Geïntegreerde netwerkfarmacologie, metabolomics en in vivo validatie van Liangxue Dihuang-aftrek bij door DSS geïnduceerde muizen met ulcerosa colitis

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare workflow die netwerkfarmacologie, niet-gerichte metabolomics en in vivo validatie integreert om de meercomponentenmechanismen van Liangxue Dihuang-aftrek te verduidelijken in een door dextran sulfaat natrium geïnduceerd muismodel van colitis ulcerosa.

Samenvatting

Colitis ulcerosa (UC) is een chronische inflammatoire darmziekte die wordt gekenmerkt door aanhoudende darmontsteking en metabole ontregeling. Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) formules worden veel gebruikt in de klinische praktijk voor ontstekingsstoornissen; echter, systematische experimentele benaderingen om hun multicomponent- en multi-doelmechanismen te verduidelijken blijven beperkt. Dit artikel presenteert een reproduceerbaar experimenteel protocol dat netwerkfarmacologie, untargeted metabolomics en in vivo validatie integreert om de ontstekingsremmende effecten van Liangxue Dihuang Decoction (LXDHD) te onderzoeken in een door dextran sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerd muismodel van UC. De workflow omvat de voorbereiding van het kruidenaftreksel, DSS-geïnduceerde colitismodellering, beoordeling van ziekteactiviteit, histopathologische en hematologische evaluatie, meting van serumcytokinen, LC–MS-gebaseerde metabolomische profilering en analyse van computationele netwerken. Met deze geïntegreerde aanpak werd door DSS geïnduceerde colitis succesvol vastgesteld, en de behandeling van LXDHD resulteerde in meetbare verbeteringen in de ziekte-activiteitsindex, de lengte van de colon, histopathologische schade, ontstekingscytokineniveaus en metabole profielen. Netwerkfarmacologie en metabolomics-analyses toonden verder aan dat dit protocol het mogelijk maakt om belangrijke doelwitten, routes en metabolieten te identificeren die samenhangen met therapeutische interventie. Deze gevisualiseerde en gestandaardiseerde workflow biedt een praktisch methodologisch kader voor het bestuderen van de farmacologische mechanismen van multicomponent-TCM-formules bij inflammatoire darmziekten en kan worden aangepast aan andere kruidenvoorschriften en ziektemodellen.

Inleiding

Colitis ulcerosa (UC) is een chronische inflammatoire darmziekte die wordt gekenmerkt door een voortdurende mucosale ontsteking van de dikke darm¹, wat leidt tot symptomen zoals buikpijn, diarree, rectale bloedingen en gewichtsverlies². De incidentie van UC neemt wereldwijd toe, wat een aanzienlijke last legt op de zorgsystemen en de kwaliteit^{van leven van} patiënten aanzienlijk aantast. Hoewel de etiologie van UC nog onvolledig begrepen is, wijst het opeenstapelende bewijs erop dat gestoorde immuunreacties, overmatige productie van inflammatoire cytokines, oxidatieve stress en metabole verstoringen centrale rollen spelen in ziektepathogenese ^4,5.

Huidige therapeutische strategieën voor UC omvatten voornamelijk aminosalicylaten, corticosteroïden, immunosuppressiva en biologische middelen gericht op inflammatoire cytokines⁶. Hoewel deze behandelingen symptomen kunnen verlichten en remissie kunnen induceren, wordt het langdurige gebruik vaak geassocieerd met bijwerkingen, hoge kosten en variabele therapeutische responsen ^7,8,9. Bovendien slaagt een aanzienlijk deel van de patiënten er niet in een langdurige remissie te bereiken, wat de noodzaak benadrukt van alternatieve of complementaire therapeutische benaderingen met verbeterde veiligheid en multi-target effectiviteit.

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) wordt al eeuwenlang veel gebruikt voor de behandeling van gastro-intestinale aandoeningen en wordt steeds meer erkend vanwege de potentiële voordelen bij complexe ontstekingsziekten zoals UC¹⁰. In tegenstelling tot single-target therapieën oefenen TCM-formules doorgaans therapeutische effecten uit door meerdere componenten die op meerdere doelen en routes werken, wat mogelijk beter aansluit bij het multifactoriele karakter van UC¹¹. Klinische en experimentele studies suggereren dat bepaalde TCM-voorschriften immuunresponsen kunnen moduleren, ontstekingen kunnen onderdrukken, de integriteit van de darmbarrière kunnen beschermen en de metabole homeostase kunnen reguleren 12,13,14,15.

Liangxue Dihuang Decoctie (LXDHD) is een klassieke TCM-formule die traditioneel wordt gebruikt om "het bloed te koelen en warmte te zuiveren" en klinisch is toegepast bij inflammatoire en hemorragische aandoeningen¹⁶. Het recept bestaat uit meerdere kruiden, waaronder Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis en Glycyrrhiza uralensis. Moderne farmacologische studies hebben aangetoond dat verschillende bestanddelen van kruiden en hun actieve verbindingen ontstekingsremmende, antioxiderende en immunomodulerende eigenschappen hebben 17,18,19. De algehele therapeutische effecten en onderliggende mechanismen van LXDHD bij UC zijn echter nog niet systematisch opgehelderd.

Netwerkfarmacologie is uitgegroeid tot een effectieve benadering om de complexe interacties tussen multicomponenten kruidenformules en ziektegerelateerde moleculaire doelstellingen^te onderzoeken. Door informatie uit meerdere databases te integreren, kan netwerkfarmacologie potentiële actieve verbindingen, therapeutische doelwitten en signaalroutes voorspellen, wat een systeemniveau begrip van TCM-mechanismen^{biedt 21}. Desalniettemin steunt netwerkfarmacologie voornamelijk op databasevoorspellingen en weerspiegelt het niet direct metabole veranderingen in vivo .

Metabolomics, als krachtig hulpmiddel voor het profileren van wereldwijde metabole veranderingen, biedt complementaire inzichten in ziektepathofysiologie en therapeutische responsen²². Bij UC hebben metabolomische analyses significante verstoringen in het lipiden- en aminozuurmetabolisme aan het licht gebracht, evenals oxidatieve stress-gerelateerde routes 23,24,25. Het integreren van metabolomics met netwerkfarmacologie kan helpen de kloof te overbruggen tussen voorspelde moleculaire doelen en daadwerkelijke metabole fenotypes, waardoor de betrouwbaarheid van mechanistische interpretaties verbetert.

In de huidige studie werd een geïntegreerde strategie gebruikt die netwerkfarmacologie, niet-gerichte metabolomics en experimentele validatie combineert om de ontstekingsremmende effecten en mogelijke mechanismen van LXDHD in een door dexternsulfaat natrium (DSS)-geïnduceerd muismodel van UC te onderzoeken (Figuur 1A). Dit algehele methodologische ontwerp, waarbij in silico-voorspellingen worden geïntegreerd met in vivo metabolomische en fenotypische validatie, is in overeenstemming met vastgestelde rigoureuze onderzoekskaders²⁶. Netwerkfarmacologische analyse werd gebruikt om actieve verbindingen, potentiële therapeutische doelwitten en signaalroutes te identificeren die verrijkt zijn door LXDHD-behandeling. Er werd untargeted metabolomics uitgevoerd om metabole veranderingen geïnduceerd door UC en hun modulatie door LXDHD te karakteriseren. Bovendien werden belangrijke bevindingen gevalideerd via in vivo experimenten, waaronder beoordelingen van ziekteactiviteit, histopathologische veranderingen, hematologische parameters en ontstekingscytokineniveaus.

Door computationele voorspellingen, metabole profilering en biologische validatie te integreren, wil deze studie een volledig begrip bieden van de multi-component, multi-target en multi-pathway mechanismen die ten grondslag liggen aan de therapeutische effecten van LXDHD bij UC. Dit werk biedt niet alleen experimenteel bewijs dat het gebruik van LXDHD als potentiële complementaire therapie voor UC ondersteunt, maar biedt ook een methodologisch kader voor het onderzoeken van de mechanismen van andere complexe TCM-formules.

Protocol

Alle dierproevenprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine (Goedkeuring nr. #2025DW-034-01; Goedkeuringsdatum: 24 maart 2025). De bereiding van het Liangxue Dihuang-aftrek werd uitgevoerd volgens de procedures beschreven in de Chinese Farmacopee²⁷. De reagentia, chemicaliën en software die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van Liangxue Dihuang-aftreksel (LXDHD)

1. Bereid de gedroogde kruidenmaterialen voor volgens de standaardformulering van LXDHD. De precieze kruidensamenstelling, botanische namen en exacte voorgeschreven doseringen van de elf bestanddelen worden gespecificeerd in Tabel 1.
   OPMERKING: Verifieer alle kruidenmaterialen door een gekwalificeerde farmacoog vóór gebruik om de botanische identiteit en kwaliteitsconsistentie te waarborgen. Bewaar authenticatierecords voor reproduceerbaarheid.
2. Poederbereiding
   1. Laat alle kruidenmaterialen aan de lucht drogen op kamertemperatuur in een schone, goed geventileerde omgeving.
   2. Verpulver elk kruid afzonderlijk met een mechanische molen totdat er een fijn poeder is verkregen.
   3. Meng de poeders volgens de voorgeschreven verhoudingen.
   4. Laat het gemengde poeder door een zeef van 80 gaas (binnendiameter 180 μm ± 7,6 μm) passeren om een uniforme deeltjesgrootte te garanderen.
   5. Homogeniseer het gezeefde poeder grondig.
      OPMERKING: Een uniforme deeltjesgrootte is essentieel voor consistente extractie-efficiëntie. Onvolledig malen of ongelijke menging kan leiden tot variabiliteit in chemische samenstelling.
3. Bereiding van LXDHD waterig extract
   1. Weeg het gemengde kruidenpulver nauwkeurig en voeg gedestilleerd water toe in een verhouding van 1:10 (w/v).
   2. Verhit het mengsel tot kookpunt en laat het 20 minuten koken.
   3. Filter het extract en verzamel het filtrat.
   4. Voeg vers gedestilleerd water toe aan het residu en herhaal het aftrekken nog eens 20 minuten.
   5. Combineer de twee filtraten om het uiteindelijke LXDHD-waterextractie te verkrijgen.
      OPMERKING: Dubbele aftrek is essentieel om een efficiënte extractie van zowel wateroplosbare als matig oplosbare componenten te garanderen.
4. Concentratie en opslag
   1. Concentreer het gecombineerde skok onder verminderde druk of zachte verhitting totdat de gewenste concentratie is bereikt.
   2. Laat het extract afkoelen tot kamertemperatuur.
   3. Bewaar het bereide LXDHD-extract bij 4 °C en gebruik het binnen 48 uur.
      OPMERKING: Vermijd herhaalde vries-ontdooicycli, omdat deze bioactieve verbindingen kunnen afbreken en de experimentele reproduceerbaarheid kunnen verminderen.
5. Bestuur
   1. Breng het extract op kamertemperatuur vóór toediening.
   2. Geef muizen het geconcentreerde waterige aftrek van LXDHD via orale gavage in de aangewezen doses volgens de experimentele groep.

2. Ontwerp van dierproeven

1. Dieren en huisvestingsomstandigheden
   1. Verkrijg mannelijke C57BL/6 muizen (leeftijd 6–8 weken, 20–25 g) bij een gecertificeerde leverancier van laboratoriumdieren.
   2. Huismuizen onder standaard laboratoriumomstandigheden met een 12 uur licht/donker cyclus, gecontroleerde temperatuur (22–25 °C) en relatieve luchtvochtigheid (50%–60%).
   3. Geef muizen gedurende het experiment gratis toegang tot standaard voedsel en water.
   4. Laat muizen minstens 7 dagen acclimatiseren voordat ze experimenteren.
      OPMERKING: Neem alleen gezonde muizen met normale activiteit en lichaamsgewicht op in latere experimenten.
2. Groepering en dosisberekening
   1. Bereken de muisdosering van LXDHD volgens het mens-dier-dosisconversieprincipe beschreven in Methodology of Pharmacological Experiments, gebaseerd op een standaard volwassen lichaamsgewicht van 70 kg en een dagelijkse klinische dosis van 8,4 g²⁸.
   2. Verdeel muizen willekeurig in de volgende groepen (n = 6 per groep): Normale controlegroep, DSS-geïnduceerde UC-modelgroep, laag-dosis LXDHD-groep (1,09 g/kg), hooggedoseerde LXDHD-groep (2,18 g/kg), en 5ASA positieve controlegroep (100 mg/kg)²⁹.
      OPMERKING: Voer randomisatie uit met behulp van een toevalsgetallen om selectiebias te minimaliseren.
   3. Inleiding van UC en medicijntoediening
      1. Maak 2,5% (met v/v) DSS-oplossing in drinkwater.
      2. Geef DSS-oplossing ad libitum aan muizen in het model, LXDHD-behandelde en 5ASA-groepen gedurende 7 opeenvolgende dagen^{en 30} dagen.
      3. Geef muizen in de normale controlegroep gezuiverd drinkwater.
      4. Geef LXDHD en 5ASA eenmaal dagelijks aan de behandelgroepen via orale gavage in de overeenkomstige doseringen gedurende de experimentele periode.
      5. Geef een gelijke hoeveelheid voertuigoplossing aan de normale besturings- en DSS-modelgroepen.
         OPMERKING: Bereid de DSS-oplossing vers voor en vervang deze elke 2 dagen. DSS-batches kunnen variëren in colitis-opwekkende potentie; voer pilottests uit bij gebruik van een nieuwe batch. Het succesvolle opzetten van het door DSS geïnduceerde UC-model wordt gekenmerkt door progressief lichaamsgewichtsverlies, bloedige diarree, verhoogde DAI-scores en duidelijke verkorting van de darm. Deze criteria en het methodologische ontwerp van de muisexperimenten zijn in overeenstemming met de vastgestelde referentiestandaarden³¹.
3. Bereiding van blank en medicijnhoudend serum voor exogene metabolomics
   1. Gebruik een aparte groep gezonde mannelijke C57BL/6 muizen.
   2. Verdeel muizen willekeurig in twee groepen: de blanco groep en de LXDHD-groep.
   3. Geef LXDHD aan de LXDHD-groep via orale gavage van 2,18 g/kg eenmaal daags gedurende 7 opeenvolgende dagen.
   4. Geef een gelijke hoeveelheid gedestilleerd water aan de blankgroep.
   5. Neem bloedmonsters 1 uur na de laatste toediening.
   6. Verwerk bloedmonsters om serum te verkrijgen zoals hierboven beschreven in sectie 3.5.

3. Beoordeling van ziekteactiviteit

1. Controleer dagelijks het lichaamsgewicht, de consistentie van de ontlasting en het bloeden van ontlasting tijdens het experiment.
2. Bereken de Disease Activity Index (DAI) op basis van lichaamsgewichtsverlies, ontlastingsconsistentie en fecale bloedingen. Het specifieke beoordelingskader wordt beschreven in Tabel 3. Bereken de
   de eindscore van DAI als het gemiddelde (of de som) van deze drie parameters³².
3. Aan het einde van dag 8 doof je muizen van elke groep met 1% natriumpentobarbital (30 mg/kg). Verzamel ongeveer 400 μL bloed uit de retro-orbitale veneuze plexus van elke muis. Vervolgens euthanasen de dieren door cervicale ontwrichting om de dood te waarborgen, strikt in overeenstemming met de richtlijnen van de American Veterinary Medical Association (AVMA) voor de euthanasie van dieren (Figuur 1B).
   OPMERKING: Bevestig voldoende verdoving door voorzichtig in de tenen en het plantaire oppervlak van de achterpoten te knijpen; Het ontbreken van een terugtrekkingsrespons duidt op voldoende diepte van de anesthesie.
4. Verzamel darmweefsel en meet de lengte van de dikke darm als indicator van de ernst van de ziekte.
   OPMERKING: Verkorte colonlengte wordt beschouwd als een kenmerk van door DSS veroorzaakte colitisernst³³.
5. Bloedserum verkrijgen
   1. Laat een deel van de verzamelde bloedmonsters 1 uur bij kamertemperatuur stollen.
   2. Centrifugemonsters op 1.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om serum te verkrijgen.
   3. Kwantificeer serumniveaus van interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-17, tumornecrose factor-alpha (TNF-α) en IL-10.
   4. Verzamel darmweefselmonsters voor histopathologische analyse.
   5. Gebruik resterende bloedmonsters voor perifere bloedanalyse.
   6. Reserveer extra serummonsters voor metabolomics-analyse.

4. Hematoxyline–Eosine (H&E) kleuring

1. Bevestig de dikke darmweefsel in 4% paraformaldehyde gedurende minstens 24 uur.
2. Dehydrateer weefsels via een gegradueerde ethanolserie.
3. Maak weefsels schoon met xyleen en voeg paraffine in.
4. Snijd weefselsecties (3–5 μm dik) met behulp van een microtoom.
5. Deparaffiniseer secties met xyleen.
6. Rehydrateer secties met gegradueerde ethanol.
7. Kleursecties met hematoxyline voor nucleaire visualisatie.
8. Tegenkleuringssecties met eosine voor cytoplasmatische kleuring.
9. Observeer histopathologische veranderingen onder een lichtmicroscoop en maak representatieve beelden met de bijbehorende beeldvormingssoftware.
10. Evalueer histologische scores (HCS) op basis van de ernst van de ontsteking, de diepte van de verwonding en de cryptebeschadiging.
11. Zie Tabel 4 voor gedetailleerde histologische scorecriteria.
    OPMERKING: Maak representatieve beelden van weefselinbedding, doorsnijden en kleuring om de protocolvisualisatie te verbeteren.

5. Perifere bloedanalyse

1. Verzamel perifere bloedmonsters in EDTA-K2 antistollingsbuisjes (1,5 mg EDTA per mL bloed).
2. Keer de buizen voorzichtig 8–10 keer om een goede menging te garanderen.
3. Analyseer bloedceltellingen met een driedelige veterinaire hematologie-analyzer (Mindray BC-2600vet) met soortspecifieke kalibratie.
4. Transportmonsters bij 4 °C.
5. Analyseer monsters binnen 4 uur na het verzamelen.
   OPMERKING: Sluit monsters met hemolyse of stolling uit van de analyse.

6. Enzym-gekoppelde immunosorbent-assay (ELISA)

OPMERKING: IL-6, IL-17, IL-1β en TNF-α zijn belangrijke pro-inflammatoire cytokines, terwijl IL-10 een belangrijke ontstekingsremmende cytokine is. Deze cytokines weerspiegelen de aanwezigheid en ernst van ontstekingsreacties³⁴.
Het meten van deze cytokines is cruciaal om ontstekingsprocessen te begrijpen en de effectiviteit van ontstekingsremmende behandelingen te evalueren.

1. Verzamel bloedmonsters van de retro-orbitale veneuze plexus.
2. Laat monsters 1 uur bij kamertemperatuur stollen.
3. Centrifugemonsters op 1.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om serum te verkrijgen.
4. Meet de serumniveaus van IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α en IL-10 met commerciële ELISA-kits.
5. Meet de absorptie met een microplaatlezer uitgerust met standaard data-acquisitiesoftware.
6. Bereken cytokinenconcentraties op basis van standaardcurves.
   OPMERKING: Test alle monsters en standaarden dubbel om technische variabiliteit te verminderen.

7. LC–MS-analyse van Liangxue Dihuang-aftrek

1. Monstervoorbereiding
   1. Nauwkeurig 10 g van het LXDHD gemengde rauwe kruidenpoeder wegen.
   2. Los het poeder op in 30 ml heet water.
   3. Voer 30 minuten ultrasone extractie uit.
   4. Meng 100 μL van het extract met 400 μL methanol.
   5. Vortex voor 10 minuten.
   6. Centrifugeer op 14.000 × g gedurende 10 minuten.
   7. Verzamel het supernatant als testoplossing.
2. LC–MS-voorwaarden
   1. Voer chromatografische scheiding uit met behulp van een LC-systeem gekoppeld aan een Q-massaspectrometer.
   2. Gebruik een C18-kolom (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   3. Stel de mobiele fase als volgt in: oplosmiddel A, 0,1% mierenzuur in water; oplosmiddel B, methanol.
   4. Stel de debiet in op 0,30 mL/min.
   5. Stel de kolomtemperatuur in op 35 °C.
   6. Stel het injectievolume in op 5 μL.
   7. Pas het volgende gradiënt-elutieprogramma toe:
      0–2 min, 5% B;
      2–15 min, 5–95% B;
      15–18 min, 95% B;
      18–18,1 min, 95–5% B;
      18,1–22 min, 5% B.
   8. Stel massaspectrometrieparameters als volgt in: gasstroomsnelheid van de mantel, 35 arb; hulpgasdebiet, 10 arb; spuitspanning, 3,5 kV (positief) en 2,8 kV (negatief); capillaire temperatuur, 320 °C; Temperatuur aux-gasverwarming, 350 °C.
   9. Verkrijg MS-gegevens in zowel positieve als negatieve ionenmodus met een volledig MS-scanbereik van m/z 100–1500 (resolutie: 70.000).
   10. Voer data-afhankelijke MS2 (dd-MS2) scans uit met een resolutie van 17.500.
   11. Verwerk ruwe data en identificeer verbindingen met behulp van de mzCloud-database.

8. Serumanalyse van ongerichte metabolomics

1. Serummonstervoorbereiding en kwaliteitscontrole (QC)
   1. Ontdooi serummonsters op ijs.
   2. Breng 50 μL serum over in een 1,5 mL centrifugebuis.
   3. Voeg 200 μL koude methanol/acetonitril toe (1:1, v/v).
   4. Vortex 1 minuut om eiwitten te laten neerslaan.
   5. Broed 15 minuten op ijs.
   6. Centrifugeer op 14.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
   7. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis.
   8. Droog het extract met een vacuümconcentrator.
   9. Reconstrueren in 100 μL acetonitril/water (1:1, v/v).
   10. Vortex grondig.
   11. Centrifugeer opnieuw op 14.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
   12. Verzamel het supernatant voor LC-MS-analyse.
   13. Bereid kwaliteitscontrolemonsters voor door 10 μL aliquot uit elk monster te combineren.
   14. Injecteer één kwaliteitscontrolemonster per 8–10 experimentele monsters om de stabiliteit en herhaalbaarheid van het instrument te monitoren.
2. LC-MS acquisitie-instellingen
   1. Voer chromatografische scheiding uit met het LC-systeem met een C18-kolom (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   2. Stel de kolomtemperatuur in op 35 °C.
   3. Stel de debiet in op 0,30 mL/min.
   4. Stel het injectievolume in op 2 μL (positieve modus) of 5 μL (negatieve modus).
   5. Gebruik oplosmiddel A (0,1% mierenzuur in water) en oplosmiddel B (acetonitril met 0,1% mierenzuur).
   6. Pas een lineair gradiënt-eluatieprogramma toe.
   7. Bedien de massaspectrometer in positieve en negatieve HESI-modi.
   8. Stel het massa-scanbereik in op m/z 100–1500.
   9. Stel de spuitspanning in op 3,5 kV (positief) en 2,8 kV (negatief).
   10. Stel de capillaire temperatuur in op 320 °C.
3. Dataverwerking en differentiële metabolietidentificatie
   1. Importeer ruwe LC-MS-gegevens (.raw bestanden) in de software.
   2. Voer piekuitlijning, piekpicking en baselinecorrectie uit.
   3. Normaliseer geëxtraheerde piekoppervlaktekenmerken tot totale ionintensiteit.
   4. Identificeer metabolieten door nauwkeurige massa (massatolerantie < 5 ppm) en MS/MS-fragmentatiepatronen te vergelijken met mzCloud- en ChemSpider-databases.
   5. Voer multivariate statistische analyses uit (PCA en OPLS-DA/PLS-DA).
   6. Definieer differentiële metabolieten op basis van de volgende drempels: VIP > 1,0 en p < 0,05 (Student's t-test).

9. Netwerkfarmacologieanalyse

OPMERKING: Netwerkfarmacologie werd gebruikt om actieve componenten en belangrijke doelwitten van LXDHD te voorspellen in UC^35,36. De methodologie omvat databasemining, verwerking van chemische informatie, bioactiviteitsgegevens, het ophalen van eiwitdoelen, genexpressieprofilering, interactienetwerkconstructie en pathway-enrichment analysis^37,38.

1. Actieve verbinding-screening
   1. Haal actieve verbindingen op uit de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis (TCMSP) database (geraadpleegd op 10 december 2025) met OB ≥ 30% en DL ≥ 0,18.
   2. Supplement verbindingen via literatuurzoekopdrachten in PubMed en Web of Science (10–15 december 2025).
   3. Standaardiseer doelen met behulp van de UniProt-database (geraadpleegd op 15 december 2025).
2. Identificatie van ziektedoelen
   1. Verzamel UC-gerelateerde doelen uit GeneCards, OMIM, TTD en DrugBank databases (geraadpleegd op 15 december 2025).
3. Netwerkconstructie en -analyse
   1. Identificeer kruisende doelen met het VennDiagram-pakket in R-software.
   2. Bouw het netwerk op met Cytoscape-software.
   3. Analyseer topologie met behulp van de NetworkAnalyzer-plugin en de CytoNCA-plugin.
4. PPI-netwerk en kerndoelidentificatie
   1. Importeer kruisende doelen in de STRING-database.
   2. Beperk soorten tot Homo sapiens.
   3. Verwijder geïsoleerde knooppunten.
   4. Pas een PPI-score toe > 0,9.
   5. Exporteer data en analyseer in de software.
   6. Bereken DC, BC, EC, CC, NC en LAC.
   7. Voer medianen-gebaseerde filtering uit om subnetwerken te genereren en kerndoelen te identificeren³⁹.
5. GO- en KEGG-verrijkingsanalyse
   1. Voer GO- en KEGG-verrijking uit met R- en Bioconductor-pakketten.
   2. Gebruik R-pakketten inclusief org. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi en ggplot2.
   3. Stel significantiedrempels in op p = 0,05 en q = 0,05.
   4. Voer GO-analyses uit voor MF-, BP- en CC-categorieën.
   5. Voer KEGG-routeverrijking en classificatie⁴⁰ uit.
6. Moleculaire koppeling
   1. Download samengestelde structuren van TCMSP in SDF-formaat.
   2. Download eiwitstructuren van AlphaFold in PDB-formaat.
   3. Voer docking uit via de CB-DOCK2 webserver (CADD Lab, Sichuan University, Chengdu, China).
   4. Definieer receptor- en ligandbestanden dienovereenkomstig.
   5. Registreer de optimale bindingshouding en bindingsenergie.
      OPMERKING: Docking werd uitgevoerd met behulp van een genetisch algoritme⁴¹. De resultaten werden gerangschikt op bindingsenergie.

10. Statistische analyse

1. Voer statistische analyses uit met GraphPad Prism-software.
2. Druk kwantitatieve gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).
3. Test op normaliteit met behulp van de Shapiro–Wilk-test.
4. Test op homogeniteit van variantie met behulp van de Brown–Forsythe-test.
5. Voer eenrichtings-ANOVA uit met Tukey's post hoc-test voor normaal verdeelde data.
6. Voer de Kruskal–Wallis-test uit met de Dunn-test voor niet-parametrische data.
7. Beschouw p < 0,05 als statistisch significant.
   OPMERKING: Een kleinere p-waarde duidt op een groter statistisch verschil tussen groepen.

Resultaten

Netwerkfarmacologische analyse van LXDHD in UC

Netwerkfarmacologie werd toegepast om de potentiële therapeutische doelwitten en moleculaire mechanismen van LXDHD bij UC te voorspellen. In totaal werden 211 verbindingen met gunstige farmacokinetische eigenschappen gescreend uit de TCMSP-database, waaronder 36 van Scutellaria baicalensis, 37 van Phellodendron chinense, 10 van Rehmannia glutinosa, 11 van Paeonia suf...

Discussie

Deze methode presenteert een gevisualiseerde, reproduceerbare experimentele workflow die netwerkfarmacologie, niet-gerichte metabolomics en in vivo validatie integreert om de ontstekingsremmende effecten van TCM-formules in een door DSS geïnduceerd muismodel van UC te onderzoeken. In tegenstelling tot conventionele farmacologische studies die zich voornamelijk richten op geïsoleerde mechanistische conclusies, benadrukt dit protocol de robuustheid van het methodologische kader ze...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5-Aminosalicylic Acid (5-ASA)	Sigma-Aldrich	A3537	Positieve controledrog voor colitis ulcerosa; toegediend op 100 mg/kg door orale sonde.
Acetonitril (LC-MS-kwaliteit)	Merck	100030	Wordt gebruikt voor de voorbereiding van metabolomics-monsters en LC-MS mobiele fase.
AlphaFold-database voor eiwitstructuren	EMBL–Europees Instituut voor Bioinformatica	https://alphafold.ebi.ac.uk/	Database gebruikt om voorspellingen van driedimensionale structuren van doeleiwitten te verkrijgen.
Angelica sinensis (Dang Gui)	Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine	Batch: 2409001	Samenstellingskruiden van LXDHD (Dosis: 1,6 g).
CB-Dock2	CADD Lab	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	Webgebaseerde platform gebruikt voor moleculair docking en voorspelling van ligand–eiwitvaste modi.
Citrus aurantium (Zhi Ke)	Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine	Batch: 2409001	Samenstellingskruiden van LXDHD (Dosis: 0,5 g).
Compound Discoverer-software	Thermo Fisher Scientific	Versie 3.3	Wordt gebruikt voor LC–MS-gegevensverwerking en identiteitsbepaling van verbindingen.
CTAn-software	Bruker	Versie 1.17	Wordt gebruikt voor 3D-beeldreconstructie van Micro-CT en analyse van boterosie.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Versie 3.8.0	Software gebruikt voor netwerkconstructie en visualisatie.
Dextransulfaatnatrium (DSS)	MP Biomedicals	160110	Molecuulgewicht 36.000–50.000 Da; wordt gebruikt om colitis ulcerosa bij muizen te induceren.
EDTA-K2-anticoagulantiatubes	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Wordt gebruikt voor perifere bloedafname.
Eosine-kleuringsoplossing	Biosharp	N/A	Wordt gebruikt voor cytoplasmatische tegenkleuring bij H&E-kleuring.
Ethanol	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	64-17-5	Wordt gebruikt voor weefseldesiccatie.
Mierenzuur (LC-MS-kwaliteit)	Merck	5.33002	Wordt gebruikt voor de voorbereiding van LC-MS mobiele fase.
Glycyrrhiza uralensis (Gan Cao)	Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine	Batch: 2409001	Samenstellingskruiden van LXDHD (Dosis: 0,5 g).
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versie 9.0	Wordt gebruikt voor statistische analyse en grafische presentatie.
Hematologie-analysator	Mindray	BC-2600vet	Drie-delige veterinaire hematologie-analysator voor bloedroutine-analyse.
Hematoxyline-kleuringsoplossing	Biosharp	BL700B	Wordt gebruikt voor H&E-kleuring van colonweefselsecties.
Hogesnelheidscentrifuge	Hitachi	CT15E/CT15RE	Wordt gebruikt voor serum- en monstersvoorbereiding.
IL-10 ELISA-kit (muis)	MEIMIAN	MM-0176M2	Wordt gebruikt om serum IL-10-niveaus te beoordelen.
IL-17 ELISA-kit (muis)	Abclonal	RK00039	Wordt gebruikt om serum IL-17-niveaus te meten.
IL-1β ELISA-kit (muis)	Abclonal	RK00006	Wordt gebruikt voor detectie van serum IL-1β-niveaus.
IL-6 ELISA-kit (muis)	Abclonal	RK00008	Wordt gebruikt om serum IL-6-niveaus te kwantificeren.
ImageJ (Fiji)-software	National Institutes of Health (NIH)	Versie 1.53c	Open-source software gebruikt voor beeldverwerking en kwantificering.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	Versie 3.7	Beeldsoftware gebruikt voor het vastleggen van histopathologische dia's.
Methanol (LC-MS-kwaliteit)	Merck	106035	Wordt gebruikt voor de voorbereiding van metabolomics-monsters en LC-MS mobiele fase.
Muizen (mannelijke C57BL/6)	Anokang Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Experimentele dieren (leeftijd 6–8 weken, 20–25 g) gebruikt voor DSS-geïnduceerde UC-model.
mzCloud-database	Thermo Fisher Scientific	https://www.mzcloud.org/	Database gebruikt voor MS/MS spectraal matching.
Optische microscoop	Leica	DM500	Wordt gebruikt voor histopathologische observatie.
Paeonia lactiflora (Chi Shao)	Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine	Batch: 2409001	Samenstellingskruiden van LXDHD (Dosis: 0,6 g).
Paeonia suffruticosa cortex (Mu Dan Pi)	Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine	Batch: 2409001	Samenstellingskruiden van LXDHD (Dosis: 0,5 g).
Paraformaldehyde (4%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Wordt gebruikt voor fixatie van colonweefsels.
Pathologische microtoom	Leica	RM2016	Wordt gebruikt voor de voorbereiding van paraffineweefselsecties.
Phellodendron chinense (Huang Bo)	Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine	Batch: 2409001	Samenstellingskruiden van LXDHD (Dosis: 0,5 g).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine	Batch: 2409001	Samenstellingskruiden van LXDHD (Dosis: 0,7 g).
Q Exactive High-Resolution Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific	Q Exactive	Orbitrap-gebaseerde massaspectrometer voor LC–MS-analyse.
R-software	R Foundation for Statistical Computing	Versie 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	Software gebruikt voor GO en KEGG-verrijkingsanalyses.
Rehmannia glutinosa (Sheng Di Huang)	Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine	Batch: 2409001	Samenstellingskruiden van LXDHD (Dosis: 2,1 g).
Sanguisorba officinalis (Di Yu Tan)	Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine	Batch: 24090