$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Deze studie werd goedgekeurd door de Wetenschappelijke Ethische Commissie van de Concepción Gezondheidsdienst. Menselijk botweefsel werd verkregen uit femorale koppen die werden gedoneerd door patiënten die een heupvervangingsoperatie ondergingen in het Traumatologieziekenhuis van Concepción, Chili, na schriftelijke geïnformeerde toestemming. Monsters werden bewaard bij −80 °C tot gebruik. Alle procedures voldeden aan institutionele richtlijnen voor het ethisch gebruik van menselijk weefsel in onderzoek. Al het menselijk botweefsel werd verkregen van femorale hoofden die door patiënten in het Traumatologisch Ziekenhuis van Concepción, Chili, werden gedoneerd, na geïnformeerde toestemming en met goedkeuring van de Wetenschappelijke Ethische Commissie van de Concepción Gezondheidsdienst. Alle procedures voldoen aan de institutionele richtlijnen voor het gebruik van menselijk weefsel.
1. GelMA-synthese
- Los 10 g type A gelatine A op in 100 mL fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS, pH 7,5) bij 60 °C onder constant roeren.
- Verlaag de temperatuur tot 50 °C en voeg 5 mL methacrylanhydride toe met een snelheid van 0,5 mL/min door voorzichtig te roeren gedurende 1–3 uur.
- Verdun het reactiemengsel 5× met PBS dat voorverwarmd is bij 40 °C om de reactie te stoppen.
- Dialyseer de oplossing met een membraan van 12–14 kDa tegen 3–5 L gedestilleerd water bij 40 °C gedurende 5–7 dagen, waarbij het water dagelijks wordt vervangen.
OPMERKING: (Kritieke stap) Zorg voor een volledige dagelijkse watervervanging om niet-gereageerde methacrylanhydride te verwijderen.
- Lyofiliseer de gedialyseerde oplossing gedurende 24 uur en bewaar de gelyofilieerde GelMA bij 4 °C tot gebruik.
2. GelMA hydrogel-bereiding
- Bereid 10 mL batches GelMA hydrogels voor op 5, 10 of 15 w/v%.
- Los 0,5, 1,0 of 1,5 g gelyofilieerd GelMA op in 9,5 mL gedeïoniseerd water bij 50 °C.
- Koel de oplossing af tot 37 °C.
- Voeg 0,5 mL Irgacure 2959 fotoinitiatoroplossing toe (0,5 w/v% in absolute ethanol).
- Meng voorzichtig en houd de oplossing op 37 °C tot steriele filtratie via een 0,22 μm cellulose-acetaat membraanfilter.
3. Botdecellularisatie
- Ontdooi de dijbeenkoppen geleidelijk tot 25 °C. Snijd elk dijbeen doormidden en vervolgens in kleinere stukken.
- Dompel stukken onder in steriel gedestilleerd water bij 60 °C en sonicateer 15 minuten (40 kHz, continu).
- Was monsters in 300 ml gedestilleerd water dat voorverhit is op 60 °C terwijl je op 200 rpm schudt, gedurende 5 minuten.
- Centrifugeer op 1850 × g gedurende 15 minuten bij 25 °C. Herhaal de was- en centrifugestappen drie keer.
- Steriliseer het weefsel door sonicatie (40 kHz, continu) gedurende 10 minuten bij 60 °C in een oplossing die 3% waterstofperoxide en 0,02% peroxyazijnzuur bevat.
- Breng het weefsel over naar 300 mL 70% ethanol en sonicateer (40 kHz, continu) gedurende 10 minuten bij 21 °C.
- Was de monsters twee keer met 300 mL gedestilleerd water, schud op 200 rpm gedurende 10 minuten op 60 °C, en centrifugeer op 1850 × g gedurende 15 minuten bij 25 °C.
- Eerst vries je het bot voor op -80 °C gedurende 4 uur, en vries je vervolgens het gedecellulariseerde bot 24 uur in een brede basis om gelijkmatige droging te garanderen en om te voorkomen dat de monsterhoogte bij 0,05 mbar bij -40 tot -60 °C wordt overdreven.
OPMERKING: (Kritieke stap) Zorg ervoor dat het monster niet hoger wordt dan 2–3 cm in de container om onvolledige lyofilisatie te voorkomen.
4. Voorbereiding van botmicrodeeltjes
- Plaats de gedecellulariseerde botfragmenten in 250 mL Erlenmeyer-kolven in de sterilisatieoplossing en homogeniseer met een homogenisator totdat een uniforme witte oplossing is verkregen (Aanvullende Video 1).
- Centrifugeer op 1850 × g gedurende 15 minuten bij 25 °C, gooi het supernatant weg en was de pellet twee keer met 300 mL gedestilleerd water bij 25°C onder schudding bij 200 rpm gedurende 10 minuten. Voer een laatste centrifugatie uit op 1850 × g gedurende 15 minuten bij 25 °C.
- Lyofiliseren (0,05 mbar bij -40 tot -60 °C) het resulterende materiaal gedurende 48 uur en bewaren bij -80 °C tot gebruik.
- Maal mechanisch het gelyofilieerde corticale of medullaire bot met een gesteriliseerde keramische mortel totdat fijn poeder is verkregen (Figuur 1).
- Laat het poeder door een gaas of zeef van 200 μm gaan, weeg het uiteindelijke materiaal en bewaar het bij -80 °C.
OPMERKING: (Kritieke stap) Zorg ervoor dat het poeder volledig droog is voordat je zeft, om aggregatie en onnauwkeurige selectie van de deeltjesgrootte te voorkomen.
Aanvullende video 1: Bothomogenisatieprocedure. Homogenisatie van gedecellulariseerde botfragmenten met behulp van een homogenisator totdat een uniforme witte suspensie is geproduceerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur 1: Botmicrodeeltjesvoorbereiding. (A) Gedecellulariseerde botfragmenten na homogenisatie met OV5-homogenisator en opslag bij -80 °C. (B,C) Gesteriliseerde keramische mortel gebruikt om gedecellulariseerd bot tot een fijn poeder te malen. (D) Definitieve gedecellulariseerde botmicrodeeltjes na zeef. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Botgelfabricage
- Bereid 10 met v% GelMA door 1 g GelMA op te lossen in 9,5 mL gedeïoniseerd water bij 50 °C.
- Koel de oplossing af tot 37 °C en voeg Irgacure 2959 fotoinitiatoroplossing toe.
- Houd de oplossing op 37 °C en voer steriele filtratie uit met een 0,22 μm-filter.
- Voeg gedecellulariseerde botmicrodeeltjes (DBMP) toe met 1% w/v.
- Meng en pipetteer voorzichtig op en neer, zonder belletjes te creëren, bij 40 °C totdat er een homogene suspensie is verkregen om botgel (BG) te vormen.
- Bewaar de bloedsuiker tot 2 weken op 4 °C.
OPMERKING: (Kritieke stap) Houd de hydrogel boven de geleringstemperatuur (≥37 °C) vóór celincorporatie om voortijdige stolling te voorkomen.
6. Osteocyten primaire kweek
- Beenmergextractie en eerste wasbeurt
- Verwijder en maal beenmergweefsel uit het binnenste van het femorale hoofd met steriele chirurgische instrumenten (Figuur 2).
- Breng het gehakte weefsel over in een steriele petrischaal.
- Was het weefsel drie keer met α-MEM kweekmedium aangevuld met antibioticum-antimycoticum oplossing (100 μg/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 0,25 μg/mL amfotericine).
- Spoel één keer af met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
OPMERKING: (Kritieke stap) Minimaliseer de tijd tussen weefselwinning en verwerking om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
- Enzymatische vertering
- Incubeer het weefsel in collagenase Type I oplossing gedurende 25 minuten bij 37 °C met zachte beweging.
- Was met HBSS.
- Herhaal stappen 6.2.1–6.2.2 nog twee keer (drie totale collagenase-verteringsprocessen).
- Incubeer het weefsel in 0,5 mM ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA) gedurende 25 minuten bij 37 °C.
- Was met HBSS en herhaal de EDTA-stap nog twee keer.
- Voer een laatste collagenase Type I digestie uit (25 minuten bij 37 °C), gevolgd door een HBSS-was.
OPMERKING: (Probleemoplossing) Onvolledige vertering kan leiden tot een lage celopbrengst; verleng de enzymatische incubatie indien nodig met 5–10 minuten.
- Celherstel en kweek
- Verzamel de collagenase-oplossing en breng de uiteindelijke HBSS-wash over in een 50 mL centrifugebuis.
- Centrifugeer op 1.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in 2 mL volledige α-MEM.
- Zaad de celsuspensie in twee T75-kweekflesjes en incubeer bij 37 °C met 5% CO₂.
OPMERKING: Vervang het kweekmedium elke 2–3 dagen totdat voldoende confluentie is bereikt (Figuur 3).
Figuur 2: Onttrekking van beenmergweefsel. (A) Femorale kop verkregen bij heupvervanging, met het medullaire gebied dat wordt gebruikt voor celisolatie. (B) Gehakte medullaire botstukken in een steriele petrischaal geplaatst vóór enzymatische spijsvertering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Primaire osteocytenkweek. Osteocyten hechten zich en vermenigvuldigen zich in een monolaag binnen een T75 na isolatie van het menselijk medullaire bot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. 3D celkweek
- Verwarm de hoeveelheid BG hydrogel voor op 37 °C.
OPMERKING: (Kritieke stap) Zorg ervoor dat het werkgebied vrij is van tocht; Afkoeling versnelt voortijdige gelering.
- Koppel gekweekte osteocyten en centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 minuten in een buis van 15 mL.
- Sussen de pellet opnieuw in 200 μL kweekmedium en meng met de BG-hydrogel om een eindceldichtheid van minstens 1000 cellen/μL te verkrijgen (vanaf nu bioinkt genoemd).
- Aspireer 50 μL van de bioinkt met een pipet van 1000 μL en houd deze op 37 °C tot afzetting.
- Pipetteer 50 μL van de bioinkt per constructie in elke put van de kweekplaat (Aanvullende Video 2); laat ongeveer 5 minuten toe voor fysieke gelatie bij kamertemperatuur (Figuur 4).
- Blootstel elke put aan 365 nm UV-licht gedurende 1 minuut om onomkeerbare crosslinking (0,30 J/cm2) te bereiken.
- Voeg kweekmedium toe en incubeer de constructies bij 37 °C, 5% CO2 voor de vereiste tijdstip. Gebruik een apart bord voor elk tijdstip.
Figuur 4: 3D-celkweekconstructievoorbereiding. Putplaat met celbelaste GelMA-constructies direct na pipetten en na UV (365 nm) kruisverbinding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 2: Voorbereiding van 3D-celrijke constructies. Deponering van hydrogelcelmengsels in een 12-wellplaat met behulp van een eenvoudige pipettechniek voorafgaand aan UV-kruisverbinding. Klik hier om dit bestand te downloaden.
8. Biocompatibiliteitstesten
- Levend/dood vlekken
- Kweek de celrijke steigers voor de gewenste tijdsintervallen.
- Was voorzichtig met steriele PBS.
- Bred de constructen 30 minuten in het donker uit met een levende/dode oplossing die 0,2% ethidium homodimeer-1 (EthD-1) en 0,05% calceïne AM bevat in PBS.
- Beeld onmiddellijk met een fluorescentiemicroscoop met filters voor calceine AM (~495/515 nm) en EthD-1 (~495/635 nm). Standaard fluoresceïneisothiocyanaat (FITC) en Texas Red filtersets zijn respectievelijk compatibel met calceïne AM- en EthD-1-detectie.
- Identificeer levende cellen aan de hand van groene cytoplasmatische fluorescentie en dode cellen met rode kernfluorescentie.
OPMERKING: Planaire afbeeldingen kunnen worden verwerkt met ImageJ (Fiji). De objectieflens, belichtingstijd, versterking en verlichtingsintensiteit werden constant gehouden voor alle vergeleken samples en alleen aangepast om signaalverzadiging te voorkomen. Om misinterpretatie veroorzaakt door autofluorescentie te minimaliseren, werden dezelfde verwervingsinstellingen voor alle monsters binnen elk experiment gehandhaafd, en werden controlewaarnemingen van steiger-/botmicrodeeltjesconstructies zonder cellen gebruikt om het achtergrondfluorescentiepatroon dat met het biomateriaal geassocieerd is, te herkennen. Deze controles stelden ons in staat om deeltjesafgeleide signalen te onderscheiden van echte afgeronde celkleuring tijdens beeldinterpretatie.
- Alamarblue-kwantificatie
- Bereid een 5% alamarblue werkoplossing in complete medium.
- Incubeer steigers in een alamarBlue-oplossing gedurende 2,5 uur bij 37 °C en 5% CO₂, beschermd tegen licht.
- Breng 100 μL supernatant over op een 96-wellplaat in drievoud van drievoud, inclusief controles.
- Meet fluorescentie bij 360/40 nm excitatie en 460/40 nm emissie.
- Normaliseer fluorescentiewaarden bij controles om relatieve metabole activiteit te bepalen.
