Een gestandaardiseerd metabolomics-protocol voor het analyseren van door inspanning veroorzaakte metabole verschuivingen bij eliteboxers door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde serummetabolomics-workflow gebaseerd op vloeistofchromatografie gekoppeld aan quadrupool time-of-flight tandem massaspectrometrie (LC-QTOF-MS/MS) en multivariate data-analyse voor het profileren van acute en kortetermijnherstelgerelateerde metabole verschuivingen bij elite mannelijke boksers.

Samenvatting

Eliteboksen veroorzaakt snelle metabole veranderingen die niet volledig worden vastgelegd door conventionele fysiologische metingen. Een gestandaardiseerde niet-gerichte serummetabolomics-workflow gebaseerd op vloeistofchromatografie-quadrupool time-of-flight tandem massaspectrometrie (LC-QTOF-MS/MS) werd toegepast op monsters die werden verzameld vóór het sparren, direct na het sparren en 24 uur na het sparren bij zeven elite mannelijke boksers. De workflow omvatte gestandaardiseerde monsterverzameling, gezamenlijke kwaliteitscontrole, metabolietprofilering, multivariate statistische analyse en route-interpretatie. Acuut sparren was geassocieerd met veranderingen in metabolieten gerelateerd aan glycolyse en gluconeogenese, terwijl het 24-uurstijdstip geassocieerd was met zwavelmetabolisme.

Fosfatidylinositol PI (16:0/18:2(9Z,12Z)) vertoonde sterke discriminatie van de directe post-sparring toestand, en thiosulfaat was geassocieerd met de 24-uur hersteltoestand. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van deze workflow voor reproduceerbare profilering van lichaamswisselingsgerelateerde veranderingen in deze lichting van zeven elite mannelijke boksers. Het protocol is bedoeld voor gecontroleerde kleine-cohortstudies van acute inspanning en kortetermijnherstel en legt de nadruk op reproduceerbare monsterbehandeling, gecombineerde kwaliteitscontrole en interpreteerbare downstream-analyse.

Inleiding

Eliteboksen, gekenmerkt door drie rondes van 2 minuten intensief sparren, maakt gebruik van een combinatie van anaerobe en aerobe stofwisseling en veroorzaakt snelle verschuivingen in energiesubstraten, mediatoren voor oxidatieve stress en weefselreparatiegerelateerde metabolieten. Traditionele beoordelingen (bloedlactaat en hartslag) vatten alleen geïsoleerde fysiologische eindpunten, waarbij ze de systemische, onderling verbonden metabole veranderingen die zich uitstrekken over "pre-sparring baseline → post-sparring acute stress → 24-uurs herstel" niet oplossen.

Niet-gerichte metabolomics, mogelijk gemaakt door vloeistofchromatografie-quadrupool time-of-flight tandem massaspectrometrie, pakken deze beperking aan door kleine-molecuulmetabolieten in biologische monsters uitgebreid te profileren. Het detecteert doorgaans duizenden metabole pieken en annoteert honderden tot duizenden metabolieten via integratie met gecureerde databases ^1,2,3. Deze benadering kan genuanceerde metabole dynamiek onthullen die traditionele methoden missen, maar bestaande op boksen gerichte metabolomische studies missen standaardisatie: ze laten vaak gecontroleerde sparringsprotocollen, strenge kwaliteitscontrolestappen (QC) of langetermijnhersteltijden weg, wat leidt tot onreproduceerbare resultaten en beperkte vertaling naar trainings- of herstelstrategieën ^4,5.

Een gestandaardiseerde metabolomische workflow gebaseerd op vloeistofchromatografie-quadrupool time-of-flight tandem massaspectrometrie en geoptimaliseerd voor eliteboksers wordt gepresenteerd om zowel acute trainingsreacties als vertraagd herstel vast te leggen. Het protocol bevat drie belangrijke tijdstippen (voor-sparren [T0], direct na sparren [T1], 24 uur na sparren [T2]) om tijdelijke spanning te onderscheiden van aanhoudende adaptatie ^6,7,8. Kritieke technische kenmerken zijn: (1) gecontroleerd sparren (80–85% maximale hartslag) om consistente intensiteit te garanderen ^7,9; (2) hoogresolutie LC-QTOF voor gevoelige detectie van serummetabolieten^met lage abundantie ^2,3,10; (3) multivariate en univariate analyses, waaronder principal component analysis (PCA), orthogonale partiële least squares-discriminant analyse (OPLS-DA) en paargewijze statistische tests, om inspanningsgevoelige metabolieten^te identificeren ^6,8,11; en (4) een enkele gepoolde serum QC-monster (gelijke volume mix van studiemonsters) met meerdere injecties om de stabiliteit van het instrument te evalueren tegen signaaldrift¹².

Dit protocol kan zich aanpassen aan andere intensieve, kortdurende sporten (bijvoorbeeld sprinten en worstelen), maar zo'n overdraagbaarheid vereist validatie in sportspecifieke groepen. In deze studie biedt de workflow een voorlopig kader voor het identificeren van metabole markers van stress en herstel bij elite mannelijke boksers. Deze werkwijze is het meest geschikt voor gecontroleerde studies van acute inspanning en kortetermijnherstel in kleine, goed gekarakteriseerde atletische cohorten met behulp van serum-gebaseerde niet-gerichte metabolomics. Het kan minder geschikt zijn voor directe extrapolatie naar andere sporten, vrouwelijke atleten, grotere heterogene populaties of langetermijnadaptatiestudies zonder aanvullende validatie.

De studie had als doel serummetabole veranderingen geïnduceerd door elite bokssparren te karakteriseren en acute post-sparringreacties te onderscheiden van herstelgerelateerde veranderingen na 24 uur. Er werd verondersteld dat acuut sparren voornamelijk invloed zou hebben op het energiemetabolisme, terwijl herstel na 24 uur geassocieerd zou zijn met metabolieten die gekoppeld zijn aan redoxbalans en weefselherstel. De algemene workflow is weergegeven in Figuur 1.

Protocol

Voer alle procedures uit in overeenstemming met goedkeuring van de Institutionele Ethische Commissie voor Menselijk Onderzoek van de Capital University of Physical Education and Sports (goedkeuringsnummer 2025A005).

VOORZICHTIG: Behandel alle menselijke bloedmonsters als mogelijk besmettelijk. Draag handschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming. Voer veneus bloed afnemen, serumbehandeling en afvalverwijdering uit volgens institutionele bioveiligheidsprocedures. Decontaminateer werkoppervlakken na het behandelen van het monster.

VOORZICHTIG: Methanol, acetonitril en mierenzuur zijn gevaarlijke chemicaliën. Voer de stappen van oplosmiddelvoorbereiding, extractie en reconstitutie uit in een gecertificeerde chemische dampkap. Vermijd huidcontact en inademing. Verzamel oplosmiddelafval in goedgekeurde containers.

1. Werving en voorbereiding van studiedeelnemers

1. Rekruteer zeven elite mannelijke boksers van 20–28 jaar oud en die uitkomen in de gewichtsklassen 60–75 kg.
2. Bevestig dat elke deelnemer ten minste 5 jaar professionele trainingservaring heeft en geen geschiedenis van metabole ziekten.
3. Sluit deelnemers met musculoskeletaal letsel uit in de voorgaande 6 maanden.
4. Instrueren deelnemers om een gestandaardiseerd dieet te volgen dat 55% koolhydraten, 25% eiwit en 20% vet bevat gedurende 3 dagen voordat ze testen.
5. Instrueer deelnemers om 48 uur lang geen zware inspanning te oefenen op of boven 60% van de maximale hartslag voordat ze testen.
6. Geef de deelnemers instructies om 12 uur te vasten voordat ze bloed afnemen. Sta waterinname toe tijdens de vastenperiode.
7. Bepaal de maximale hartslag door een week voor sparren een gegradueerde inspanningstest.
8. Verhoog de loopbandsnelheid elke 3 minuten met 1 km/u tot uitputting. Gebruik de gemeten maximale hartslag om de intensiteit van het sparringdoel te bepalen.

2. Sparringprotocol en verzameling van serummonsters

1. Bereid een standaard boksring van 6 × 6 m voor, handschoenen van 16 oz en een hartslagmeter met borstband.
2. Voer een gestandaardiseerde warming-up van 10 minuten uit bestaande uit 5 minuten joggen op 8 km/u, 3 minuten dynamisch stretchen en 2 minuten shadowboxen.
3. Voer het sparringsprotocol als volgt uit.
   1. Voer drie rondes sparren van elk 2 minuten uit.
   2. Match tegenstanders op gewichtsklasse en technisch niveau.
   3. Sta een rustinterval van 1 minuut tussen de rondes in.
   4. Controleer de hartslag elke 30 seconden gedurende de sessie.
   5. Pas de intensiteit van het sparren aan om de hartslag op 80%–85% van de MHR te houden.
   6. Pauzeer sparren als de hartslag boven 90% van de MHR uitkomt. Hervat het sparren pas nadat de hartslag weer op het doel is teruggekeerd.
4. Verzamel serummonsters op drie tijdstippen als volgt.
   1. Verzamel 5 ml veneus bloed uit de antecubitale vena 30 minuten na de warming voor T0 met behulp van één 8 mL serum-scheidingsbuis (SST).
   2. Verzamel 5 ml veneus bloed binnen 5 minuten na de laatste ronde voor T1 met een nieuwe SST.
   3. Verzamel 5 ml veneus bloed op hetzelfde tijdstip van de dag als T0 voor T2 door een nieuwe SST te gebruiken. Zorg ervoor dat deelnemers dezelfde vasten- en activiteitsbeperkingen volgen als voor T0.
5. Verwerk bloedmonsters als volgt.
   1. Centrifugeer elke SST op 11.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C binnen 1 uur na verzameling.
   2. Breng 2–3 mL van de bovenste serumlaag over in 1,5 mL cryovialen.
   3. Bewaar de cryovials onmiddellijk op -80 °C.
   4. Beperk elk monster tot maximaal twee vries-dooicycli.
6. Maak een samengevoegd QC-monster klaar.
   1. Ontdooi alle 21 serummonsters van het onderzoek (T0, T1 en T2 van zeven deelnemers) op ijs voordat je samen QC-voorbereiding uitvoert.
   2. Breng een gelijke aliquot van elk onderzoeksmonster over in één buis van 1,5 mL.
   3. Overdracht van 20 μL van elk monster om een uiteindelijke pooled QC-volume van 420 μL te verkrijgen.
   4. Vortex de gepoolde QC-sample gedurende 10 seconden.
   5. Gebruik het gepoolde QC-monster voor herhaalde injecties tijdens LC-QTOF-MS-analyse om instrumentele stabiliteit en signaaldrift te monitoren.

3. Metabolietextractie uit serummonsters

1. Verwijder bevroren serummonsters (T0, T1, T2 en QC) bij -80 °C. Ontdooi de monsters op ijs gedurende 30 minuten en laat elk monster 10 seconden vortexen.
2. Pipetteer 100 μL serum in een 1,5 mL laag-eiwitbindende microcentrifugebuis. Voeg 500 μL ijskoude extractie-oplosmiddel toe bestaande uit methanol:acetonitril (1:1, v/v). Vortex 30 seconden.
   1. Voeg geen interne standaard toe tijdens het extractie. Pas geen extractiecorrectie of downstream-normalisatie toe op interne standaarden gebaseerde workflow.
3. Sonicaer de buis in een ijswaterbad op 4 °C gedurende 10 minuten op 300 W en 40 kHz. Incubeer de buis bij -20 °C gedurende 1 uur om eiwitten te precipiteren.
4. Centrifugeer de buis op 13200 × g gedurende 20 minuten op 4 °C. Breng ongeveer 450 μL supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis en gooi de pellet weg als gevaarlijk biologisch afval.
5. Droog het supernatant in een vacuümconcentrator bij 37 °C en -0,09 MPa gedurende 45 minuten of totdat volledige droogheid is bereikt.
6. Reconstrueren van het gedroogde extract in 100 μL acetonitril:water (1:1, v/v). Vortex 30 seconden.
   Opmerking: Acetonitril:water (1:1, v/v) werd gebruikt omdat het compatibel was met de kolom van omgekeerde fase chromatografie die in deze workflow werd gebruikt en geen zichtbare neerslag produceerde bij voorlopige tests.
7. Centrifugeer de gereconstitueerde oplossing op 13200 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Breng ongeveer 90 μL supernatant over in een LC-MS glazen flesje met een 200 μL inzet, en sluit het flesje af.

4. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie detectie

1. Installeer een kolom met omgekeerde fase chromatografie die geschikt is voor serummetabolomics (zie Materiaaltabel) in het vloeistofchromatografiesysteem. Zet de kolomoven op 40 °C.
2. Bereid mobiele fase A voor als 0,1% (v/v) mierenzuur in ultrazuiver water. Bereid mobiele fase B voor als 0,1% (v/v) mierenzuur in acetonitril.
3. Filter beide mobiele fasen door een membraan van 0,22 μm.
4. Stel de debiet in op 400 μL/min en het injectievolume op 5 μL.
5. Pas de volgende gradiënt toe: 0,0–0,5 min, 95% A en 5% B; 0,5–5,5 min, lineaire gradiënt tot 50% A en 50% B; 5,5–9,0 min, lineaire gradiënt tot 5% A en 95% B; 9,0–10,5 min, 5% A en 95% B; 10,5–12,0 min, terugkeren naar 95% A en 5% B en herbalanceren
6. Koppel het vloeistofchromatografiesysteem aan een hogeresolutie massaspectrometer uitgerust met een elektrospray-ionisatiebron.
7. Verzamel gegevens in positieve en negatieve ionenmodi in afzonderlijke runs.
8. In positieve ionenmodus stel je de capillaire spanning in op 2500 V en de kegelspanning op 30 V.
9. In negatieve ionmodus stel je de capillaire spanning in op -2000 V en de kegelspanning op 25 V.
10. Stel de temperatuur van het desolvatiegas in op 500 °C, de desolvatiegasstroom op 800 L/u en de kegelgasstroom op 50 L/u.
11. Verzamel gegevens over m/z 50–1200 met een scantijd van 0,2 seconden.
12. Verkrijg tandem-massaspectrometriegegevens door gebruik te maken van lage botsingsenergie bij 0 V en hoge botsingsenergie bij 10–40 V.
13. Voer monsters uit in de volgende volgorde: Eén blanke injectie van reconstitutie-oplosmiddel; Drie opeenvolgende injecties van het gepoolde QC-monster; Alle studiemonsters met één blanco injectie en één QC-injectie na elke vijf studiemonsters; Nog één laatste kwaliteitscontrole-injectie; en Nog één laatste blankinjectie
14. Evalueer de datakwaliteit en analytische stabiliteit in beide ionenmodi door middel van pooled-QC correlatieanalyse en principal component analysis (PCA) clustering.
15. Interpreteer pooled-QC correlatiecoëfficiënten groter dan 0,8 als een aanvaardbare analytische stabiliteit over de analytische sequentie.

5. Datapreprocessing en statistische analyse

1. Importeer ruwe vloeistofchromatografie-massaspectrometriebestanden in dataverwerkingssoftware voor retentietijd-uitlijning, deconvolutie, piekuitlijning en feature-extractie (zie Materiaaltabel).
   1. Selecteer de eerste pooled-QC-injectie als aligneringsreferentie.
   2. Voer retentietijd-uitlijning, deconvolutie en piekuitlijning uit door gebruik te maken van de standaardworkflow van de geselecteerde software. Gebruik een retentietijdtolerantie van ± 0,1 minuten en een massatolerantie van ± 5 ppm.
   3. Voer peak picking uit en behoud kenmerken met een intensiteit van meer dan 1000 tellingen die aanwezig zijn in ten minste 80% van de monsters in ten minste één groep.
   4. Pas geen extra na-voorbewerkingsnormalisatie toe in een van beide ionenmodi.
   5. Exporteer de verwerkte featuretabel met m/z, retentietijd en piekoppervlaktewaarden.
   6. Log2-transformatie alle behouden piekintensiteiten.
   7. Imputeer ontbrekende waarden met een vijfde van de minimale positieve waarde voor elk kenmerk.
   8. Plaats elk kenmerk met een gemiddelde centrum en deel door zijn standaarddeviatie vóór multivariate analyse.
   9. Gebruik de getransformeerde en geschaalde matrix voor principal components analysis (PCA), partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), orthogonale partial least squares-discriminant analyse (OPLS-DA), clustering en correlatieanalyse. Gebruik de originele bewerkte feature-intensiteiten voor abundantiegrafieken.
2. Annoteer metabolieten door kenmerken te vergelijken met openbare metabolomica-databases, waaronder de Human Metabolome Database (HMDB), de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) en LIPID MAPS waar van toepassing.
   1. Beoordeel elke annotatie op precursor-ion massafout, isotoopverdeling en tandem massaspectrometriefragmentmatching. Ken maximaal 20 punten toe aan elk criterium.
   2. Pas een precursor-ion massafoutvenster van 100 ppm toe en een fragment-ion massafoutvenster van 50 ppm. Pas geen vast retentietijdvenster toe.
   3. Behou annotaties met een totaalscore van minstens 40 uit 60. Sluit annotaties met een lagere score uit.
3. Definieer vergelijkingsgroepen expliciet als volgt: A = T0 (voor het sparren), B = T1 (direct na het sparren), en C = T2 (24 uur na het sparren).
4. Voer downstream statistische analyses uit met behulp van statistische computersoftware en bijbehorende analysepakketten (zie Materiaaloverzicht).
   1. Voer een principal component analysis (PCA) uit na unit-variantie scaling en visualiseer de scoregrafieken.
   2. Bouw gedeeltelijke kleinste-kwadraten-discriminantenanalyse (PLS-DA) en orthogonale gedeeltelijk-kleinste-kwadraten-discriminantenanalyse (OPLS-DA) modellen voor A versus B, B versus C, en A versus C.
   3. Gebruik 7-voudige kruisvalidatie wanneer het steekproefnummer minstens 7 is. Als het aantal monsters kleiner is dan 7, stel dan het aantal vouwingen gelijk aan het aantal monsters.
   4. Voer 200 permutatietests uit om de validiteit van het model te beoordelen.
   5. Screenen differentiële metabolieten door de volgende drempels toe te passen: fold change (FC) ≥ 2 of FC ≤ 0,5, variabele projectiebelang (VIP) ≥ 1, en t-test P. < 0,05.
   6. Genereer vulkaangrafieken en bijbehorende statistische grafieken voor paargewijze vergelijkingen.
   7. Genereer heatmaps door gebruik te maken van de log2-getransformeerde en eenheidsvariantie-geschaalde matrix.
   8. Genereer correlatie-heatmaps met een significantiedrempel van P ≤ 0,05 en toon tot 20 metabolieten.
   9. Bepaal het optimale aantal clusters voordat k-means clustering plaatsvindt. Voer k-means clustering uit na unit-variantie scaling.
   10. Genereer abundantiebalkgrafieken uit de oorspronkelijke bewerkte feature-intensiteiten.
   11. Genereer Venn-diagrammen om overlap tussen paargewijze vergelijkingen samen te vatten.
   12. Voer een analyse van de ontvanger-operating characteristic (ROC) uit voor geselecteerde metabolieten. Evalueer de diagnostische prestaties aan de hand van het oppervlak onder de kromme (AUC).
5. Koppel differentiële metabolieten aan KEGG-routes door gebruik te maken van een verrijkingsfunctie in een geschikt bio-informaticapakket (zie Materiaaltabel).
   1. Interpreteer paden met P. < 0,05. Er werd geen meervoudige testcorrectie gerapporteerd in het definitieve analyserecord.

Resultaten

Kwaliteitscontrole (QC) validatie van LC-QTOF-MS/MS-gegevens

Om de signaalstabiliteit en reproduceerbaarheid te evalueren, werden herhaalde injecties van het gepoolde QC-monster in beide ionenmodi geanalyseerd. De Spearman-correlatiecoëfficiënten tussen pooled-QC-injecties overschreden 0,8 in beide ionenmodi, wat wijst op stabiele instrumentprestaties over de analytische sequentie. PCA van alle studiemonsters en QC-injecties toonde een strakke...

Discussie

Deze gestandaardiseerde workflow karakteriseerde metabolietveranderingen die geassocieerd worden met elite bokssparren en kortetermijnherstel in een kleine, gecontroleerde cohort. De pooled-QC-injecties, QC-gebaseerde correlatieanalyse, PCA-clustering en multivariate analyses samen ondersteunden acceptabele analytische stabiliteit. Het succes van het protocol hing voornamelijk af van vier factoren: het handhaven van de sparringintensiteit binnen 80%–85% van de maximale hartslag, het verw...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents	Acetonitrile	Merck	LC-MS grade, CAS 75-05-8
Reagents	Methanol	Merck	LC-MS grade, CAS 67-56-1
Reagents	Formic acid	TCI	LC-MS grade, CAS 64-18-6
Consumables	VACUETTE TUBE CAT Serum Clot Activator	Greiner Bio-One	8 mL serum clot activator tube
Consumables	Nalgene Cryogenic Vial	Thermo Fisher Scientific	1.5 mL, external thread
Consumables	Protein LoBind Tube	Eppendorf	Cat. No. 0030108442, 1.5 mL
Glassware	Screw-top glass vial with insert	Agilent	2 mL vial with 200 μL glass insert; insert Cat. No. 5183-2090
Consumables	Millex-GP Filter	Merck	Cat. No. SLGP033RS, 0.22 μm membrane
Instruments	Custom Boxing Ring 6x6 m	Muay Thai Sport	6 × 6 m training ring
Consumables	Pro Style 2 Boxing Gloves	Everlast	16 oz
Instruments	Polar H10	Polar	Chest-strap heart-rate sensor
Instruments	quasar	h/p/cosmos	Motorized treadmill
Instruments	Centrifuge 5425 R	Eppendorf	Refrigerated microcentrifuge
Instruments	Bransonic CPX2800	Emerson / Branson	40 kHz digital ultrasonic bath
Instruments	Savant SpeedVac SPD1030	Thermo Fisher Scientific	Integrated vacuum concentrator
Instruments	VWR Mini Vortex Mixer	Avantor / VWR	Cat. No. 10153-688
Instruments	TSX ULT Freezer	Thermo Fisher Scientific	Model TSX50086A
Instruments	ACQUITY UPLC I-Class PLUS	Waters	UHPLC system
Instruments	Xevo G2-XS QTof	Waters	QTOF mass spectrometer
Instruments	ACQUITY UPLC HSS T3 Column	Waters	P/N 176001132, 1.8 μm, 2.1 × 100 mm
Software	MassLynx	Waters	Version 4.2
Software	Progenesis QI	Waters	Version 2.3
Software	R	R Foundation for Statistical Computing	Version 3.6.1
Software	prcomp	base R	Base R function
Software	ropls	Bioconductor	R package
Software	pheatmap	CRAN	R package
Software	corrplot	CRAN	R package
Software	kmeans	base R	Base R function
Software	NbClust	CRAN	R package
Software	venn	CRAN	R package
Software	MetaboAnalystR	CRAN / Xia Lab	Version 1.0
Software	pROC	CRAN	Version 1.15.0
Software	clusterProfiler	Bioconductor	Bioconductor package
Databases	Human Metabolome Database (HMDB)	HMDB	Online database
Databases	Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)	KEGG	Online database
Databases	LIPID MAPS	LIPID MAPS	Online database