Efficiënte stamcel-afgeleide muisblastocystmodellen bouwen voor milieustudies

Summary

Dit protocol beschrijft de generatie en analyse van iGATA4-blastoïden, een schaalbaar stamcelgebaseerd model dat belangrijke kenmerken van de muisblastocyst herhaalt, waaronder de organisatie en cavitatie van de afstamming, en reproducerbare, hoogdoorvoerde beoordeling mogelijk maakt van omgevings- en moleculaire verstoringen die de vroege embryonale ontwikkeling beïnvloeden.

Abstract

Embryomodellen op basis van stamcellen bieden een krachtig platform om vroege zoogdierontwikkeling en hun gevoeligheid voor omgevingsverstoringen te onderzoeken. Hier wordt een robuust en toegankelijk protocol gepresenteerd voor het genereren van high-fidelity muisblastoïden met behulp van embryonale stamcellen (ESC's), trofoblaststamcellen (TSC's) en embryonale stamcellen die zijn ontworpen voor induceerbare GATA4-expressie (iGATA4-ESCs). Dit systeem produceert iGATA4-blastoïden die de natuurlijke E4.5-blastocystmorfologie, afstammingsverhoudingen en transcriptiesignaturen nauwkeurig recapituleer, en zo een betrouwbaar in vitro model bieden van de primitieve endoderm (PE), epiblast (EPI) en trophectoderm (TE) compartimenten. Dit protocol demonstreert eerst hoe de drie stamcelpopulaties die nodig zijn voor blastoïdevorming kunnen behouden en voorbereiden. De stapsgewijze assemblage van iGATA4-blastoïden onder pre-implantatie kweekomstandigheden wordt vervolgens uiteengezet, waarbij kritieke experimentele parameters worden benadrukt. Om rigoureuze karakterisering mogelijk te maken, wordt een geteste workflow voor blastoïdefixatie, kleuring en beeldvorming aangeboden. Tot slot wordt een voorbeeld gegeven dat laat zien hoe iGATA4-blastoïden kunnen worden gebruikt voor high-throughput assays. Door grote cohorten blastoïden bloot te stellen aan gedefinieerde omgevingsfactoren, kunnen veranderingen in morfologie, afstammingsallocatie en ontwikkelingsprogressie snel en reproduceerbaar worden gekwantificeerd. Samen creëert dit protocol een schaalbaar platform voor het modelleren van de ontwikkeling vóór implantatie, het ontleden van vroege afstammingsbeslissingen en het uitvoeren van multiparametrische screenings om omgevings- of moleculaire invloeden op blastocystvorming te beoordelen.

Introduction

Begrijpen hoe vroege zoogdierembryo's zichzelf assembleren en hoe veelvoorkomende omgevingsfactoren hun vorming negatief kunnen beïnvloeden, vereist modelsystemen die reproduceerbaar, experimenteel toegankelijk en schaalbaar zijn. Geïntegreerde embryo-achtige modellen die worden gegenereerd door het combineren van embryonale en extraembryonale stamcellen bieden zo'n platform ^1,2. Dit protocol beschrijft hoe embryonale stamcellen (ESC's), trofoblaststamcellen (TSC's) en ESC's die zijn ontworpen voor induceerbare GATA4-expressie (iGATA4-ESC's) onder pre-implantatiecondities kunnen worden samengesteld om blastoïden te produceren met robuuste en goed geproportioneerde primitieve endoderm (PE), epiblast (EPI) en trophectoderm (TE) lijnen. Recent onderzoek heeft aangetoond dat deze structuren, aangeduid als iGATA4-blastoïden³, lijken op de E4.5-blastocyst qua afstammingsverhoudingen, transcriptiesignaturen en functionele markerexpressie. Wanneer in vitro gekweekt, gaat 12,5% van deze structuren over naar postimplantatiemorfologie. Belangrijk is dat ze geschikt zijn voor toxicologische en milieuonderzoeken.

De ontwikkeling van deze techniek werd gemotiveerd door beperkingen in bestaande blastoïdesystemen ^2,4,5. Hoewel veel protocollen 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 gecaviteerde structuren genereren die lijken op vroege blastocysten, de meeste doen dit met relatief lage efficiëntie of produceren structuren met onvolledige PE-vorming, ongedefinieerde celidentiteiten of verkeerde afstammingsverhoudingen. Deze inconsistenties verminderen hun geschiktheid voor mechanistische studies en hoge-doorvoer verstoringsscreenings. Omdat PE-specificatie in vivo volgt op de activatie van GATA6, SOX17, GATA4 en SOX7²², en defecten in zowel de PE als zijn afgeleide, het viscerale endoderm (VE), de peri-implantatieontwikkeling belemmeren 23,24,25,26,27, wat dit transcriptionele programma in vitro afdwingt Verbetert de nauwkeurigheid van blastoïden. ESC's die een conditioneel GATA4-transgen dragen, transdifferentiëren robuust naar VE en, wanneer ze worden gecombineerd met ESC's en TSC's onder post-implantatiecondities, genereren ze geïntegreerde embryomodellen die gastruleren en organogenese initiëren 28,29,30,31. Hier is dit principe aangepast aan pre-implantatieomstandigheden, waarmee wordt aangetoond dat iGATA4-ESC's betrouwbaar PE genereren en blastoïden produceren die sterk lijken op natuurlijke blastocysten³.

Deze methode overwint eerdere beperkingen in blastocystmodellering met stamcellen en biedt een hoge efficiëntie van de vorming van blastoïden (80% van de gevormde structuren zijn blastoïden, waarvan 75% de juiste lijn en verhoudingen vertonen) en een hoge embryo-gelijkheid. Bovendien biedt de modulaire assemblage van iGATA4-blastoïden, waarbij elke blastocystenlijn afkomstig is van een onafhankelijk gekweekte stamcelpopulatie, directe experimentele toegang tot elk embryocompartiment. Deze eigenschappen maken het systeem bijzonder geschikt voor toepassingen met multiparametrische screening. Omdat het grote cohorten van morfologisch consistente structuren oplevert met nauwkeurig geproportioneerde TE-, EPI- en PE-lijnen, maakt het parallelle verstoringen en kwantificatie van lijn-specifieke responsen mogelijk met statistische kracht die onbereikbaar is met natuurlijke embryo's.

Als principebewijs werden de effecten van veelvoorkomende omgevingsfactoren gepresenteerd op fysiologische afstanden 32,33,34,35,36,37,38 op de ontwikkeling van blastoïden gemeten. De impact van modificaties in cafeïne, nicotine, ethanol en aminozuren op cavitatiesnelheid, morfologie, fitheid en afstammingsverhoudingen werd beoordeeld over een reeks concentraties en tijdsbehandelingsvensters. De meeste aandoeningen (cafeïne, ethanol, nicotine en die een eiwitarm dieet nabootsen) resulteerden in abnormale vorming van blastoïden en een verminderde structurele kwaliteit. Daarentegen verbeterde het verhogen van de concentratie van vertakte aminozuren (vergelijkbaar met eiwitrijke diëten) de efficiëntie en kwaliteit van blastoïdevorming. Deze resultaten weerspiegelden effecten die werden waargenomen in in in vitro gekweekte natuurlijke muisblastocysten³, waarmee werd aangetoond dat dit systeem subtiele, dosisafhankelijke fenotypes vastlegt en schaalbare, multidimensionale screeningpijplijnen ondersteunt die niet haalbaar zijn met natuurlijke embryo's.

Binnen de bredere context van embryo-modellering toont deze techniek aan dat dezelfde cellen die worden gebruikt om geïntegreerde postimplantatieontwikkeling te modelleren, ook als pre-implantatiemodellen kunnen worden ingezet. Deze methode is bijzonder geschikt voor toepassingen die schaalbare modellering van blastocystachtige structuren vereisen met nauwkeurige PE-vorming en robuuste lineage-integratie. Echter, net als bij andere stamcelmodellen van de muisblastocyst, slagen iGATA4-blastoïden er echter niet in zich te implanteren en ontwikkelen zich verder na overdracht naar een gastmuis en zijn daarom niet geschikt voor studies naar embryo-moederinteracties. Al met al biedt dit protocol een betrouwbare en toegankelijke benadering voor het genereren van high-fidelity blastoïden die vroege celtypebeslissingen in het zoogdierembryo modelleren.

Protocol

Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, betreffen gevestigde cellijnen en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen van het California Institute of Technology. Er werd geen werk verricht met levende dieren of menselijke proefpersonen.

Meerdere ESC- en TSC-lijnen zijn getest en hebben aangetoond dat ze iGATA4-blastoïde vormen ondersteunen. ESC's, iGATA4-ESC's en TSC's uit eerdere studies²⁸ zijn succesvol gebruikt om alle stappen die in dit protocol worden beschreven te voltooien. Dezelfde auteurs beschrijven de generatie van iGATA4-ESC's uit een eerder gevestigde CD1 (ICR) muis ESC-lijn.

TSC's worden gekweekt bovenop commercieel verkrijgbare embryonale fibroblasten van muizen (MEF's). Alle chemicaliën, reagentia, kits, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Kweek van muisstamcellen voor blastoïdevorming

1. Voorbereiding van MEF-voederplaten
   1. Bedek een 6-put celkweekplaat met 1,5 mL 0,2% (w/v) gelatine in geïoniseerd (DI) water per put. Broeden op 37 °C in normoxia gedurende minstens 45 minuten.
   2. Tijdens de incubatie bereid je een 15 mL centrifugebuis voor met 4 mL FC-media (Tabel 1) voorverwarmd tot 37 °C.
   3. Ontdooi het FEF-flesje in een waterbad met een achtvormige beweging totdat er alleen nog een klein bolletje ijs overblijft. Doe de inhoud in de voorbereide buis en pipetteer dan op en neer om goed te mengen. Centrifugeer op 500 × g gedurende 4 minuten.
   4. Aspireer het supernatant en sus de pellet opnieuw in 1 mL FC-medium. Stel het volume aan om ~160.000 cellen per put in 1,5 mL per put te verplaten.
   5. Aspiraat de gelatine en plaat 1,5 mL MEF's per put. Incubeer 's nachts in normoxia zonder verstoring.
   6. Vervang het medium de volgende dag door verse 1,5 mL per put FC medium. Verander het medium elke 48 uur. Gebruik MEF's 2–7 dagen na het opmaken. MEF's kunnen langere tijd gezond blijven, maar hun vermogen om de groei van de TSC te ondersteunen kan worden aangetast.

VOORZICHTIG: Voer alle muiscelkweek uit in biosafety level (BSL) 1 laminaire flowkasten met behulp van de BSL-2 techniek.

2. Ontdooien en doorgeven van embryonale stamcellen van muizen (WT ESC's en iGATA4-ESC's)
   1. Ontdooi WT ESC's of iGATA4-ESC's volgens stappen 1.1.1–1.1.3. Na centrifugatie worden de cellen opnieuw opgehangen in 1 mL N2B27/2i/LIF medium (Tabel 1) en ~50.000 cellen per put in een met gelatine gecoate 6-put plaat met ~1,5 mL per put. Incubeer bij 37 °C in normoxia en wissel elke 48 uur van medium.
   2. Zorg ervoor dat kolonies dicht op elkaar staan en rond zijn met minimale uitsteeksels voordat je doorgaat. Passage elke 2–3 dagen.
      OPMERKING: WT ESC's en iGATA4-ESC's zijn morfologisch niet van elkaar te onderscheiden tot inductie met doxycycline (DOX).
   3. Bedek een 6-well plaat met 1,5 mL 0,2% gelatine in DI-water per put. Incubeer op 37 °C gedurende minstens 45 minuten.
   4. Voeg 500 μL celdissociatiereagens per put toe en incubeer 3 minuten. Voeg 2 ml FC medium toe terwijl je voorzichtig langs de randen pipetteert. Bevestig >90% loskoppeling onder een microscoop. Als cellen blijven zitten, pipetteer dan voorzichtig om de re-suspension te bevorderen.
   5. Breng de celsuspensie over in een 15 mL centrifugebuis en centrifugeer 4 minuten op 500 × g .
   6. Aspireer het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL N2B27/2i/LIF medium. Bepaal de celconcentratie met 10 μL op een hemocytometer. Pas het volume aan om ~50.000 cellen per put te zaaien.
   7. Aspireer de gelatine en zaad de cellen. Incubeer in normoxie. Verander de volgende dag van medium en daarna elke 48 uur.
3. Ontdooien en doorgeven van muistrofoblaststamcellen (TSC's)
   1. Ontdooi TSC's volgens stappen 1.1.1–1.1.3. Na centrifugatie worden de cellen opnieuw opgehangen in 1 mL TSF4H-medium (Tabel 1) en ~20.000 cellen per put in een met MEF gecoate 6-well plaat gezaaid. Incubeer bij 37 °C, 5% CO₂, 5% O₂ (hypoxie) en wissel elke 24 uur van medium.
   2. Zorg ervoor dat kolonies groot zijn (>75 μm diameter) en afgeplat voordat je ze passert. Voeg 500 μL celdissociatiereagens per put toe en incubeer 5 minuten. Voeg 2 ml FC medium toe terwijl je voorzichtig pipettert. Bevestig >90% detachering.
   3. Cellen overbrengen naar een centrifugebuis en 4 minuten draaien op 500 × g .
   4. Heropsussen in 1 mL TSF4H medium. Bepaal de concentratie en pas aan op ~20.000 cellen per put.
   5. Plat op MEF's en incubeer in hypoxie. Vervang elke 24 uur van medium en passage elke 2–3 dagen voordat de kolonie samensmelt.

2. Vorming van iGATA4-blastoïden

1. Voorbereiding van microwell-aggregatieplaat voor celaggregatie
   1. Voeg 500 μL anti-adherentie spoeloplossing toe aan elke put van een microwell-aggregatieplaat. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 5 minuten met een juiste balans om gevangen lucht uit de microwells te verwijderen. Broeuw op 37 °C in normoxia gedurende minstens 1 uur of een nacht.
2. Blastoïdevoorbereiding, dag 0 — Voorbereiding en beplating van WT en iGATA4-ESC's
   1. Pre-warm N2B27/2i/LIF, FC en FCYL media (FC + 10 ng/mL muis recombinant LIF (mLIF) + 2 μM ROCK-remmer Y27632) tot 37 °C. Bereid 0,2% gelatine in DI-water en zorg dat het celdissociatie-reagens klaar is.
   2. Aspiraat anti-hechtingsoplossing zonder de bodem van de put aan te raken. Was twee keer met 1 ml PBS en één keer met 1 ml FCYL medium. Pipetteer langs de wand om schade aan de microwells te voorkomen.
   3. Bereid een met gelatine gecoate 6-well plaat voor (≥45 min incubatie) voor het passeren van cellen.
   4. Oogst WT- en iGATA4-ESC's door het aspiratiemedium en het toevoegen van 500 μL celdissociatiereagens per put. Breng 3 minuten uit bij 37 °C. Voeg 2 ml FC medium toe en pipetteer voorzichtig. Bevestig volledige loskoppeling onder een microscoop. Overbrengen naar een 15 mL buis en centrifugeren op 500 × g gedurende 4 minuten.
   5. Opnieuw ophangen in 1 mL FCYL-medium. Bepaal de celconcentratie met 10 μL op een hemocytometer. Stel het aan naar 500.000–700.000 cellen/mL. Bereken het volume dat nodig is voor 5 WT ESC's en 5 iGATA4-ESC's per microwell (6.000 cellen per put).
      OPMERKING: Optimaliseer indien nodig voor andere ESC-lijnen. Een startbereik is 4–7 ESC's per microwell met een verhouding van 1:1 ESC's tot iGATA4-ESCs.
   6. Bereid 500 μL celsuspensie per put voor. Voeg druppelgewijs toe aan de Microwell-aggregatieplaat met een 1000 μL pipet. Centrifugeer op 100 × g gedurende 3 minuten en controleer de gelijkmatige verdeling. Bred 6 uur uit tot er aggregaten ontstaan.
   7. Overige ESC's zoals beschreven in Sectie 1.2.
3. Blastoïde-voorbereiding, dag 0 — Bereiding van TX-medium
   1. Bereid ~20 mL TX basaal medium voor met DMEM/F12 (Tabel 2). Bereid je voor voor elk experiment vers voor.
      1. Voeg 200 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamine supplement toe (laatste 2 mM). Bewaar voorraad op 4 °C.
      2. Voeg 200 μL 10.000 U/mL penicilline/streptomycine toe (definitieve 100 U/mL elk). Bewaar bij −20 °C.
      3. Voeg 40 μL 32 mg/mL L-ascorbinezuur toe (eind 64 μg/mL). Bereid het voor in DI-water, filter en bewaar bij −20 °C.
      4. Voeg 20 μL natriumseleniet toe (laatste 14 ng/mL). Bereid het voor en bewaar bij −20 °C.
      5. Voeg 240 μL NaHCO₃ toe (eind 543 μg/mL). Meng goed na het ontdooien.
      6. Voeg 20 μL holo-transferrine toe (uiteindelijke 10,7 μg/mL). Meng na het ontdooien.
      7. Voeg ~37,5 μL insuline toe (eindwaarde 19,4 μg/mL; batchafhankelijk). Bewaar op 4 °C.
   2. Voeg direct voor gebruik Y27632 toe aan een eindconcentratie van 20 μM, CHIR99021 aan 3 μM, IL-11 aan 30 ng/mL, FGF4 aan 25 ng/mL, heparine aan 1 μg/mL, mLIF aan 10 ng/mL, TGFβ aan 15 ng/mL en 8Br-cAMP aan 25 μM.
4. Blastoïdevoorbereiding, dag 0 — Voorbereiding en beplating van TSC's
   1. Voorverwarming TSF4H, FC (Tabel 1) en TX media (Sectie 2.3). Bereid gelatine-gecoate borden voor (≥45 min) voor MEF-uitputting.
   2. Oogst TSC's door 500 μL celdissociatiereagens per put toe te voegen en 5 minuten te incuberen bij hypoxie. Voeg 2 ml FC medium toe en pipetteer voorzichtig. Bevestig loskoppeling. Overbrengen naar een buis en centrifugeren op 500 × g gedurende 4 minuten.
      OPMERKING: TSC's die >4 dagen worden gekweekt, kunnen tot 10 minuten celdissociatie-reagensbehandeling vereisen.
   3. Stil opnieuw in 1 mL TSF4H medium en pas het juiste volume aan voor het platen bij een 1:2 split.
   4. Plat op met gelatine gecoate putten voor MEF-depletie. Incubeer ~45 minuten bij hypoxie. Zorg ervoor dat MEF's vastzitten terwijl TSC's grotendeels niet aangesloten blijven.
   5. Vervang 900 μL medium uit microwell-aggregatieplaatputten door 500 μL TX-medium. Terug naar hypoxie.
   6. Breng TSC-bevattende supernatant over in een buis zonder de aanhechte MEF's te verstoren. Bepaal concentratie (doel 500.000–700.000 cellen/mL).
   7. Bereken het volume voor 12 TSC's per microwell (14.400 cellen per put). Centrifugeer als verdere concentratie nodig is.
      OPMERKING: Optimaliseer voor andere TSC-lijnen (10–15 cellen per microwell worden aanbevolen).
   8. Voeg 500 μL celsuspensie per put toe qua drop. Centrifugeer op 100 × g gedurende 3 minuten. Bevestig verspreiding en incubeer in hypoxie gedurende 24 uur.
   9. Overige TSC's worden indien nodig doorgevoerd (Sectie 1.3).
5. Blastoïdevoorbereiding, dag 1 — Inleiding
   1. Ongeveer 24 uur na toevoeging van de TSC voeg je 20 μL 5 mM 8Br-cAMP en 1 μL 1 μg/mL DOX per put toe. Incubeer 48–72 uur bij hypoxie.
6. Blastoïdevoorbereiding, dag 3 — Fixatie
   1. Suspendeer aggregaten opnieuw met een afgeknipte pipettip van 1000 μL. Zet over naar 2 mL buizen en laat 5 minuten bezinken.
   2. Verwijder supernatant en voeg 250 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe. Stil voorzichtig weer op.
      VOORZICHTIG: Behandel PFA in een afdampkap met de juiste PBM.
   3. Incubeer 15 minuten, elke 5 minuten knippen.
   4. Verwijder PFA en voeg 300 μL PBST toe (PBS + 0,1% Tween-20). Meng voorzichtig. Bewaar op 4 °C gedurende <1 week voordat je beitst.
7. Immunofluorescentie van blastoïden
   1. Breng 150 μL per monster over naar een 96-put U-bodemplaat.
   2. Voeg 100 μL permeabilisatiebuffer toe en incubeer 20 minuten. Vervang met een primaire antistofoplossing en incubeer een nacht bij 4 °C.
   3. Was 3× met PBST (5 minuten per stuk). Voeg secundaire antilichamen toe.
   4. Incubeer 2 uur op kamertemperatuur in het donker.
   5. Was 3 × en breng het over in een beeldvormend schoteltje.
   6. Afbeelding met behulp van confocale microscopie (≥25× objectief, NA ≥0,8).

3. Hoogdoorvoerschermen met het iGATA4-blastoïdemodel

1. iGATA4-blastoïde voorbereiding en testen van omgevingsfactoren
   1. Bereid de microwell-aggregatieplaat voor zoals beschreven in sectie 2.1 en genereer iGATA4-blastoïden volgens secties 2.2–2.4. Bereid voldoende putten voor, inclusief geschikte controles. Voeg een blanke controle (blastoïden voorbereid met het standaardprotocol), een draaggolfbesturing en een of meer experimentele omstandigheden toe.
   2. Incubeer blastoïden 's nachts bij hypoxie. Ongeveer 24 uur na het zaaien van TSC bereid TX-medium voor aangevuld met 8Br-cAMP, doxycycline (DOX) en de verbinding van belang (of dragercontrole). De volgende omstandigheden zijn getest:
      1. Cafeïne: 3,5 mg/L, verdund van ultrazuivere watervoorraden.
      2. Nicotine: 330 ng/L, verdund uit 100% ethanol (EtOH) voorraden.
      3. Ethanol: 17 mM, verdund van absolute EtOH.
      4. Hoge vertakke-keten aminozuren (BCAA): +5%, +25%, +50% ten opzichte van de basisconcentraties (0,45 mM L-leucine, 0,45 mM L-valine, 0,42 mM L-isoleucine), bereid uit geconcentreerde voorraden in ultrazuiver water.
      5. Lage methionine en leucine: −5%, −25%, −50%, −100% ten opzichte van de basisconcentraties (0,12 mM L-methionine, 0,45 mM L-leucine), bereid met Met-/Leu-vrije DMEM/F12. Met-/Leu-free DMEM (LM-DMEM) wordt vóór gebruik aangevuld met 1x Ham's F-12 Nutrient Mix.
         VOORZICHTIG: Bereid geconcentreerde cafeïne- en nicotinevoorraden voor en hanteer ze in een dampkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM; handschoenen, labjas, oogbescherming). Ethanol is brandbaar en moet uit de buurt van warmtebronnen worden gehouden.
   3. Aspireer het medium uit elke put en voeg 1 mL compoundhoudend TX-medium toe. Bewerking één voor één om droog te voorkomen. Plaats het bord terug in de hypoxie-incubator en kweek tot dag 3.
   4. Maak representatieve brightfield-beelden op dag 3 met een transmissielichtmicroscoop. Herstel de structuren en voer immunofluorescentie uit zoals beschreven in secties 2.6 en 2.7.
      OPMERKING: Pas behandelvensters aan afhankelijk van het experimentele doel. Behandelingen kunnen worden toegepast tijdens vroege aggregatie (dag 1) of latere stadia (bijv. perforatie van de holte). Voorbeeldvensters zijn dag 1–3, dag 1–2 (gevolgd door mediavervanging) en dag 2–3.
2. Multiparametrische iGATA4-blastoïde analyse
   1. Gebruik brightfield-beelden om het percentage putten met cavitatiestructuren (d.w.z. structuren met een duidelijk afgebakende centrale holte) te kwantificeren en de blastoïdediameter te meten.
      1. Open afbeeldingen in de beeldanalysesoftware.
      2. Gebruik het rechte lijn-gereedschap om een lijn over elke structuur te trekken.
      3. Meet de diameter met Analyze > Measure.
   2. Selecteer representatieve immunogekleurde monsters (20–40 structuren per biologische replicatie, met ten minste drie biologische replicaten per conditie) en beeld zoals beschreven in sectie 2.7.
   3. Kwantificeer het totale celaantal en de samenstelling van de afstamming met behulp van immunofluorescentiemarkers: TE (CDX2-positief), EPI (SOX2-positief en SOX17-negatief) en PE (SOX17-positief).
   4. Beoordeel structurele organisatie en morfologie door te bepalen of PE-cellen ruimtelijk gescheiden zijn van EPI-cellen binnen de binnenste celmassa (ICM) (binaire classificatie: ja/nee).
   5. Classificeer de morfologie als goed (duidelijke blastocystachtige structuur met een gedefinieerde holte en goed georganiseerde TE-, EPI- en PE-compartimenten), middelmatig (kleine afwijkingen zoals een onregelmatige vorm of gedeeltelijk gevormde holte), of slecht (grote afwijkingen zoals afwezigheid van een holte of ongeorganiseerde/ongesorteerde lijnen).
   6. Kwantificeer aanvullende parameters, waaronder de grootte of het volume van de holte, waar van toepassing. Gebruik bio-informatische tools of andere tools voor plotten en statistische analyse, en 3D-beeldanalysesoftware voor celtelling en/of beeldvoorbereiding voor weergave.

Results

Het behouden van ESC's en iGATA4-ESC's (normoxie) en TSC's (hypoxie) onder geschikte kweekomstandigheden is essentieel voor succesvolle blastoïdegeneratie. Wanneer ze worden gekweekt zoals beschreven, zouden ESC's en iGATA4-ESC's grotendeels niet van elkaar te onderscheiden moeten zijn, en vormen ze na 3 dagen middelgrote, ronde en goed gedefinieerde kolonies. Het uiterlijk van afgeplatte kolonies of uitstekende randen duidt op beginnende differentiatie, en dergelijke culturen mogen niet worden gebruikt voor blastoïdevorming. TSC's moeten platte epitheelkolonies vormen met licht verhoogde randen en vlakkere centra. Overwoekerde of samensmeltende TSC-kolonies (meestal na >3 dagen in kweek) resulteren vaak in slechte blastoïde uitkomsten (Figuur 1).

Tijdens de assemblage van iGATA4-blastoïden wijzen verschillende vroege kenmerken op het succes van het protocol (Figuur 2A, B). Ongeveer 6 uur na ESC- en iGATA4-ESC-aggregatie zouden strakke celaggregaten zichtbaar moeten zijn aan de onderkant van de microwells. Losse aggregaten suggereren overmatige blootstelling aan celdissociatie-reagens, wat de cel-celadhesie vermindert. Voortgang naar de volgende stap (TSC-toevoeging; Sectie 2.4) pas moeten optreden wanneer strakke aggregaten zijn waargenomen (Figuur 2B, tijdstip D0.5). Immunokleuring in dit stadium zou homogene SOX2⁺- en GATA4⁻-aggregaten moeten laten zien (Figuur 2B, D0.5-tijdstip).

Na toevoeging van TSC en nachtelijke incubatie zou een enkele samenhangende aggregate omringd door CDX2⁺-cellen zichtbaar moeten zijn (Figuur 2B). De aanwezigheid van grote, niet-geaggregeerde cellen aan het oppervlak van aggregaten duidt vaak op residuele MEF's. MEF-besmetting kan de efficiëntie van blastoïdevorming verminderen; daarom is voldoende MEF-depletie cruciaal om een overwegend TSC-populatie vóór aggregatie te verkrijgen. Een 40 μm celfilter kan worden gebruikt om resterende MEF's te verwijderen, hoewel dit de opbrengst van TSC kan verminderen. Onvolledige of overmatige CDX2⁺-dekking kan worden gecorrigeerd door het aantal toegevoegde TSC's per microwell aan te passen (aanbevolen bereik: 10–15).

Na toevoeging van DOX en 8Br-cAMP worden gaatjes meestal vanaf dag 2 waargenomen en kunnen ze aanhouden tot dag 3. Bij brightfield-microscopie verschijnen holtes als heldere, lege ruimtes binnen blastoïden (Figuur 2B, C; witte gestreepte lijn). GATA4⁺-cellen verschijnen kort na de DOX-inductie en sorteren geleidelijk naar het oppervlak van het ICM-achtige compartiment (Figuur 2B). Succesvolle vorming van blastoïden wordt gekenmerkt door een hoge cavitatie-efficiëntie (typisch ~80% van de structuren per microwell-aggregatieplaat; Figuur 2D), een enkellaags CDX2⁺ TE-achtig buitenepitheel, een blastocoel-achtige holte en een afgerond ICM-achtig compartiment met SOX2⁺ EPI-achtige cellen overheen GATA4⁺ PE-achtige cellen (Figuur 2C–E).

Veelvoorkomende suboptimale uitkomsten zijn niet-cavitatieve structuren, onregelmatig gevormde blastoïden met meerdere holtes of ICM-achtige compartimenten, en putten met weinig structuren of cellulair afval. Hoewel ongeveer 20% abnormale structuren wordt verwacht (Figuur 2C), kunnen hogere percentages wijzen op problemen zoals onjuiste voorbereiding van het TX-medium, slechte kwaliteit van de startcel, het niet toevoegen van DOX of 8Br-cAMP op dag 1, of verplaatsing van structuren tijdens mediumwisselingen.

Voor hoge-doorvoer screeningstoepassingen zouden onbehandelde en voertuigcontroleputten blastoïden moeten opleveren die vergelijkbaar zijn met positieve controleomstandigheden (Figuur 3A,B). Experimentele behandelingen kunnen meerdere kwaliteitsindicatoren beïnvloeden, waaronder de grootte van de blastoïde (Figuur 3C), cavitatie-efficiëntie, totale en afstammingsspecifieke celnummers (Figuur 3D), PE-sortering en algehele morfologie (Figuur 3E). Zo resulteerde behandeling met cafeïne, nicotine of ethanol tijdens de vorming van blastoïden in kleinere structuren met verminderde cavitatie-efficiëntie, lager totaal of ICM-celaantal, verminderde PE-sortering en een slechtere morfologie. Daarentegen produceerden toenemende concentraties vertakte aminozuren grotere, sterker gecaviteerde blastoïden met een toename van cellen en verbeterde morfologie (Figuur 3C–E). Biologische variabiliteit tussen experimenten wordt verwacht, wat het belang benadrukt van het opnemen van zowel blank- als dragercontroles in elk experiment.

Figuur 1: Voorbeelden van goede en slechte kwaliteit WT ESC's, iGATA4-ESC's en TSC's. Brightfield-micrografieën van WT ESC's, iGATA4-ESC's en TSC's tonen verwachte koloniemorfologieën na 2–3 dagen kweek in N2B27/2i/LIF (ESC's) of TSF4H-medium (TSC's). Het paneel getiteld "WT ESC's – slechte kwaliteit" toont cellen met suboptimale morfologie, waaronder afgeplatte kolonies met uitstekende randen (rode pijlpunten). Het paneel "TSC overwoekerd" toont samengesmolten en vergrote TSC-kolonies na 4 dagen kweek. Schaalbalk: 100 μm voor alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schematische en verwachte morfologie van iGATA4-blastoïden. Herdrukt uit Developmental Cell, Vol. 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S et al., Efficiënte stamcel-afgeleide muisembryo-modellen voor milieustudies, pp. 193–207.e6, Copyright (2025)³, met toestemming van Elsevier. (A) Schematische weergave van natuurlijke muisblastocystontwikkeling (boven) en stamcelgebaseerde blastocystmodellering met behulp van WT ESC's, iGATA4-ESC's en TSC's.
(B) Micrografieën die de verwachte morfologie en markerexpressie tonen in verschillende stadia van het protocol. Maximale intensiteitsprojectie (MIP); Stippellijnen markeren de holte. Schaalbalk: 20 μm. (C) Brightfield-afbeelding van iGATA4-blastoïden op dag 3. Schaalbalk: 100 μm.
(D) Cavitatiesnelheden van iGATA4-blastoïden die worden gegenereerd met TSC's die vooraf zijn gekweekt in normoxie of hypoxie; aggregaten werden onder hypoxische omstandigheden gekweekt. n ≥ 4; foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. (E) Immunokleuring van E4.5-blastocysten en dag 3 iGATA4-blastoïden voor afstammingsmarkers (CDX2, cyaan; OKT4, rood; GATA4, groen). Maximale intensiteitsprojectie (MIP); enkel Z-vlak weergegeven waar aangegeven. Schaalbalk: 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Effecten van omgevingsfactoren op de vorming en kwaliteit van blastoïden. (A) Representatieve immunofluorescentie 3D-beelden (boven) en IMARIS oppervlaktereconstructies (onder) van iGATA4-blastoïden behandeld met omgevingsfactoren (cafeïne, nicotine, ethanol en omstandigheden die hoog- en eiwitarm dieet nabootsen). Schaalbalken: 25 μm voor alle beelden. (B) Schema van de experimentele workflow. (C) Blastoïdediameter onder verschillende behandelingsomstandigheden. Het bereik omvat het 10e tot 90e percentielen; vakjes geven het interkwartielbereik aan; De lijn geeft de middenberm aan. Statistische analyse werd uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen. (D) Kwantificering van totale (grijs), trofoectoderm (cyaan), epiblast (rood) en primitieve endoderm (groene) celaantallen in controle- en behandelde blastoïden. Balken geven het gemiddelde aan; Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Statistische analyse werd uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen. (E) Kwantificering van het aandeel blastoïden dat onder controle- en behandelingsomstandigheden wordt geclassificeerd als "goed" (juiste lijnsortering met minimale morfologische afwijkingen), "middelmatig" (grotendeels correcte morfologie met kleine afwijkingen, inclusief onvolledige EPI–PE-sortering), of "slecht" (ernstig abnormale morfologie met verstoorde lijnorganisatie) onder controle- en behandelingsomstandigheden. Statistische analyse werd uitgevoerd met tweerichtings-ANOVA ten opzichte van controleomstandigheden. Voor alle panelen, n ≥ 3. Statistische significantie wordt aangegeven als *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Media	Reagens	Eindconcentratie
FC
	DMEM	N.A.
	Hitte-geïnactiveerde FBS (iFBS)	15%
	GlutaMax	2 mM
	2-Mercaptoethanol (2-ME)	0,1 mM
	Niet-essentiële aminozuren (NEAA)	1x
	Na Pyruvate	1x
	Penicilline–Streptomycine	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	NeurobasalA	50%
	B27-supplement	1x
	N2-supplement	0,5x
	2-ME	100 μM
	Penicilline–Streptomycine	1%
	GlutaMax	2 mM
	PD0325901	1 μM
	CHIR99021	3 μM
	Muizenrecombinant LIF	10 ng/mL
TSF4H
	Megacell RPMI-1640 Medium	N.A.
	iFBS	20%
	GlutaMax	2 mM
	Na Pyruvate	1x
	Penicilline–Streptomycine	1x
	FGF4	25 ng/mL
	Heparine	1 μg/mL

Tabel 1: Mediarecepten voor FC, N2B27/2i/LIF en TSF4H. Recepten om FC-media te bereiden, N2B27/2i/LIF-media en TSF4H-media, met uiteindelijke concentraties.

Component	Eindconcentratie	Voorraadconcentratie	Oplosmiddel en opslag	Volume tot ~20 mL
8Br-cAMP	25 μM	5 mM	PBS, bewaar bij -20 °C	100 μL
CHIR99021	3 μM	10 mM	DMSO, bewaar bij -20 °C	6 μL
DMEM/F12	N.v.t.	N.v.t.	Bewaar op 4 °C	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	0,1% BSA in PBS, bewaren bij -20 °C	5 μL
L-alanyl-L-glutamine Supplement	2 mM	200 mM	Bewaar op 4 °C	200 μL
Heparine	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS, bewaar bij -20 °C	20 μL
Holo-transferrin	10,7 μg/mL	10,7 mg/mL	DI-water, bewaar bij -20 °C	20 μL
Menselijke TGF-β1	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + 0,1% BSA, opgeslagen bij -20 °C	15 μL
IL-11	30 ng/mL	25 μg/mL	0,1% BSA in PBS, bewaren bij -20 °C	24 μL
Insuline	19,4 μg/mL	9,5 - 11,5 mg/mL	De concentratie is batch-afhankelijk, bewaar bij 4 °C	33,7–40,8 μL, pas het volume aan volgens de voorraadconcentratie.
L-ascorbinezuur-2-fosfaat magnesium	64 μg/mL	32 mg/mL	DI-water, bewaar bij -20 °C	40 μL
Muizenrecombinant LIF	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + 0,1% BSA, bewaren bij -20 °C	20 μL
NaHCO3	543 μg/mL	45,25 mg/mL	DI-water, bewaar bij -20 °C	240 μL
Penicilline/Streptomycine	1x	100x	Bewaar bij -20 °C	200 μL
Natriumseleniet	14 ng/mL	14 μg/mL	DI-water, bewaar bij -20 °C	20 μL
Y27632	20 μM	20 mM	DMSO, bewaar bij -20 °C	20 μL

Tabel 2: Media-recept voor TX. Recept voor het bereiden van TX-media, met details over hoe je kleine moleculen en andere reagentia bereidt en opslaat, en de uiteindelijke concentraties.

Discussion

iGATA4-blastoïden bieden een zeer efficiënt, embryo-achtig, stamcelgebaseerd model van de muisblastocyst door drie in vitro gekweekte celtypen zelf te organiseren: ESC's, induceerbare GATA4-ESC's (iGATA4-ESC's) en hypoxie-gekweekte TSC's. Deze structuren recapitulaten belangrijke kenmerken van de E4.5 blastocyst, waaronder passende afstammingsverhoudingen en transcriptie-identiteit, en kunnen worden gebruikt voor multiparametrische omgevingsscreening, waarbij ze betrouwbaar blastocyst-ontwikkelingsdefecten weerspiegelen³. Een recente studie toont verder aan dat aggregatie van ESC's, iGATA4-ESC's en TSC's in basale blastoïdemedia ook zorgt voor hoogefficiënte blastoïdevorming, wat de robuustheid en aanpassingsvermogen van deze aanpak in laboratoria en kweekcondities^{benadrukt 39}. iGATA4-ESC's zijn eerder aangetoond de functies van VE-cellen te recapituleren in post-implantatie stamcel-gebaseerde embryo-modellen 28,29,30,31. Samen illustreren deze resultaten hoe iGATA4-ESC's kunnen dienen als flexibele en betrouwbare vervangers voor PE/VE-cellen in stamcelgebaseerde embryo-modellering over ontwikkelingsstadia heen.

Verschillende stappen in het protocol zijn cruciaal om hoogwaardige blastoïden te bereiken. Deze omvatten de kwaliteit van de startcelpopulaties, met name hypoxie-gekweekte TSC's (Figuur 1); de bereiding van TX-medium, dat vers op dag 0 moet worden bereid (Tabel 2; Sectie 2.3); en zorgvuldig omgaan met platen na het aggregatie. Belangrijke metingen van het succes van het protocol zijn onder andere cavitatie-efficiëntie (meestal ~80%), geschikte morfologie (structuren met een diameter van ~100 μm met een blastocoel-achtige holte, een CDX2⁺ TE-achtige buitenlaag, en een gesorteerde SOX2⁺- en GATA4⁺-binnencelmassa met een ongeveer 3 TE:1 EPI:1 PE-verhouding), en de aanwezigheid van een correct gesorteerde GATA4⁺-achtige PE-achtige laag. Dit zijn metrieken die vaak worden gebruikt in het vakgebied 1,2,4,5. Onder de gecaviteerde blastoïden vertoont ongeveer 75% van de structuren al deze kenmerken. Deze metrics kunnen worden gebruikt als eerste indicatoren voor probleemoplossing. Suboptimale celkwaliteit wordt meestal weerspiegeld in abnormale koloniemorfologie, wat resulteert in slecht geaggregeerde of niet-gecaviteerde structuren. Onjuiste voorbereiding van het medium kan leiden tot onvolledige aggregatie of afstammingsdefecten, terwijl ruw hanteren kan leiden tot meerdere aggregaten per microwell of lege putten.

Verdere optimalisatie kan het aanpassen van het aantal gezaaide cellen omvatten (aanbevolen startbereiken: 4–7 ESC's en iGATA4-ESC's, en 10–15 TSC's per microwell), het verfijnen van MEF-uitputtingsmethoden (bijv. filtratie via een 40 μm celzeef) en het aanpassen van de samenstelling van het TX-medium. Zo kan het verwijderen van FGF4 en heparine nog steeds efficiënte blastoïdevorming ondersteunen en tegelijkertijd een meer muurachtige TE-achtige identiteit bevorderen. iGATA4-blastoïden kunnen tot 6 dagen in cultuur worden gehouden; structuren van dag 4–6 nemen echter vaak in omvang toe, terwijl ze blastocystachtige proporties van de lijn behouden. Het protocol levert consistente resultaten op bij biologische replicaten, maar bij elk experiment moeten passende controles worden opgenomen.

Vergeleken met andere muisblastooïdesystemen, die variëren in startcelpopulaties en^{kweekcondities}, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , iGATA4-blastoïden bereiken zowel een hoge formatie-efficiëntie als een nauwkeurige weergave van de afstamming. Hoewel veel bestaande protocollen cavitatiestructuren genereren en waardevol zijn voor specifieke biologische toepassingen, vertonen ze vaak onvolledige PE-vorming, heterogene of ongedefinieerde celidentiteiten of onjuiste afstammingsverhoudingen. Door drie stamcelpopulaties die op afstamming gericht zijn stapsgewijs te combineren, overwinnen iGATA4-blastoïden deze beperkingen en bieden ze een reproduceerbaar, modulair en experimenteel toegankelijk systeem.

Ondanks deze voordelen blijven er verschillende beperkingen bestaan. Verlengde in vitro-kweek in het medium van Texas langer dan 4–6 dagen resulteert in overgroei, zelfs als de afstammingsverhoudingen blastocystachtig blijven. Ongeveer 12,5% van de iGATA4-blastoïden gaat in vitro over naar peri-implantatie-achtige morfologieën, gekenmerkt door een kopvormige, pseudogelaagde epiblast die een pro-amnionholte omsluit, een uitgebreid extraembryonaal ectodermachtig compartiment naast de proximale epiblast, en een buitenste viscerale endodermachtige laag. Echter, iGATA4-blastoïden slagen er niet in zich te implanteren en ontwikkelen zich verder na overdracht naar een gastheermuis. Daarom zijn iGATA4-blastoïden, en blastoïden in bredere zin, niet geschikt voor het bestuderen van implantatie of embryo-moederinteracties.

De moleculaire basis van het falen van implantaten door blastoïden blijft onduidelijk, hoewel het huidige bewijs suggereert dat onvolledige trofocodedermmodellering een bijdragende factor kan zijn. TE-achtige cellen in iGATA4-blastoïden vertonen een overpolaire moleculaire identiteit. Toekomstige pogingen om TSC's te ontwerpen die meer lijken op murale TE-cellen, of om alternatieve cellijnen te introduceren die implantatie-competente TE beter reproduceren, vormen veelbelovende richtingen om deze beperkingen te overwinnen. De modulaire aard van iGATA4-blastoïden, waarin TE-specifieke modificaties onafhankelijk van EPI- en PE-vorming kunnen worden geïmplementeerd, maakt dit systeem bijzonder geschikt voor dergelijke ontwikkelingen.

Gezamenlijk biedt het iGATA4-blastoïde protocol een robuust en schaalbaar platform voor het bestuderen van lijnspecificatie en vroege ontwikkelingsprocessen in het zoogdierembryo. De reproduceerbaarheid en aanpassingsvermogen maken het zeer geschikt voor toepassingen met hoge doorvoer in omgeving, farmacologie en genetische screening. Als zodanig vormen iGATA4-blastoïden een krachtig systeem voor het onderzoeken van vroege ontwikkelingsmechanismen en het beoordelen van hoe diverse verstoringen de ontwikkeling vóór implantatie beïnvloeden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Gebaten voor algemene media bereiding
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	Gebaten voor TX media bereiding en blastoid cavitatie
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Microwell aggregatieplaat; Gebruikt voor blastoid bereiding
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Gebaten voor blastoid bereiding
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Breed buisje voor blastoid beweging tijdens immunokleuring.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Gebaten voor media bereiding
Caffeine	Sigma	58-08-2	Gebaten als omgevingsfactor om te testen in iGATA4-blastoids
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	Voor immunofluorescentie, gebruikt bij 1:200
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	Andere merken/modellen kunnen ook werken.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Gebaten voor media bereiding
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	Gebaten voor algemene weefselkweek doeleinden
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Gebaten voor immunofluorescentie, gebruikt bij 1:500-1:1,000
DMEM	Gibco	11995040	Gebaten voor FC media bereiding
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	Gebaten voor N2B27 en TX media bereiding
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Supplement DMEM-LM met Ham's F-12 Nutrient Mix poeder tot een uiteindelijke 1x concentratie om Met- en Leu-vrije DMEM/F12 te verkrijgen
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	Gebaten voor immunofluorescentie, gebruikt bij 1:500-1:1,000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	Gebaten voor immunofluorescentie, gebruikt bij 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	Gebaten voor immunofluorescentie, gebruikt bij 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	Gebaten voor immunofluorescentie, gebruikt bij 1:500-1:1,000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Gebaten voor immunofluorescentie. Ontdooi bij 4°C; en bewaar geportioneerd bij -20°C.
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	Voor iGATA4 inductie tijdens blastoid bereiding
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	gebruikt in ons lab, anderen zullen werken. Vereist buis- en plaatadapters.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	Gebaten voor immunofluorescentie
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Gebaten voor media bereiding
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	Gebaten voor beeldanalyse
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	Gebaten voor immunofluorescentie, gebruikt bij 1:500
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	Gebaten voor algemene weefselkweek doeleinden
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	Voor immunofluorescentie en beeldvorming
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-alanyl-L-glutamine supplement; Gebaat voor media bereiding
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	Gebaten als supplement voor DMEM-LM, voor low-protein dieet condities.
Heparin	Sigma	H3149	Gebaten voor media bereiding
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	Andere merken/modellen kunnen ook werken.
Holo-transferrin	Sigma	T4132	Gebaten voor TX media bereiding.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	Gebaten voor TX media bereiding.
IL-11	PeproTech	200-11	Gebaten voor TX media bereiding.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Gebaten voor beeldanalyse en beeldvoorbereiding.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Gebaten voor media bereiding
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Cel lijn beschikbaar van het Zernicka-Goetz lab op aanvraag
Insulin	Sigma	I9278	Gebaten voor TX media bereiding.
Irradiated C57bl/6 Mouse Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A34960	Gebaten als feeder laag voor TSC kweek. Ontdooi zoals aangegeven in het protocol en gebruik binnen een week.
L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium	Sigma	A8960	Gebaten voor TX media bereiding.
L-isoleucine	Thermo Fisher Scientific	73-32-5	Gebaten om TX media aan te vullen.
L-leucine	Thermo Fisher Scientific	61-90-5	Gebaten om TX media aan te vullen.
L-valine	Thermo Fisher Scientific	72-18-4	Gebaten om TX media aan te vullen.
Megacell RPMI-1640 Medium	Sigma	M3817