Cytokinen en inflammatoire genpolymorfismen geassocieerd met nosocomiale longinfectie na spontane intracerebrale bloeding

Samenvatting

Deze retrospectieve studie presenteert een reproduceerbare workflow voor vroege bloedafname na opname, meting van serumcytokines en Toll-achtige receptoren, genotypering van inflammatoire genpolymorfismen en infectierisicobeoordeling bij patiënten met spontane intracerebrale bloeding.

Samenvatting

Nosocomiale longinfectie is een veelvoorkomende complicatie na spontane intracerebrale bloeding en kan het neurologisch herstel verslechteren, de ziekenhuisopname verlengen en de klinische belasting vergroten. Deze retrospectieve klinisch-laboratoriumstudie presenteert een reproduceerbare workflow voor het evalueren van inflammatoire biomarker- en gastheer-immuungenetische profielen die geassocieerd zijn met nosocomiale pulmonale infectie na primaire spontane intracerebrale bloeding. Patiënten worden geclassificeerd op basis van of een nosocomiale longinfectie na opname optreedt. Perifeer veneus bloed wordt verzameld in de vroege periode na opname onder gestandaardiseerde pre-analytische omstandigheden. Serum wordt gescheiden, gealiquoteerd en opgeslagen voor enzymgekoppelde immunosorbent-assaymetingen van IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 en TLR9. Parallel wordt genomisch DNA geëxtraheerd uit anticoaguleerd volbloed en gebruikt voor polymerasekettingreactie-restrictiefragmentlengte-polymorfisme-genotypering van geselecteerde cytokine- en Toll-achtige receptorgerelateerde loci. De workflow omvat ook kwaliteitscontroleprocedures voor monsterbehandeling, dubbele ELISA-metingen, DNA-zuiverheidsbeoordeling, genotype-oproep en herhaald genotyperen. Statistische analyse omvat een vergelijking tussen groepen van klinische kenmerken en biomarkerniveaus, Hardy-Weinberg evenwichtstesten, logistische regressieanalyse voor genotype- en allelassociaties, aanpassing voor relevante klinische covariaten en correctie van valse ontdekkingspercentages voor meerdere genetische vergelijkingen. Deze gecombineerde klinische, inflammatoire en immuungenetische workflow kan helpen bij het karakteriseren van infectierisicoprofielen na spontane intracerebrale bloeding, hoewel prospectieve multicentervalidatie nog steeds vereist is voor routinematige klinische toepassing.

Inleiding

Spontane intracerebrale bloeding (ICH) is een ernstige subtype beroerte veroorzaakt door niet-traumatische ruptuur van hersenvaten en blijft een belangrijke oorzaak van neurologische dood en invaliditeit. Klinisch wordt ICH gewoonlijk geclassificeerd als primair of secundair. Primaire ICH is verantwoordelijk voor de meeste gevallen en is voornamelijk gerelateerd aan hypertensieve arteriopathie of cerebrale amyloïde angiopathie¹. Daarentegen wordt secundaire ICH geassocieerd met structurele of hematologische oorzaken, waaronder aneurysma's, arterioveneuze malformaties, de ziekte van Moyamoya en stollingsstoornissen. Hoewel ICH een kleiner deel van alle beroerte-evenementen uitmaakt dan ischemische beroerte, brengt het een onevenredig hoge kortetermijnsterfte en langetermijnfunctionele last met zich mee, 2,3,4,5.

Onder de belangrijkste complicaties in het ziekenhuis na ICH is nosocomiale longinfectie bijzonder frequent en klinisch ingrijpend. Eerdere studies hebben aangetoond dat een longinfectie bij een aanzienlijk deel van de opgenomen patiënten na een beroerte of intracerebrale bloeding kan voorkomen en geassocieerd is met langere ziekenhuisopnames, grotere medische belasting, slechtere neurologisch herstel en verhoogde sterfte ^6,7,8. Het klinische belang van deze complicatie reikt verder dan alleen het ademhalingsbeheer. Verminderd bewustzijn, verminderde slik- en hoestreflexen, immobilisatie, mechanische luchtwegondersteuning en invasieve drainageprocedures kunnen allemaal het risico op infectie tijdens de acute fase na ICH verhogen. Tegelijkertijd kan een longinfectie systemische ontstekingen verder verergeren, de zuurstofafgifte verstoren en neurokritische zorg bemoeilijken, waardoor secundaire letselprocessen worden versterkt.

Deze relatie is biologisch aannemelijk omdat ICH niet alleen een focaal cerebrovasculaire gebeurtenis is, maar ook een trigger van systemische immuunontregeling. Een acute hersenbloeding kan ontstekingscascades activeren, aangeboren immuunsignalering veranderen en het evenwicht tussen neuro-inflammatie en perifere gastheerverdediging verstoren. In deze context kunnen sommige patiënten vatbaarder worden voor ziekenhuisinfecties, zelfs onder vergelijkbare klinische behandeling. Daarom moet een longinfectie na ICH niet uitsluitend worden gezien als een gevolg van blootstelling aan het bed of ondersteunende zorg; Het kan ook verschillen weerspiegelen in ontstekingsactivatie van de gastheer en immuunrespons.

Ondanks de klinische relevantie van deze complicatie blijven praktische benaderingen voor vroege risicostratificatie beperkt⁹. Bestaande klinische risicostratificatiebenaderingen voor post-ICH longinfectie zijn over het algemeen gebaseerd op bedzijde- en opnamegerelateerde variabelen, zoals neurologische ernst, leeftijd, slikproblemen, comorbiditeiten, invasieve procedures en duur van blootstelling aan het apparaat. Deze hulpmiddelen zijn klinisch nuttig omdat ze snel kunnen worden toegepast in spoedeisende hulp, intensive care of neurokritische zorg. Klinische variabelen alleen kunnen echter niet volledig verklaren waarom patiënten met vergelijkbare neurologische ernst en vergelijkbare zorgblootstelling verschillende infectie-uitkomsten vertonen. Ontstekingsbiomarkers en immuun-genetische factoren van de gastheer kunnen daarom extra informatie geven over biologische vatbaarheid, vooral tijdens de vroege periode na opname wanneer preventieve surveillance en ademhalingsbeheer worden genomen.

Cytokinen zijn centrale mediatoren van immuun- en ontstekingsreacties, en Toll-achtige receptor (TLR)-routes spelen een sleutelrol bij het herkennen van pathogeen en de aangeboren immuunactivatie. Serumcytokine- en TLR-eiwitmetingen kunnen een momentopname geven van vroege systemische ontstekingsactivatie, terwijl geselecteerde immuungenpolymorfismen stabielere gastheerverschillen in cytokineproductie, receptorsignalering of ontstekingsregulatie kunnen weerspiegelen. In vergelijking met alleen klinische beoordeling kan een gecombineerde biomarker- en polymorfismeworkflow zowel de huidige ontstekingstoestand als de onderliggende immuunrespons van elke patiënt vastleggen. Deze aanpak is niet bedoeld om klinische beoordeling aan het bed te vervangen, maar om deze aan te vullen door laboratorium- en gastheergenetische informatie toe te voegen die kan helpen patiënten te identificeren die nauwlettende infectiesurveillance na spontane ICH nodig hebben.

Op basis hiervan stelden we de hypothese op dat patiënten met spontane ICH die nosocomiale longinfectie ontwikkelen, een duidelijk ontstekingsprofiel zouden vertonen, samen met een andere verdeling van geselecteerde immuungerelateerde genetische polymorfismen in vergelijking met patiënten die vrij van infectie blijven. Om deze hypothese te testen, analyseerde de huidige retrospectieve klinisch-laboratoriumstudie vroege serumcytokines na opname, serumeiwitniveaus van TLR2, TLR4 en TLR9, en geselecteerde inflammatoire genpolymorfismen bij patiënten met primaire spontane ICH. De workflow maakt gebruik van perifeer bloed dat is afgenomen tijdens acute ziekenhuisopname, ELISA-gebaseerde eiwitkwantificatie, PCR-RFLP-gebaseerde genotypering en statistische vergelijking tussen patiënten met en zonder nosocomiale longinfectie. Het doel was om een reproduceerbaar kader te bieden voor het karakteriseren van ontstekings- en gastheergenetische profielen die samenhangen met infectierisico, en zo eerdere herkenning van hoogrisicopatiënten in de acute ziekenhuisomgeving te ondersteunen.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Affiliated Hospital of Jiaxing University, The First Hospital of Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China (Goedkeuringsnummer 2025-LP-599). Alle procedures waarbij menselijke deelnemers betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele vereisten en de principes van de Verklaring van Helsinki. Schriftelijke geïnformeerde toestemming voor bloedafname en gegevensgebruik werd verkregen van alle deelnemers en/of hun wettelijk bevoegde vertegenwoordigers vóór de monsterafname.

Alle commerciële kits, reagentia, verbruiksartikelen, instrumenten, software, fabrikanten, catalogusnummers en belangrijke bedrijfsspecificaties die in deze workflow worden gebruikt, worden vermeld in de Materiaalkunde.

Studiescope, geschiktheid en patiëntengroepering

Deze studie werd uitgevoerd als een retrospectieve klinische cohortanalyse van patiënten met een primaire spontane intracerebrale bloeding (ICH) die werden opgenomen in het Spoed- en Intensiefcarecentrum of de Intensive Care Unit van het Affiliated Hospital of Jiaxing University, The First Hospital of Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China, tussen mei 2019 en september 2024. De diagnose ICH werd bevestigd door craniële computertomografie of magnetische resonantiebeeldvorming volgens de Chinese richtlijnen voor diagnose en behandeling van cerebrale bloeding (2019)¹⁰.

Patiënten kwamen in aanmerking als zij beeldvormingsbevestigde primaire spontane ICH hadden, binnen 3 dagen na het begin van de symptomen werden opgenomen en volledige belangrijke klinische variabelen hadden, samen met beschikbare perifere bloedmonsters voor het meten van ontstekingsbiomarkers en genetische analyse. Patiënten werden uitgesloten als zij traumatische intracraniële bloeding, secundaire ICH, een longinfectie vóór opname of binnen 48 uur na opname, ontslag tegen medisch advies in, of overlijden binnen 48 uur na opname, een voorgeschiedenis van maligniteit of auto-immuunziekte, of onvolledige sleutelklinische, laboratorium- of genotyperingsgegevens hadden. Na screening voldeden 360 patiënten aan de geschiktheidscriteria en werden ze opgenomen in de eindanalyse. Van hen ontwikkelden 180 patiënten tijdens ziekenhuisopname een nosocomiale longinfectie, en 180 patiënten niet. Patiënten werden ingedeeld in de groep pulmonale infecties of de groep zonder longinfectie op basis van of er na opname een nosocomiale pulmonale infectie was opgetreden.

Voor de definitieve groepering werden beeldvormende diagnose, opnametijd, infectietijd, beschikbaarheid van bloedmonsters en de volledigheid van klinische en laboratoriumgegevens gecontroleerd. Deze stap werd gebruikt om verkeerde classificatie te verminderen en ervoor te zorgen dat alle opgenomen gevallen volledige gegevens hadden voor klinische vergelijking, meting van ontstekingsbiomarkers en genotypering.

Definitie van nosocomiale longinfectie

Nosocomiale longinfectie werd gedefinieerd op basis van radiologisch bewijs gecombineerd met klinische criteria¹¹. Radiologische bevestiging vereiste een nieuwe of progressieve infiltratieve, consolidatieve of glas-grondlaesie op een röntgenfoto van de borst of computertomografie. Daarnaast moesten er minstens twee van de volgende criteria aanwezig zijn: lichaamstemperatuur > 38 °C, purulente ademhalingsafscheidingen, of een abnormaal perifere aantal witte bloedcellen met witte bloedcellen < 4 × 10⁹/L of > 10 × 10⁹/L.

Longinfectie aanwezig vóór opname of gediagnosticeerd binnen de eerste 48 uur na opname werd niet geclassificeerd als nosocomiale pulmonale infectie. De infectieclassificatie werd geverifieerd met behulp van radiologische rapporten, lichaamstemperatuurgegevens, documentatie van ademhalingssecreties, resultaten van perifere bloedtellingen en klinische diagnosegegevens.

Bioveiligheid en afvalverwerking

Menselijk bloed, serum en DNA afkomstig van bloed werden behandeld onder standaard bioveiligheidsniveau 2-voorzorgsmaatregelen. Laboratoriumpersoneel droeg handschoenen, laboratoriumjassen, maskers en beschermende brillen tijdens het behandelen van bloed, serum-aliquotering, ELISA-testen, DNA-extractie, PCR-voorbereiding, gelelektroforese, restrictiedigestie en UV-visualisatie. Bloedbuizen werden gecontroleerd op lekkage of breuk vóór de bewerking. Centrifugatie werd uitgevoerd met afgesloten buizen of, waar beschikbaar, afgesloten centrifugeemmers.

Scherpe voorwerpen werden onmiddellijk in goedgekeurde scherpe containers gegooid. Bloedbesmette buizen, pipetten, handschoenen, ELISA-platen en andere wegwerpbenodigdheden werden als biologisch laboratoriumafval weggegooid. Vloeibaar biologisch afval werd gedesinfecteerd volgens institutionele procedures voordat het werd afgevoerd. Agarosegels, polyacrylamidegels, kleuringsreagentia en elektroforesegerelateerde materialen werden afgevoerd volgens institutionele chemische en laboratoriumafvaleisen.

PCR-reagensvoorbereiding, toevoeging van DNA-templates, amplified producthantering, restrictiedigestie en gelelektroforese werden zo ver mogelijk gescheiden om besmetting te verminderen. Spuitresistente pipettips werden gebruikt voor PCR- en DNA-behandeling. UV-visualisatie werd alleen uitgevoerd met een beschermend schild of geldocumentatiesysteem, en directe blootstelling aan UV-licht van het oog of de huid werd vermeden.

Perifere bloedafname en monsterverwerking

Om pre-analytische variatie te verminderen, werd om 08:00 uur na opname 10 ml perifeer veneus bloed verzameld, na een nachtelijke vasten van minstens 12 uur. 5 ml bloed werd in een gewone vacuümbuis gehaald voor serumvoorbereiding, en de resterende 5 ml werd in een hepariniseerde buis voor genomische DNA-extractie genomen.

Voor de verwerking werd elke buis gecontroleerd op patiëntidentificatie, afnametijd, type buis, bloedvolume, lekkage, zichtbare stolling en grove hemolyse. Monsters met onjuiste labeling, onvoldoende bloedvolume, tube leakage of zichtbare stolling in de anticoagulated tube werden uitgesloten van downstream analyse. Het bloed in de gewone buis mocht 60 minuten bij kamertemperatuur stollen, waarna het 10 minuten bij 1.500 × g centrifugeerde bij 4 °C. De serumsupernatant werd overgebracht in steriele, laag-eiwitbindende polypropyleenbuisjes zonder de cellaag te verstoren, gealiquoteerd in 0,5 mL fracties en opgeslagen bij −80 °C tot analyse.

Monsters met zichtbare matige of ernstige hemolyse werden uitgesloten van ELISA-gebaseerde kwantificering. Licht gehemolyseerde monsters werden opgenomen en niet gebruikt voor de primaire cytokine-analyse. Monsters met zichtbare troebelheid, duidelijke lipemie, onvoldoende restvolume of herhaalde blootstelling aan vorst-dooi werden vóór het testen gemarkeerd. Geen enkele serum aliquot heeft meer dan één vries-dooicyclus ondergaan voordat de analyse werd geanalyseerd.

Cytokinekwantificatie met ELISA

Serumconcentraties van IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ en TNF-α werden gemeten met commercieel verkrijgbare menselijke sandwich ELISA-kits die gevalideerd waren voor serummonsters. Serumaliquots werden ontdooid, zachtjes gemengd en geïnspecteerd op hemolyse, troebelheid, lipemie, onvoldoende volume en vorst-dooi geschiedenis voordat ze werden geladen.

Standaarden, blancoputten en serummonsters werden in dubbele oplage geladen. Standaardcurves werden op elke plaat gegenereerd met seriële verdunningen van standaardconcentraties en een blanke regeling, volgens de instructies van de kit. De optische dichtheid werd gemeten op 450 nm, met een referentiecorrectie op 570 nm, met behulp van een gekalibreerde microplaatlezer. Concentraties werden berekend met behulp van een vier-parameter logistische curve-fitting.

Assayresultaten werden alleen geaccepteerd wanneer de standaardcurve een passend concentratie-responspatroon vertoonde, lege putten een lage achtergrond toonden en de dubbele variatiecoëfficiënt van de steekproef ≤ 10% was. Monsters met dubbele CV > 10% werden opnieuw getest van het oorspronkelijke serum aliquot wanneer voldoende volume beschikbaar was. Monsters buiten het betrouwbare standaardcurvebereik werden verdund of herhaald volgens de instructies van de kit. Platen met inconsistente standaarden, overmatige achtergrond of duidelijke randeffecten werden herhaald.

De lagere analytische detectielimieten die werden gebruikt voor dataacceptatie waren 2,0 pg/mL voor IL-1β, 1,5 pg/mL voor IL-6, 2,0 pg/mL voor IL-10, 3,0 pg/mL voor IL-17, 4,0 pg/mL voor IFN-γ en 2,5 pg/mL voor TNF-α. De definitieve cytokinewaarden werden gecontroleerd aan de hand van monsteridentificaties, plaatkaarten, dubbele uitleesrecords en aantekeningen van de monsterkwaliteit vóór statistische analyse.

Kwantificering van serum TLR2, TLR4 en TLR9 door ELISA

Serum TLR2, TLR4 en TLR9 eiwitniveaus werden gemeten met commercieel verkrijgbare menselijke ELISA-kits die gevalideerd waren voor serummonsters. Serummonsters werden ontdooid, voorzichtig gemengd en geïnspecteerd volgens dezelfde kwaliteitscriteria voor het monster als voor cytokinemetingen.

Standaarden, blanco putten en serummonsters werden dubbel geanalyseerd. Platen werden gelezen op 450 nm met referentiecorrectie op 570 nm, en concentraties werden berekend met behulp van logistische regressie met vier parameters. De resultaten werden geaccepteerd wanneer de standaardcurve geldig was, lege putten binnen het verwachte achtergrondbereik lagen en de dubbele CV ≤ 10% was. Monsters die deze dubbele CV-drempel overschreden, werden opnieuw getest wanneer er voldoende monsters over waren.

De lagere analytische detectielimieten die voor resultaatacceptatie werden gebruikt, waren 0,10 ng/mL voor TLR2, 0,12 ng/mL voor TLR4 en 0,15 ng/mL voor TLR9. De definitieve TLR2-, TLR4- en TLR9-waarden werden gecontroleerd aan de hand van steekproefidentificaties, plaatkaarten, duplicaatuitleesrecords en steekproefkwaliteitsnotities vóór statistische analyse.

Extractie van genomisch DNA

Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit heparine-anticoaguleerd volbloed met behulp van een silicakolom-gebaseerde bloedgenomische DNA-extractiekit. Voor de extractie werden antistollingsbloedmonsters gecontroleerd op correcte etikettering, voldoende volume, zichtbare stolling, lekkage en opslagconditie.

DNA-zuiverheid en concentratie werden beoordeeld met spectrofotometrie. Alleen monsters met een A260/A280-verhouding tussen 1,80 en 2,00 werden geaccepteerd voor downstream PCR-versterking. Monsters buiten dit bereik werden opnieuw gemeten na voorzichtig mengen. Als de abnormale zuiverheidsverhouding bleef bestaan, werd DNA-extractie herhaald wanneer er voldoende volbloed over was.

DNA werd verdund met nucleasevrij water tot een werkconcentratie van 50 ng/μL en opgeslagen bij -20 °C tot PCR-amplificatie. Voor de PCR-opstelling werd elk DNA-monster gecontroleerd op concentratie, zuiverheid, monsteridentificatie en vries-dooigeschiedenis.

PCR-RFLP genotypering en genotype aanroepen

Genotypering werd uitgevoerd met polymerasekettingreactie-restrictiefragmentlengtepolymorfisme (PCR-RFLP) voor IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, TNF-α-308 G/A, TLR2-196 tot 174 ins/del, TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, TLR9 rs187084, IFN-γ +874 A/T en IFN-γ +2108 A/G. Locus-specifieke primersequenties, verwachte amplicongroottes, restrictie-enzymen en genotype-specifieke verteringspatronen zijn weergegeven in Aanvullende Tabel 1.

PCR-amplificatie werd uitgevoerd in een eindreactievolume van 25 μL met 2,5 μL van 10 × buffer, 2,0 μL dNTP-mengsel van 2,5 mM elk, 1,0 μL voorwaartse primer bij 10 μM, 1,0 μL omgekeerde primer bij 10 μM, 0,25 μL Taq DNA-polymerase bij 5 U/μL, 2,0 μL genomisch DNA bij 50 ng/μL, en 16,25 μL nucleasevrij water. PCR-mastermix werd bereid in een schoon pre-PCR-gebied, en de DNA-template werd als laatste toegevoegd. Bij elke PCR-run werd een negatieve controle zonder sjabloon toegevoegd.

Het thermische profiel bestond uit een initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 35 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 30 seconden, annealing bij 58–62 °C gedurende 30 seconden afhankelijk van het primerpaar, en extensie bij 72 °C voor 30 seconden, met een laatste verlenging bij 72 °C voor 7 minuten. PCR-producten werden eerst bevestigd op 1,5% agarosegel vóór de restrictie-vertering.

PCR-versterking werd alleen geaccepteerd wanneer de verwachte ampliconband zichtbaar was, en de no-template control toonde geen versterking. Reacties met zwakke banden, niet-specifieke amplificatie, primer-dimeer interferentie of besmetting in de negatieve controle werden herhaald vanuit het oorspronkelijke DNA-sjabloon.

PCR-producten werden met de bijbehorende restrictie-endonuclease bij 37 °C 3 uur lang verteerd in een totaal verteringsvolume van 15 μL volgens de instructies van de fabrikant. Verteerde fragmenten werden opgelost op 2,5% agarosegel voor de meeste loci. De TLR2-196 tot -174 ins/del-locus werd opgelost op 8% polyacrylamide gel om fragmentdiscriminatie te verbeteren.

Restrictievertering werd alleen geaccepteerd wanneer fragmentpatronen overeenkwamen met het verwachte genotype-specifieke verteringsprofiel. Reacties met onvolledige vertering, uitgestrekte banden, onverwachte fragmentgroottes of onduidelijke scheiding werden herhaald. Banden werden zichtbaar onder ultraviolet licht na nucleïnezuurkleuring. Gelafbeeldingen werden opgeslagen met de monsteridentificatie, locusnaam, uitvoeringsdatum en gelnummer.

De toewijzing van genotypen werd onafhankelijk uitgevoerd door twee geblindeerde laboratoriumonderzoekers. Dissonante of ambigue genotype-oproepen werden beoordeeld met behulp van het oorspronkelijke gelbeeld en herhaald vanuit PCR-versterking wanneer nodig. Tien procent van de willekeurig geselecteerde steekproeven werd opnieuw genotyped voor kwaliteitscontrole, en het concordantiepercentage was 99,2%. Definitieve genotypegegevens werden pas in de analysedataset ingevoerd nadat monsteridentificaties, locusnamen, genotype-oproepen en kwaliteitscontrolegegevens waren gecontroleerd.

Statistische analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een geschikte statistische analysesoftware. De klinische, ELISA- en genotypedatasets werden samengevoegd met behulp van gedeïdentificeerde patiëntcodes. Patiëntcodes werden gecontroleerd op duplicatie, mismatch en ontbrekende waarden vóór de analyse. Er werd een complete-case-strategie gebruikt omdat alle betrokken patiënten over belangrijke klinische, inflammatoire en genotyperingsgegevens beschikten.

In een geschikte statistische analysesoftware werd de status van een longinfectie gecodeerd als groepsvariabele, waarbij de groep zonder longinfectie als referentiecategorie werd gebruikt. Continue variabelen werden eerst getest op normaliteit met behulp van de Shapiro-Wilk-test. Normaal verdeelde continue variabelen werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergeleken met behulp van de onafhankelijke steekproeven Student's t-test. Niet-normaal verdeelde continue variabelen werden gerapporteerd als medianen met interkwartielbereiken en vergeleken met behulp van de Mann-Whitney U-test. Categorische variabelen werden uitgedrukt als tellingen en percentages en vergeleken met behulp van de chi-kwadraattest of de exacte test van Fisher, indien van toepassing.

Genotypeverdelingen in de groep zonder pulmonale infectie werden geëvalueerd op Hardy-Weinberg evenwicht vóór associatieanalyse. Genotype en alleelfrequenties werden samengevat als n (%). Odds ratio's en 95% betrouwbaarheidsintervallen voor longinfectierisico werden geschat met behulp van multivariabele logistische regressiemodellen. De status van een longinfectie werd ingevoerd als afhankelijke variabele. Genotype-, allel- of biomarkervariabelen werden als onafhankelijke variabelen ingevoerd, zoals gespecificeerd voor elke analyse.

Leeftijd en geslacht werden a priori in het primaire model opgenomen. BMI, chronische obstructieve longziekte, hartziekte, lekkage van cerebrospinale vloeistof, verblijftijd van de drain en opname Glasgow Coma Scale-categorie werden gelijktijdig in het volledig aangepaste model ingevoerd omdat deze variabelen klinisch relevant waren of een basislijnonevenwicht tussen groepen vertoonden. Multicollineariteit werd beoordeeld met behulp van variantie-inflatiefactoren (VIFs), en VIFs <5,0 werden als acceptabel beschouwd.

Omdat meerdere polymorfismen werden getest, werd correctie van de Benjamini-Hochberg false discovery rate toegepast op de genetische associatieanalyses¹². P-waarden uit de genetische associatietests werden gerangschikt van kleinst naar grootst, en de gecorrigeerde significantie werd bepaald volgens de Benjamini-Hochberg-procedure. Alle tests waren tweezijdig, en P <0,05 werd als statistisch significant beschouwd, tenzij anders vermeld na meervoudige vergelijking.

De uiteindelijke output werden gecontroleerd aan de hand van de brondataset, ELISA-kwaliteitscontrolerecords, genotype-aanroeprecords en tabelwaarden vóór de opbereiding van het manuscript. De resultaten werden geïnterpreteerd als associaties in plaats van causale effecten omdat de studie een retrospectief observationeel ontwerp gebruikte.

Resultaten

Klinische indicatoren

Klinische kenmerken van de basis worden samengevat in Tabel 1. In totaal werden 360 patiënten met spontane intracerebrale bloeding opgenomen in de eindanalyse, waaronder 180 patiënten die tijdens ziekenhuisopname nosocomiale longinfectie ontwikkelden en 180 patiënten die dat niet deden. Er waren geen significante verschillen tussen groepen in leeftijd (62,4 jaar ± 6,8 jaar versus 63,6 jaar ± 7,0 jaar,

Discussie

Spontane intracerebrale bloeding (ICH) blijft een van de ernstigste subtypen van beroerte en blijft aanzienlijke last van vroege sterfte en langdurige invaliditeit veroorzaken¹³. In de klinische praktijk zijn patiënten met ICH bijzonder kwetsbaar voor complicaties in het ziekenhuis, omdat neurologisch letsel de luchtwegbescherming kan verzwakken, de effectiviteit van hoesten kan verminderen, de mobiliteit kan beperken en de blootstelling aan invasieve ondersteunen...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Human TNF-α ELISA Kit	Invitrogen / Thermo Fisher Scientific	KHC3011	ELISA-kit voor kwantitatieve meting van humaan TNF-α in serum.
Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit	Sigma-Aldrich / Merck	RAB0744-1KT	96-wells ELISA-kit voor meting van humaan TLR2 in serum- of plasmamonsters.
Human TLR4 ELISA Kit, colorimetrisch	Novus Biologicals / Bio-Techne	NBP3-11807	Colorimetrische sandwich ELISA-kit voor meting van humaan TLR4 in serum, plasma of andere biologische vloeistoffen.
Human TLR9 ELISA Kit, colorimetrisch	Novus Biologicals / Bio-Techne	NBP2-76574	Colorimetrische ELISA-kit voor meting van humaan TLR9 in serummonsters.
Absorbance microplate reader	Agilent BioTek	800 TS	Microplate reader voor ELISA optische dichtheidsmeting bij 450 nm met referentiecorrectie bij 570 nm.
QIAamp DNA Blood Mini Kit	QIAGEN	51104	Op silicamembraan gebaseerde kit voor genomische DNA-extractie uit geanticoaguleerd volbloed.
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Microvolumespectrofotometer voor DNA-concentratie en A260/A280-zuiverheidsbeoordeling.
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermische cycler gebruikt voor endpoint PCR-amplificatie bij PCR-RFLP-genotypering.
PCR Master Mix, 2X	Thermo Scientific	K0171	Voorgemixt PCR-reagens dat Taq DNA-polymerase, dNTP's, MgCl2 en reactiebuffer bevat; gebruikt voor conventionele PCR-amplificatie.
Recombinant Taq DNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0401	Alternatieve enzymbron voor locus-specifieke PCR-reacties wanneer afzonderlijke PCR-componenten worden gebruikt in plaats van 2X mastermix.
Nuclease-vrij water	Thermo Scientific	R0581	Moleculair-biologiekwaliteitswater gebruikt voor PCR-opzet, DNA-verdunning en sjablonenvrije controles.
Aangepaste DNA-primers	Sangon Biotech	Aangepaste synthese	Locus-specifieke primers voor PCR-RFLP-genotypering; primersequenties staan vermeld in Aanvullende Tabel S1.
Restrictieneukleasen voor PCR-RFLP	Thermo Scientific / New England Biolabs	Locus-specifieke enzymen vermeld in Aanvullende Tabel S1	Restrictieneukleasen gebruikt voor genotype-specifieke digestie van PCR-producten. Het voor elk locus geselecteerde enzym moet overeenkomen met het in Aanvullende Tabel S1 vermelde digestiepatroon.
Agarose I, moleculair-biologiekwaliteit	Thermo Scientific	17850	Agarose voor bereiding van 1,5% en 2,5% gels gebruikt om PCR-producten te bevestigen en de meeste RFLP-fragmenten op te lossen.
GeneRuler 50 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0371	DNA-maatstaf voor PCR-amplicons en schatting van RFLP-fragmentgrootte.
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen / Thermo Fisher Scientific	S33102	Nucleïnezuurgelkleurstof voor visualisatie van DNA in agarose- of acrylamidegels; gebruikt als een risicoreducerende alternatief voor ethidiumbromide.
Horizontaal agarose gelelektroforesesysteem	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT systeem / 1704360 basis	Elektroforesesysteem voor agarose gelscheiding van PCR- en RFLP-producten.
Verticaal PAGE-elektroforesesysteem	Bio-Rad	Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001	Vertikaal elektroforesesysteem voor 8% polyacrylamide gelscheiding wanneer hogere resolutiefragmentdiscriminatie vereist is.
Gel documentatiesysteem met UV- of blauw-lichttransverlichting	Bio-Rad / gelijkwaardig laboratoriumsysteem	Gel Doc XR+ of gelijkwaardig	Beeldvormingssysteem voor het documenteren van gekleurde DNA-banden na gelelektroforese. Gebruik UV-bescherming of blauw-lichtmodus waar beschikbaar.
Gekoelde centrifuge	Eppendorf / gelijkwaardige laboratoriumcentrifuge	5424 R of gelijkwaardig	Gekoelde centrifuge gebruikt voor serumscheiding bij 1.500 × g en 4 °C.
−80 °C ultra-lage temperatuurvriezer	Thermo Scientific / gelijkwaardige laboratoriumvriezer	Forma 900 Serie of gelijkwaardig	Opslag van serumfracties vóór ELISA-analyse.
IBM SPSS Statistics	IBM	Versie 25.0	Statistisch software gebruikt voor beschrijvende statistieken, normaliteitstest, groepsvergelijkingen, logistieke regressie en modeluitvoer-export.
Spreadsheetsoftware	Microsoft	Excel voor Microsoft 365	Gebruikt voor gegevenscontrole, platenmaporganisatie, duplicaatwaardencontrole en voorbereiding van samengevoegde analysebestanden vóór SPSS-analyse.