Vijf-smaken Sophora flavescens enterisch gecoate capsules verlichten experimentele colitis en ferroptose-gerelateerde veranderingen

Samenvatting

In een muismodel van colitis ulcerosa verlichtten vijf-smaken Sophora flavescens enterisch gecoate capsules colonische schade en verbeterden oxidatieve stress, inflammatoire cytokine-disbalans, JAK2/STAT3-signalering en veranderingen in ferroptose-gerelateerde markers.

Samenvatting

Colitis ulcerosa blijft moeilijk te behandelen omdat effectieve en gerichte therapeutische opties beperkt zijn, en oxidatieve stress, ontstekingssignalering en gereguleerde celdoodsroutes kunnen bijdragen aan mucosale schade. Deze studie evalueerde of vijf-smaken Sophora flavescens enterisch gecoate capsules (FSEC) experimentele colitis verlichten en onderzocht geassocieerde veranderingen in oxidatieve stress, ontsteking en markers van ferroptose. Een muismodel van ulcerosa colitis werd ontwikkeld met cyclische blootstelling aan 2,5% dextronsulfaatnatrium, gecombineerd met tumornecrosefactor alfa-uitdaging. Muizen werden behandeld met laag-, middel- of hoge doses FSEC of met de TLR4-antagonist CRX-526 als positieve controle. De histopathologie van de colon werd beoordeeld met hematoxyline- en eosinekleuring. Serum-superoxidedismutase, katalase, glutathion, myeloperoxidase en Fe²⁺-niveaus werden gemeten met biochemische assays. Cytokines in het colonweefsel werden gekwantificeerd door een enzymgekoppelde immunosorbentassay, de expressie van JAK2 en STAT3 werden geëvalueerd met immunohistochemie, en de expressie van GPX4, FTH1 en ACSL4 werden geanalyseerd met western blotting. FSEC-behandeling verminderde schade aan het darmslijmvlies en infiltratie van inflammatoire cellen, verhoogde de antioxidantenindices en verlaagde de myeloperoxidasespiegels. FSEC verlaagde ook TNF-α en IL-1α niveaus, herstelde IL-13 gedeeltelijk en was geassocieerd met zwakkere JAK2- en STAT3-immunokleuring. Tegelijkertijd verbeterde FSEC de ferroptose-gerelateerde markerveranderingen, waaronder verlaagde Fe²⁺- en ACSL4-niveaus en verhoogde GPX4- en FTH1-expressie. Deze bevindingen suggereren dat FSEC experimentele ulcerosa colitis bij muizen verlicht, ten minste gedeeltelijk door de oxidatieve stressstatus te verbeteren, inflammatoire signalering te matigen en ferroptose-gerelateerde markerprofielen te herstellen.

Inleiding

Colitis ulcerosa (UC) is een chronische ontstekingsaandoening die voornamelijk het darm- en rectusmucosa aantast en wordt gekenmerkt door terugkerende episodes van mucosale ontsteking, ulceratie en een verminderde barrièrefunctie ^1,2,3. Hoewel genetische vatbaarheid, omgevingsfactoren, disfunctie van de epitheelbarrière en immuundysregulatie betrokken zijn bij de pathogenese van UC, blijven de mechanismen achter aanhoudende mucosale schade onvolledig begrepen. Huidige farmacologische behandelingen, waaronder aminosalicyllaten, corticosteroïden, immunosuppressiva en biologische middelen, kunnen de ziekteactiviteit bij veel patiënten verminderen; hun klinische gebruik kan echter beperkt zijn door terugval na het stopzetten van de behandeling, bijwerkingen, hoge kosten en onvolledige therapeutische responsen³.

Ferroptose, een ijzerafhankelijke vorm van gereguleerde celdood die wordt gekenmerkt door lipideveroxidatie en veranderde ijzerstofwisseling, wordt steeds vaker in verband gebracht met darmontsteking en UC-geassocieerd epitheelletsel 4,5,6,7,8. Tegelijkertijd krijgen traditionele Chinese geneeskundeformuleringen steeds meer aandacht als complementaire benaderingen voor de behandeling van UC vanwege hun multi-target therapeutisch potentieel⁹.

Vijf-smaken Sophora flavescens enterisch gecoate capsules (FSEC) worden klinisch gebruikt voor de behandeling van milde tot matige actieve UC in de traditionele Chinese geneeskundepraktijk. Eerdere studies suggereren dat FSEC de symptomen van UC kan verbeteren via multi-componenten en multi-target mechanismen¹⁰. De effecten van FSEC op oxidatieve stress, inflammatoire signalering, JAK2/STAT3-activiteit en ferroptose-gerelateerde veranderingen in experimentele UC zijn echter onvoldoende gekarakteriseerd.

Oxidatieve stress en ontstekingssignalering zijn belangrijke bijdragers aan darmslijmvliesbeschadiging bij UC. Overmatige productie van reactieve zuurstofsoorten kan de epitheelintegriteit verstoren, inflammatoire celinfiltratie bevorderen en de antioxidantenafweersystemen aantasten. Cytokine-gemedieerde routes zoals JAK2/STAT3-signalering dragen bij aan inflammatoire amplificatie en weefselbeschadiging 11,12,13,14,15. Daarnaast zijn oxidatieve stress en ferroptose nauw verbonden door veranderingen in antioxidantafweer, ijzermetabolisme en lipideperoxidatie 16,17,18,19,20. Daarom kan gelijktijdige evaluatie van oxidatieve stressindices, ontstekingscytokines, JAK2/STAT3-signalering en ferroptose-gerelateerde markers een uitgebreider begrip bieden van mucosale beschadiging en therapeutische responsen in experimentele UC.

In de huidige studie werd een cyclisch dextransulfaatnatrium- en tumornecrosefactor-alfa-uitgedaagde muismodel gebruikt om de effecten van laag-, middel- en hoge doses FSEC te evalueren. Een belangrijke methodologische kracht van dit ontwerp is de integratie van histopathologische beoordeling met metingen van serumoxidatieve stressindices, colonweefselcytokines, JAK2/STAT3 immunohistochemie en western blot-analyse van ferroptose-gerelateerde eiwitten binnen één experimenteel kader. Deze benadering werd gebruikt om te bepalen of FSEC experimentele UC verlicht en om geassocieerde veranderingen in oxidatieve stress, inflammatoire signalering en ferroptose-gerelateerde markerprofielen te karakteriseren. Het algemene experimentele ontwerp en de analytische workflow worden samengevat in Figuur 1.

Figuur 1: Experimentele workflow van het muismodel en downstream analyses. Chronische experimentele colitis ulcerosa werd geïnduceerd door cyclische blootstelling aan 2,5% dextransulfaatnatrium (DSS) gecombineerd met tumornecrose factor alpha (TNF-α) uitdaging tijdens de laatste week van het experimentele protocol. Muizen werden ingedeeld in normale controlegroepen, model-, laag-dosis FSEC, middel-dosis FSEC, hoge dosis FSEC en CRX-526 positieve controlegroepen. FSEC werd toegediend via intragastrische gavage in doses van 108, 216 of 432 mg/kg lichaamsgewicht. CRX-526 werd gebruikt als positieve controle-interventie. Na de laatste behandeling werden monsters verzameld voor histopathologische evaluatie, biochemische tests gerelateerd aan oxidatieve stress, cytokineanalyse met ELISA, immunohistochemie en western blot-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Welfare and Ethics Committee van Nanchang Medical College (goedkeuring nr. NY2SC 20250407). Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De chemicaliën, reagentia en apparatuur worden vermeld in de Materiaallijst.

1. Dieren en behandeling

Mannelijke C57BL/6J muizen (wildtype, 8 weken oud) werden in deze studie gebruikt. Dieren werden gehuisvest onder standaard laboratoriumomstandigheden met gecontroleerde temperatuur en luchtvochtigheid en kregen gratis toegang tot voedsel en water. Na acclimatisatie werd chronische colitis veroorzaakt door drie cycli van 2,5% dextransulfaatnatrium (DSS) in het drinkwater toe te dienen. Elke cyclus duurde 1 week en werd gescheiden door een herstelperiode van 2 weken met regelmatig drinkwater. Tijdens de laatste week van het experimentele protocol ontvingen muizen in de model- en behandelgroepen tumornecrosefactor alfa (TNF-α; 10 μg/100 g lichaamsgewicht, tweemaal daags) via intragastrische gavage om het darmletsel verder te verergeren. Normale controlemuizen kregen alleen voertuig en werden niet blootgesteld aan DSS of TNF-α.

Vijf-smaken Sophora flavescens enterisch gecoate capsules (FSEC) werden gebruikt als commercieel verkrijgbaar, goedgekeurd Chinees patentmedicijn. De formulering bevatte Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., en Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. De inhoud van de capsules uit dezelfde productiebatch werd gewogen en opgehangen in steriel gedestilleerd water om verse doseeringssuspensies voor toediening te bereiden. De ophangingen werden voor elke gavage grondig gemengd om een gelijkmatige verspreiding te garanderen. Productbron, goedkeuringsnummer, farmaceutische specificaties en kwaliteitscontrole-informatie worden vermeld in de Materiaaltabel. De productkwaliteit werd beschreven in overeenstemming met de goedgekeurde farmaceutische specificatie en door de fabrikant verstrekte informatie, waaronder capsulespecificaties, uiterlijk, enterische vrijlating en desintegratie, microbiële limietvereisten en kwaliteitscontrolestandaarden.

Met FSEC behandelde muizen kregen lage dosis FSEC (108 mg/kg lichaamsgewicht), middelhoge dosis FSEC (216 mg/kg lichaamsgewicht) of hoge dosis FSEC (432 mg/kg lichaamsgewicht) via intragastrische gavage tweemaal daags in de laatste week van de modellering. Dosisniveaus werden geselecteerd op basis van de goedgekeurde klinische dosis, lichaamsoppervlakte-omzetting en voorlopige dosiswaardigheid. Met voertuig behandelde muizen ontvingen hetzelfde volume steriel gedestilleerd water via intragastrische gavage.

De positieve controlegroep ontving de TLR4-antagonist CRX-526 bij 1 mg/kg via staartveninjectie tijdens de laatste week van de modellering. CRX-526 werd gebruikt als referentie-ontstekingsremmende interventie. De studie omvatte zes groepen (n = 6 per groep): normale controlegroep, model, laag-dosis FSEC, middel-dosis FSEC, hoge dosis FSEC en CRX-526 positieve controlegroepen. De muizen werden 24 uur na de laatste studie geofferd. Euthanasie werd uitgevoerd door cervicale dislocatie onder isoflurane anesthesie, in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

2. Histologische evaluatie door middel van hematoxyline- en eosine kleuring

Er werden darmweefsels verzameld uit het macroscopisch meest aangetaste gebied tussen de anus en het ileocecale gebied. Voor elke muis werd één representatief colonsegment uit dit gebied vastgezet in 10% neutraal gepufferde formaline, ingebed in paraffine, gesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine. Voor histologische evaluatie werden van elk dier minstens drie secties voorbereid, en vijf niet-overlappende hoogvermogenvelden per sectie werden onderzocht. Velden werden systematisch willekeurig geselecteerd door het gedeelte van de ene rand naar de andere te scannen, waarbij gescheurde, gevouwen of slecht bevlekte gebieden werden vermeden. Histopathologische veranderingen, waaronder mucosale ulceratie, klierenvernietiging, verstopping en infiltratie van inflammatoire cellen, werden geëvalueerd met lichtmicroscopie.

3. Meting van biochemische indicatoren gerelateerd aan oxidatieve stress.

Bloedmonsters (0,5 mL) werden verzameld in buisjes met antistollingsmiddelen en gecentrifugeerd bij ongeveer 1160 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. De supernatant werd verzameld en gebruikt om serumijzer, superoxidedismutase (SOD), glutathion (GSH), katalase (CAT) en myeloperoxidase (MPO) te meten met behulp van de bijbehorende assay kits die volgens de instructies van de fabrikant in de Table of Materials zijn vermeld.

4. Immunohistochemische analyse van JAK2 en STAT3

Paraffine-ingebedde colonweefseldoorsneden (5 μm) werden gedeparaffiniseerd in xyleen, gerehydrateerd via een gegradueerde ethanolreeks en afgespoeld met fosfaatgeborrelde zoutoplossing. Antigeenwinning werd uitgevoerd in een citraatbuffer (pH 6,0) met behulp van microgolfverwarming. Na afkoeling tot kamertemperatuur werd de endogene peroxidaseactiviteit geblokkeerd met 3% H₂O₂ gedurende 10 minuten. De secties werden 30 minuten bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% normaal geitenserum en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen JAK2 en STAT3 bij verdunningen van respectievelijk 1:50 en 1:80. Na fosfaatgeborde zoutoplossingsspoelingen werden secties geïncubeerd met een mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam volgens de instructies van de fabrikant. Immunoreactieve signalen werden weergegeven met 3,3′-diaminobenzidine, en de kernen werden tegengekleurd met hematoxyline. Secties werden gedehydrateerd, gemonteerd en onderzocht onder een lichtmicroscoop.

5. Cytokinenkwantificatie door enzym-gekoppelde immunosorbentassay

Darmweefsels werden in 2–^{3 mm} stukjes gesneden, gehomogeniseerd op ijs in fosfaatgeborde zoutoplossing en gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Het supernatant werd verzameld en de concentraties TNF-α, IL-1α en IL-13 werden gemeten met de bijbehorende ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant. Absorptiewaarden werden gemeten met een microplaatlezer en cytokinenconcentraties werden berekend op basis van standaardcurves die voor elke assay werden gegenereerd.

6. Western blot-analyse van ferroptose-gerelateerde eiwitten

Totale eiwitten werden uit colonweefsels geëxtraheerd en eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van een bicinchoninezuurassay. Gelijke hoeveelheden eiwit uit elk monster werden gescheiden door SDS-PAGE en overgedragen op membranen. Na blokkering met 5% magere melk of een equivalente blokkeringsbuffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, werden membranen 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen GPX4, FTH1, ACSL4 en het loading-control eiwit β-actine, zoals vermeld in de Table of Materials. De volgende dag werden membranen gewassen en geïncubeerd met het bijbehorende mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Eiwitbanden werden visualiseerd met een chemiluminescente substraat en afgebeeld met een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met behulp van densitometriesoftware. De expressieniveaus van GPX4, FTH1 en ACSL4 werden genormaliseerd naar β-actine, en de relatieve eiwitexpressie werd berekend voor statistische analyse.

7. Statistische analyse

De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden uitgevoerd met eenrichtingsanalyse van variantie, gevolgd door Bonferroni's post hoc-test wanneer aan de aannames van normaliteit en homogeniteit van variantie werd voldaan. Een waarde van P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

FSEC verlicht histopathologische schade en verbetert oxidatieve-stressgerelateerde indices bij muizen met colitis ulcerosa
Zoals weergegeven in Figuur 2, vertoonde de normale controlegroep een intacte colonische slijmvliesarchitectuur, met goed georganiseerde klieren en minimale ontstekingscelinfiltratie. Daarentegen vertoonde de modelgroep ernstige slijmvliesbeschadiging, gekenmerkt door epitelverstoring, mucosale ulceratie, klierenverni...

Discussie

Deze studie onderzocht de effecten van vijf-smaken Sophora flavescens enterisch-gecoate capsules (FSEC) in een muismodel van experimentele ulcerosa colitis (UC) en evalueerde geassocieerde veranderingen in oxidatieve-stressgerelateerde indices, ontstekingscytokines, JAK2/STAT3-signalering en ferroptose-gerelateerde markers. De belangrijkste bevindingen waren dat FSEC-behandeling de histopathologische schade van de colon verlichtte, de biochemische indices van antioxidanten verbe...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018	Chromogeen substraat voor HRP-gebaseerde immunohistochemie.
ACSL4 antibody (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	Muis monoklonaal primair antilichaam voor western blot; gebruikt bij 1:500; RRID: AB_10842002.
Antigen retrieval solution, citrate buffer, pH 6,0	Beyotime Biotechnology	P0081	Warmte-geïnduceerde epitoop retrieval buffer voor paraffine-sectie immunohistologie.
BCA eiwit assay kit	Beyotime Biotechnology	P0012	Eiwit kwantificering vóór western blotting.
C57BL/6J muizen	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Mannelijke SPF muizen, 8 weken oud; dierenbron consistent met de ingediende ethische goedkeuringsmaterialen.
Catalase (CAT) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	Colorimetrische kit voor serum CAT activiteitsmeting.
ChemiDoc XRS+ beeldvormingssysteem	Bio-Rad Laboratories	1708265	Chemiluminescentie beeldvormingssysteem voor western blot detectie.
CRX-526	TargetMol	T27090	TLR4 antagonist gebruikt als de positieve-controle interventie; CAS nr. 245515-64-4.
Dextransulfaat natriumzout (DSS), colitis graad	MP Biomedicals	160110	DSS, colitis graad, moleculair gewicht 36.000–50.000 Da; gebruikt bij 2,5% in drinkwater.
ECL chemiluminescent substraat	Bio-Rad Laboratories	1705061	Clarity Western ECL substraat voor HRP-gebaseerde western blot signaal detectie.
ELISA kit, muis IL-13	Abcam	ab219634	Colorimetrische sandwich ELISA kit voor muis IL-13 kwantificering; 450 nm aflezing.
ELISA kit, muis IL-1α	Abcam	ab199076	Colorimetrische sandwich ELISA kit voor muis IL-1α kwantificering; 450 nm aflezing.
ELISA kit, muis TNF-α	Abcam	ab208348	Colorimetrische sandwich ELISA kit voor muis TNF-α kwantificering; 450 nm aflezing.
Ethanol, absoluut	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Gebruikt voor weefselverwerking, dehydratie en reagensvoorbereiding.
Ferro-ijzer (Fe2+) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	Colorimetrische kit voor Fe2+ meting in serum of weefsel monsters.
Five-flavor Sophora flavescens enteric-coated capsules	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	NMPA goedkeuring nr. Z20150002	Chinese patentmedicijn; 0,4 g/capsule; formule omvat Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., en Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.; farmaceutische specificatie YBZ00152015
Glutathione (GSH) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	Reduceerde glutathion assay kit voor serum GSH meting.
GPX4 antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	Muis monoklonaal primair antilichaam voor western blot; gebruikt bij 1:500; RRID: niet vermeld in de leveranciersgegevens.
Hematoxyline en eosine kleuring kit	Solarbio	G1120	H&E kleuring van paraffine-ingesloten colon weefselsecties.
Horseradish peroxidase-geconjugeerd geit anti-muis IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	Secundair antilichaam voor western blot; gebruikt bij 1:50.000; RRID: AB_631736.
ImageJ software	National Institutes of Health	Versie 1.54	Beeldanalyse en densitometrie software gebruikt voor western blot band kwantificering.
Immunohistochemie detectie kit	ZSGB-BIO	PV-9000	Polymeer-gebaseerde HRP detectie kit voor paraffine-sectie immunohistologie.
JAK2 antibody (D2E12)	Cell Signaling Technology	3230	Konijn monoklonaal primair antilichaam voor JAK2 immunohistologie op paraffine secties; RRID: AB_2128522.
Microplaat reader	BioTek Instruments	Synergy H1	Plate reader voor ELISA absorptie meting bij 450 nm.
Myeloperoxidase (MPO) activiteits assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	Colorimetrische kit voor serum MPO activiteitsmeting.
Neutraal gebufferd formaline, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Fixatie van colon weefsel vóór paraffine-inbedding.
Normaal geit serum	Solarbio	SL038	Blocking reagens voor immunohistologie.
Paraffine	Leica Biosystems	39601006	Inbeddingsmedium voor colon weefselverwerking.
Fosfaat-gebufferd zoutoplossing (PBS)	Solarbio	P1020	Buffer voor weefsel homogenisatie, wassen en immunokleuring procedures.
PVDF membraan	MilliporeSigma	IPVH00010	Eiwit-overdracht membraan voor western blotting.
Recombinant muis TNF-α eiwit	R&D Systems	410-MT	Recombinant muis TNF-α gebruikt voor de laatste week inflammatoire uitdaging.
SDS-PAGE en overdracht systeem	Bio-Rad Laboratories	1658004	Mini-PROTEAN Tetra systeem voor SDS-PAGE en western blot overdracht workflow.
SPSS Statistics software	IBM	Versie 24.0	Statistische analyse software voor one-way ANOVA en Bonferroni post-hoc testen.
STAT3 antibody (124H6)	Cell Signaling Technology	9139	Muis monoklonaal primair antilichaam voor STAT3 immunohistologie; RRID: AB_331757.
Superoxide dismutase (SOD) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-3-2	WST-1 methode kit voor serum SOD activiteitsmeting.
Xyleen	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418	Ontwassing