Methodenartikel

Microvasculaire perfusie gemonitord met laserspeckle contrastbeeldvorming tijdens nierischemie - reperfusieschade bij muizen

DOI:

10.3791/70762

⸱

27 februari 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital & Cardiovascular Research Center, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een laser-speckle contrast beeldvormingssysteem werd gebruikt om de veranderingen in de microvasculaire bloedstroom van de nier te monitoren tijdens unilaterale nierischemie-reperfusie na de resectie van de rechternier bij muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laser speckle contrast imaging (LSCI) is een niet-invasieve techniek om oppervlakkige bloedperfusie over grote gebieden te meten. Met zijn hoge ruimtelijke temporele resolutie kwantificeert LSCI heterogene bloedstroomveranderingen over verschillende regio's binnen het afgebeelde gebied semi-kwantificeert. Hier demonstreren we de techniek van LSCI om de bloedstroom te registreren tijdens unilaterale nierischemie-reperfusieschade (IRI) bij muizen. Na de rechternefrectomie werden de positie van de muis en het brandpunt van het doel van het LSCI-systeem aangepast om ervoor te zorgen dat de linkernier in het gezichtsveld was. LSCI-scans werden uitgevoerd voor, tijdens en na de ischemie van de nier. Bovendien werd door het selecteren van interessegebieden (ROI's) de bloedstroom in de regio's gelijktijdig gemonitord. De methode van LSCI visualiseert microvasculaire perfusie van de nier en maakt een realtime mapping van de bloedstroom mogelijk. Het kan worden gebruikt om de microvasculaire bloedstroom te monitoren en het effect van een interventie op de reperfusiekinetiek en ruimtelijke homogeniteit tijdens muisrenale IRI of andere vergelijkbare diermodellen te evalueren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ischemie-reperfusieschade (IRI) is een van de belangrijkste oorzaken van acute nierschade (AKI), die geassocieerd wordt met een hoge morbiditeit en hoge sterfte bij patiënten 1,2. De verandering van de nierhemodynamica is een van de cruciale factoren van IR-geïnduceerde AKI1. Door IR-veroorzaakte microcirculatiestoornissen zijn een belangrijke oorzaak van het ontstaan van letsel, wat leidt tot zuurstoftekort en mitochondriale disfunctie van cellen 3,4. Daarom is het monitoren van veranderingen in de bloedstroom in realtime een effectieve methode om succesvolle ischemie of reperfusie van de nier te waarborgen en de mate van IRI in diermodellen voor de aandoening te beoordelen.

Er zijn meerdere technieken om de microvasculaire perfusie van weefsels te meten, waaronder laser Doppler flowmetry (LDF)5, nicotinamide adenine-dinucleotide dehydrogenase (NADH) autofluorescentiebeeldvorming 6,7,8, infraroodbeeldvorming9 en indocyanine green (ICG) angiografie10. Onder deze methoden meten infraroodbeeldvorming en NADH-autofluorescentiebeeldvorming indirect de microvasculaire perfusie. LDF, met behulp van een optische sonde, monitort alleen de regionale bloedstroom5, en het scannen van LDF is niet snel genoeg om de realtime veranderingen van weefselmicrovasculaire perfusie onder I/R-conditieste monitoren. ICG-angiografie kan ook geblokkeerde niervatenidentificeren 10, maar vereist de toediening van een contrastmiddel, dat het gebruik beperkt tot een beperkt aantal metingen12. Laser speckle contrast imaging (LSCI) is een efficiënte niet-invasieve methode om niermicroperfusie in realtimete monitoren. Het is gebruikt om ruimtelijk opgeloste informatie te genereren die verband houdt met de bloedstroomdynamiek. Wanneer een coherente bundel op een ruw oppervlak wordt gespoten, zullen de gereflecteerde of verstrooide lichtgolven elkaar interfereren door kleine padverschillen, waardoor een willekeurige verdeling van heldere en donkere vlekken ontstaat, bekend als "speckle". LSCI brengt de snelheid van de bloedstroom in oppervlakkige weefsels in kaart door de mate van wazigheid van de "dynamische speckle" te analyseren die ontstaat wanneer laserlicht het weefsel bestraalt 12,14,15. In deze studie werkte het LSCI-systeem op een lasergolflengte van 785 nm met een ruimtelijke resolutie van 3 μm, een gezichtsveld dat instelbaar was tussen 6,3 mm × 4,7 mm en 42 mm × 31 mm, en een beeldsnelheid tot 120 beelden per seconde, wat een hogeresolutie, realtime mapping van corticale microvasculaire perfusie mogelijk maakte. Gezien deze voordelen is LSCI toegepast in diverse experimentele en klinische contexten voor het monitoren van de bloedstroom, waaronder brandwonden16, retinale perfusie17, cerebrale bloedstroom18, slokdarm19 en darm20.

Het moet worden opgemerkt dat LSCI voornamelijk perfusie in oppervlakkig weefsel beoordeelt, relatieve in plaats van absolute stromingswaarden geeft, en beïnvloed kan worden door optische eigenschappen van weefsels en bewegingsartefacten. Deze inherente kenmerken worden meegenomen bij het interpreteren van de beeldgegevens.

Dit werk, waarbij een model werd gebruikt met een rechternefrectomie om blootstelling en beeldvorming van de contralaterale nier te faciliteren, monitorde de veranderingen in microvasculaire perfusie vóór, tijdens en na de ischemie in een unilateraal renaal I/R-muismodel met behulp van LSCI en toonde de ruimtelijke heterogeniteit van de bloedstroom aan het oppervlak van de nier aan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures voldeden aan de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Shantou University Medical College. Om geslachts- en stamgebaseerde verschillen in IRI-effecten te elimineren, werden in de studie alleen mannelijke C57BL/6N-muizen gebruikt. Alle muizen waren qua leeftijd en gewicht op elkaar afgestemd om vergelijkbare resultaten te behalen. Er werd een steekproefgrootte van n = 5 gebruikt, in overeenstemming met eerdere methodologische studies waarbij LSCI werd gebruikt voor technische validatie21. De dieren kregen humane zorg en werden na de experimenten geëuthanaseerd door middel van CO2-inademing. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

Zet voordat je met de operatie begint het laser-speckle contrast imagingsysteem aan. Het systeem dat in deze studie wordt gebruikt, werkt met een laser van 785 nm. Stel de werkafstand in op ongeveer 15-20 cm boven het operatieveld. Het systeem berekent de bloedstroom in Laser Speckle Perfusion Units (LSPU) op basis van het ruimtelijk contrastalgoritme. Zorg ervoor dat het instrument warm en stabiel is voordat je verder gaat.

1. Diervoorbereiding en laparotomie

  1. Steriliseer de operatietafel voor elke ingreep. Bereid alle benodigde materialen voor en plaats ze (gesteriliseerde instrumenten en wattenstaafjes, gaas, voorverdunde verdundingsmiddelen, warmtekussen, vaatklem, zoutoplossing, depilatiecrème, wattenbolletjes, hechtingen, huidantiseptica en hechtingen) op de operatietafel.
  2. Dien meloxicam (0,2 mg/kg lichaamsgewicht; subcutane injectie) 30 minuten van tevoren toe aan de muis om de pijn te verlichten.
  3. Giet een bepaalde hoeveelheid gesteriliseerde zoutoplossing in een schoon bakje. Neem dan een stuk gaas en snijd een geschikte opening in het midden uit.
  4. Verdoof een muis door intraperitoneale injectie van 2,5% tribromoethanol (400 mg/kg lichaamsgewicht; voorheen verdund in steriele zoutoplossing).
    OPMERKING: Tribromoethanol werd als anestheticum gebruikt tijdens het proces van de rechternefrectomie. En 1% isofluraan werd gebruikt voor anesthesie tijdens langdurige procedures van het monitoren van de bloedstroom.
  5. Leg de muis met tape op het verwarmingskussen en gebruik ontharingscrème om het haar uit de buik van de muis te verwijderen. Gebruik tijdens de operatie het verwarmingskussen om de rectale temperatuur op 37 °C ± 0,5 °C te houden.
  6. Desinfecteer de huid in het operatiegebied eerst met 75% alcohol en daarna met jodoforen met een wattenstaafje.
  7. Gebruik een tang om de teen van de muis te knijpen. Zodra de muis geen pijnrespons vertoont, maak je een verticale incisie langs de middenlijn van de buik met een schaar. Verwijder voorzichtig de huid van het buikvliezen, snijd vervolgens het buikvlies open en ga in de buikholte terecht.
  8. Pas een retractor aan op de muis om de zichtbaarheid te optimaliseren en bedek het operatieveld met gaas, terwijl je de opening tussen het gaas uitlijnt met de buikholte, en bevochtig het met zoutoplossing.

2. Rechternefrectomie

  1. Gebruik een wattenstaafje om de darm voorzichtig naar één kant van het gaas te duwen, waardoor de rechternier en het omliggende weefsel zichtbaar worden. Vouw het gaas om de darm te bedekken en bevochtig deze met gewone zoutoplossing om te voorkomen dat de darm uitdroogt.
  2. Gebruik een schuine pincet om de rechter ureter op te tillen. Steek twee 6-0 hechtdraadjes door de ureter en voer ligatie uit op twee posities.
  3. Snijd de ureter tussen de twee ligaturen met behulp van een microschar.
  4. Na het bevochtigen van de wattebolletjes met gewone zoutoplossing, gebruik fijne pincetten om de wattenbolletjes op te pakken, duw de lever voorzichtig omhoog en fixeer deze met de wattenbolletjes om de nieren en bloedvaten aan hun rechterkant bloot te leggen.
  5. Gebruik een schuine tang om de vetkussentjes van het perinefricum langs de zijkant van de rechternier stomp te scheiden totdat de nierslagader en ader volledig blootliggen.
    OPMERKING: Scheid tegelijkertijd de massa bijnierweefsel boven de nier.
  6. Schuif voorzichtig schuine pincetten onder de nierslagader en -ader om een kanaal te creëren. Vervolgens breng je een 6-0 zijden gevlochten hechting om de vaten om ze aan elkaar te binden.
  7. Snijd de afgesloten nierslagader en ader dicht bij de nier door. Verwijder de nier samen met het resterende aanhechtende weefsel.
  8. Verwijder de wattenbolletjie die de lever vasthoudt.

3. Monitoring van de nierbloedstroom met Laser Speckle Contrast Imaging (LSCI) tijdens ischemie-reperfusie

  1. Zet het LSCI-systeem en de speciale software van het instrument aan.
  2. Klik op Originele afbeelding en Preview om de rauwe, onbewerkte afbeelding van het operatieveld te bekijken.
  3. Verander de positie van de muizen, houd de anesthesie met 1% isoflurane toegediend met 600 mL/min via een neuskegel, en pas de vergroting van de camera aan terwijl je het originele beeld bekijkt om een helder zicht op de doelnier te krijgen.
  4. Klik op Simultaan Weergeven om het realtime bloedstroombeeld te bekijken. Stel de vergroting in op 2,5× en selecteer Automatische Bloedstroomaanpassing om het beeld te optimaliseren. Vergrendel vervolgens de bloedstroomparameters. Stel daarnaast in dat elke 5000 ms één frame van de foto wordt opgenomen.
    OPMERKING: Natte wattenbolletjes kunnen worden gebruikt om de stabiele positie van de nier te waarborgen en de omliggende organen en weefsels ervan te houden, waardoor het onderscheid tussen het niergebied en de achtergrond wordt versterkt.
  5. Stel de grootte van de parameters van het vierkante oppervlak in op 112 en rangschik de 5 vierkante oppervlakken uniform in een vaste oriëntatie in het nierbeeld. Klik op Real-time Beeldregistratie en Record om bloedstroomgegevens te registreren.
    OPMERKING: De machine registreert automatisch de laser speckle perfusie-units (LSPU), die de realtime bloedstroom-eenheden in de ROI's weergeven en gebruikt kunnen worden voor analyses. Tijdens het detectieproces kunnen ademhalingsgerelateerde bewegingen of omgevingsveranderingen ervoor zorgen dat het gezichtsveld verschuift. Als het systeem dit aangeeft in het detectiegebied, moet de huidige opname worden gestopt. Klik vervolgens op Real-time Image Registration en neem opnieuw op.
  6. Na het registreren van een 30 minuten baseline, scheid het vetweefsel rondom de linker niervaten. Gebruik de hemostatische tang om een microklem vast te pakken en deze over de linker nierslagader en -ader bij het hilum te plaatsen. Blijf nog 30 minuten in realtime monitoren.
  7. Laat de microclamp los om reperfusie te starten. Monitor en registreer het realtime herstel van de microvasculaire bloedstroom van de nier.
  8. Zodra de bloedtoevoer minstens 60 minuten is gemonitord, stop je met het monitoren en hecht je de buikincisie met een 7-0 zijden gevlochten hechting.

4. Postoperatief herstel en zorg

  1. Geef vocht met een intraperitoneale injectie van 1 ml zoutoplossing om uitdroging na de operatie te voorkomen.
  2. Houd de muizen op het warmtekussen. Houd muizen zorgvuldig in de gaten totdat ze weer bij bewustzijn zijn, alert lijken en zichzelf kunnen herstellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel was bedoeld om veranderingen in de nierbloedstroom tijdens door IR-geïnduceerde AKI te detecteren. Daarom gebruikten we een veelgebruikt muismodel waarbij een rechternefrectomie wordt uitgevoerd (Figuur 1A) gevolgd door een IR-procedure op de contralaterale nier (Figuur 1B). Omdat realtime monitoring van de bloedstroom tijdens IRI vereist was, werden alle manipulaties op de muizen gedurende het hele proces uitgevoerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk beschrijft de toepassing van een LSCI-systeem voor de realtime, hoogresolutie visualisatie van de renale microvasculaire bloedstroomdynamiek tijdens IRI bij muizen. Het protocol biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van traditionele eindpuntmetingen of methoden met beperkte ruimtelijke resolutie, zoals LDF, door een tweedimensionale perfusiekaart te bieden die regionale heterogeniteit binnen de niermicrocirculatie vastlegt. De efficiëntie en bruikbaarheid van LSCI voor int...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door het Innovative Team Research Program voor Universiteiten van de provincie Guangdong (2022KCXTD009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absorber canister (for anesthesia)Shenzhen Laiyue Biotech Co., Ltd, China10-0210
Alcohol, medical (75%)HENGLIYA, Xinjiang, ChinaN/AHuiddesinfectiemiddel
Anesthetic vaporizerMidmarkhttps://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
WattenstaafjesQingdao Hainuo Biological Engineering Co., Ltd, Chinahttps://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
Depilatoire crèmeVEEThttps://www.veet.com.cn/jingchun/whx
GaasverbandWinner Medical Co., Ltd, Shenzhen, Chinahttps://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
VerwarmingskussenRenqiu Dingsheng Heating Equipment Co., Ltd, ChinaHD-1902Voor het handhaven van lichaamstemperatuur
IodofooroplossingTaixinkang, Jinxian, Chinahttps://www.11467.com/nanchang/co/120661.htmHuid-antisepticum
IsofluraanRWD Life Science Co., Ltd, ChinaR510-22-10Inhalatieanestheticum
Laser speckle contrast beeldvorming (LSCI) systeemHubei Xunwei Optoelectronic Technology Co., Ltd, ChinaSIM BFI HR PROMoorFLPI-2 equivalent systeem
MeloxicamQilu Animal Health Products Co., Ltd, Chinahttps://en.qiludb.com/companion_animal/500.html0,2 mg per kg lichaamsgewicht; pijnstiller
Micro-klemShanghai Medical Instrument(Group) Co., Ltd, ChinaW40140Vasclere klem
Normale zoutoplossing (0,9% natriumchloride)Cisen Pharmaceutical Co., Ltd, Chinahttps://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62
Zijde gevlochten hechtdraad (6-0)Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd, Chinahttp://www.fdma.com.cn/products_detail/12.htmlVoor vaatligatie
Zijde gevlochten hechtdraad (7-0)Wego Terumo (Weihai) Medical Products Co., Ltd, Chinahttps://www.weigaoholding.com/Voor wondsluiting, niet-absorbeerbare chirurgische hechtingen met de gebogen naald
Spuit (1 mL)Shandong Ande Healthcare Apparatus Co., Ltd, Chinahttps://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.htmlMet 26 G naald
TribromoethanolSigma-AldrichT48402-100G2,5% oplossing; injecteerbaar anestheticum
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. Renal ischaemia-reperfusion injury. Br J Surg. 83 (2), 162-170 (1996).
  2. Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. Acute renal failure: Definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy. J Clin Invest. 114 (1), 5-14 (2004).
  3. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  4. Legrand, M., Mik, E. G., Johannes, T., Payen, D., Ince, C. Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney. Mol Med. 14 (7-8), 502-516 (2008).
  5. Zhu, X., et al. Ischemic preconditioning prevents in vivo hyperoxygenation in postischemic myocardium with preservation of mitochondrial oxygen consumption. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1442-H1450 (2007).
  6. Coremans, J. M. C. C., et al. Pretransplantation assessment of renal viability with NADH fluorimetry. Kidney Int. 57 (2), 671-683 (2000).
  7. Fitzgerald, J. T., Demos, S., Michalopoulou, A., Pierce, J. L., Troppmann, C. Assessment of renal ischemia by optical spectroscopy. J Surg Res. 122 (1), 21-28 (2004).
  8. Raman, R. N., Pivetti, C. D., Matthews, D. L., Troppmann, C., Demos, S. G. A non-contact method and instrumentation to monitor renal ischemia and reperfusion with optical spectroscopy. Opt Express. 17 (2), 894(2009).
  9. Gorbach, A. M., et al. Assessment of critical renal ischemia with real-time infrared imaging. J Surg Res. 149 (2), 310-318 (2008).
  10. Ietto, G., et al. Indocyanine green angiography for quality assessment of the kidney during transplantation: An outcome predictor prospective study. Transplant Proc. 53 (6), 1892-1896 (2021).
  11. Bezemer, R., et al. Real-time assessment of renal cortical microvascular perfusion heterogeneities using near-infrared laser speckle imaging. Opt Express. 18 (14), 15054(2010).
  12. Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Ann Biomed Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
  13. Heeman, W., et al. Real-time visualization of renal microperfusion using laser speckle contrast imaging. J Biomed Opt. 26 (05), 056004(2021).
  14. Briers, J. D. Laser speckle contrast analysis (LASCA): A nonscanning, full-field technique for monitoring capillary blood flow. J Biomed Opt. 1 (2), 174(1996).
  15. Boas, D. A., Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging in biomedical optics. J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2010).
  16. Stewart, C. J., et al. A comparison of two laser-based methods for determination of burn scar perfusion: Laser Doppler versus laser speckle imaging. Burns. 31 (6), 744-752 (2005).
  17. Tamaki, Y., Araie, M., Kawamoto, E., Eguchi, S., Fujii, H. Noncontact, two-dimensional measurement of retinal microcirculation using laser speckle phenomenon. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (11), 3825-3834 (1994).
  18. Kazmi, S. S., Richards, L. M., Schrandt, C. J., Davis, M. A., Dunn, A. K. Expanding applications, accuracy, and interpretation of laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (7), 1076-1084 (2015).
  19. Ambrus, R., et al. Evaluation of gastric microcirculation by laser speckle contrast imaging during esophagectomy. J Am Coll Surg. 225 (3), 395-402 (2017).
  20. Knudsen, K., et al. Laser speckle contrast imaging to evaluate bowel lesions in neonates with NEC. Eur J Pediatr Surg Rep. 5 (1), e43-e46 (2017).
  21. Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neurosci. 23 (1), 80(2022).
  22. Hren, R., Brezar, S. K., Marhl, U., Sersa, G. Laser speckle contrast imaging of perfusion in oncological clinical applications: A literature review. Radiol Oncol. 58 (3), 326-334 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Laser speckle imagingbloedstroommonitoringmuisnierreal time imagingrenale microcirculatiedierchirurgie

Gerelateerde artikelen