Netwerkfarmacologie en experimentele verificatie om de cinnamomicortex te onderzoeken tegen steroïde-geïnduceerde osteonecrose van het femorale hoofd

Samenvatting

Deze studie heeft als doel de mogelijke mechanismen van de Cinnamomi Cortex te onderzoeken bij de behandeling van osteonecrose van het femorale hoofd door netwerkfarmacologie, moleculaire dynamica-simulaties en dierproeven te integreren.

Samenvatting

Door steroïden veroorzaakte osteonecrose van het femorale hoofd (SONFH) veroorzaakt hevige pijn en beperkte mobiliteit, wat de kwaliteit van leven van patiënten aanzienlijk aantast. Cinnamomi Cortex (CC) is aangetoond deze aandoening effectief te verlichten, maar het werkingsmechanisme blijft onduidelijk. Deze studie heeft als doel de actieve verbindingen van CC te identificeren en hun mechanismen in SONFH te onderzoeken. Actieve bestanddelen werden gescreend met behulp van de databases HERB 2.0, PubChem en SwissADME, en hun overeenkomstige doelen werden voorspeld met behulp van de Swiss Target Prediction-database. Doelen voor SONFH werden geïdentificeerd door doelen uit GEO-, DisGeNET-, GeneCards- en OMIM-databases te kruisen met de samengestelde doelen. Een eiwit-eiwit interactie (PPI) netwerk werd opgebouwd met behulp van de STRING-database, en GO- en KEGG-verrijkingsanalyses werden uitgevoerd via de DAVID-database. De meest veelbelovende interacties tussen verbinding en doelwit werden gevalideerd via moleculaire docking (MD) en moleculaire dynamica-simulaties. De onderzoekers identificeerden 563 potentiële doelen, waaronder 61 SONFH-gerelateerde doelen, waarbij AKT1, HIF-1α en STAT3 als centrale knooppunten fungeerden. KEGG-verrijkingsanalyse benadrukte de HIF-1α signaalroute als een belangrijk mechanisme. Bovendien toonden dierproeven aan dat de actieve fractie van CC effectief de structurele schade aan het femorale hoofd in een muismodel met SONFH verminderde. De bevindingen suggereren dat CC SONFH kan verbeteren door de aanpassing van hypoxie te coördineren en angiogenese en osteogenese te reguleren.

Inleiding

Steroïde-geïnduceerde osteonecrose van het femorale hoofd (SONFH) is een kritieke osteoarticulaire aandoening, die wordt veroorzaakt door verstoring of vermindering van de bloedtoevoer naar het femorale hoofd door verschillende¹. De dood van botcellen en beenmergcomponenten leidt tot structurele schade in het femorale hoofd en functionele beperkingen van het heupgewricht². Klinisch gezien presenteren patiënten zich meestal met heuppijn en beperkte mobiliteit³. Zonder effectieve behandeling zal 80% van de SONFH-patiënten overgaan in een dijbeenhoofdinstorting, wat een totale heupvervanging^vereist. Het legt een zware psychologische druk en een zware economische last op patiënten⁵. De klinische praktijk raadt aan een combinatie van anticoagulantia, fibrinolytische medicijnen, vasodilatatoren en lipidenverlagende middelen te gebruiken voor de behandeling van SONFH, die klinisch potentieel hebben aangetoond maar over het algemeen de therapeutische werkzaamheid^{beperken 6}.

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft steeds meer haar positieve impact op de behandeling van SONFH⁷ aangetoond. TCM toont potentieel voor symptoomverlichting, ziektebestrijding, verbeterde gewrichtsmobiliteit en de kwaliteit van leven van patiënten⁸. Klinisch zijn CC en de componenten ervan uitgebreid gebruikt bij het verbeteren van SONFH, met een opmerkelijke effectiviteit⁹. Talrijke bioactieve stoffen die in CC worden gevonden, hebben verschillende biologische effecten, waaronder ontstekingsremmende, antioxidante, angiogenesebevorderende en microcirculatieverbeterende eigenschappen¹⁰. Eerder onderzoek in botweefselengineering en -metabolisme heeft aangetoond dat cinnamaldehyde, een belangrijk actief bestanddeel van CC, signaalroutes kan moduleren die verband houden met botremodellering¹¹. De eerste studie gaf aan dat Yougui-pillen (YGP's) therapeutisch potentieel hebben voor SONFH door angiogenese te bevorderen en ontstekingsreacties te versterken¹². Als het soevereine geneesmiddel in YGP's kan CC yang verwarmen en qi versterken en meridianen ontblokkeren, wat gunstige therapeutische effecten op SONFH¹³ heeft. Desalniettemin blijven de precieze mechanismen achter de effectiviteit onduidelijk. Het verduidelijken van het multi-target reguleringsnetwerk dat CC gebruikt om SONFH te verbeteren, zou niet alleen helpen om het farmacologische karakter ervan te begrijpen, maar ook het zinvol klinisch gebruik en de creatie van gerelateerde verbeteringen stimuleren. Het integreren van bio-informatica met netwerkfarmacologie biedt een effectieve benadering om mechanismen van actie¹⁴ te verduidelijken.

Netwerkfarmacologie kan bioactieve componenten in kruiden identificeren en de verbanden voorspellen tussen deze geneesmiddelcomponenten en gendoelwitten¹⁵. MD wordt ingezet om de bindingsinteracties tussen kandidaat-actieve verbindingen en belangrijke therapeutische doelwitten te valideren. Moleculaire dynamica gebruikt Newtoniaanse mechanica om ligand-receptorbindingsstabiliteit en flexibiliteit te evalueren via bewegingssimulatie¹⁶. De auteurs onderzochten uitgebreid de mogelijke effecten van CC op SONFH met behulp van netwerkfarmacologie, MD en moleculaire dynamica-simulaties. De bevindingen vormen een referentie voor toekomstig diepgaand onderzoek naar de farmacodynamische materiële basis en het mechanisme van CC bij het verbeteren van SONFH. Het studiestroomdiagram is weergegeven in Figuur 1.

Protocol

Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Experimental Ethics Committee van de Zhejiang Chinese Medicine University (IACUC-20240708-22) en voldeden aan de Gids voor de Verzorging en het Gebruik van Laboratoriumdieren, uitgegeven door de National Institutes of Health. In dit experiment werden twintig vrouwelijke C57BL/6J-muizen van 10 weken oud gebruikt die 20 tot 22 g wogen. Deze muizen zijn afkomstig uit het dierencentrum van de Zhejiang Chinese Medische Universiteit. Zie de Materiaaltabel voor een lijst van alle reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.

Screening van actieve verbindingen en doelwitten van CC
Chemische verbindingen van CC werden geïdentificeerd met het Kruid 2.0¹⁷ met het trefwoord "CC." Chemicaliën zonder PubChem ID of met hetzelfde ID werden eruit gefilterd. Vervolgens samenvoegen en duplicaten verwijderen om de doellocaties te verkrijgen die overeenkomen met CC. Voer een eerste screening uit met de PubChem-database¹⁸ op basis van Lipinski's regel van vijf (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹. De auteurs gebruiken de PubChem-database om de SMILES-representatie voor elke chemische verbinding te bepalen. Met behulp van de SwissADME-database selecteren de auteurs verbindingen met de beperking van "Hoge" GI-absorptie en ≥2 "Ja"-waarden in Geneesmiddellikheid²⁰. Gebruik de Swiss-Target Prediction database²¹ om doeleiwitten te extraheren met een kans hoger dan nul. Vervolgens merge en verwijder ik duplicaten om de doellocaties te verkrijgen die bij CC horen.

Compilatie van gendoelen geassocieerd met SONFH
SONFH-gerelateerde doelen werden verkregen uit databases: DisGeNET database²²; GeneCards-database²³; OIM-database²⁴ en GEO-database²⁵. De auteurs downloadden en dedupliceerden de SONFH-genen uit de OMIM- en DisGeNET-databases. In totaal werden 233 ziektegerelateerde doelen verkregen uit de GeneCards-database na het verwijderen van duplicaten. Alle teruggevonden doelwitten hadden relevantiescores hoger dan 0 en werden opgenomen in latere analyses. De minimale relevantiescore onder de teruggevonden genen was 6,48. Differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) gerelateerd aan SONFH werden verkregen uit de GSE123568-serie op het GPL15207-platform in de GEO-database. Batch-effecten werden gecorrigeerd met behulp van het limma-pakket in R, en differentieel expressieve genen (DEGs) werden geïdentificeerd met criteria |logFC| > 1 en P < 0,05²⁶. Het ggplot2-pakket werd gebruikt om een vulkaangrafiek te maken voor het visualiseren van de verspreiding van DEG's, en er werd een heatmap gemaakt om de bevindingen te presenteren. De SONFH-ziektedoelbibliotheek werd opgericht door dubbele doelen te verwijderen met behulp van het Venn-pakket in R.

Oprichting van het PPI-netwerk
Op basis van de verwachte doelen van de actieve componenten van CC- en SONFH-gerelateerde doelen werd een Venn-diagram gemaakt door Venny 2.1.0²⁷. Met als doel PPI-gegevens te verkrijgen, importeerden de auteurs de doelen in de STRING-database²⁸. De beperking van het screeningscriterium van het organisme was "Homo sapiens" met een betrouwbaarheidsindex ≥0,4. De auteurs gebruikten Cytoscape 3.7.2 om de PPI-netwerk-sleuteldoelen vast te stellen. Degree centrality (DC) werd gebruikt om PPI-netwerksleuteldoelen te onderzoeken. Het parameters filter is meer dan het dubbele van de mediaanwaarde. Met het doel de belangrijkste doelen verder te specificeren, werd de toevoeging aan Cytoscape gebruikt.

Verrijkingsanalyses werden uitgevoerd met behulp van genontologie (GO) en Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) databases
De gemeenschappelijke doelen van CC en SONFH werden geanalyseerd voor GO- en KEGG-verrijkingsanalyses via de DAVID-database²⁹. Om de top 10 GO-termen en de top 20 KEGG-paden te visualiseren, werd Wei Sheng Xin³⁰ gebruikt om de verrijkingsdot bubble chart te tekenen.

Netwerkconstructie
De moleculaire mechanismen van CC bij het verbeteren van SONFH werden opgehelderd via de herb-compound-target (H-C-T) en compound-target-pathway (C-T-P) netwerken. De software Cytoscape 3.10.3 illustreerde de netwerken. Het H-C-T netwerk is ontwikkeld met behulp van de actieve verbindingen van CC en hun gedeelde doelen. Gebruik daarna de tool Netwerkanalyse (Analyzen Network). Om het begrip van de relaties tussen paden, verbindingen en doelwitten te vergroten, werden de top 20 paden, samen met hun gerelateerde doelen en verbindingen, door Network Tools georganiseerd in een C-T-P-netwerk.

MD-verificatie
De kerndoelen: HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 en EGFR werden verkregen uit de PPI-analyse. Het doelwit werd doorzocht door de Uniport-database³¹ met de beperking van Human en beoordeeld door de RCSB PDB-database³². Menselijke eiwitstructuren met relatief hoge resolutie werden geselecteerd. De actieve ingrediënten werden geïdentificeerd via het C-T-P-netwerk. Hun bijbehorende 3D-structuren werden in mol2-formaat gedownload uit de PubChem-database. Elk bestand werd geopend in Chem3D en de energie werd geminimaliseerd. Vervolgens gebruikten de auteurs de AutoDockTools^33-software om de dehydratatie, hydrogenering en het berekenen van Gasteiger-ladingen van het receptoreiwit uit te voeren. Zowel liganden als receptoren werden in het PDBQT-formaat gehouden. Op basis van de ruimtelijke locatie en bindingscapaciteit beoordelen de auteurs de haalbaarheid en stabiliteit van koppelen. Via de AutoDock Vina werden de dockinggridbox en het macromolecuul voorspeld. In dit onderzoek mochten alle roteerbare bindingen van het ligand vrij draaien, terwijl de receptoren als rigide werden ingesteld. De koppelingsscore geeft de bindingsaffiniteit tussen de receptor en het ligand aan; hoe lager de score, hoe hoger de bindingsaffiniteit. In overeenstemming met dit principe selecteren de auteurs de conformaties met de meest gunstige bindingsenergie om bindingsinteracties van liganden met eiwitten te onderzoeken. De visuele resultaten werden getoond door PyMOL.

Moleculaire dynamica-simulatie
Moleculaire dynamica-simulaties werden uitgevoerd met GROMACS³⁴ met het CHARMM36 krachtveld. Het eiwit-ligandencomplex werd gecentreerd in een kubische periodieke simulatiebox met een minimale afstand tussen opgeloste doos en 1,0 nm, en het systeem werd opgelost met behulp van het SPC216 watermodel. Het systeem werd geneutraliseerd door passende Na⁺- en Cl⁻-tegenbewegingen toe te voegen. Energieminimalisatie werd sequentieel uitgevoerd met het steilste dalingsalgoritme, gevolgd door de conjugaatgradiëntmethode om ongunstige atomaire contacten te verwijderen. Elektrostatische interacties op lange afstand werden berekend met behulp van de deeltjesmesh Ewald (PME) methode met een afsnijafstand van 10 Å. Alle covalente bindingen met waterstofatomen werden beperkt met behulp van het LINCS-algoritme. De temperatuur werd op 300 K gehouden met behulp van de V-rescale thermostaat, en de druk werd geregeld op 1 bar met de Berendsen barostaat met isotrope koppeling. Positiebeperkingen werden op de ligand toegepast met een krachtconstante van 1000 kJ·mol⁻¹·nm⁻² tijdens de evenwichtsfase. Na energieminimalisatie werd het systeem in evenwicht gebracht met 2 ns NVT en 2 ns NPT-simulaties, gevolgd door een productie van 100 ns moleculaire dynamica-simulatie met een tijdstap van 2 fs. Atomaire coördinaten werden elke 10 ps geregistreerd voor latere trajectanalyse.

Experimentele validatie in een SONFH-muismodel
Dieren en de SONFH-modelinstelling
Twintig vrouwelijke C57BL/6J-muizen, 10 weken oud en met een gewicht van 20 tot 22 g, werden verkregen uit het dierencentrum van de Zhejiang Chinese Medische Universiteit. De muizen ondergingen een acclimactieperiode van 7 dagen in een gecontroleerde omgeving en kregen onbeperkte toegang tot voedsel en water. Alle muizen werden willekeurig toegewezen aan de groepen (n = 5 per groep): de controlegroep, de SONFH-groep, de SONFH + CC laag-dosis (CC-Laag, 7,5 g/kg/d) groep, en de SONFH + CC hoge dosis (CC-Hoog, 15 g/kg/d) groep. Het SONFH-model werd vastgesteld zoals eerder beschreven. Kort gezegd kregen muizen in de groepen SONFH, SONFH + CC-Low en SONFH + CC-High twee intraveneuze injecties van lipopolysaccharide (LPS; 20 μg/kg) op dag 0. Vervolgens werden drie intramusculaire injecties van methylprednisolon (MPS; 40 mg/kg) toegediend met intervallen van 24 uur, beginnend 24 uur na de LPS-injecties. Muizen in de behandelgroepen kregen dagelijks 6 weken lang CC-extract toegediend via orale gavage, te beginnen op de dag van de laatste MPS-injectie. De muis van de controlegroep ontvingen op overeenkomstige tijdstippen gelijkwaardige hoeveelheden zoutoplossing.

Monsterverzameling en -voorbereiding
Aan het einde van de zes weken durende behandelperiode werden muizen geëuthanaseerd. Bilaterale dijbeenkoppen werden zorgvuldig ontleed en geoogst. Voor elk dier werd de linker femoralkop 48 uur vastgezet bij 4 °C voor daaropvolgende decalcificatie en paraffine-inbedding. De rechter femorale kop werd vastgezet en vervolgens direct gebruikt voor micro-CT-scanning zonder ontkalking.

Histologische analyse (ABH-kleuring)
Na ontkalking en paraffine-inbedding werden de hoofdsecties van het femorale hoofd gekleurd met een Alcian Blue/Hematoxylin (ABH) protocol om veranderingen in osteonecrose te beoordelen. Kort werden de secties 30 minuten gekleurd met 1% Alcian Blue (pH 2,5), afgespoeld en daarna tegengekleurd met Harris hematoxyline. Na uitdroging en montage werden de preparaten onder een lichtmicroscoop gefotografeerd. Kwantificatie van osteonecrose werd uitgevoerd door twee geblindeerde waarnemers met behulp van ImageJ-software. De verhouding van lege lacunes werd berekend als (aantal lege lacunae/totaal aantal lacunae) × 100% in drie willekeurig geselecteerde hoogvermogenvelden per steekproef binnen het subchondrale gebied. De verhouding van pyknotische kernen werd op vergelijkbare wijze bepaald.

Micro-computertomografie (Micro-CT) analyse
De driedimensionale botmicrostructuur van het femorale hoofd werd geanalyseerd met een micro-CT-scanner met hoge resolutie. Vaste monsters werden gescand met een resolutie van 10 μm (70 kV, 114 μA). Een gestandaardiseerde sferische volume van belang (VOI) die het primaire draaggebied omvat, werd gereconstrueerd en geanalyseerd met behulp van CTAn-software. De volgende morfometrische parameters werden gekwantificeerd: Botvolume/Totaal Volume (BV/TV), Trabeculaire Dikte (Tb.Th) en Trabeculaire Scheiding (Tb.Sp).

Immunofluorescentie (IF) kleuring
Om de botmicro-omgeving te evalueren, werd immunofluorescentiekleuring uitgevoerd op paraffinesecties. Na antigeenwinning en blokkering werden secties 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met de volgende primaire antilichamen: konijn anti-HIF-1α (1:200), konijn anti-ALP (1:300) en konijn anti-VEGF (1:150). Na het wassen werden secties geïncubeerd met een mengsel van fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen: Alexa Fluor 488-gelabelde geitenanti-konijn IgG, Alexa Fluor 555-gelabelde geitenanti-konijn IgG. De kernen werden tegengekleurd met DAPI. Beelden werden vastgelegd met een fluorescentiemicroscoop onder consistente belichtingsinstellingen. De relatieve fluorescentieintensiteit voor elke marker werd gekwantificeerd met ImageJ-software over drie velden per monster.

Statistische analyse
Alle kwantitatieve gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's post hoc-test werd uitgevoerd met GraphPad Prism-software (versie 9.0) om de statistische significantie tussen groepen te bepalen. Een P-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Identificatie van actieve componenten en voorspelde doelen van CC en ontwikkeling van het "H-C-T" netwerk.
Om de mechanismen van sleutelcomponenten en doelwitten van CC bij SONFH-verbetering te onderzoeken, gebruikten de auteurs de HERB 2.0-database om alle gescreende CC-componenten te identificeren. Er werden 85 waarschijnlijke bioactieve verbindingen gevonden van de 209 kandidaat-actieve bestanddelen van CC (Aanvullende Tabel 1). Met behulp van het Swiss Target Prediction-platform en het elimineren van dubbele en ongeldige vermeldingen werden 563 veronderstelde doelen verkregen die overeenkomen met deze CC-componenten (Aanvullende Tabel 2). De auteurs hebben de actieve componenten en doelen van CC geïdentificeerd.

Het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij het ontstaan en de progressie van SONFH en het identificeren van potentiële biomarkerdoelen. Analyse van de GSE123568 dataset in de GEO-database identificeerde DEG's die geassocieerd zijn met SONFH, waaronder 207 opgewaardeerde en 216 neergereguleerde genen. De vulkaangrafiek van de 425 DEG's is weergegeven in Figuur 2A, terwijl de expressiepatronen van de top 60 DEG's, gerangschikt op expressieniveau, als heatmap worden weergegeven in Figuur 2B, met kleurintensiteit die de log-getransformeerde expressiewaarden weerspiegelt. De databases DisGeNET, OMIM en GeneCards leverden 711 doelen die aan SONFH waren gekoppeld. Door de 425 DEG's uit de GEO-database te combineren, zijn in totaal 1136 doelen gekoppeld aan SONFH. Na het elimineren van duplicaten werden 1115 SONFH-gerelateerde doelen bevestigd, zoals geïllustreerd in Figuur 2C. De auteurs hebben voorlopig een ziektedoelbibliotheek voor SONFH vastgesteld.

Om doelen en primaire componenten te identificeren, identificeerde een intersectieanalyse tussen de 563 doelen van CC en de 1115 SONFH-gerelateerde doelen 61 gemeenschappelijke doelen (Figuur 3A en Aanvullende Tabel 3), die in Cytoscape 3.10.3 werden opgenomen om het "H-C-T" netwerk op te bouwen (Figuur 3B). Dit netwerk bestond uit 147 knooppunten en 413 randen. Topologische analyse wees uit dat (s)-4-nonanolid (graad: 16), isohomogenol (graad: 15), nerylacetaat (graad: 14), Melilotocarpaan A (graad: 14), 3-methoxycinnamaldehyde (graad: 13) de hoogste connectiviteit met eiwitdoelen vertoonden.

Ontwikkeling en topologische evaluatie van het PPI-netwerk.
Om de doelstellingen van CC bij het verbeteren van SONFH verder te verkennen. Cytoscape 3.10.3 werd gebruikt om het PPI-netwerk te bekijken nadat 61 identieke doelen in de STRING-database waren geplaatst. Er waren 463 randen en 60 knooppunten in het netwerk. In Figuur 4A veranderen de knopen in kleur en grootte van lichter en kleiner naar donkerder en groter, wat een toename in graad aangeeft van laag naar hoog. De MCODE-plug-in maakte het mogelijk om deze doelen te clusteren in twee functionele modules (Figuur 4A), waarvan cluster 1 23 knooppunten en 216 randen bevatte, met een score van 19,636. Om de netwerkarchitectuur verder te karakteriseren, werden DC, BC en CC gebruikt als topologische metrieken. Met de mediaanwaarden van deze parameters als afkappunten identificeerden de auteurs 8 actieve doelen (Figuur 4B). De CytoHubba-plugin gebruikte het MCC-algoritme om knooppunten te rangschikken en identificeerde de top 10 genen. (Figuur 4C).

GO-verrijkingsanalyse
Om de mechanismen van CC bij ONFH-verbetering verder te onderzoeken, werd een GO-verrijkingsanalyse uitgevoerd op 61 potentiële doelen, waarbij BP, CC en MF werden gebruikt. In totaal werden 435 GO-termijnen verrijkt, waaronder 293 BP-termen, 41 CC-termen en 101 MF-termen. Deze bevindingen worden weergegeven in aanvullende tabellen 4, 5 en 6. Figuur 5A toont visueel de top 10 verrijkte BP-, CC- en MF-termen met behulp van een bubbeldiagram. De bevindingen gaven aan dat BP-termen voornamelijk geassocieerd waren met signaaltransductie, positieve regulatie van transcriptie door RNA-polymerase II, negatieve regulatie van apoptotisch proces, positieve regulatie van DNA-sjabloontranscriptie en negatieve regulatie van transcriptie door RNA-polymerase II. De analyse toonde aan dat de MF-termen voornamelijk betrokken waren bij eiwitbinding, metaalionbinding en identieke eiwitbinding. De CC-resultaten toonden aan dat de meerderheid van de doelwitten zich voornamelijk bevond in het cytoplasma, membraan en plasmamembraan.

KEGG-analyse
Om informatie te verschaffen over de mogelijke biochemische mechanismen waarmee CC SONFH kan verbeteren, werd KEGG-routeverrijkingsanalyse uitgevoerd om de biochemische mechanismen te verduidelijken waarmee CC SONFH kan verbeteren. Met een screeningscriterium van P < 0,05 en FDR < 0,05 werden 48 KEGG-verrijkingsvermeldingen geïdentificeerd (Aanvullende Tabel 7). De top 20 significant verrijkte paden, bepaald door Fold Enrichment en count, werden weergegeven met behulp van bubbel- en staafdiagrammen (Tabel 1, Figuur 5B en 5C). Met behulp van Cytoscape 3.10.3 werd een C-T-P-netwerk met 167 knooppunten en 589 randen geconstrueerd (Figuur 5D). De effecten van CC op SONFH zijn voornamelijk gekoppeld aan de Kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirusinfectie, de HIF-1 signaalroute en lipide en atherosclerose, zoals aangegeven door GO functionele en KEGG routeverrijkingsanalyses.

MD-verificatie
Om de potentiële interacties tussen actieve verbindingen en belangrijke doelwitten te evalueren, werden de 10 verbindingen uit het C-T-P-netwerk, waaronder anethol, melilotocarpan A, nerylacetaat, caprylzuur, isohomogenol, 3-methoxycinnamaldehyde, (s)-4-nonanolid, myristicine, borneol en cinnamylacetaat, gekoppeld aan de belangrijkste doelwitten AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC en EGFR. De volledige koppelingsresultaten voor alle compound–target paren worden samengevat in Aanvullende Tabel 8, en gedetailleerde informatie over de verbindingen, doelen en koppelparameters is beschikbaar in Aanvullende Tabel 9. Figuur 6 toont een warmtekaart van de bindingsenergieverdeling.

Over het algemeen vertoonden verschillende verbinding-doelparen relatief gunstige bindingsaffiniteiten, waarbij lagere bindingsenergiewaarden meer stabiele voorspelde interacties aangaven. Opmerkelijk is dat de koppelingsresultaten duidelijke heterogeniteit in bindingsaffiniteiten tussen zowel verbindingen als doelwitten aantoonden. Bepaalde verbindingen, zoals melilotocarpan A, vertoonden consequent relatief sterke bindingsaffiniteiten over meerdere doelwitten, terwijl andere meer matige of zwakke interacties vertoonden, wat suggereert dat verschillende verbindingen ongelijk kunnen bijdragen aan de voorspelde farmacologische effecten.

Daarnaast werd variabiliteit ook waargenomen tussen doelwitten. Bepaalde doelen zoals STAT3 en EGFR vertoonden bijvoorbeeld relatief matige of zwakke bindingsaffiniteiten met meerdere verbindingen, met sommige waarden die naderden tot -5,0 kcal/mol, vergeleken met doelen zoals AKT1 of SRC. Dit patroon geeft aan dat niet alle kerndoelwitten noodzakelijkerwijs functioneren als directe, hoogaffiniteitsbindende partners van de geïdentificeerde verbindingen, maar in plaats daarvan indirecte regulerende rollen binnen het interactienetwerk kunnen spelen. Dergelijke verschillen kunnen verband houden met variaties in structurele compatibiliteit tussen liganden en eiwitbindingsplaatsen, evenals de inherente kenmerken van de doelwitten.

Van de geëvalueerde paren vertoonde AKT1 de laagste bindingsenergie met melilotocarpan A (-9,6 kcal/mol), wat wijst op een mogelijk gunstige interactie. Figuur 7 illustreert de voorspelde bindingsmodus van dit complex. Specifiek vormt SER205 van AKT1 waterstofbruggen met melilotocarpan A, anethole en myristicine. Daarnaast werd voorspeld dat melilotocarpan A waterstofbruggen zou vormen met GLY309 van HIF-1α, LEU438 en THR440 van STAT3, SER433 en ARG412 van ESR1, en ARG500 en GLU510 van SRC.

Om representatieve kandidaatverbindingen te identificeren, werd de laagste bindingsenergie voor elk doelwit gebruikt, en werd een bindingsenergiedrempel van ≤ -5,0 kcal/mol ingesteld om relatief stabiele interacties aan te geven. Op basis van deze criteria werden melilotocarpan A, anethole en myristicine geïdentificeerd als potentiële sleutelverbindingen. Over het geheel genomen vertoonde de meerderheid van de actieve componenten van CC potentiële interacties met de geselecteerde therapeutische doelwitten, waarbij sommige verbindingen relatief sterkere bindingstrends vertoonden over meerdere doelwitten. Het moet echter worden opgemerkt dat MD een vereenvoudigde computationele benadering is die voorlopige voorspellingen van potentiële interacties geeft en mogelijk niet volledig rekening houdt met eiwitflexibiliteit en complexe biologische omgevingen. Daarom moeten deze resultaten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd, en vormen de waargenomen interacties geen definitief bewijs van directe binding.

Moleculaire dynamica-simulatie
Om de stabiliteit van de complexen verder te beoordelen, selecteerden de auteurs de AKT1-melilotocarpan A, HIF-1α-melilotocarpan A en STAT3-melilotocarpan A-complexen voor moleculaire dynamica-simulaties. Onder de voorspelde doelen werden STAT3 en HIF-1α geselecteerd voor MD-simulaties op basis van hun centrale rollen in het PPI-netwerk en hun biologische relevantie voor de SONFH-pathologie. STAT3 toonde een van de hoogste connectiviteitsgraden in het PPI-netwerk, wat wijst op een mogelijke regulerende rol in meerdere signaalpaden. HIF-1α werd geselecteerd omdat KEGG-verrijkingsanalyse de HIF-1 signaalroute identificeerde als een van de meest relevante routes die geassocieerd zijn met angiogenese en hypoxie-adaptatie bij osteonecrose.

Tegelijkertijd richtten de auteurs zich op AKT1 als representatief doelwit vanwege hun sterke dockingscores en directe relevantie voor de pathologische kenmerken van SONFH, met name hypoxie-geïnduceerde angiogenese en botregeneratie. Vanwege beperkingen in computationele middelen werden drie representatieve complexen geselecteerd voor gedetailleerde MD-simulaties, een veelgebruikte strategie in moleculaire simulatiestudies op basis van netwerkfarmacologie. Root mean square deviation (RMSD) evalueert effectief de conformationele stabiliteit van eiwit-ligandencomplexen, waarbij lagere waarden een grotere structurele stabiliteit aangeven. Zoals weergegeven in Figuur 8A, voltooide het AKT1-melilotocarpan A-complex de relaxatie binnen de eerste 12 ns en bereikte vervolgens een stabiel plateau, met slechts een tijdelijke fluctuatie rond 50-55 ns voordat het snel terugkeerde naar evenwicht. De totale RMSD gedurende de simulatie was ongeveer 0,369 nm. Figuur 8B illustreert dat het HIF1A-melilotocarpan A-complex binnen de eerste 16 ns relaxatie onderging, gevolgd door het behouden van een stabiel plateau. Er vond een korte fluctuatie plaats tussen 38 en 42 ns, waarna snelle herstabilisatie werd waargenomen. De totale RMSD voor dit complex bedroeg 0,25 nm. In Figuur 8C onderging het STAT3-melilotocarpaan A-complex een relaxatie binnen 0,3 ns, waarna het een stabiel plateau bereikte. De korte fluctuatie vond plaats tussen 5 n en 80 ns. De totale simulatie was ongeveer 0,21 nm. Zoals aangetoond in The AKT1-melilotocarpan A, behielden HIF-1α-melilotocarpan A en STAT3-melilotocarpan complexen stabiliteit zonder noemenswaardige veranderingen, wat wijst op een relatief stabiele combinatie.

De flexibiliteit van aminozuurresiduen in de eiwitten werd beoordeeld met behulp van root mean square fluctuation (RMSF). Figuur 9A bedroeg de gemiddelde wereldwijde residufluctuatie ongeveer 0,17 nm, wat suggereert dat stabiliteit voornamelijk werd behouden door de structurele kern en de bindingspocket. De hogere flexibiliteit was grotendeels beperkt tot intrinsiek mobiele gebieden zoals terminalsegmenten en lusregio's, in plaats van de pocket core. Het is algemeen bekend dat deze regio's flexibel van aard zijn. Figuur 9B toont dat ongeveer 94% van de residuen RMSF-waarden onder 0,20 nm vertoonde, en slechts ongeveer 6% meer dan 0,30 nm, wat aangeeft dat de algehele eiwitruggengraat en interne residuen binnen een stabiel bereik fluctueerden. Figuur 9C toont dat het gemiddelde globale residu ongeveer 0,17 nm was. Er werden geen fluctuaties van meer dan 0,15 nm vastgesteld in de data, wat aangeeft dat de bindingspocket gedurende de simulatie een stabiele conformatie behield. Zowel de AKT1-melilotocarpan A- als de HIF-1α-melilotocarpan A-complexen zijn aangetoond sterk en stabiel te interageren.

Waterstofbruggen zijn cruciaal voor het bevorderen van eiwit-ligandinteracties. Figuur 10A toont dat de AKT1-melilotocarpan A-complexen typisch één waterstofbinding vormden, waarbij het aantal waterstofbruggen varieerde tussen 0 en 2. Tussen melilotocarpan liggen A en HIF-1α minder dan 0,35 nm van elkaar verwijderd. AKT1 heeft vaak interactie in de nabijheid van melilotocarpan A. De HIF-1α-melilotocarpan A-complexen vormen 0 tot 2 waterstofbruggen, voornamelijk één waterstofbinding, zoals weergegeven in Figuur 10B. In Figuur 10 C is het aantal waterstofbruggen van het STAT3-melilotocarpaan A-complex nul tot vier. Meestal zijn A-atomen tussen melilotocarpan A en HIF-1α minder dan 0,35 nm van elkaar verwijderd. HIF-1α-melilotocarpan A-complexen vormen 1-3 paren nauwe contacten en soms zelfs 7-9 paren. Dit suggereert effectieve waterstofbruggeninteracties tussen het kleine molecuul en de doeleiwitten. Samenvattend tonen zowel de AKT1-melilotocarpan A als de HIF-1α-melilotocarpan A-complexen stabiliteit en sterkte.

CC remt de ontstekingsreactie en apoptose van SONFH-muizen
Histologische analyse met ABH-kleuring toonde uitgesproken osteonecrotische veranderingen in de SONFH-groep, gekenmerkt door toegenomen lege lacunae, pyknotische kernen en verstoorde trabeculaire architectuur, terwijl deze pathologische kenmerken merkbaar werden verminderd na CC-behandeling (Figuur 11A). Kwantitatieve analyse bevestigde dat de verhoudingen van lege lacunes en pyknotische kernen significant waren verminderd in de CC-behandelde groepen vergeleken met de SONFH-groep (Figuur 11B–C). Micro-CT-analyse toonde ernstig trabeculair botverlies aan in de SONFH-groep, wat gedeeltelijk werd omgekeerd door toediening van CC (Figuur 11D). Consistent verhoogde CC-behandeling BV/TV en tuberculose significant. Terwijl Tb.Sp afneemt ten opzichte van de SONFH-groep (Figuur 11E–G). Immunofluorescentiekleuring toonde verhoogde HIF-1α-expressie en verlaagde ALP-niveaus in de SONFH-groep, vergezeld van veranderde VEGF-expressie. CC-behandeling moduleerde HIF-1α en VEGF-expressie en verbeterde ALP-signalen, wat wijst op een verbeterde botmicro-omgeving en osteogene activiteit (Figuur 11H).

BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:
De datasets die tijdens de huidige studie zijn gebruikt of geanalyseerd, zijn beschikbaar via de link: https://zenodo.org/records/19730455.

Figuur 1: Stroomdiagram van de netwerkfarmacologie-studiestrategie voor CC-verbetering van SONFH. Figuur 1 toont dat de studie potentiële doelwitten van actieve bestanddelen uit CC uit de database identificeert, met SONFH als kernziekte. Na het kruisen hiervan met ziektegerelateerde doelwitten werden een "component–doel-pathway" netwerk en GO, KEGG-termen geconstrueerd. Moleculaire koppeling en moleculaire dynamica-simulatie worden vervolgens ingezet om de bindingsaffiniteit tussen belangrijke componenten en kerndoelen te evalueren, waarbij de definitieve bevestiging plaatsvindt via experimentele verificatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Screening van overlappende doelen geassocieerd met SONFH. (A) Vulkaangrafiek die de verdeling van differentieel tot expressie gebrachte genen in ziektemonsters toont. Rode punten duiden op opgereguleerde genen, blauwe punten op neergereguleerde genen, en grijze punten op genen zonder significante differentiële expressie. (B) Heatmap die de expressiepatronen van de 60 verschillend tot expressie gebrachte genen toont, met kolommen die overeenkomen met monsters en rijen die overeenkomen met genen. (C) Venn-diagram dat de overlap toont van ziektegerelateerde doelen verkregen uit verschillende databases. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Screening van kruisende doelen tussen CC en SONFH. (A) Venn-diagram dat de verdeling illustreert van 61 gemeenschappelijke doelwitten gedeeld tussen de voorspelde doelwitten van actieve verbindingen in CC (geel) en SONFH-gerelateerde ziektedoelen (paars). (B) Het Herb-Compound-Target (H-C-T) netwerk illustreert de interacties tussen verbindingen en hun bijbehorende doelwitten. De blauwe vierkante knoop staat voor de ziekte, groene vierkante knopen duiden op actieve verbindingen en oranje vierkante knopen op gemeenschappelijke doelwitten. Randen geven de interacties aan tussen verbindingen en hun doelwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Kandidaat-doelidentificatie via PPI-analyse. (A) PPI-netwerk geclusterd met de MCODE-plugin. (B) Schematische workflow van topologische screening binnen het PPI-netwerk. (C) Belangrijke genen geëxtraheerd uit het PPI-netwerk door de CytoHubba-plugin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: GO-verrijkingsanalyseresultaten en KEGG-routeverrijkingsanalyse voor de 61 veelvoorkomende doelwitten. (A) Bubbelgrafiek met de top 10 GO-verrijkingsanalysetermen voor BP, CC en MF. (B) Bubbelplot dat de top 20 significant verrijkte KEGG-paden toont. (C) Verdeling van de top 20 verrijkte routes op basis van KEGG-functionele classificatie. (D) Illustratief C-T-P-netwerk dat de mogelijke mechanismen weergeeft waarmee CC osteonecrose van het femorale hoofd kan verbeteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Bindingsenergie-warmtekaart van de interacties tussen de actieve verbindingen van CC en de belangrijkste doelwitten (kcal/mol). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Bindingsmodi van belangrijke doelen met specifieke actieve verbindingen. AKT1-melilotocarpan A (A1), HIF-1α-melilotocarpan A (B1), STAT3-melilotocarpan A (C1), ESR1-melilotocarpan A (D1), CASP3-melilotocarpan A (E1), SRC-melilotocarpan A (F1), EGFR-melilotocarpan A (G1), AKT1-anethole (H1), AKT1-myristicine (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) en (H2) illustreren respectievelijk hun 2D-bindingsmodi. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: RMSD van MD. (A) RMSD-waarden voor AKT1-Melilotocarpan A-complexen. (B) De RMSD-waarden van HIF-1α-Melilotocarpan A-complexen. (C) De RMSD-waarden van STAT3-Melilotocarpan A-complexen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: RMSF van MD. (A) De RMSF-waarden van AKT1-Melilotocarpan A-complexen. (B) De RMSF-waarden van HIF-1α-Melilotocarpan A-complexen. (C) De RMSF-waarden van STAT3-Melilotocarpan A-complexen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: H-bindingen van MD. (A) De H-bindingswaarden van AKT1-Melilotocarpan A-complexen. (B) De H-bindingswaarden van HIF1A-Melilotocarpan A-complexen. (C) De H-bindingswaarden van AKT1-Melilotocarpan A-complexen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: CC remt de ontstekingsrespons en apoptose in het femorale hoofd, waardoor SONFH verbetert. (A) Vertegenwoordigende femure hoofdsecties bevlekt met ABH. Lege lacunes worden aangegeven door zwarte pijlpunten, en pyknotische kernen worden aangeduid door pijlen. (B–C) Kwantitatieve analyse van de verhouding van lege lacunes (B) en het aantal pyknotische kernen (C). n = 5. (D) Representatieve driedimensionale micro-CT-reconstructies van femorale hoofden. (E–G) Kwantificering van micro-CT-parameters, waaronder botvolumefractie (BV/TV), trabeculaire scheiding (Tb.Sp) en trabeculaire dikte (Tb.Th). (H) Representatieve immunofluorescentiekleuring van HIF-1α, VEGF en ALP in femorale hoofdsecties; kernen werden tegengekleurd met DAPI. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Term		Vouwverrijking	P-Waarde	Graaf	Gebruikers-ID's
Blaaskanker		28.44	1.23E-07	7	CREBBP,CXCL8,NOS2,MMP2,STAT3,F2,PTGS2, HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA,CASP3, ERBB2,EP300,PPARG,NFE2L2,BCL2L1
HIF-1 signaalpad		16.66	6.56E-10	11	SRC,MMP2,STAT3,HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR, MTOR,VEGFA,CASP3,ERBB2,KDR,PDCD4,PTPN6
EGFR-tyrosinekinase-remmerresistentie		16.66	3.84E-07	8	CCR1,CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3 ,EP300,TYK2,PTGS2,HIF1A,MTOR,VEGFA
Adherens-knooppunt		12.54	1.64E-05	7	CREBBP,ABCB1,CASP3,ERBB2,STAT3,PDCD4, EP300,PTGS2,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA
Endocriene resistentie		11.78	2.35E-05	7	CREBBP,NOS2,NOS3,ERBB2,STAT3, SERPINE1,EP300,HIF1A,EGFR,MTOR,VEGFA
LEEFTIJD-WOEDE signaalweg bij diabetische complicaties		11.55	2.63E-05	7	CCR1,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,CXCR2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
Proteoglycanen bij kanker		11.43	1.19E-10	14	CXCL8,SRC,NOS3,CASP3,STAT3,PPARG,MMP9,BCL2L1,NFE2L2
Relaxine-signaalweg		10.25	1.02E-05	8	OXTR,NOS2,NOS3,ERBB2,PTAFR,KDR,NOS1,EGFR,VEGFA
Kasosi-sarcoom-geassocieerde herpesvirusinfectie		10.20	1.45E-08	12	SRC,ERBB2,STAT3,KDR,EGFR,MTOR,BCL2L1,VEGFA
Schildklierhormoon signaalroute		9.56	7.64E-05	7	NOS2,SRC,NOS3,MMP2,NOS1,MMP9,EGFR,VEGFA
Afschuifspanning en atherosclerose		8.21	0.000177	7	CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,EP300,TYK2,MMP9
Hepatitis B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP,STAT3,EP300,PTPN6,TYK2,EGFR,MTOR,BCL2L1
JAK-STAT seinroute		7.93	5.35E-05	8	SRC,VDR,STAT3,CYP3A4,ESR1,EGFR,MTOR,VEGFA
Infectie met het humaan cytomegalovirus		7.34	6.2E-06	10	CREBBP,CASP3,EP300,TYK2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
Lipide en atherosclerose		6.94	0.000035	9	CXCL8,SRC,MMP2,ERBB2,MMP9,EGFR,VEGFA
MicroRNA's bij kanker		6.25	2.06E-06	12	CREBBP,SRC,ERBB2,EP300,PTPN6,PTPRF,EGFR
Chemische carcinogenese - receptoractivatie		6.14	0.000265	8	SRC,MMP2,ERBB2,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR
Pathways bij kanker		5.94	6.64E-10	19	CXCL8,NOS3,CASP3,MMP2,STAT3,SERPINE1,VEGFA
Calciumsignaalweg		5.90	0.00011	9	KAT2B,CREBBP,SRC,EP300,HIF1A,ESR1,MTOR
Infectie met het humaan papillomavirus		4.00	0.00324	8	SRC,NOS3,MMP2,KDR,MMP9,NFE2L2,VEGFA

Tabel 1: De KEGG-verrijkingsresultaten van de top 20 verrijkte routes.

Aanvullende Tabel 1: Basisinformatie over actieve verbindingen in CC.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: De doelstellingen van 85 actieve componenten in CC.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 3: Informatie over 61 CC-SONFH gemeenschappelijke doelen.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 4: Resultaten van de biologische procescategorietermen uit GO-verrijkingsanalyse.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 5: Resultaten van de categorisatietermen van cellulaire componenten uit de GO-verrijkingsanalyse.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 6: Resultaten van de moleculaire functiecategorietermen uit GO-verrijkingsanalyse.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 7: Resultaten van de routes uit KEGG-verrijkingsanalyse.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 8: Moleculaire koppelingsenergieën (kcal/mol) van verbinding-doelparen.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 9: Details van doelen en componenten voor moleculaire koppeling.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In deze studie verkregen de auteurs 85 bioactieve verbindingen uit CC via verschillende databases en voerden screening uit, waarvan de belangrijkste chemische componenten anethole, melilotocarpan A en myristicine omvatten. Om doelen te identificeren, kruisten de auteurs 563 drug CC-doelen met 1116 SONFH-gerelateerde doelen, waarmee uiteindelijk 61 doelen werden behaald. De auteurs importeerden 61 gemeenschappelijke doelen in de STRING- en DAVID-databases om een PPI-netwerk op te bouwen en mogelijke farmacologische routes te onderzoeken. De resultaten onthulden 10 belangrijke doelen in het PPI-netwerk, waaronder HIF-1α en STAT3. Ischemie en hypoxie zijn twee van de belangrijkste pathogene kenmerken van SONFH, volgens eerder onderzoek³⁵. CC kan positieve effecten uitoefenen op SONFH via meerdere biologische processen, waaronder angiogenese en transcriptieregulatie. Dit zou kunnen worden bereikt via de HIF-1α signaalroute, vloeistofafschuifstress en atherosclerose, lipiden en atherosclerose, de AGE-RAGE signaalweg bij diabetische complicaties, en andere signaalpaden, volgens KEGG verrijkingsanalyse. Dit suggereert dat CC mogelijk op SONFH werkt via deze sleuteldoelen en de bijbehorende paden. Om verder te verduidelijken of de componenten van CC nauw verbonden zijn met de doelwitten, op basis van bovenstaande onderzoeksresultaten van het netwerk farmacologie, namelijk de screeningsresultaten van de werkzame stoffen van het voorschrift en de screeningsresultaten van de doelwitten in het PPI-netwerk, voerden de auteurs moleculaire dynamica-simulaties uit van de melilotocarpan A-AKT1, melilotocarpan A-HIF-1α, en STAT3-melilotocarpische complexen. Dit toont aan dat melilotocarpan A gestaag bindt aan AKT1, HIF-1α en STAT3, dus CC kan inderdaad positieve effecten uitoefenen door op deze belangrijke doelen in te werken. Al met al kan CC via een multicomponent, multi-doel, multi-pathway mechanisme beschermende effecten uitoefenen op de kwaliteit van leven bij SONFH-patiënten.

De onderzoeksgroep richt zich op het verduidelijken van de mechanismen waarmee YGP's therapeutische effecten uitoefenen bij botgerelateerde ziekten. Uit eerdere onderzoeken bleek dat YGP's de botvorming verbeteren en de trabeculaire microarchitectuur in het femorale hoofd verbeteren door β-catenine te activeren om osteoclastogenese te remmen en osteogenese te bevorderen tijdens konijn SONFH³⁶. Bovendien hebben de onderzoekers vastgesteld dat YGP's therapeutische effecten op SONFH hebben, voornamelijk door ontstekingen te verlichten en angiogenese¹² te bevorderen. YGP's kunnen niet alleen SONFH verzachten, maar ook osteoporose verbeteren. Door het IL-17/NF-κB signaalpad te remmen en de Th17-immuunresponsen te verminderen, stoppen YGP's met succes botverlies door ovariectomie³⁷. Via dierproeven bevestigden de onderzoekers dat Cornus officinalis, een van de componenten van YGP's, effecten uitoefent op SONFH door de secretie van ontstekingsmediatoren en botcelapoptose³⁸ te remmen. CC, dat yang kan verwarmen en qi kan versterken en meridianen kan ontblokkeren, is het belangrijkste kruid in YGP's en speelt een cruciale rol bij het verbeteren van SONFH en het verlichten van het lijden van patiënten. Samenvattend weerspiegelen deze studies de langdurige focus op het ontrafelen van de mechanismen van YGP's bij osteonecrose en op het aanwijzen van CC als een belangrijk kruid dat mechanistisch onderzocht moet worden in SONFH.

Onder de voorspelde werkzame stoffen hebben anethol, myristicine en andere ingrediënten biologische activiteit vertoond tegen botgerelateerde ziekten. Van anethole is aangetoond dat het de verhoging van botresorptiemarkers remt. Anethole vermindert uiteindelijk osteoclastdifferentiatie en resorptieve functie door downstream routes en belangrijke regulerende factoren^{te remmen 39}. Onderzoek wijst uit dat anethole ontstekingsremmende eigenschappen vertoont en de adipogene differentiatie in mesenchymale stamcellen van het menselijk beenmerg (hBMSC's) ^remt40. Myristicine remt ontstekingen en beschermt de vaatvormige gladde spiercellen door de PI3K/Akt- en NF-κB-routes⁴¹ te onderdrukken. Ferroptose is een van de belangrijkste mechanismen achter de pathogenese van SONFH. Ferroptosis is een type geprogrammeerde celdood dat wordt veroorzaakt door lipideperoxidatie die afhankelijk is van ijzer. Myristicine voorkomt ferroptose en beschermt zo de redoxhomeostase van osteoblastcelmembranen⁴². Het andere ingrediënt van borneol is bevestigd dat het de vorming van actineringen, een kenmerk van het resorberen van osteoclasten dat celpolarisatie weerspiegelt, binnen 30 minuten^{en 43} minuten remoreert. Deze bevindingen wijzen erop dat deze componenten mogelijk zeer belangrijk zijn voor het beschermende effect van CC in SONFH, en het is het waard om verder onderzocht te worden. Binnen al deze ingrediënten werd Melilotocarpan A gekozen als de representatieve ligand omdat het in de MD-analyse de meest stabiele bindingsaffiniteiten vertoonde met meerdere kerndoelen. Onder de hoogst gerangschikte verbindingen vertoonde Melilotocarpan A consequent sterke bindende interacties met verschillende belangrijke eiwitten in het PPI-netwerk, wat suggereert dat het een belangrijk bioactief bestanddeel van CC kan zijn.

Daarnaast toonden de resultaten van het PPI-netwerk aan dat vooral HIF-1α en STAT3 mogelijk de kerndoelen zijn. HIF-1α is de centrale mediator van de cellulaire reactie op hypoxie. In SONFH-experimenten versterkt activatie van HIF-1α de angiogenese en botherstel, waardoor femorale hoofdnecrose⁴⁴ wordt verlicht. Daarnaast heeft onderzoek aangetoond dat HIF-1α een beschermend effect kan uitoefenen op kraakbeen onder hypoxische omstandigheden⁴⁵. Upregulatie van HIF-1α onderdrukt ferroptose en activeert STAT3 om de differentiatie van beenmergmonocyten tot osteoclasten⁴⁶ te versnellen. STAT3 is een signaaltransductie- en transcriptieactivator. HBMSC's bevorderen de omzetting van STAT3 naar p-STAT3, waardoor de proliferatie, migratie en anti-apoptotische effecten van chondrocyten onder hypoxische omstandigheden worden versterkt⁴⁷. STAT3 versterkt de osteogene differentiatie en anti-apoptotische effecten van hBMSC's, terwijl het hun secretie van de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) verhoogt om de microvasculaire regeneratie^{van botten te} bevorderen. AKT1 is een eiwitkinase die fungeert als een belangrijke mediator van angiogenese-signaaloverdracht. AKT1 is betrokken bij de koppeling van botangiogenese en osteogenese en de vorming van trabeculaire botten⁴⁹. Al met al convergeren deze hub-doelen op angiogenese, hypoxie-adaptatie, ontsteking en botremodelatie, wat suggereert dat CC beschermende effecten kan uitoefenen tegen SONFH door deze doelen en hun bijbehorende signaalroutes te moduleren.

Om het mechanisme van CC bij de verbetering van SONFH te onderzoeken, voerden de onderzoekers GO-analyse en KEGG-verrijkingsanalyse uit. GO-resultaten tonen aan dat de doelgenen voornamelijk verrijkt zijn met biologische functies zoals de respons op hypoxie, cellulaire respons op lipopolysakkaride en positieve regulatie van angiogenese. De KEGG-verrijkingsanalyse suggereerde dat de farmacologische effecten van CC bij SONFH voornamelijk verband houden met de AGE-RAGE-signaalroute bij diabetische complicaties, HIF-1α-signaalroute, lipide- en atherosclerose, en andere signaalwegen. SONFH treedt op wanneer de bloedtoevoer naar het femorale hoofd wordt onderbroken, wat leidt tot een gebrek aan voedingsondersteuning voor het femorale hoofd en celapoptose⁵⁰ veroorzaakt. HIF-1 bestaat uit HIF-1α en HIF-1β, waarbij HIF-1α een sleutelrol speelt in de transcriptierespons op hypoxische en ischemische omgevingen⁴⁷. Eerdere studies hebben aangetoond dat HIF-1α via de VEGF/AKT/mTOR-signaalcascade osteogenese en angiogenese coördineert, waardoor de osteogene differentiatie van adipos-afgeleide stamcellen cruciaal wordt versterkt. Na het optreden van ischemie ontwikkelt zich weefselhypoxie, wat leidt tot een duidelijke verhoging van HIF-1α binnen cellen. wat het expressieniveau van VEGF verhoogt en daardoor de vaskulaire reparatie en regeneratie^bevordert. Hypoxie verstoort de mitochondriale energieproductie en verhoogt de vorming van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Deze veranderingen bevorderen osteoclastogenese, remmen de activiteit van osteoblasten en leiden uiteindelijk tot apoptose van osteocyten. Hoge HIF-1α-expressie verschuift het cellulaire energiemetabolisme van oxidatieve fosforylering naar glycolyse, vermindert de ROS-productie en vermindert daarmee apoptose in osteoblasten en osteocyten^52,53. Cancellous bot ondersteunt de hematopoëtische functie van het beenmerg en slaat mineralen zoals calcium op. Verhoogde activiteit van HIF-1α kan direct de annulerende botvorming^{verhogen 54}. Daarnaast handhaaft HIF-1α de overleving en homeostase van chondrocyten onder hypoxische omstandigheden⁴⁵. Daardoor is de HIF-1α signaalweg een therapeutisch doelwit geworden voor ONFH, met een potentiële therapeutische toepassing voor ONFH.

In de AGE-RAGE signaalroute ontstaan geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's) uit de niet-enzymatische covalente kruisbinding van koolhydraten met eiwitten, vetten of andere biologische macromoleculen⁵⁵. AGEs kunnen de cellen en weefsels beschadigen door ontstekings- en oxiderende schade. Via vier paden worden signalen getransduceerd door de AGE-RAGE-interactie. Deze zijn 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK, en (4) NADPH oxidase-ROS⁵⁶. Uiteindelijk komt de gefosforyleerde NF-κB de kern binnen om de expressie van pro-inflammatoire cytokines, groeifactoren, profibrotische cytokines en oxidatieve stress te transcriberen. De studie heeft aangetoond dat AGE-RAGE osteoblastapoptose bevordert via de MAPK-signaalroute en de activatie van oxidatieve stress, en osteogene differentiatie remt door het onderdrukken van de niveaus van endoplasmatische reticulum-stresssensoren, evenals via DNA-methylering/de Wnt-route⁵⁷. Daarnaast hebben studies aangetoond dat AGEs en RAGEs betrokken zijn bij vasculaire verkalking⁵⁸.

In de lipiden- en atherosclerose-signaalroute activeren geoxideerde lipiden PPARγ. Het is een meesterregulator van adipogenese die osteogene differentiatie remt⁵⁹. Daarnaast hebben verschillende studies aangetoond dat lipiden de differentiatie en rijping van osteoklasten en osteoblasten beïnvloeden, waardoor de bothomeostase⁶⁰ wordt verstoord. Meerdere fundamentele studies hebben aangetoond dat apoptose significant betrokken is bij de fysiologische en pathologische mechanismen van SONFH. Latere in vivo dierproeven bevestigden verder dat de actieve fractie van CC effectief apoptose en ontsteking in SONFH onderdrukt, waardoor de ziekteprogressie wordt geremd.

In overeenstemming met deze bevindingen suggereren netwerkfarmacologie en experimentele analyses dat CC SONFH kan verbeteren door de aanpassing van hypoxie, het reguleren van angiogenese en het moduleren van metabole processen. Kwantitatieve micro-CT-analyse toonde aan dat CC-interventie de botvolumefractie (BV/TV) significant herstelde, trabeculaire scheiding verminderde (Tb.Sp, Tb.Th) en het herstel van botmicrostructuur bevorderde. De KEGG-verrijkingsanalyse benadrukte verder het HIF-1α signaalpad als een belangrijk mechanisme ten grondslag aan deze effecten. Gezamenlijk geven deze dierproeven aan dat CC SONFH kan verlichten door hypoxie- en ontstekingsgerelateerde biologische processen te reguleren en angiogenese en botremodellering te bevorderen, mogelijk via belangrijke routes zoals de HIF-1α signaalroute.

Hoewel er enkele belangrijke voorlopige bevindingen zijn gedaan, kent deze studie nog steeds enkele beperkingen. De auteurs vertrouwden uitsluitend op moderne bio-informatica-methoden, waaronder netwerkfarmacologie en MD, evenals enkele dierproeven, om de rol van CC in SONFH te onderzoeken. Daarom moeten de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de voorspellingen verder worden geverifieerd in vivo en in vitro experimenten. Deze studie geeft voorlopige aanwijzingen over de mechanismen waarmee CC SONFH verbetert, die verdere experimentele validatie vereisen. Door netwerkfarmacologie te integreren met MD, brachten de auteurs systematisch de kandidaat-bioactieve ingrediënten, belangrijke doelwitten en verrijkte routes van CC in SONFH in kaart. Concluderend onderzocht deze studie de potentiële beschermende effecten van CC in SONFH via integratieve netwerkfarmacologie en in vivo validatie. De resultaten geven aan dat de mechanismen voornamelijk geassocieerd waren met modulatie van het HIF-1 signaalpad en de bevordering van osteogene regeneratie. Zoals geïllustreerd in de bijbehorende figuur, moduleerde CC-amelioratie de expressie van belangrijke eiwitten, waaronder HIF-1α, VEGF en ALP, aanzienlijk op een dosisafhankelijke manier, wat de rol in het coördineren van hypoxie-adaptatie, angiogenese en osteogene activiteit verder ondersteunt. Deze bevindingen werden bevestigd door micro-CT-analyse, die aantoonde dat CC-interventie effectief de botvolumefractie herstelde en de trabeculaire microstructuur verbeterde.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4% PFA	biosharp	BL539A
Absolute ethenol	Sinopharm Group Co.Ltd	10009218
Alcian Blue Stain Kit	Solarbio	G1563
ALP	ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Scripps Research		Versie 1.2.7
AutoDockTools	Scripps Research		Versie 1.5.7
Bioinformatics online platform			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 force field			Gebruikt voor MD-parameterisatie
CTD			https://ctdbase.org
Cytoscape	Cytoscape Consortium		Versie 3.10.3; plugins: CytoHubba, CytoNCA
DAPI Staining Solution	Beyotime Biotech Inc	C1006-50mL
DAVID	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020; docking visualisatie
DisGeNET			https://disgenet.com
EDTA Decalcification	Beyotime Biotech Inc	C0167-3L
Endogenous Peroxidase Blocking Solution	Beyotime Biotech Inc	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Goat anti-rabbit IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
Goat Serum	Beyotime Biotech Inc	C0265
GraphPad Prism	GraphPad (Dotmatics)		Versie 10; statistische analyse en grafieken
GROMACS	GROMACS		Versie 2022; CHARMM36 force field
Herb 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1α	Hangzhou Huaan	HA721997
high resolution micro-CT equipment	Bruker	SkyScan
Lipinski Rule Filter			Mw ≤ 500; miLogP ≤ 5; HBD ≤ 5; HBA ≤ 10
lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	L4516
methylprednisolone	Sinopharm Group Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
Neutral balsam	biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
Paraffin	Sinopharm Group Co.Ltd	C416770020
Particle Mesh Ewald (PME)			Long-range electrostatics
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrödinger		Eiwitvisualisatie en -voorbereiding
R	CRAN		Versie 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
STRING			https://string-db.org
SwissADME	Swiss Institute		http://www.swissadme.ch
SwissTargetPrediction	Swiss Institute		http://www.swisstargetprediction.ch
TIP3P water model			Gebruikt voor solvatie
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	Hangzhou Huaan	ET1604-28
Weishengxin			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		Gebruikt voor gegevensverwerking, moleculaire docking en MD-simulaties
Xylene	Sinopharm Group Co.Ltd	10023418