsaanbevelingen voor antimicrobiële gevoeligheidstest³⁸.
5. Inoculeer Mueller-Hinton-agarplaten uniform met elke gestandaardiseerde bacteriële suspensie met behulp van een steriel wattenstaafje.
6. Breng een gestandaardiseerd volume van 15 μL van het steriele Aloe vera/NAC testmengsel toe op elke steriele 6 mm antimicrobiële schijf met behulp van een gekalibreerde micropipet. Hetzelfde laadvolume, absorptietijd (minimaal 2 min) en luchtdroogtijd (ongeveer 5 min) werden op alle schijven toegepast in de replicaties om procedurele consistentie te waarborgen. Dit volume werd geselecteerd als een praktische laadhoeveelheid voor 6 mm schijven in plant-extractgebaseerde schijfdiffusiescreening en werd constant gehouden voor alle experimenten.
7. Plaats de met extract geïmpregneerde schijven op het oppervlak van de geïnënteerde agarplaten met behulp van steriele pincetten.
8. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 18–24 uur onder aerobe omstandigheden.
9. Na de incubatie meet u handmatig de diameter van elke inhibitiezone, inclusief de schijfdiameter, tot de dichtstbijzijnde millimeter met een liniaal. Voer het experiment uit als een enkele beschrijvende meting, waarbij de geregistreerde zonediameters worden gerapporteerd als individueel waargenomen waarden. Voer metingen uit door de platen visueel te inspecteren volgens de standaard schijfdiffusie-leesaanbevelingen³⁸.
10. Maak dubbele seriële verdunningen (1/2, 1/4, 1/8 en 1/16) van het 70:30 (v/v) aloë vera/NAC testmengsel in Mueller-Hinton-bouillon.
11. Inoculeer elke buis met 500 μL van de bijbehorende 0,5 McFarland gestandaardiseerde bacteriële suspensie, bereid in steriele zoutoplossing. Bereid een aparte verdunningsreeks voor voor elke referentiestam en incubeer de geïnënfiseerde buizen onder de hieronder gespecificeerde voorwaarden.
12. Incubeer de geïnënte buizen bij 37 °C gedurende 18–24 uur.
13. Evalueer de microbiële groei visueel op troebelheid ten opzichte van de bouilloncontrole; interpreteer de assay kwalitatief in plaats van als een formele MIC-bepaling.
14. Gebruik een ciprofloxacineschijf (5 μg) als positieve controle parallel aan aloë vera/NAC-geïmpregneerde schijven. Pas dezelfde positieve controleschijf toe voor Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 en Escherichia coli ATCC 25922 om de gevoeligheid onder discdiffusiecondities te bevestigen.
    OPMERKING: Voer alle microbiologische procedures uit onder BSL-2 omstandigheden en registreer alle zonediameter- en troebelheidswaarnemingen direct na de incubatie voor latere beschrijvende analyse. Dit protocol combineert aseptische bereiding van A. vera.extract met complementaire biochemische en microbiologische assays ter ondersteuning van de ontwikkeling van plantaardige formuleringen voor topisch en complementair gebruik in geneeskunde. De workflow is zo ontworpen dat deze praktisch is voor routinelaboratoriums: pH- en redoxscreening (TAC) kan worden uitgevoerd naast sterilisiteitskweek en twee veelgebruikte antimicrobiële assays (schijfdiffusie en buisverdunning).

Resultaten

pH-waarden van aloë vera. Extractie in verschillende concentraties

Het pH-profiel vertoonde een niet-monotoon patroon over concentraties heen. De gemiddelde pH-waarden waren respectievelijk 6,47, 6,60, 6,26 en 6,28 voor de formuleringen 5%, 10%, 15% en 20%. De algemene groepsverschillen waren significant (p = 0,024). De 5%- en 10%-formuleringen vertoonden relatief hogere pH-waarden, terwijl de 15%- en 20%-formuleringen zich clusterden...

Discussie

De huidige studie biedt een geïntegreerde laboratoriumworkflow voor de voorlopige karakterisering van verse binnengel-aloë vera-extractformuleringen door pH-metingen, analyse van totale antioxidantcapaciteit (TAC), cultuurgebaseerde beoordeling van niet-detecteerbare groei en beschrijvende antimicrobiële screening te combineren. Toenemende concentraties verse binnengel-aloë vera. gingen gepaard met hogere TAC-waarden, terwijl er geen zichtbare bacteriële of schimmelgroe...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(-)80 C Deep Freezer	Thermofisher/USA	Sample storage	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	Sample preperation	88882010
Blood Agar	RTA/Turkey	Culture inoculation	2001
Eosine Methilene Blue Agar	RTA/Turkey	Culture inoculation	2010
SDA Agar	RTA/Turkey	Culture inoculation	2036
Müller Hinton Agar	RTA/Turkey	Culture inoculation	2022
Müller Hinton Broth	RTA/Turkey	Culture dilution	1018
Pipettes	Thermofisher/USA	Sample preperation	4642090N
Hanna pH Meters	Hitachi/JAPAN	Sample analyses	HI2211-02
Rel Assay Plate Reader	Rel Assay(Turkey)	Sample TAC analyses	M201 (Smart Model)
TAC Kits	Rel Assay(Turkey)	Kit	RL0017