Isolatie, synthese en karakterisering van CD47- en integrine α4/β1–gemodificeerde macrofagenmembraan-gecoate poly(melkzuur-co-glycolzuur) nanopels

Summary

Dit protocol maakt de bereiding en karakterisering mogelijk van CD47- en integrine α4/β1-co-gemodificeerde macrofagen, membraan-gecoate poly(melkzuur-co-glycolzuur) nanodeeltjes voor gerichte toepassingen van geneesmiddelafgifte.

Abstract

Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte en een belangrijke bijdrager aan cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit. Gerichte toediening van ontstekingsremmers aan atherosclerotische plaatsen blijft een aanzienlijke uitdaging. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en karakterisering van CD47- en integrine α4/β1–co-gemodificeerde macrofagenmembraan-gecoate colchicine-geladen poly(melkzuur-co-glycolzuur) nanodeeltjes (MMM/COL NP's). Het protocol omvat macrofagenmodificatie via plasmidetransfectie en endotheline-1 stimulatie, membraanisolatie, NP-fabricage en membraancoating. De resulterende MMM/COL NP's worden geëvalueerd met behulp van fysisch-chemische karakterisering, eiwitexpressie-analyse en in vitro- en in vivo-assays . Functionele validatie omvat de beoordeling van cellulaire associatie met geactiveerde endotheelcellen, opname van macrofagen, ontstekingsremmende effecten in schuimcellen en biodistributie in een muisatherosclerosemodel. Daarnaast worden belangrijke experimentele parameters en kwaliteitscontrolestappen benadrukt om reproduceerbaarheid en consistentie tussen laboratoria te waarborgen. Dit protocol biedt een robuuste en schaalbare benadering voor het genereren van biomimetische NP's voor gerichte geneesmiddelafgiftetoepassingen in atheroscleroseonderzoek.

Introduction

Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte die leidt tot fatale cardiovasculaire gebeurtenissen en beroertes door arteriële lumenstenose en een onstabiele plaque-ruptuur, wat een aanzienlijke wereldwijde gezondheidslast^{veroorzaakt 1,2,3}. Downregulatie van ontstekingsreacties op de atherosclerotische locatie is een belangrijk therapeutisch doelwit ^4,5. Colchicine, een krachtig ontstekingsremmer, heeft veelbelovend getoond in het verminderen van nadelige cardiovasculaire gebeurtenissen ^6,7. De klinische bruikbaarheid wordt echter beperkt door een smal therapeutisch venster en systemische bijwerkingen, waardoor gerichte toedieningssystemen nodig zijn om de ophoping op de plaqueplaats te verbeteren en tegelijkertijd toxiciteit⁸ te minimaliseren.

Celmembraan-gecoate nanodeeltjes (NP's) zijn uitgegroeid tot een krachtig platform voor gerichte geneesmiddelafgifte, waarbij gebruikgemaakt wordt van de natuurlijke biologische functies van broncellen ^9,10,11. Onder de celtypen die betrokken zijn bij atherosclerose spelen macrofagen een cruciale rol 12,13,14. Integrine α4/β1, tot expressie gebracht op macrofagen, bemiddelt de rekrutering naar atherosclerotische plaques door te binden aan het vaatceladhesiemolecuul-1 (VCAM-1) dat tot expressie komt op geactiveerde endotheelcellen (EC's). CD47, een "eet me niet"-signaal, maakt het mogelijk om fagocytose te ontwijken door het mononucleaire fagocytensysteem^15,16. Door macrofagenmembranen zo te ontwerpen dat ze deze eiwitten overexpresseren in vergelijking met native macrofagenmembranen, kan men NP's creëren met verbeterde targeting via integrine α4/β1–VCAM-1 interactie en verminderde fagocytose via CD47-gemedieerde signalering⁶. De dubbele modificatiestrategie verbetert native membraan-gecoate NP's en ligand-gebaseerde targetingsystemen door tegelijkertijd de targeting naar geactiveerde EC's te verbeteren en de fagocytische clearance te verminderen. In tegenstelling tot native macrofagenmembranen die alleen basisniveaus van deze eiwitten tot expressie brengen, biedt ons gemodificeerde membraan verbeterde functionaliteit zonder synthetische doelliganden te introduceren die immunogeniteit kunnen triggeren.

Dit protocol beschrijft de bereiding en karakterisering van colchicine-geladen poly(lactic-co-glycolic acid) NP's (COL NP's) die zijn geco-47- en integrine α4/β1-co-gemodificeerde macrofagenmembranen, waarmee gemodificeerde macrofage-membraan-gecoate NP's (MMM/COL NP's) worden gegenereerd. We beschrijven methoden voor genetische en farmacologische modificatie van RAW 264.7-macrofagen, isolatie van gemodificeerde membranen, voorbereiding en coating van PLGA-NP's, en uitgebreide in vitro en in vivo functionele assays. Deze methode biedt een reproduceerbaar kader voor het voorbereiden en evalueren van biomimetische NP's voor gerichte toepassingen van geneesmiddelafgifte in atheroscleroseonderzoek.

Protocol

Alle dierprocedures die in dit protocol zijn beschreven, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Nanjing Drum Tower Hospital en volgden de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren die zijn vastgesteld door de National Institutes of Health.

1. Aanpassing van RAW 264.7 macrofagen

1. Bereid RAW 264,7 cellen voor, voltooi Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS) en 1% penicilline–streptomycine, CD47 overexpressieplasmide, Lipofectamine 3000 transfectiereagentia, endotheline-1 (ET-1), fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS) en steriele weefselkweekvoorraden.
2. Kweek RAW 264,7 cellen in een bevochtigde broedmachine bij 37°C met 5% CO₂ en onderhoud de cellen totdat ze ongeveer 4–5 × 10^{5 cellen} per put in een 6-put plaat bereiken.
3. Voer CD47-modificatie uit
   1. Bereid plasmide-DNA-oplossing voor door 2,5 μg plasmide-DNA te mengen met 5 μL P3000-reagens in 125 μL Opti-MEM serumvrij medium.
   2. Bereid een transfectiereagensoplossing voor door 3,75 μL transfectiereagens te verdunnen in 125 μL serumvrij medium.
   3. Gebruik deze volumes voor een 6-put plaatformaat. Schaal alle componenten proportioneel voor andere formaten, terwijl je een DNA:P3000-verhouding van 1:2 (μg:μL) en een DNA:transfectie-reagensverhouding van 1:1,5 (μg:μL) handhaaft.
      OPMERKING: Gebruik bijvoorbeeld 10 μg DNA, 20 μL P3000 en 15 μL transfectiereagens voor schotels van 10 cm.
   4. Combineer de DNA-oplossing met de transfectie-reagensoplossing en breng 15 minuten uit bij 25°C.
   5. Voeg de transfectioncomplexen toe aan de cellen in antibioticavrij DMEM, aangevuld met 10% FBS bij ongeveer 2–2,5 × 10^{6 cellen} per 10 cm schotel.
   6. Vervang het medium door een nieuw volledig medium met antibiotica, 6 uur na transfectie.
4. Voer integrine α4/β1-modificatie uit
   1. Stimuleer getransfecteerde of niet-getransfecteerde cellen met 100 nM ET-1 in serumvrij medium gedurende 24 uur om integrine α4/β1-expressie op te reguleren.
      OPMERKING: Controleer de modificatie-efficiëntie met behulp van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en Western blot-analyse voor CD47, integrine α4 en integrine β1.

2. Isolatie van het gemodificeerde macrofagenmembraan (MMM)

1. Oogst de aangepaste RAW 264.7-cellen met een celschraper.
2. Centrifugeer de cellen op 900 × g gedurende 5 minuten op 4°C.
3. Was de celpellet drie keer met koude 1× PBS.
4. Sussief de celpellet opnieuw in 2 mL voorgekoelde hypotone lysebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride) en incubeer de suspensie op ijs gedurende 15 minuten.
5. Vries de suspensie 2 minuten in vloeibare stikstof in en ontdooi het daarna 5 minuten in een waterbad van 37°C. Herhaal de vries-ontdooicyclus vijf keer om de cellen volledig te laten lyseren.
   VOORZICHTIG: Vloeibare stikstof kan ernstige cryogene brandwonden veroorzaken. Behandel met geschikte geïsoleerde handschoenen en gezichtsbescherming.
6. Centrifugeer het lysaat op 850 × g gedurende 10 minuten bij 4°C om kernen en ongebroken cellen te verwijderen.
7. Centrifugeer het verzamelde supernatant op 15.000 × g gedurende 30 minuten bij 4°C. Om een hogere membraanzuiverheid te verkrijgen, breng je het supernatant dat na centrifugatie van 15.000 × g is verkregen over in ultracentrifugebuizen en centrifugeer je bij 100.000 × g gedurende 1 uur bij 4°C met een ultracentrifuge.
   VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat ultracentrifugebuizen goed in balans zijn en geschikt zijn voor hogesnelheidscentrifugatie om rotoronbalans of falen te voorkomen.
   OPMERKING: Ultracentrifugatie levert gezuiverde plasmamembranen op met verminderde intracellulaire organelbesmetting.
8. Verzamel de pellet met MMM-fragmenten en suspendeer deze opnieuw in 300 μL van 1× PBS of lysisbuffer om een eiwitconcentratie van ongeveer 1–2 mg/mL te verkrijgen.
9. Bepaal de membraaneiwitconcentratie met behulp van een BCA-eiwitkwantificatie-assaykit.
   OPMERKING: Geïsoleerde membranen kunnen worden opgeslagen bij −80°C voor later gebruik.

3. Bereiding van colchicine-geladen PLGA NP's (COL NP's)

1. Los 10 mg PLGA op (50:50, MW 90.000) en 1 mg colchicine in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO).
   VOORZICHTIG: DMSO kan de huid binnendringen en de opname van andere stoffen verbeteren. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (nitril handschoenen, labjas en veiligheidsbril) bij het hanteren. Verzamel DMSO-bevattende oplossingen als organisch oplosmiddelafval en voer het af via erkende diensten voor de verwijdering van gevaarlijk afval. Colchicine is giftig en mogelijk teratogeen. Verzamel alle met colchicine besmette materialen (oplossingen, handschoenen en tubes) als gevaarlijk farmaceutisch afval en voer het af via erkende diensten voor de verwijdering van gevaarlijk afval volgens institutionele en lokale regelgeving.
2. Roer de oplossing op 500 tpm met een magnetische roeraar en een 10 mm teflon-gecoate roerstang bij 25°C.
3. Voeg 4 ml ultrazuiver water druppelgewijs toe bij ongeveer 1 mL/min met een spuitpomp uitgerust met een 5 ml spuit en een 26G naald bij 25°C.
4. Blijf het mengsel 3 uur roeren om NP te vormen.
5. Breng de NP-suspensie over in een dialysezak (MWCO 3.500 Da).
6. Dialyseer tegen 2 L gedestilleerd water bij 4°C onder zacht roeren bij 200 tpm.
7. Ga 24 uur door met dialyse en vervang de dialysebuffer volledig na 6, 12 en 24 uur om vrije colchicine en DMSO te verwijderen.
   VOORZICHTIG: Verzamel alle organische oplosmiddelen en reagentia, inclusief die van dialyse, als organisch chemisch afval. Gooi het niet weg in het afvoer. Volg de institutionele protocollen voor de verwijdering van gevaarlijk afval.
8. Verzamel de gedialyseerde COL NP-suspensatie en bewaar bij 4°C.
   OPMERKING: COL NP's kunnen worden bewaard bij 4°C voor kortdurend gebruik (tot 3 dagen). Voor fluorescentielabeling voeg 0,1% (w/w) van 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) kleurstof toe aan de PLGA-oplossing tijdens stap 3.1.
9. Controleer het verwijderen van DMSO en gratis colchicine
   1. Verzamel het uiteindelijke dialysaat (de buffer na de laatste verandering bij 24 uur) en analyseer het met ultraviolet-zichtbare (UV-vis) spectrofotometrie.
   2. Scan het dialysaat van 200 tot 400 nm en vergelijk het met een controlemonster (verse dialysebuffer).
   3. Bevestig dat er geen absorptiepiek aanwezig is bij ongeveer 210 nm (kenmerkend voor DMSO) of bij 345 nm (kenmerkend voor colchicine), wat wijst op succesvolle verwijdering van restoplosmiddel en vrij geneesmiddel.
   4. Of bepaal de resterende DMSO-concentratie met behulp van een DMSO-assaykit volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de resterende DMSO onder 0,1% (v/v) ligt om cytotoxiciteit in downstream assays te voorkomen.

4. Fabricage van membraangecoate NP's (MMM/COL NP's)

1. Sonicate de geïsoleerde MMM-suspensie (vanaf stap 2.7) gedurende 20 minuten met een waterbadsonicator op 40 kHz en 110 W. Houd het monstervolume op 1 mL in een 1,5 mL buis en de temperatuur onder 25°C met een ijsbad indien nodig.
2. Extrudeer de sonicatie-membraansuspension door een polycarbonaatmembraanfilter met een poriegrootte van 400 nm met behulp van een mini-extruder om membraanblaasjes te vormen.
3. Meng de COL NP's (vanaf stap 3.5) met de MMM-blaasjes bij een membraaneiwit-tot-PLGA massaverhouding van 1:1.
   1. Gebruik een membraan-suspensie met 10 mg eiwit voor 10 mg PLGA, bepaald door een protenekwantificatie-assay.
   2. Meng voorzichtig de COL NP's met de MMM-blaasjes 15 keer omhoog en omlaag met een 1 mL pipet.
4. Co-extrudeer het mengsel door een polycarbonaatmembraanfilter met een poriegrootte van 200 nm en herhaal de extrusie gedurende 15 passes.
5. Verzamel de resulterende suspensie met MMM/COL NP's en bewaar deze bij 4°C voor direct gebruik.

5. Karakterisering van NP's

1. Meet de hydrodynamische diameter, polydispersiteitsindex (PDI) en zetapotentiaal met dynamische lichtverstrooiing (DLS) onder de volgende omstandigheden: temperatuur, 25°C; terugverstrooiingshoek, 173°; evenwichtigheidstijd, 2 minuten; en drie replicatmetingen per monster.
2. Verdun de monsters 20 keer in gedeïoniseerd water (eindconcentratie, ongeveer 0,1 mg/mL).
   OPMERKING: Verdunning minimaliseert meerdere verstrooiingseffecten.
3. Visualiseer de kern-schilstructuur van MMM/COL NP's met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
   1. Breng 5 μL NP-suspensie (ongeveer 0,1 mg/mL) op een gloei-geladen, koolstofgecoat koperen rooster (300 mesh).
   2. Laat het monster 2 minuten adsorberen bij 25°C.
   3. Verwijder overtollige vloeistof door voorzichtig de rand van het rooster met filterpapier aan te raken.
   4. Breng 5 μL 1% uranylacetaatoplossing aan op het rooster en incubeer 1 minuut bij 25°C.
   5. Verwijder overtollige beits met filterpapier.
   6. Laat het rooster minstens 10 minuten volledig aan de lucht drogen voordat je beelden neemt.
      WAARSCHUWING: Uranylacetat is giftig en radioactief. Behandel het met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, labjas en oogbescherming) en voer afval af volgens de institutionele richtlijnen voor gevaarlijke stoffen.
4. Label het membraan met 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat (DiO) kleurstof tijdens stap 2 of door intacte cellen te labelen voorafgaand aan membraanisolatie, en merk de PLGA-kern met DiI.
5. Analyseer de co-lokalisatie van DiO (groen) en DiI (rood) signalen met behulp van confocale laserscanning microscopie (CLSM).
   1. Stel excitatie-/emissieparameters als volgt in: DiO (groen), excitatie 488 nm, emissie 550 nm; DiI (rood), excitatie 561 nm, emissie 620 nm.
   2. Gebruik een 60× olie-onderdompelingsobjectief (numerieke apertuur, 1,4).
   3. Zet het gaatje op 1 Airy-unit.
   4. Pas de detectorversterking aan om pixelverzadiging te voorkomen.
   5. Neem beelden op met een resolutie van 1024 × 1024 pixels met 2× lijngemiddelde.
   6. Houd het laservermogen onder de 5% om fotobleaching te minimaliseren.
6. Analyseer de aanwezigheid van CD47, integrine α4 en integrine β1 op het MMM/COL NP-oppervlak met behulp van Western blot-analyse.
7. Bepaal de lading en afgifte van het medicijn
   1. Lys een volume van 100 μL NP's in DMSO en meet de colchicineabsorptie bij 345 nm om de geneesmiddelbelasting en inkapselingsefficiëntie te bepalen.
   2. Doe 1 ml MMM/COL NP-suspensie (met ongeveer 100 μg colchicine) in een dialysezak (MWCO, 3.500 Da).
   3. Sluit de zak af en dompel hem onder in 50 mL PBS (pH 7,4) met 20% FBS in een glazen beker van 100 mL.
   4. Houd het loslaatmedium op 37°C onder constant roeren op 100 tpm met een magnetische roermachine met een 20 mm teflonbeklede roerstang.
   5. Houd de gootcondities gedurende het hele experiment in stand.
      OPMERKING: Colchicine-oplosbaarheid in PBS met 20% FBS is >1 mg/mL; De maximale colchicineconcentratie in het vrijgavemedium is <10% van de verzadiging.
   6. Op vooraf bepaalde tijdstippen (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 en 62 uur) wordt 500 μL loslaatmedium ontnomen.
   7. Vervang het teruggetrokken volume door een gelijke hoeveelheid verse vooropgewarmde PBS (37°C) met 20% FBS.
   8. Meet de colchicineconcentratie in de teruggetrokken monsters met UV–Vis-spectrofotometrie op 345 nm.
   9. Voer alle metingen in drievoud uit.

6. In vitro functionele assays

1. Zaad menselijke navelvenendotheelcellen (HUVECs). Stimuleer de cellen met 10 ng/mL tumornecrosefactor alfa (TNF-α) gedurende 24 uur om VCAM-1 op te reguleren.
2. Cellulaire associatie van MMM/DiI NP's met HUVECs
   1. Incubeer de cellen met DiI-gelabelde MMM/COL NP's (MMM/DiI NP's) bij een concentratie van 50 μg/mL (gebaseerd op PLGA-kernmassa) gedurende 4 uur bij 37°C in een atmosfeer van 5% CO₂.
   2. Was de cellen drie keer met voorgekoelde PBS. Centrifugeer de cellen op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C na elke wasbeurt.
   3. Sussen de gewassen cellen opnieuw in PBS met 0,5% rundserumalbumine (BSA). Pas de eindcelconcentratie aan op 1 × 10^{6 cellen} /mL.
   4. Stel de instrumentparameters in voor flowcytometrie of CLSM. DiI-fluorescentie detecteren met excitatie bij 549 nm en emissie bij 565 nm (PE-kanaal).
   5. Verkrijg gegevens uit de monsters. Verzamel minstens 10.000 gebeurtenissen per monster voor flowcytometrie of vang representatieve velden voor CLSM.
   6. Selecteer vijf representatieve velden per monster uit verschillende regio's, exclusief randen, met een 60× olie-onderdompelingslens. Zorg ervoor dat cellen intact zijn en niet overlappen.
   7. Maak de monsters blind voordat je beelden verkrijgt. Selecteer velden door het level willekeurig te verplaatsen in plaats van handmatig specifieke gebieden te kiezen.
   8. Pas identieke drempel- en analyseparameters toe op alle monsters onder geblindeerde omstandigheden.
   9. Sluit celafval uit met FSC-A/SSC-A gating. Selecteer singletcellen met FSC-A/FSC-H gating.
   10. Selecteer levende cellen met behulp van levensvatbaarheidskleurstof. Voeg 7-aminoactinomycine D (7-AAD) toe bij 1 μg/mL, incubeer 5 minuten bij 4°C in het donker, en gebruik het voor live cell gateing.
   11. Analyseer de fluorescentieintensiteit om cellulaire associatie te kwantificeren. Gebruik de gemiddelde fluorescentieintensiteit als kwantificatiemaatstaf. Voer data-analyse uit met de FlowJo (v10.8.1) flowcytometrie-analysesoftware.
3. Cellulaire opname van MMM/DiI NP's door RAW 264.7 macrofagen
   1. Incubeer DiI-gelabelde MMM/COL NP's (MMM/DiI NP's) met ongemodificeerde RAW 264,7 macrofagen bij een concentratie van 50 μg/mL (gebaseerd op PLGA-kernmassa) gedurende 4 uur bij 37°C in een atmosfeer van 5% CO₂.
   2. Bereid de cellen voor op analyse zoals beschreven in stappen 6.2.2–6.2.3.
   3. Stel instrumentparameters in voor DiI-detectie met excitatie bij 549 nm en emissie bij 565 nm (PE-kanaal).
   4. Verkrijg gegevens uit de monsters. Verzamel minstens 10.000 gebeurtenissen per monster.
   5. Sluit celafval uit met FSC-A/SSC-A gating. Selecteer singletcellen met FSC-A/FSC-H gating.
   6. Selecteer levende cellen met behulp van levensvatbaarheidskleurstof. Voeg 7-AAD toe bij 1 μg/mL, incubeer 5 minuten bij 4 °C in het donker, en gebruik het voor live cell gateing.
   7. Analyseer de fluorescentieintensiteit om de cellulaire opname te kwantificeren. Gebruik de gemiddelde fluorescentieintensiteit als kwantificatiemaatstaf. Voer data-analyse uit met behulp van flow cytometrie-analysesoftware.
4. Schuimcelassay
   1. Differentieer RAW 264,7 cellen tot schuimcellen door te incuberen met geoxideerd low-density lipoproteïne (oxLDL) bij 50 μg/mL gedurende 48 uur. Bevestig de vorming van schuimcellen door Oil Red O-kleuring, aangegeven door intracellulaire lipidenophoping.
   2. Behandel schuimcellen met vrije colchicine, COL NP's of MMM/COL NP's bij een equivalente colchicineconcentratie van 1 μM. Incubeer de cellen 24 uur bij 37°C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂.
      OPMERKING: Selecteer deze concentratie op basis van voorlopige dosis-respons experimenten die de cellevensvatbaarheid en ontstekingsremmende effectiviteit evalueren.
   3. Meet de niveaus van inflammatoire cytokines met behulp van een enzym-gekoppelde immunosorbentassay (ELISA).
      1. Verzamel celkweek-supernatanten direct na de behandeling (24 uur na behandeling).
      2. Centrifugeer de platen op 300 × g gedurende 5 minuten op 4°C om celresten te verwijderen.
      3. Breng de geklaarde supernatanten over in schone buizen en bewaar bij −80°C tot analyse.
      4. Meet TNF-α en interleukine-6 niveaus met ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant.
      5. Voer alle metingen uit in driedubbele putten en herhaal het experiment drie onafhankelijke keren.
      6. Rapporteer cytokineconcentraties als absolute waarden (pg/mL) zonder extra normalisatie, aangezien de celzaaidichtheid en behandelingscondities consistent zijn in alle groepen.

7. In vivo therapeutische toepassing in een atherosclerosemodel

OPMERKING: Alle dierprocedures moeten worden goedgekeurd door de relevante Commissie voor Institutionele Dierenverzorging en Gebruik.

1. Stel diermodel vast
   1. Vestig een kwetsbaar atherosclerotisch plaquemodel bij 8 weken oude mannelijke E knockout (ApoE⁻/⁻) muizen (C57BL/6 achtergrond).
   2. Geef muizen een vetrijk dieet met 15% vet en 0,25% cholesterol ad libitum gedurende 1 week voor de operatie en ga 4 weken na de operatie door.
   3. Verdoving van muizen met isoflurane (2%–3% voor inductie en 1,5%–2% voor onderhoud) en toediening van buprenorfine (0,1 mg/kg, subcutaneus) voor pijnstilling tijdens een carotisvernauwingsoperatie.
   4. Vernauw de linker arterie common carotis met een naald van 0,3 mm diameter naast de slagader. Bind een 6-0 zijden ligatuur om zowel de slagader als de naald, en verwijder vervolgens de naald om gedeeltelijke vernauwing te creëren.
   5. Bevestig de vorming van kwetsbare plaque 4 weken na de operatie door histologische beoordeling.
   6. Voer Hematoxyline en Eosin (H&E), Oil Red O en Masson's trichrome kleuring uit om plaquemorfologie, lipidenafzetting en collageengehalte te evalueren.
   7. Definieer kwetsbare plaques aan de hand van plaqueoppervlak > 40% van de dwarsdoorsnede van het vat, de vezelige kapdikte < 120 μm, het lipidenkernoppervlak > 40% van het totale plaqueoppervlak en aanzienlijke CD68-positieve macrofageninfiltratie.
2. Injecteer 100 μL DiI-gelabelde MMM/COL NP's intraveneus via de staartader in een dosis van 2 mg/kg (gebaseerd op PLGA-kernmassa).
   1. Beeld muizen 1 dag na injectie met een in vivo beeldvormingssysteem om de biodistributie van het hele lichaam te beoordelen.
      1. Verdoof muizen met isofluraan (3% voor inductie en 1,5%–2% voor onderhoud, met zuurstofstromen van respectievelijk 1 en 0,5 L/min). Monitor de diepte van de anesthesie met behulp van ademhalingsfrequentie en teenknijpreflex.
      2. Plaats muizen op rugligging op een verwarmd podium van 37°C om tijdens de beeldvorming de lichaamstemperatuur te behouden.
      3. Neem fluorescentiebeelden vast met DiI-instellingen (excitatie 549 nm en emissie 565 nm) met een CY3- of TRITC-filterset. Gebruik automatische belichtingsmodus (meestal 50–200 ms) en epifluorescentie-opname.
      4. Leg gelijktijdig bijpassende brightfield-beelden vast voor anatomische referentie met een resolutie van 1024 × 1024 pixels.
   2. Oogst belangrijke organen en halsslagaders voor ex vivo fluorescentiebeeldvorming.
      1. Verdoof muizen met isoflurane (3% voor inductie en 2,5%–3% voor onderhoud).
      2. Perfuseren muizen met 20 mL ijskoude PBS (pH 7,4) via een linker ventrikelpunctie bij een debiet van 5 mL/min om restbloed en ongebonden NP's te verwijderen.
      3. Oogst organen (hart, aorta, lever, milt, nier en long) direct na de perfusie 24 uur na de injectie.
      4. Spoel de geoogste organen uit met ijskoude PBS om het bloed aan de oppervlakte te verwijderen.
      5. Open de aorta in de lengte en pen deze plat (endotheelzijde omhoog) op een zwarte siliconen plaat met roestvrijstalen pennen.
      6. Houd weefsels in ijskoude PBS en voer ex vivo fluorescentiebeeldvorming uit binnen 30 minuten na de oogst. Verwijder overtollig PBS direct voor beeldvorming van het weefseloppervlak.
3. Voer dosering en behandeling uit
   1. Bepaal de colchicinedosis uit een voorlopige dosis-responsstudie (0,01–0,45 mg/kg, n = 7/groep). Selecteer 0,05 mg/kg colchicine als therapeutische dosis.
   2. Geef 100 μL via een staartveninjectie, wat overeenkomt met een NP-dosis van 2 mg/kg (PLGA kernmassa) en een colchicinedosis van 0,05 mg/kg. Injecteer één keer per dag gedurende 14 opeenvolgende dagen.
   3. Randomiseer muizen in behandelgroepen (PBS, vrije colchicine en MMM/COL NP's) met behulp van een random number generator. Voer alle kwantificaties uit door twee waarnemers die blind zijn voor behandelgroepen.
   4. Pas humane eindpunten toe, waaronder >20% gewichtsverlies, verminderde mobiliteit of tekenen van stress.
4. Voer eindpuntanalyse uit
   1. Euthanaceer muizen 24 uur na de laatste injectie. Oogst halsslagaders en aorta's op. Beoordeel de plakbelasting door middel van de verkleuring van de aortas in het gezicht.
   2. Kwantificeer plaque-oppervlakte
      1. Kwantificeer plaquegebied als Oil Red O-positief oppervlak percentage van de totale aorta-lumenoppervlakte in doorsneden (vijf secties per muis) met behulp van beeldanalysesoftware.
      2. Open de afbeelding in de ImageJ-beeldanalysesoftware.
      3. Klik op Afbeelding → Typ → 8-bit om de afbeelding naar grijstinten te converteren.
      4. Klik op afbeelding → → drempel aan te passen. Selecteer de Otsu-methode en pas de drempel toe om Oil Red O-positieve regio's te identificeren.
      5. Pas dezelfde drempelparameters toe op alle voorbeeldafbeeldingen en registreer de drempelinstellingen voor verificatie.
      6. Klik op Analyseren → Metingen instellen en selecteer Oppervlakte.
      7. Klik op Analyze → Measure om de geselecteerde gebieden te kwantificeren.
      8. Exporteer de gekwantificeerde data.
   3. Evalueer de stabiliteit van plaque
      1. Evalueer de stabiliteit van plaque door histologische kleuring van carotisdoorsneden met behulp van H&E, Oil Red O en Masson's trichrome kleuring. Kwantificeer collageen als het tricroom-positieve blauwe gebied van Masson's plaque-gebied.
      2. Bereid paraffine-ingesloten secties voor op een dikte van 5 μm en op optimale snijtemperatuur ingebedde bevroren secties met een dikte van 8 μm.
      3. Voer H&E-kleuring uit door secties te deparaffiniseren en te rehydrateren, gevolgd door hematoxylinekleuring van 5 minuten en eosinekleuring van 2 minuten bij kamertemperatuur (RT; 23°C ± 2°C).
      4. Voer Oil Red O-kleuring uit op bevroren secties door 15 minuten te incuberen met Oil Red O-werkoplossing bij RT. Differentieer secties in 60% isopropanol gedurende 2 seconden en spoel af met gedestilleerd water.
      5. Voer Masson's tricchrome kleuring uit volgens de instructies van de kit door secties te incuberen met Weigert's ijzerhematoxyline gedurende 10 minuten, Ponceau-zuurfuchsine gedurende 5 minuten, fosfofolybdicezuur gedurende 5 minuten en anilineblauw voor 5 minuten bij RT.
      6. Open histologische afbeeldingen in beeldanalysesoftware.
      7. Pas kleurdrempels toe om collageen-positieve gebieden te identificeren. Voer automatische drempelwaarden uit en pas dezelfde parameters toe op alle voorbeeldafbeeldingen.
      8. Noteer drempelinstellingen voor verificatie.
      9. Definieer het totale plaquegebied als de som van alle plaquegebieden binnen de vasculaire intima.
      10. Meet plaquegebied door handmatig de plaquegrenzen te traceren of door automatische drempelsegmentatie te gebruiken om alle plaqueregio's te identificeren.
      11. Meet het collageen-positieve gebied.
      12. Bereken het collageengehalte als collageen-positief oppervlak gedeeld door het totale plaqueoppervlak × 100%.
   4. Macrofageninhoud beoordelen
      1. Voer CD68 immunofluorescentiekleuring uit om het macrofagengehalte te beoordelen. Kwantificeer het macrofagengehalte als het CD68-positieve percentage van plaque.
      2. Bereid weefseldoorsneden voor (5 μm dikte voor paraffine-ingebedde doorsneden). Voer antigeenwinning uit met een citratbuffer (pH 6,0) onder hoge druk gedurende 2 minuten.
      3. Blok secties met 5% BSA gedurende 30 minuten bij RT.
      4. Incubeer secties met konijn anti-muis CD68 monoklonaal primair antilichaam (kloon D4B9C, verdunning 1:200 in 1% BSA) 's nachts bij 4°C.
      5. Incubeer secties met Alexa Fluor 488-geconjugeerde geitenantikonijn IgG secundaire antistof (verdunning 1:500) gedurende 1 uur bij RT.
      6. Tegenkleurkernen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 5 minuten.
      7. Open fluorescentiebeelden in beeldanalysesoftware.
      8. Identificeer CD68-positieve regio's met behulp van drempelwaarde. Voer automatische drempelwaarden uit en pas dezelfde parameters toe op alle voorbeeldafbeeldingen.
      9. Noteer drempelinstellingen voor verificatie.
      10. Meet het CD68-positieve gebied.
      11. Bereken het macrofagengehalte als CD68-positieve oppervlakte gedeeld door het totale plaqueoppervlak × 100%.

Results

DLS-metingen werden uitgevoerd met een Zetasizer Nano ZS-systeem bij 25°C met een terugverstrooiingshoek van 173°. De monsters werden 20 keer verdund in gedeïoniseerd water (eindconcentratie ongeveer 0,1 mg/mL) en 2 minuten voor de meting in evenwicht gebracht. Elk monster werd in drievoud gemeten en de resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SD. DLS en TEM tonen een toename in NP-grootte na membraancoating en bevestigen de vorming van een kern–schaalstructuur (

Discussion

Dit protocol biedt een uitgebreide methode voor het construeren en toepassen van CD47- en integrine α4/β1–co-gemodificeerde macrofagenmembragen-gecoate NP's voor gerichte atherosclerosetherapie. De belangrijkste voordelen van dit systeem zijn actieve targeting via de integrine α4/β1–VCAM-1 interactie en een verminderde macrofagenopname die geassocieerd wordt met CD47-gemedieerde signalering, zoals ondersteund door in vitro opnametests (Figuur 3) en in vi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (USA)	A1310	Viabiliteitskleurstof voor flow cytometry live/dead discriminatie
Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit anti-konijn IgG	Thermo Fisher Scientific (USA)	A-11008	Secundaire antilichaam voor CD68 immunofluorescentie kleuring
Anti-muis CD47 antilichaam	Abcam (USA)	ab214453	Gebruikt voor Western blot analyse om CD47 expressie te verifiëren
Anti-muis integrine α4 antilichaam (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (USA)	sc-376334	Gebruikt voor Western blot analyse om integrine α4 expressie te verifiëren
Anti-muis integrine β1 antilichaam (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (USA)	sc-374429	Gebruikt voor Western blot analyse om integrine β1 expressie te verifiëren
ApoE-/- muizen	The Jackson Laboratory (USA)	N/A	Gebruikt voor in vivo atherosclerose model
BCA assay kit	Thermo Fisher Scientific (USA)	23225	Gebruikt om eiwitconcentratie te bepalen
Zwarte siliconen plaat	N/A	N/A	Gebruikt om aorta te monteren voor ex vivo beeldvorming
CD47 plasmide (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (China)	G0177361-1	Bevat muis Cd47 gen voor overexpressie
Colchicijn	Sigma-Aldrich (USA)	C9754	Therapeutisch lading in nanodeeltjes
Confocale laser scanning microscoop	Leica Microsystems	TCS SP8	Gebruikt voor fluorescentie beeldvorming en co-lokalisatie analyse
Citraat buffer (pH 6.0)	Thermo Fisher Scientific (USA)	N/A	Gebruikt voor antigeen herstel in immunofluorescentie kleuring
Dialyse buis (MWCO 3.500 Da)	Sigma-Aldrich (USA)	PURD35030	Gebruikt voor nanodeeltje zuivering
Dimethyl sulfaat (DMSO)	Sigma-Aldrich (USA)	D2447	Oplosmiddel voor nanodeeltje voorbereiding
DiI (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchloraat)	Beyotime (China)	C1036	Fluorescente markering van nanodeeltje kern
DiO (3,3′-dioctadecyloxyacarbocyanine perchloraat)	Beyotime (China)	C1038	Fluorescente markering van macrofaag membraan
DiR	Beyotime (China)	Y239280	Gebruikt voor in vivo fluorescentie beeldvorming
DAPI	Thermo Fisher Scientific (USA)	D3571	Kerntellerkleur voor fluorescentie beeldvorming
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (USA)	11965092	Celcultuur medium
Dynamische lichtverstrooiing analyazer (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (UK)	N/A	Gebruikt voor dynamische lichtverstrooiing (DLS) metingen van nanodeeltje grootte, PDI, en zeta potentiaal
ELISA kit	R&D Systems (USA)	Afhankelijk van doel cytokine	Gebruikt om inflammatoire cytokines te kwantificeren
Endotheline-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (USA)	E7764	Gebruikt om integrine α4/β1 expressie te stimuleren
Foetaal bovien serum (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, USA)	10091148	Aanvulling voor celcultuur medium
Flow cytometer	BD Biosciences (USA)	FACSCalibur	Gebruikt voor fluorescentie signaal acquisitie
Flow cytometry analyse software (FlowJo v10.8.1)	BD Biosciences (USA)	N/A	Gebruikt voor flow cytometry data analyse
Menselijke umbilicale vene endotheel cellen (HUVECs)	FuHeng Biotechnologies (China)	FH1122	Gebruikt voor in vitro targeting assays
Beeldanalyse software (ImageJ)	National Institutes of Health (USA)	N/A	Gebruikt voor kwantitatieve beeldanalyse
In vivo beeldvorming systeem	PerkinElmer (USA)	IVIS Lumina III	Gebruikt voor whole-body fluorescentie beeldvorming
Isopropanol (60%)	Sigma-Aldrich (USA)	34863	Gebruikt voor differentiatie tijdens Oil Red O kleuring
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific (USA)	L3000001	Transfectie reagens
Magnetische roerder en roerstaaf	N/A	N/A	Gebruikt voor nanodeeltje voorbereiding
Masson’s Trichrome kleuring kit	Abcam (USA)	ab150686	Gebruikt voor collageen kleuring
Mini extruder	Avanti Polar Lipids (USA)	610000	Gebruikt voor membraan extrudering
Muis RAW 264.7 cel lijn	FuHeng Biotechnologies (China)	FH0328	Bron van macrofagen
Muis gladde spiercel lijn	FuHeng Biotechnologies (China)	FH-Y063	Gebruikt voor veiligheidsevaluatie
Oil Red O	Sigma-Aldrich (USA)	O0625	Gebruikt voor lipide kleuring
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (USA)	31985062	Gereduceerd serum medium voor transfectie
Geoxideerde lagedichtheids lipoproteïne (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (China)	YB-002	Gebruikt om foam cel formatie te induceren
Penicilline–streptomycine	Thermo Fisher Scientific (USA)	15140122	Antibioticum aanvulling voor celcultuur
Fenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich (USA)	78830	Protease remmer
Fosfaat-gebufferde saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific (USA)	10010023	Was en verdunnings buffer
Poly(lactisch-co-glycolzuur) (PLGA, 50:50; MW 90.000)	Dalian Meilun Biotechnology (China)	MB5649-1	Polymeer voor nanodeeltje fabricage
Polycarbonaat membraan