Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

P. gingivalis/F. nucleatum bij chronische apicale parodontitis zijn geassocieerd met zwangerschapsverkorting via de TLR4/MyD88/NF-κB-route.

166 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70793

⸱

15 mei 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cariology and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, The Affiliated Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, 2Development and Related Diseases of Women and Children Key Laboratory of Sichuan Province, 3Stomatology Disease Institute of Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang Medical University, 4Department of Endodontics, Urumqi Stomatological Hospital, 5Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Chronische apicale parodontitis-geassocieerde orale pathogenen (P. gingivalis, F. nucleatum) worden geëvalueerd met behulp van muis-CAP-modellen en menselijke trofoblast-infectietests. Zwangerschapsverkorting wordt waargenomen naast placenta-inflammatoire activatie die consistent is met TLR4/MyD88/NF-κB-signalering. Bacterieel DNA is detecteerbaar in placenta/vasculaire weefsels, wat een hematogene link en potentiële interventiedoelen ondersteunt.

Samenvatting

Spontane vroeggeboorte (sPTB; bevalling vóór 37 weken) blijft een belangrijke oorzaak van neonatale sterfte, en intrauteriene infectie wordt in een aanzienlijk deel van de gevallen betrokken. Opkomend bewijs koppelt orale pathogenen zoals Porphyromonas gingivalis en Fusobacterium nucleatum aan nadelige gestationele uitkomsten; de mechanistische paden die chronische apikale parodontitis (CAP) verbinden met het zwangerschapsrisico blijven echter onvolledig gedefinieerd. Bij zwangere C57BL/6J-muizen werd CAP vastgesteld door wortelkanaalinoculatie en aangevuld met een staart-ader challengemodel met bacteriële suspenties (1 × 108 CFU/mL). Zwangerschapslengte, placentahistopathologie, ontstekingsmarkers en bacteriële DNA-signalen werden beoordeeld met qPCR. Parallel werden menselijke trofoblasten blootgesteld aan P. gingivalis of F. nucleatum (MOI = 50, 24 uur) om inflammatoire signalering te onderzoeken die consistent is met activatie van de TLR4/MyD88/NF-κB-as. In vergelijking met de controlegroep vertoonden CAP-geassocieerde groepen zwangerschapsverkorting (mediaan 19,5 versus 20,5 dagen), vergezeld van verhoogde placenta-inflammatoire waarden (inclusief verhoogde IL-1β en TNF-α) en histopathologische kenmerken die consistent zijn met inflammatoire schade. qPCR gaf verder de aanwezigheid van bacteriële DNA-signalen in placenta- en vaatweefsels aan. In trofoblast-assays veroorzaakte F. nucleatum sterkere pro-inflammatoire responsen dan P. gingivalis, in combinatie met verhoogde NF-κB-fosforylering. Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat CAP-geassocieerde orale pathogenen kunnen bijdragen aan zwangerschapsverkorting door placenta-ontsteking te stimuleren via TLR4/MyD88/NF-κB-signalering, wat een oraal-placenta microbiële as ondersteunt als potentieel doelwit voor het verminderen van infectiegerelateerde zwangerschapsrisico.

Inleiding

Spontane vroeggeboorte (sPTB) wordt gedefinieerd als de bevalling tussen 20 en 37 weken zwangerschap zonder medische interventie1. Als een kritieke wereldwijde volksgezondheidszorg varieert de incidentie van sPTB van ongeveer 5%–9% in ontwikkelde landen tot 12%–18% in gebieden met beperkte middelen 2,3. Vroeggeboorte en de complicaties daarvan blijven een van de belangrijkste oorzaken van sterfte bij kinderen jonger dan 5 jaar, en zijn verantwoordelijk voor ongeveer één miljoen neonatale sterfgevallen perjaar. Overlevenden ervaren vaak zowel directe complicaties, zoals het ademhalingsnoodsyndroom, als langdurige gevolgen, waaronder cerebrale parese en ontwikkelingsachterstanden 5,6, waardoor aanzienlijke economische lasten voor gezinnen en samenleving worden opgelegd 7,8.

De etiologie van sPTB is multifactorieel en weerspiegelt interacties tussen maternale, foetale en omgevingsfactoren, waaronder uteriene contractiele dysfunctie, cervicale insufficiëntie, endocriene stoornissen, placentastoornissen en intrauteriene infectie9. Intrauteriene infectie wordt erkend als een belangrijke bijdrager en wordt geschat op ongeveer 30%–40% van de gevallen van vroeggeboortes10,11. Pathogenen kunnen toegang krijgen tot de vruchtholte via opstijgende (bijv. cervicovaginale) of hematogene routes, waardoor immuunresponsen van de gastheer worden geactiveerd en de afgifte van proinflammatoire cytokines (bijv. IL-6, TNF-α) en prostaglandines worden bevorderd die parturitie12 kunnen veroorzaken. Trofoblasten, als belangrijke cellulaire componenten van de moeder-foetale interface, dragen bij aan immuuntolerantie en antimicrobiële verdediging13.

Orale micro-organismen, waaronder Porphyromonas gingivalis en Fusobacterium nucleatum, zijn betrokken bij sPTB-gerelateerde ontstekingsprocessen, mogelijk via bacteriëmie en/of verspreiding van ontstekingsmediatoren14. Deze soorten zijn vastgestelde parodontale pathogenen, en associaties tussen parodontitis en sPTB zijn gerapporteerd in epidemiologische en klinische studies 15,16,17. Opmerkelijk is dat P. gingivalis en F. nucleatum ook vaak worden aangetroffen bij chronische apicale parodontitis (CAP)18,19, maar de relatie tussen CAP en nadelige zwangerschapsuitkomsten blijft relatief onderbelicht, en de relevante biologische routes zijn niet volledig gedefinieerd20. Harjunmaa et al. rapporteerden voor het eerst een verband tussen apicale parodontitis en een verminderde zwangerschapsduur en een laag geboortegewicht in 2015. Een vervolgonderzoek van dezelfde cohort ondersteunde geen directe bacteriële overdracht naar de placenta, wat suggereert dat systemische ontsteking een plausibele link kan vormen tussen apikale parodontitis en zwangerschapsuitkomsten22. In overeenstemming met deze interpretatie is radiografisch bevestigde apicale parodontitis geassocieerd met een verhoogd risico op vroegtijdige geboortegewichten23. Als een persistente occulte infectie kan CAP bijdragen aan het zwangerschapsrisico door chronische laaggradige systemische ontsteking en/of hematogene blootstelling aan microbiële componenten24,25. Verdere verduidelijking van de relatie tussen CAP en zwangerschap is daarom nodig om het begrip van orale–placentale ontstekingsroutes te verfijnen en om preventiestrategieën voor infectiegerelateerde zwangerschapsrisico's te informeren.

Recente studies hebben de relevantie van de TLR4/MyD88/NF-κB signaalas benadrukt bij ontstekingsgeassocieerde vroeggeboorte. Robertson et al. identificeerden TLR4 als een potentieel therapeutisch doelwit bij door ontsteking veroorzaakte vroeggeboorte en rapporteerden preventieve effecten in diermodellen26. Peng et al. toonden verder aan dat miR-199a-3p cervicale epitheelontsteking verzwakt door onderdrukking van de HMGB1/TLR4/NF-κB-route27. Daarnaast beschreven Shen et al. de antioxidatieve en ontstekingsremmende effecten van syringine bij diabetische zwangere ratten, waarbij modulatie van de TLR4/MyD88/NF-κB-route betrokken was bij de waargenomen verbeteringen28. Samen ondersteunen deze bevindingen een mechanistisch kader waarin TLR4/MyD88/NF-κB-gekoppelde inflammatoire signalering bijdraagt aan infectie-geassocieerde routes die de geboorte beïnvloeden, terwijl wordt erkend dat meerdere aangeboren immuunreceptoren parallel kunnen opereren, afhankelijk van de context van het pathogeen.

De huidige studie evalueert CAP-geassocieerde zwangerschapseffecten met behulp van complementaire in vitro trofoblastassays en in vivo muismodellen. Het trofoblastmodel maakt gecontroleerde onderzoeken van door ziekteverwekkers veroorzaakte inflammatoire signalering mogelijk, terwijl het zwangere muis CAP-model cellulaire reacties verbindt met zwangerschapsfenotypes op organismeniveau onder fysiologische zwangerschapsomstandigheden. Een staart-vener challengemodel wordt opgenomen om een complementaire hematogene blootstellingsroute te bieden en om te beoordelen of ontstekingsactivatiepatronen die in orale infecties worden waargenomen, worden herhaald wanneer bacteriële componenten toegang krijgen tot de maternale circulatie. Specifiek wordt trofoblastblootstelling aan P. gingivalis en F. nucleatum gebruikt om cytokineresponsen en activatie van de TLR4/MyD88/NF-κB-as te profileren, terwijl dierproeven de zwangerschapslengte, placentaontsteking en qPCR-gebaseerde detectie van bacteriële DNA-signalen in carotisbifurcatie en placentaweefsel beoordelen. Omdat qPCR de aanwezigheid van bacterieel DNA aangeeft in plaats van levensvatbaarheid of cellulaire lokalisatie, blijven interpretaties met betrekking tot de aanwezigheid van microbiële microbiële gebieden op de moeder-foetale interface voorzichtig. Daarnaast kunnen soortverschillen en gecontroleerde experimentele blootstelling de directe klinische vertaling beperken, wat de noodzaak van latere validatie in mensrelevante omgevingen benadrukt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de ethische richtlijnen vastgesteld door de Animal Research Ethics Committee van het Eerste Aangesloten Ziekenhuis van de Xinjiang Medische Universiteit (Goedkeuringsnummer: IACUC-20231121-13) en in overeenstemming met de National Institutes of Health (NIH) gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (editie 2011). Bovendien werd deze studie uitgevoerd volgens de ARRIVE-richtlijnen. Alle benodigdheden (reagentia, verbruiksartikelen, apparatuur en software) en hun bijbehorende fabrikantinformatie en catalogusnummers worden vermeld in de Materiaaltabel om reproduceerbaarheid te vergemakkelijken.

1. Bacteriecultuur

Referentiestammen van Porphyromonas gingivalis en Fusobacterium nucleatum (stamidentificaties vermeld in de Materiaaltabel) werden onder anaerobe omstandigheden behandeld. Primaire culturen werden gevestigd op pre-gereduceerde Columbia bloedagarplaten en anaeroob geïncubeerd (85% N₂, 10% H₂ en 5% CO₂) bij 37 °C gedurende 48 uur. Voor experimentele preparaten werd een enkele goed geïsoleerde kolonie geïnëntificeerd in 40 ml hersenhartinfusiebouillon en geïncubeerd onder identieke anaerobe omstandigheden tot de groei van de halverwege logitaritma (OD660 = 0,6–0,8). Om de blootstelling aan zuurstof te minimaliseren, werden inoculatie- en overdrachtsstappen uitgevoerd in een anaerobe werkstation met voorgereduceerd medium en gereedschap. Bacteriële concentraties werden gestandaardiseerd op 1 × 10à 8 CFU/mL voor dierlijke blootstelling met OD660-gebaseerde kwantificatie en een stam-specifieke OD–CFU-standaardcurve die onder dezelfde kweekomstandigheden werd gegenereerd; De kalibratiecurve werd vastgesteld door seriële verdunning en kolonietelling op anaerobe agarplaten met ten minste drie onafhankelijke kalibraties. Voor studies naar trofoblastinfecties werden bacteriële suspenties gekwantificeerd met een gevalideerde enumeratiemethode en verdund in een antibioticavrij volledig kweekmedium om de gespecificeerde multipliciteit van infectie (MOI) direct vóór co-kweek te bereiken.

2. Dierenhuisvesting en groepering

Specifieke pathogenevrije C57BL/6J muizen (n = 90; 60 vrouwtjes, 30 mannetjes) van 6–7 weken werden onder gecontroleerde omstandigheden gehuisvest (22 °C ± 2 °C, 60% ± 10% luchtvochtigheid, 12 uur lichtcyclus) met ad libitum toegang tot voedsel en water. Na 1 week acclimatisatie werden muizen willekeurig verdeeld over zes experimentele groepen (n = 15/groep): normale controle (NC), CAP met P. gingivalis (AP), CAP met F. nucleatum (AF), normale zoutoplossing staartader injectie (VN), P. gingivalis staartader injectie (VP) en F. nucleatum staartader injectie (VF). Randomisatie en kooitoewijzing werden geregistreerd om allocatiebias en mogelijke kooi-effecten te minimaliseren.

3. Oprichting van het CAP-model

Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. Anesthesie werd geïnduceerd door intraperitoneale toediening van pentobarbital natrium (1,62 mg/30 g lichaamsgewicht) gecombineerd met atropinesulfaat (12,5 μg/30 g lichaamsgewicht), en een adequate anesthesiediepte werd bevestigd door het ontbreken van een terugtrekkingsreflex van het pedaal. Muizen werden op rugligging op een verwarmingskussen geplaatst om de lichaamstemperatuur te behouden, en de mond werd voorzichtig geopend om een stabiele visualisatie van de bilaterale bovenkaken te mogelijk te maken. Bij vergroting werden de pulpakamers van de bilaterale bovenste kiezen geopend met een steriele ronde boor, gevolgd door het verwijderen van coronale pulpaweefsel met steriele micro-instrumenten. Wortelkanaalopeningen werden geïdentificeerd met een kleine endodontische vijl (grootte 06–10), en kanalen werden voorzichtig genavigeerd om openheid te bereiken zonder overmatige kracht te vermijden en zo het risico op perforatie te minimaliseren. De kamer werd gespoeld met steriele zoutoplossing (of steriele PBS) en gedroogd met steriele papieren punten voorafgaand aan de inoculatie.

Bacteriële inoculatie werd uitgevoerd met een gestandaardiseerde suspensie van 1 × 108 CFU/mL. Om de dosering reproduceerbaar te maken, werd het toegediende volume operationeel vastgezet op 2 μL per tand (ongeveer 2 × 105CFU per tand), toegediend met een gekalibreerde micropipettip die bij de kameringang was geplaatst. Een steriele absorberende papieren punt, vooraf doordrenkt met dezelfde suspensie, werd vervolgens in de pulpkamer geplaatst om lokale blootstelling te behouden. Succesvolle levering werd bevestigd door zichtbare natheid van de papierpunt en het ontbreken van lekkage in de mondholte. Na de inenting werd de kamer aan de lucht gedroogd totdat er geen zichtbare vloeistof meer over was, waarna deze werd afgesloten met een licht uitgeharde tandlijm (20 s), gevolgd door restauratie met een licht uitgeharde, vloeibare harscomposiet (20 s). De integriteit van de afdichting werd bevestigd door visuele inspectie en voorzichtig onderzoek; restauraties die gaten of vroegtijdig verlies vertoonden, werden onmiddellijk opnieuw verzegeld. Postprocedurele analgesie en monitoring werden verzorgd volgens de richtlijnen van de institutionele dierenverzorging.

Twee weken later werden periapicale röntgenfoto's gemaakt om de vestiging van CAP te bevestigen. Succesvolle vestiging werd gekenmerkt door een duidelijke periapicale radiolucentie met omringende botveranderingen die overeenkomen met chronische periapicale ontsteking en botdestructie. De paring werd twee weken na de infectie/modelvestiging gestart.

4. Vaststelling van het model voor staartaderinjectie

Bacteriële suspenties werden bereid bij een concentratie van 1 × 108 CFU/mL in steriele zoutoplossing. Muizen werden vastgebonden en de staart werd 1–2 minuten verwarmd om de laterale staartaren te verwijden. Injecties werden uitgevoerd met een fijne naald (meestal 29–30 G) die met de afschuining omhoog in de laterale staartader werd ingebracht onder een ondiepe hoek (ongeveer 10–15°). De juiste intraveneuze plaatsing werd bevestigd door een bloedflits in de naaf en een soepele infusie met lage weerstand; Onsuccesvolle plaatsing werd aangegeven door verhoogde weerstand en/of vorming van een subcutane bleb, waarbij de infusie werd gestopt en herhaald op een meer proximale plaats na korte herverwarming. Muizen kregen dagelijks injecties gedurende drie opeenvolgende dagen (100 μL per muis elke keer). Na drie dagen werden de vrouwen samen met mannen geplaatst en werden de vaginale plugs de volgende ochtend gecontroleerd. Na bevestiging van vaginale plugs (GD 0,5) werden injecties elke drie dagen toegediend (100 μL per muis per tijd) tot de zwangerschapsdag 15.

5. Vaststelling van het zwangere muismodel

Vrouwelijke en mannelijke muizen werden elke dag vanaf 20:00 uur gezamenlijk gehuisvest in een verhouding van 2:1 (vrouwtje:mannetje). De aanwezigheid van een vaginale plug of een sperma-positieve vaginale uitstrijkje om 08:00 uur de volgende ochtend werd aangeduid als zwangerschapsdag (GD) 0,5. Voor elke muis werden het initiële lichaamsgewicht, het gewicht vóór de bevalling, het gewicht na de bevalling, de draagtijd, het gewicht van de neonatale geboorte, de grootte van het nest en het aantal doodgeboorten geregistreerd. Op basis van eerdere studies 29,30 werd de bevalling vóór GD 18.5 operationeel gedefinieerd als vroeggeboorte bij muizen. Omdat zwangerschapsverkorting binnen het termijnbereik kan optreden, werden zwangerschapsuitkomsten geïnterpreteerd met aandacht voor het onderscheid tussen echte vroeggeboorte en zwangerschapsverkortingsfenotypes.

6. Monsterverzameling en -verwerking

Op de 15e zwangerschapsdag werden drie zwangere muizen per groep willekeurig geselecteerd voor placenta- en vasculaire bemonstering (NC/AP/AF en VN/VP/VF). Na anesthesie geïnduceerd door intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (1,62 mg per 30 g lichaamsgewicht) en atropinesulfaat (12,5 μg per 30 g lichaamsgewicht), werden bloedmonsters genomen via retro-orbitale bloedingen. Muizen werden geëuthanaseerd in een kooldioxidekamer totdat de dood werd bevestigd door het ontbreken van ademhaling, hartslag en hoornvliesreflex; De levering van kooldioxide volgde een geleidelijke vulling in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor dierenwelzijn. De bifurcatie van de halsslagader en placentaweefsels werden snel verzameld met steriele instrumenten om kruismonsterbesmetting te verminderen. Het placentaweefsel werd verdeeld in twee delen: één deel werd opgeslagen bij −80 °C, en het andere deel werd vastgezet in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 24 uur, gevolgd door gegradueerde ethanoldehydratie en paraffine-inbedding. De overgebleven muizen werden gemonitord op dagelijks lichaamsgewicht, draagtijd, nestgrootte en geboortegewicht bij neonatale kinderen.

7. Celkweek en behandeling

De menselijke trofoblastcellijn HTR-8/SVneo werd gekweekt in RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd fotaal runderenserum bij 37 °C en 5% CO₂. Voor infectie-experimenten werden HTR-8/SVneo-cellen (1 × 106 cellen) in de logaritmische groeifase in 6-wellplaten geplant en een nacht laten hechten. Voor de bacteriële uitdaging werd het medium vervangen door een antibioticavrij volledig medium om antibacteriële overdrachtseffecten tijdens co-kweek te voorkomen. Bacteriële suspenties van P. gingivalis of F. nucleatum werden toegevoegd bij MOI = 50, en elke put werd aangepast naar een eindvolume van 2,5 mL met behulp van een volledig kweekmedium. Platen werden 24 uur geïncubeerd. Supernatanten werden na 24 uur verzameld en geklarend door korte centrifugatie om afval te verwijderen voorafgaand aan de meting van de cytokine. Adherente cellen werden twee keer gewassen met steriele PBS om niet-hechtende bacteriën te verwijderen en vervolgens direct verwerkt voor RNA- of eiwitextractie volgens de hieronder beschreven workflows.

8. Histologische analyse van de muizenplacenta

Placentaweefsels werden vastgezet in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 24 uur, paraffine-ingebed, en doorgesneden op een dikte van 4,5 μm. Er werd routinematig hematoxyline- en eosine (H&E) kleuring uitgevoerd om de morfologie van de placenta te onderzoeken. Voor immunohistochemische kleuring werd antigeenlokalisatie gevisualiseerd met een chromogeen peroxidasesubstraat dat bruine afzettingen op positieve locaties produceerde, gevolgd door tegenkleuring met hematoxyline. Negatieve controles werden uitgevoerd door primaire antistoffen te vervangen door niet-immuunserum.

Om reproduceerbaarheid en transparantie te vergroten, gebruikte immunohistochemische evaluatie een vooraf bepaalde semi-kwantitatieve scoringsmethode. De kleuringsintensiteit werd beoordeeld als 0 (geen), 1 (zwak), 2 (matig) of 3 (sterk), en het percentage positieve cellen werd gescoord als 0 (<5%), 1 (5–25%), 2 (26–50%), 3 (51–75%) of 4 (>75%). Een immunoreactiviteitsscore werd berekend door intensiteits- en procentuele scores per vakgebied te vermenigvuldigen. Voor elke placenta werden minstens vijf niet-overlappende hoogvermogenvelden uit vergelijkbare anatomische gebieden gescoord. De scoring werd onafhankelijk uitgevoerd door twee waarnemers die blind waren voor groepstoewijzing, en meningsverschillen werden opgelost door gezamenlijke beoordeling.

9. Kwantitatieve realtime PCR-detectie van bacteriële DNA-signalen in de carotisbifurcatie en placenta van de muis

Weefsel-DNA werd geëxtraheerd met behulp van een silicakolom-gebaseerde weefsel-DNA-extractieworkflow. Weefsellysaten werden geklarificeerd door centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 5 minuten bij 20–25 °C, en supernatanten werden aangebracht op silicakolommen voor DNA-binding door centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 1 minuut bij 20–25 °C. De wasstappen werden uitgevoerd volgens de workflow, waarbij elke wasbeurt gevolgd werd door centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 1 minuut bij 20–25 °C. Er werd een laatste droge spin uitgevoerd bij 12.000 × g gedurende 2 minuten bij 20–25 °C om restethanol te verwijderen. DNA werd geëlueerd in een 50 μL eluatiebuffer na een incubatie van 20–25 °C en verzameld door centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 1 minuut bij 20–25 °C. Bacterieel genomisch DNA werd geëxtraheerd met behulp van een silicakolom-gebaseerde bacteriële DNA-extractieworkflow met dezelfde binding/wash/dry spin/eluation centrifugatieparameters, tenzij anders vereist door de workflow.

DNA-concentratie en zuiverheid werden gemeten met een microvolume nucleïnezuurkwantificeer, en de integriteit werd beoordeeld met agarosegelelektroforese. Gekwalificeerde DNA-monsters werden opgeslagen bij –20 °C voor latere analyse. Doelbacteriële genen werden geamplificeerd en gekloond met primers zoals vermeld in Aanvullende Tabel 1, met PCR-condities gedetailleerd in Aanvullende Tabel 2 en Aanvullende Tabel 3. Versterkte doelbanden werden gezuiverd, gekloond volgens de specificaties van Aanvullende Tabel 4 en omgezet in competente Escherichia coli DH5α-cellen. Recombinante stammen met plasmiden werden geverifieerd om correcte insertsequenties te garanderen, en plasmide-DNA werd geëxtraheerd voor standaardvoorbereiding. Standaardcurves werden gegenereerd door qPCR uit te voeren op seriëel verdunde plasmidstandaarden die doelbacteriële genfragmenten bevatten. De bacteriële DNA-signalen van P. gingivalis 16S en F. nucleatum 16S in carotisbifurcatie- en placentamonsters werden kwantitatief gedetecteerd met realtime PCR, waarbij DNA-kopienummers werden berekend uit Ct-waarden met behulp van de standaardcurve. Reactiesystemen en -programma's worden respectievelijk beschreven in Aanvullende Tabel 5 en Aanvullende Tabel 6. Omdat qPCR bacteriële DNA-signalen aangeeft in plaats van levensvatbaarheid of cellulaire lokalisatie, blijven interpretaties met betrekking tot de aanwezigheid van microbiële micro's op het moeder-foetale grensvlak voorzichtig.

10. ELISA-detectie van ontstekingsfactoren in muisserummonsters en celkweeksupernatanten

Alle reagentia en monsters werden vóór de tests in evenwicht gebracht tot kamertemperatuur. Serumniveaus van TNF-α en IL-1β werden gemeten met behulp van muis ELISA-workflows, en TNF-α en IL-1β niveaus in celkweeksupernatanten werden bepaald met behulp van menselijke ELISA-workflows, volgens de kitprocedures. Standaarden en monsters werden gemeten in dubbele putten, en standaardcurves werden voor elke plaat gegenereerd. Technische duplicaten werden gemiddeld berekend om één waarde per biologische replica te geven.

11. Overige moleculaire biologische analyses

Voor qRT-PCR werd totaal RNA geëxtraheerd uit gekweekte cellen met behulp van een op fenol-chloroform gebaseerde RNA-extractieworkflow. Na fasescheiding werd de waterige fase gezuiverd door centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C, en RNA werd neergelaten, gewassen en opnieuw gesuspendeerd volgens de workflow. De RNA-concentratie werd gemeten met een nucleïnezuuranalyzer en de RNA-integriteit werd beoordeeld met agarosegelelektroforese. Reverse transcriptie werd uitgevoerd om cDNA te genereren, en kwantitatieve realtime PCR werd gebruikt om TNF-α en IL-1β mRNA-niveaus te kwantificeren. Primersequenties worden vermeld in Aanvullende Tabel 7, reactiemengsels in Aanvullende Tabel 8 en reactieprogramma's in Aanvullende Tabel 9.

Voor Western blotting werden eiwitlysaten uit muizenplacentaweefsels of trofoblastcellen geclarificeerd door centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C, gekwantificeerd en onderworpen aan SDS-PAGE, gevolgd door membraantransfer en antilichaamdetectie met behulp van een fluorescentiebeeldvorming. Gelijke eiwitbelasting werd ingesteld op 30 μg per baan. Originele, niet-bijgesneden membraanbeelden, inclusief molecuulgewichtmarkers, werden behouden voor alle vlekken die in de figuren worden getoond en zijn beschikbaar DOI: 10.57760/sciencedb.28254. Tenzij anders vermeld, verwijst "n" naar biologische replicaten (individuele dieren of onafhankelijke celculturen), terwijl technische herhalingen worden gebruikt voor kwaliteitscontrole en de biologische replicatie niet vervangen.

12. Statistische analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische analysesoftware en de cijfers werden gegenereerd met grafische software (vermeld in de Materiaalkunde). Normaal verdeelde continue gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie en geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA met passende post hoc tests, terwijl niet-normaal verdeelde gegevens werden uitgedrukt als mediaan (interkwartielbereik) en geanalyseerd met de Kruskal–Wallis-test met passende paargewijze vergelijkingen. Statistische significantiedrempels werden vastgesteld op P < 0,05, P < 0,01 en P < 0,001. Tenzij anders gespecificeerd, duidt "n" biologische replicaten aan, en technische replicaten (bijv. duplicaat ELISA-putten) werden gemiddeld om één waarde per biologische replicat te leveren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Infectie met P. gingivalis of F. nucleatum wordt geassocieerd met zwangerschapsverkorting en verhoogde proinflammatoire cytokines in het serum bij muizen
De basisstatistieken voor veranderingen in het moedergewicht, neonatale uitkomsten en zwangerschapsduur worden samengevat in Tabel 1 en Figuur 1. Moederlijke gewichtstrajecten en neonatale aandoeningen verschilden niet significant tussen groepen (eenric...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In de afgelopen jaren heeft steeds meer bewijs gesuggereerd dat er nauwe verbanden zijn tussen mondgezondheid en zwangerschapsuitkomsten, wat heeft geleid tot toenemende aandacht voor mogelijke verbanden tussen chronische apicale parodontitis (CAP) en nadelige zwangerschapsuitkomsten, waaronder fenotypes gerelateerd aan vroeggeboorte31 . Een systematische review geeft aan dat de huidige klinische bewijsbasis beperkt en heterogeen blijft, maar over het algemeen een...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende belangen om te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Stichting voor Ontwikkeling en Verwante Ziekten van Vrouwen en Kinderen Key Laboratory van de provincie Sichuan (Subsidie nr. FYYFEJB2025002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chromogenic Peroxidase SubstrateAgilent DakoK3468Chromogenic peroxidase substrate voor IHC
Defibrinerend schapenbloed, sterieelThermo Fisher (Remel)R54012Additief voor bloedagar (5%)
Tandheelkundige röntgenapparaat / radiografiesysteemPlanmecaIntra (model)Periapicale röntgenfoto's voor CAP-bevestiging
DNeasy Blood & Tissue KitQIAGEN69504Silica-kolom DNA-extractie uit weefsels/bacteriën
E. coli DH5α Competent CellsTaKaRa9057Transformatie voor plasmide standaardconstructie
Eosine Y oplossing, alcoholischSigma-Aldrich (Merck)HT110132H&E kleurstof
Fetaal runderserum (FBS), gekwalificeerd, AustraliëGibco (Thermo Fisher Scientific)10099-141Aanvulling op compleet medium 
Flowable resin composiet3MFiltek Supreme Flowable 6010Restauratie na verzegeling; lichtuitharding
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum referentiestamATCC25586Anaërobe cultuur; CAP en staartvene-expositie
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 9 (versie)Statistische analyse en figuurgeneratie
Hematoxyline-oplossingSigma-Aldrich (Merck)HHS32H&E tegenkleuring
HTR-8/SVneo menselijke trofoblastcellijnATCCCRL-3271In vitro infectietests 
Human IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA-kitR&D Systems (Bio-Techne)DLB50IL-1β meting in celsupernatant
Human TNF-α Quantikine ELISA-kitR&D Systems (Bio-Techne)DTA00DTNF-α meting in celsupernatant
Immobilon-FL PVDF-membraan, 0,45 µmMillipore (Merck)IPFL00010Fluorescent Western blot-overdracht
IRDye 680RD Geit anti-Konijn IgG (H+L)LI-COR925-68071Fluorescent secundair antilichaam
IRDye 800CW Geit anti-Konijn IgG (H+L)LI-COR926-32211Fluorescent secundair antilichaam
IκBα (44D4) Konijn mAbCell Signaling Technology4812Primair antilichaam (WB)
K-File (endodontisch bestand)Dentsply Sirona (Maillefer)A012D015Kanalinstrumentatie (voorbeeldmaat 15)
LED tandheelkundig uithardingslicht3MElipar DeepCure-S (model)20 s uitharding (per protocol)
Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA-kitR&D Systems (Bio-Techne)MLB00CSerum IL-1β meting
Mouse TNF-α Quantikine ELISA-kitR&D Systems (Bio-Techne)MTA00BSerum TNF-α meting
MyD88 (D80F5) Konijn mAbCell Signaling Technology4283Primair antilichaam (WB)
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrofotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WDNA/RNA kwantificering
Near-infrared beeldvormingssysteemLI-COROdyssey CLx (model)Fluorescent Western blot-beeldvorming
NF-κB p65 (D14E12) Konijn mAbCell Signaling Technology8242Primair antilichaam (WB)
PBS, pH 7,4, zonder Ca2+/Mg2+Gibco (Thermo Fisher Scientific)10010-023Celwassing en bereiding van reagentia
Penicilline-Streptomycine Gibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Antibiotica 
Pentobarbital natriumzoutSigma-Aldrich (Merck)P3761Anesthesie-inductie (dosering volgens protocol)
Peroxidase blokkeringsoplossingAgilent DakoS2023Blokkeer endogene peroxidase voor IHC
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Konijn mAbCell Signaling Technology3033Primair antilichaam (WB)
Porphyromonas gingivalis referentiestamATCC33277Anaërobe cultuur; CAP en staartvene-expositie
PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037AcDNA-synthese
Real-time PCR-systeemApplied BiosystemsQuantStudio 5 (model)qPCR-kwantificering van 16S-doelwitten
Ronde boor (sterieel)Dentsply SironaH1-010Toegangsopening voor pulpkamer van de eerste kies in de maxilla
RPMI 1640 MediumGibco (Thermo Fisher Scientific)11875-093HTR-8/SVneo cultuurmedium-basis
SYBR-safe DNA gelkleuringInvitrogenS33102DNA-visualisatie
TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9760Plasmid-miniprep voor standaarden
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820AqPCR mastermix (kleurstof-gebaseerd)
TLR4 (D8L5W) Konijn mAbCell Signaling Technology14358Primair antilichaam (WB)
TRIzol ReagentInvitrogen15596-026Fenol–chloroform RNA-extractie
Trypsine-EDTA (0,25%), fenol roodGibco (Thermo Fisher Scientific)25200-056Celdetachering
T-Vector pMD19 (Eenvoudig)TaKaRa3271PCR-productklonering voor standaardcurves
Universele tandheelkundige kleefstof3MScotchbond Universele kleefstof 26200Versluiting van pulpkamer na inoculatie

Referenties

  1. American College of Obstetricians and Gynecologists’ Committee on Practice Bulletins—Obstetrics. Practice bulletin no. 171: Management of preterm labor. Obstet Gynecol. 128, e155-e164 (2016).
  2. Vogel, J. P., Chawanpaiboon, S., Moller, A. B., Watananirun, K., Bonet, M., et al. The global epidemiology of preterm birth. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 52, 3-12 (2018).
  3. Svenvik, M., et al. Early prediction of spontaneous preterm birth before 34 gestational weeks based on a combination of inflammation-associated plasma proteins. Front Immunol. 15, 1415016-1415028 (2024).
  4. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388, 3027-3035 (2016).
  5. Saigal, S., Doyle, L. W. An overview of mortality and sequelae of preterm birth from infancy to adulthood. Lancet. 371, 261-269 (2008).
  6. Liang, S., et al. Development of a spontaneous preterm birth predictive model using a panel of serum protein biomarkers for early pregnant women: A nested case-control study. Int J Gynaecol Obstet. 168, 701-708 (2025).
  7. Bradley, E., et al. Born too soon: Global epidemiology of preterm birth and drivers for change. Reprod Health. 22, 105-119 (2025).
  8. Hodek, J. M., von der Schulenburg, J. M., Mittendorf, T. Measuring economic consequences of preterm birth: Methodological recommendations for the evaluation of personal burden on children and their caregivers. Health Econ Rev. 1 (1), 6 (2011).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: One syndrome, many causes. Science. 345, 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., et al. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
  11. Combs, C. A., et al. Amniotic fluid infection, inflammation, and colonization in preterm labor with intact membranes. Am J Obstet Gynecol. 210, 125.e1-125.e15 (2014).
  12. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58-64 (2013).
  13. Semmes, E. C., Coyne, C. B. Innate immune defenses at the maternal-fetal interface. Curr Opin Immunol. 74, 60-67 (2022).
  14. Han, Y. W., Wang, X. Mobile microbiome: Oral bacteria in extra-oral infections and inflammation. J Dent Res. 92, 485-491 (2013).
  15. Ide, M., Papapanou, P. N. Epidemiology of association between maternal periodontal disease and adverse pregnancy outcomes—systematic review. J Periodontol. 84, S181-S194 (2013).
  16. Offenbacher, S., et al. Periodontal infection as a possible risk factor for preterm low birth weight. J Periodontol. 67, 1103-1113 (1996).
  17. Jeffcoat, M. K., et al. Periodontal infection and preterm birth: Results of a prospective study. J Am Dent Assoc. 132, 875-880 (2001).
  18. Siqueira, J. F., Rôcas, I. N. Microbiology and treatment of acute apical abscesses. Clin Microbiol Rev. 26, 255-273 (2013).
  19. Marchesan, J., et al. TLR4, NOD1 and NOD2 mediate immune recognition of putative newly identified periodontal pathogens. Mol Oral Microbiol. 31, 243-258 (2016).
  20. Georgiou, A. C., Crielaard, W., Armenis, I., de Vries, R., van der Waal, S. V. Apical periodontitis is associated with elevated concentrations of inflammatory mediators in peripheral blood: A systematic review and meta-analysis. J Endod. 45 (11), 1279-1295.e3 (2019).
  21. Harjunmaa, U., et al. Association between maternal dental periapical infections and pregnancy outcomes: Results from a cross-sectional study in Malawi. Trop Med Int Health. 20, 1549-1558 (2015).
  22. Harjunmaa, U., et al. Periapical infection may affect birth outcomes via systemic inflammation. Oral Dis. 24, 847-855 (2018).
  23. Leal, A. S., et al. Association between chronic apical periodontitis and low-birth-weight preterm births. J Endod. 41, 353-357 (2015).
  24. León, R., et al. Detection of Porphyromonas gingivalis in the amniotic fluid in pregnant women with a diagnosis of threatened premature labor. J Periodontol. 78, 1249-1255 (2007).
  25. Sanz, M., et al. Periodontitis and cardiovascular diseases: Consensus report. J Clin Periodontol. 47, 268-288 (2020).
  26. Robertson, S. A., et al. Targeting Toll-like receptor-4 to tackle preterm birth and fetal inflammatory injury. Clin Transl Immunol. 9, e1121-e1139 (2020).
  27. Peng, J., et al. miR-199a-3p suppresses cervical epithelial cell inflammation by inhibiting the HMGB1/TLR4/NF-κB pathway in preterm birth. Mol Med Rep. 22, 926-938 (2020).
  28. Shen, Z., et al. Protective effects of syringin against oxidative stress and inflammation in diabetic pregnant rats via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 131, 110681-110690 (2020).
  29. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: Suggested assessment and reporting guidelines. Biol Reprod. 99, 922-937 (2018).
  30. Ao, M., et al. Dental infection of Porphyromonas gingivalis induces preterm birth in mice. PLoS One. 10 (8), e0137249-e0137265 (2015).
  31. Jakovljevic, A., et al. The association between apical periodontitis and adverse pregnancy outcomes: A systematic review. Int Endod J. 54 (9), 1527-1537 (2021).
  32. Khalighinejad, N., Aminoshariae, A., Kulild, J. C., Mickel, A. Apical periodontitis, a predictor variable for preeclampsia: A case-control study. J Endod. 43 (10), 1611-1614 (2017).
  33. Venugopal, B., Narasimman, H., Mahalingam, A., Naren Kishore, R., Jayavel, K., et al. Systemic health associations of apical periodontitis: A systematic review of observational studies. Cureus. 17 (10), e95273 (2025).
  34. Liang, S., et al. Periodontal infection with Porphyromonas gingivalis induces preterm birth and lower birth weight in rats. Mol Oral Microbiol. 33 (4), 312-321 (2018).
  35. Lin, D., et al. Porphyromonas gingivalis infection in pregnant mice is associated with placental dissemination, an increase in the placental Th1/Th2 cytokine ratio, and fetal growth restriction. Infect Immun. 71 (9), 5163-5168 (2003).
  36. Han, Y. W., et al. Fusobacterium nucleatum induces premature and term stillbirths in pregnant mice: Implication of oral bacteria in preterm birth. Infect Immun. 72 (4), 2272-2279 (2004).
  37. Liu, H., et al. Fusobacterium nucleatum induces fetal death in mice via stimulation of TLR4-mediated placental inflammatory response. J Immunol. 179 (4), 2501-2508 (2007).
  38. Chan, E., et al. Identification of Fusobacterium nucleatum in formalin-fixed, paraffin-embedded placental tissues by 16S rRNA sequencing in a case of extremely preterm birth secondary to amniotic fluid infection. Pathology. 51 (3), 320-322 (2019).
  39. Habelrih, T., Augustin, T. L., Mauffette-Whyte, F., Ferri, B., Sawaya, K., et al. Inflammatory mechanisms of preterm labor and emerging anti-inflammatory interventions. Cytokine Growth Factor Rev. 78, 50-63 (2024).
  40. Gomez-Lopez, N., Romero, R., Plazyo, O., Panaitescu, B., Furcron, A. E., et al. Intra-amniotic administration of HMGB1 induces spontaneous preterm labor and birth. Am J Reprod Immunol. 75 (1), 3-7 (2016).
  41. Wang, S., Ma, L., Ji, J., Huo, R., Dong, S., et al. Protective effect of soy isolate protein against streptozotocin induced gestational diabetes mellitus via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 168, 115688 (2023).
  42. Reyes, L., et al. Porphyromonas gingivalis and adverse pregnancy outcome. J Oral Microbiol. 10 (1), 1374153 (2017).
  43. Aagaard, K., et al. The placenta harbors a unique microbiome. Sci Transl Med. 6 (237), 237ra65 (2014).
  44. Kuperman, A. A., et al. Deep microbial analysis of multiple placentas shows no evidence for a placental microbiome. BJOG. 127 (2), 159-169 (2020).
  45. Einenkel, R., et al. Less is more! Low amount of Fusobacterium nucleatum supports macrophage-mediated trophoblast functions in vitro. Front Immunol. 15, 1447190 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Porphyromonas gingivalisFusobacterium nucleatumTLR4-routeMyD88-signaleringNF-kappaB-activatieplacentale ontstekingvroeggeboorteorale pathogenen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.