Methodenartikel

Meting van de translationele dynamiek van mRNA in levende cellen met split luminescente tagging in HEK293-cellen

DOI:

10.3791/70840

⸱

14 augustus 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren wij een flexibele, high-throughput-compatibele methode voor het meten van live mRNA-translatiedynamiek in cellulo in HEK293-cellen, met gebruik van split luminescent tagging. Deze veelzijdige assay maakt onderscheid tussen structurele effecten, ondersteunt de optimalisatie van in vitro transcriptie en stroomlijnt de ontwikkeling van mRNA-therapeutica.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De snelle ontwikkeling van vaccins om COVID-19 te bestrijden illustreerde het potentieel van therapeutica op basis van messenger RNA (mRNA) om de geneesmiddelenontwikkeling te transformeren. Net als matuur mRNA bezit in vitro getranscribeerd mRNA dezelfde elementen, waaronder een 5’-cap, niet-vertaalde regio's (UTRs), een coderende sequentie en een poly(A)-staart. Eerder werk waarin de effecten van deze componenten op de mRNA-translatie werd bestudeerd, maakte voornamelijk gebruik van sterk gemanipuleerde reportereiwitten die een efficiënte translatie en eiwitstabiliteit vertonen. Omdat de structurele elementen van elk mRNA hun translatie verschillend beïnvloeden, is het essentieel om het optimale ontwerp te identificeren dat relevant is voor het therapeutische eiwit van belang (POI). Om de translatie van het POI te kunnen karakteriseren, werd een split-luciferase-complementatiesysteem gebruikt. Een kort peptide-label (HiBiT), dat aan beide uiteinden van het POI gefuseerd kan worden, associeert met zijn complementaire heterodimeer (LgBiT) om de enzymatische activiteit te herstellen in de aanwezigheid van een cel-permeabel substraat. Tot nu toe is split-luminescente labeling voornamelijk gebruikt voor high-throughput studies naar eiwitomzetting. We hebben eerder aangetoond hoe split-luminescente labeling kan worden ingezet om high-throughput kwantificering van mRNA-translatie temporeel in cellulo mogelijk te maken in HEK293-cellen die het complementaire heterodimeer constitutief tot expressie brengen. Hier demonstreren we verder de veelzijdigheid van de assay en beschrijven we hoe deze assay kan worden gebruikt voor het optimaliseren van in vitro transcriptie om kosten te reduceren. Het assaysysteem kan uniek onderscheid maken tussen wijzigingen in structurele componenten, terwijl de effecten van optimalisatie van de coderende sequentie met niet-gemanipuleerde genen worden benadrukt. Daarnaast tonen we aan dat een 4-voudige reductie in de 5’-cap-concentratie voor in vitro transcriptie resulteert in een equivalente translatie in cellulo. Deze bevindingen illustreren hoe split-luminescente labeling gemakkelijk kan worden geïntegreerd in de workflow voor mRNA-therapeutica, waardoor monitoring van real-time mRNA-gestuurde eiwitexpressiedynamiek in cellulo mogelijk wordt, wat een veelzijdige methode biedt voor de vooruitgang van mRNA-gebaseerde therapeutica.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Therapeutica op basis van messenger-RNA (mRNA) en onderzoekstoepassingen zijn de afgelopen jaren snel uitgebreid, gestuwd door het succes van mRNA-vaccins1,2 en de groeiende erkenning van de veelzijdigheid van RNA als een programmeerbaar biomolecuul. Een centrale uitdaging in dit veld is het vermogen om de translatie-efficiëntie van mRNA kwantitatief en dynamisch te beoordelen in diverse contexten. De hier beschreven methode – waarbij gebruik wordt gemaakt van een split luminescent tagging-systeem – biedt een flexibel en schaalbaar platform voor het bestuderen van live mRNA-translatie in cellulo3. Het overkoepelende doel van deze methode is om onderzoekers in staat te stellen te meten hoe sequentiekenmerken, chemische modificaties en structurele elementen de translatiekinetiek en de daaropvolgende eiwitomzet beïnvloeden, waardoor een krachtig instrument ontstaat voor het optimaliseren van mRNA-constructen voor therapeutische toepassingen en fundamenteel wetenschappelijk onderzoek.

In vitro getranscribeerd mRNA weerspiegelt de essentiële architectuur van rijpe transcripten, met een 5′-cap, niet-vertaalde regio's (UTR's), een coderende sequentie en een poly(A)-staart, waarbij vaak gemodificeerde nucleotiden worden opgenomen om de immunogeniciteit te verminderen4,5. Uit uitgebreid onderzoek is gebleken dat elk van deze elementen – afzonderlijk en in combinatie – zodanig kunnen worden ontworpen dat ze de vertaalefficiëntie en de eiwitopbrengst sterk beïnvloeden6,7. Toch vertrouwden de meeste eerdere studies op sterk geoptimaliseerde reportereiwitten zoals Green Fluorescent Protein (GFP)7, NanoLuc8 of het SARS-CoV-2 spike-eiwit8,9, die zijn ontworpen om met een hoge efficiëntie te vertalen en zeer stabiele eiwitten te produceren, en daarom niet de uitdagingen weerspiegelen die in therapeutische contexten voorkomen. Omdat therapeutische mRNA's diverse eiwitten van belang (POI's) coderen, die elk onderhevig zijn aan unieke structurele beperkingen en celtype-specifieke regulatie, zijn de ontwerpprincipes die de vertaling voor het ene construct maximaliseren mogelijk niet generaliseerbaar naar een ander, zoals eerder is gerapporteerd3. Het identificeren van de optimale configuratie voor een specifieke therapeutische POI is daarom essentieel en vereist methoden die gevoelig en systematisch kunnen evalueren hoe individuele kenmerken van het transcript bijdragen aan de eiwitopbrengst.

Ribosoomgerichte methoden, zoals polysoomprofilering, maken onderscheid tussen translatiefracties via gradiëntcentrifugatie10, terwijl ribosoomprofilering (Ribo-seq) resolutie op nucleotide-niveau biedt van ribosoombezetting, initiatieplaatsen en pauzes11. Net als Ribo-seq karakteriseren andere sequencing-gebaseerde benaderingen, zoals High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Crosslinking Immunoprecipitation (HITS-CLIP) en Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP), verder de translatie van RNA's geassocieerd met RNA-bindende eiwitten of ribosomen12. Hoewel krachtig, vereisen deze technieken complexe preparatie, gespecialiseerde apparatuur en computationele expertise, waardoor ze ongeschikt zijn voor high-throughput therapeutische mRNA-ontwikkeling. Nascent chain immunoprecipitatie13 meet de translatie-efficiëntie met behulp van FLAG-getagde eiwitten die via immunoprecipitatie van ribosomen worden geïsoleerd en gekwantificeerd via Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Hoewel aanpasbaar voor therapeutische mRNA's, is deze assay arbeidsintensief, ontbreekt het aan temporele resolutie en is deze ongeschikt voor high-throughput toepassingen. Het SunTag-systeem14 maakt live-cell metingen mogelijk van de eiwitsynthese-output en translationele regulatie van individuele mRNA-moleculen en werkt via de interactie van een single-chain variable fragment (scFv) gefuseerd aan GFP met tandemherhalingen van het peptide-epitoop. Dit systeem maakt dynamische metingen van translatie en lokalisatie mogelijk met resolutie op single-mRNA-niveau, en is daarom ingezet voor de ontwikkeling van talrijke systemen voor het volgen van nascent chains15,16. Deze benadering heeft echter een lage doorvoersnelheid en vereist het gebruik van krachtige microscopen.

Hoewel het labelen van het nascente eiwit onvermijdelijk is, werd het potentiële gebruik van een kleine peptide-tag geïdentificeerd, afgeleid van NanoLuc-luciferase, om de mRNA-translatie in levende cellen te rapporteren. Het NanoLuciferase werd zodanig ontwikkeld dat het kan worden opgesplitst in een kleine subunit van 11 aminozuren (HiBiT) en een grotere subunit van 158 aminozuren (LgBiT), die snel kunnen dimeriseren en, in de aanwezigheid van een substraat, een functioneel luciferase kunnen reconstitueren17,18. Er zijn verschillende belangrijke voordelen van het gesplitste luminescente tagging-systeem voor studies naar mRNA-dynamiek. Ten eerste zorgt de minimale grootte van de kleine subunit die gefuseerd is aan het POI ervoor dat het gecodeerde construct zo dicht mogelijk bij het natuurlijke eiwit van belang blijft. Aangezien de lengte van de coderende sequentie direct invloed kan hebben op de translatieratio's19, verbetert het minimaliseren van de tag-lengte onze voorspelling van de translatiedynamiek van synthetische mRNA's. Cruciaal is dat deze minimale tagging-strategie het mogelijk maakt om verschillen in translatie te detecteren die worden veroorzaakt door synonieme variaties in de coderende sequentie, waardoor de translationele efficiëntie onafhankelijk van de eiwitsequentie of -stabiliteit kan worden onderzocht3. Om deze reden is het gebruik van grotere tags, zoals fluorescerende eiwitten of volledige luciferases, suboptimaal. Ten tweede maakt het hier gebruikte gesplitste luminescente tagging-systeem onmiddellijke signaalgeneratie mogelijk. De snelle en efficiënte in cellulo complementatiereactie heeft een gerapporteerde hoge affiniteit (KD = 700 pM) en is gebruikt om de modulatie van eiwitomzet te meten met metingen met intervallen van slechts 30 s18. Hoewel het oorspronkelijke gesplitste luminescente tagging-systeem primair werd gebenchmarkt tegen andere gesplitste luciferase-systemen17,18, is het belangrijkste voordeel in deze context dat de signaalgeneratie niet wordt beperkt door eiwitmaturatie. In tegenstelling hiermee vereisen fluorescerende eiwitten chromofoormaturatie, die minuten tot uren kan duren20, waardoor de temporele resolutie wordt beperkt. Ten slotte overwint het hier gebruikte gevestigde gesplitste luminescente tagging-systeem de beperkingen van gesplitste fluorescerende eiwitsystemen, die doorgaans chromofoorvorming na complementatie vereisen21, wat een extra vertraging introduceert en hun geschiktheid voor het vastleggen van snelle, dynamische processen beperkt. Eerdere studies hebben het nut van gesplitste luminescente tagging aangetoond in assays voor eiwitomzet en degradatiestudies22,23,24. De uitbreiding van deze gevestigde technologie naar translatiekinetiek vertegenwoordigt een aanzienlijke methodologische vooruitgang. Zo kan ribosome profiling bijvoorbeeld de ribosoomdichtheid langs transcripten onthullen, maar kan het dynamische veranderingen in translatie-initiatie- of elongatiesnelheden onder verschillende omstandigheden niet eenvoudig vastleggen. Zoals eerder geïllustreerd3, kan dit gesplitste luminescente tagging-systeem verschillen detecteren bij het wijzigen van de cap-structuur, de samenstelling van de 5′ onvertaalde regio (UTR), codon-optimalisatie, nucleotide-modificaties en de lengte van de poly(A)-staart, die allemaal kritieke determinanten van de translationele efficiëntie zijn. Deze breedte van toepasbaarheid maakt de methode uniek krachtig voor het ontleden van de bijdragen van individuele mRNA-kenmerken aan de totale eiwitopbrengst. Het is vermeldenswaardig dat, afhankelijk van het gebruikte instrument, zowel single-cell- als whole-well-data met deze technologie kunnen worden vastgelegd. Imaging-platforms die in staat zijn om luminescentie-gebaseerde beelden te verwerven, kunnen deze technologie in staat stellen om single-cell translatiedynamiek te bestuderen. Hier richten we ons op een plate-reader, well-gebaseerde applicatie vanwege het medium-tot-high-throughput karakter en de minimale vereisten voor data-analyse.

Onderzoekers die deze methode overwegen, dienen de geschiktheid ervan te evalueren in het licht van hun specifieke experimentele doelstellingen. De assay is bijzonder waardevol in contexten waar high-throughput screening van synthetische mRNA-constructen vereist is, zoals in pipelines voor het ontwerp van mRNA-gebaseerde therapeutica. Het is uitermate geschikt voor vergelijkende analyses van kenmerken van synthetische mRNA-sequenties – waaronder niet-vertaalde regio's, codongebruik of nucleotide-modificaties – waarbij subtiele verschillen in translationele efficiëntie kunnen worden gedetecteerd3. Omdat het systeem compatibel is met celvrije translatieplatforms, live-cell assays en een tijdstipspecifieke lytische assay, biedt het flexibiliteit voor onderzoekers die hun experimentele ontwerp willen afstemmen op ofwel mechanistische studies ofwel toegepast onderzoek. Tegelijkertijd is het belangrijk de beperkingen van de techniek te erkennen. Cruciaal is dat de split luminescent tagging assay geen resolutie biedt van de ribosoombezetting, een capaciteit die uniek blijft voor ribosome footprinting-benaderingen, noch meet het direct de RNA-stabiliteit of degradatie, wat mogelijk met aanvullende methoden moet worden beoordeeld. Vanwege de beperkingen van bestaande ribo-centrische technieken zijn onderzoekers echter aangewezen op tag-gebaseerde assays zoals het split luminescentiesysteem om tijdopgeloste, door mRNA aangestuurde eiwitexpressie te onderzoeken als proxy voor translationele dynamiek. Hoewel dit systeem dus een krachtig instrument is voor het monitoren van door synthetisch mRNA aangestuurde eiwitexpressie, hangt de geschiktheid ervan af van de vraag of de onderzoeksvraag zich richt op de dynamische eiwitoutput in plaats van op fijnmazige ribosoompositionering of RNA-afbraak.

Samenvattend vormt het split-luminescent tagging-systeem een krachtige en veelzijdige methode voor het bestuderen van mRNA-translatie. Het algemene doel is om onderzoekers een flexibel, systeem-schaalbaar en high-throughput instrument te bieden dat in staat is om verschillen in eiwitoutput te detecteren die voortvloeien uit synthetisch mRNA met variërende structurele en sequentie-elementen3. De rationale voor de ontwikkeling ligt in het overwinnen van de beperkingen van bestaande technieken, waarbij voordelen worden geboden op het gebied van gevoeligheid, schaalbaarheid en temporele resolutie. Binnen de bredere literatuur over RNA-biologie en therapeutica vormt deze methode een waardevolle toevoeging aan het experimentele repertoire, wat zowel fundamentele inzichten als translationele vooruitgang mogelijk maakt. Door zorgvuldig de sterke punten en beperkingen van de assay af te wegen, kunnen onderzoekers bepalen of deze geschikt is voor hun specifieke toepassingen, om zo de impact in het snel evoluerende veld van de RNA-wetenschap te maximaliseren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een grafische weergave van het volledige protocol wordt getoond in Figuur 1.

1. Templatepreparatie voor in vitro transcriptie (IVT)

OPMERKING: Zorg er bij het voorbereiden van het DNA-template voor IVT voor dat het plasmide-DNA een RNA-polymerase-promotor bevat (over het algemeen T7 of SP6), 5’- en 3’-UTR's, en het open leesraam van het POI (Figuur 1).

  1. Lineariseer het plasmide-DNA met een restrictie-enzym met één enkele knipplaats na de 3’ UTR en stel de reactie samen volgens de instructies van de fabrikant. Reinig na incubatie de restrictie-digestreactie met een DNA-zuiveringskit op basis van spin-kolommen. Kwantificeer het DNA met een spectrofotometer.
  2. Bereid ter bevestiging van de linearisatie een 1% agarose TAE-gel voor met de DNA-kleurstof Ethidiumbromide in een concentratie van 0,1 µg/mL. Meng 150 ng van het gedigesteerde DNA met water en ladingskleurstof. Laad de agarosegel met het monster, niet-geknipt plasmide en een DNA-ladder, en laat de agarosegel 40 min lopen bij 100 V in een 1× Tris-azijnzuur-EDTA (TAE) buffer. Visualiseer dit met een gel-imager.
    WAARSCHUWING: Ethidiumbromide-oplossing is een krachtig mutagen en vereist zorgvuldige hantering met gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
  3. Indien het plasmide-DNA geen poly(A)-staart direct na de 3’ UTR heeft, introduceer deze dan via een PCR. Voer de PCR uit volgens de instructies van de fabrikant met een high-fidelity polymerase en passend ontworpen primers. Zorg ervoor dat het amplicon de T7-promotor, het open leesraam en een poly(A)-staart bevat.
    OPMERKING: Capping-technologieën kunnen specifieke sequentie-eisen hebben bij de T7-promotor; deze eisen kunnen worden vervuld door een passend ontwerp van de forward-primer. De reverse-primer bindt aan het einde van de 3’ UTR en introduceert een poly(A)-staart (aanbevolen lengte van minimaal 80 T). Voor constructen met een hoog GC-gehalte worden step-up PCR en/of 3% DMSO aanbevolen.
  4. Bereid ter bevestiging van een succesvolle PCR een agarose TAE-gel voor met Ethidiumbromide (zie stap 1.2). Als de lengte van het construct ≥1 kb of <1 kb is, bereid dan respectievelijk een 1% of 2% gel. Meng 5 µL van de PCR-reactie met water en ladingskleurstof. Laad de agarosegel met zowel het monster als een DNA-ladder en laat deze 40 min lopen bij 100 V in TAE-buffer. Visualiseer dit met een gel-imager.
  5. Reinig na bevestiging van de PCR-grootte de PCR-reactie met een DNA-zuiveringskit op basis van spin-kolommen. Elueer in 15–20 µL elutiebuffer (vaak meegeleverd bij de DNA-zuiveringskit) of nucleasevrij water om de DNA-template te concentreren voor gebruik in IVT. Kwantificeer het DNA met een spectrofotometer.

2. In vitro transcriptie

  1. Bespuit en veeg vóór aanvang de werkbank, handschoenen en pipetten af met een RNase-decontaminatieloosing. Voer deze procedure uit in een steriele zuurkast om de opbrengst en kwaliteit te verbeteren.
  2. Ontdooi en stel de componenten van een T7-gebaseerde in vitro transcriptie (IVT) kit samen volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Sommige fabrikanten raden het gebruik van dithiothreitol (DTT, 0.1 M) aan om oxidatie van de reactie te beperken en de efficiëntie te verbeteren. Deze stap wordt aanbevolen indien compatibel met de kit. Vervang bij gebruik van gemodificeerde dNTP's het overeenkomstige ongemodificeerde nucleotide door dezelfde hoeveelheid gemodificeerd nucleotide. Evalueer de opbrengst van een halve reactie, aangezien er geen substantiële verbetering in opbrengst werd waargenomen bij een volledige reactie. Bij de synthese van meer dan één mRNA wordt aanbevolen om een mastermix te maken om pipetteerfouten en variabiliteit te verminderen.
  3. Pipetteer en meng grondig en kort, en incubeer vervolgens gedurende 5 h bij 37 °C met een verwarmde dop om condensatie te voorkomen. Verleng de incubatie indien nodig tot overnacht, aangezien dit een minimaal effect heeft op de opbrengst of integriteit van het mRNA.
  4. Voeg 1 µL DNase I toe en pipetteer grondig. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
  5. Zuivering van in vitro getranscribeerd (IVT) RNA
    1. Zuiver de IVT-reactie met een kolomgebaseerde RNA Cleanup kit volgens de instructies van de fabrikant (verschillende kits kunnen leiden tot verschillende herstelpercentages en variërende bindingscapaciteiten hebben). Voeg voor elutie 60 µL nucleasevrij water toe en incubeer 5 min bij kamertemperatuur vóór het centrifugeren.
    2. Gebruik alternatief lithiumchloride-precipitatie als een goedkopere en flexibelere methode.
      1. Voeg een gelijk volume 7,5 M lithiumchloride toe aan de reactie, meng en incubeer overnacht bij -20 °C.
      2. Centrifugeer 20 min bij 18.300 × g bij 4 °C en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant zonder het RNA-pellet te verstoren.
      3. Was met 950 µL 70% ethanol en centrifugeer 5 min bij 18.300 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant, laat het pellet ongeveer 5 min drogen bij kamertemperatuur en resuspendeer in nucleasevrij water (60 µL is standaard; verminder het volume afhankelijk van de grootte van het pellet om de concentratie te verhogen).
        WAARSCHUWING: Lithiumchloride kan huid- of oogirritatie veroorzaken als er geen geschikte PBM worden gebruikt. Draag handschoenen en oogbescherming bijv hantering. Bovendien is ethanol een zeer brandbare vloeistof en kan het oogirritatie veroorzaken. Houd weg van open vuur en draag geschikte PBM, inclusief oogbescherming.
  6. Kwantificeer het mRNA met een spectrofotometer. Zorg dat de A260/A280-ratio voor mRNA ~2,0 is en bevestig dat de A260/A230-ratio tussen 1,8 en 2,2 ligt.
  7. Om een succesvolle IVT te bevestigen, bereid een 1% agarose TAE (niet-denaturerende) gel voor die Ethidiumbromide bevat. Meng 500 ng mRNA met water en laadkleurstof, en volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding van de RNA-ladder en de denatureerinstructies. Laad de agarosegel en laat deze 40 min lopen bij 80 V in TAE-buffer. Visualiseer met een gel-imaging systeem.
  8. Voor verdere bevestiging van de correcte mRNA-grootte kunnen de monsters op een Bioanalyser worden geanalyseerd.
  9. Om vries-dooi cycli te vermijden, wordt het mRNA verdeeld in aliquots van het volume dat vereist is voor het experiment. Gebruik bijvoorbeeld 1,2 pmol mRNA per well in een 96-well plaat. Verdeel daarom het juiste volume voor 1,2 pmol × n replicaten in aliquots en bewaar deze vervolgens bij -80 °C.

3. Reverse transfectie van HEK293

OPMERKING: Voor temporele metingen is een cellijn vereist die constitutief het complementaire luciferase-fragment tot expressie brengt. Dit kan worden bereikt door een stabiele cellijn te creëren via transfectie van een plasmide dat het vereiste luciferase-fragment tot expressie brengt, gevolgd door clonale selectie. Dit stelt de gebruiker in staat om temporeel opgeloste mRNA-translationele dynamiek te meten in elke gewenste cellulaire achtergrond. Alternatief kunnen cellijnen die het vereiste luciferase-fragment tot expressie brengen worden aangeschaft. Deze experimenten werden uitgevoerd met HEK293-cellen die constitutief de complementaire heterodimeer tot expressie brengen.

  1. Ontdooi vóór aanvang het mRNA op ijs om degradatie te voorkomen.
  2. Bereid de transfectiecomplexen voor. Voor een 96-wells plaat is 1,2 pmol mRNA per well vereist. Bij uitvoering in dubbele bepalingen dient er voldoende te worden gemaakt voor 2,5 dubbele bepalingen om pipetteerfouten op te vangen. Combineer daarom 3 pmol mRNA met Opti-MEM Reduced Serum Medium tot een eindvolume van 50 µL (20 µL/well).
  3. Voeg 0,5 µL kationisch lipide-gebaseerd transfectiereagens toe (0,2 µL/well), meng door herhaaldelijk te pipetteren en incubeer bij kamertemperatuur. Meng na een incubatie van 5 min opnieuw door herhaaldelijk te pipetteren en voeg vervolgens 20 µL per well toe aan een witte 96-wells microplaat met vlakke bodem. Het wordt aanbevolen om de transfectiewells in het midden van de plaat te plaatsen en de randwells vrij te laten.
  4. Bereid HEK293-cellen voor door het medium te verwijderen en te wassen met 2 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2+ en Mg2+. Verwijder het wasmiddel en voeg 500 µL Trypsine-EDTA toe, en incubeer vervolgens 3 min bij 37 °C.
  5. Vul tijdens de celdissociatie de randwells van de 96-wells plaat met PBS om verdamping van het medium tijdens de celkweek te verminderen. Indien alle wells nodig zijn, kan de plaat tussen de wells worden gevuld met PBS.
  6. Voeg 4,5 mL Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 1× L-glutamine en 10% foetaal runderserum (FBS), toe om de cellen te verzamelen. Bepaal het celgetal met een hemocytometer of een automatische celsteller.
  7. Breng de benodigde hoeveelheid cellen over (genoeg voor 1 x 105 cellen per well) plus 3 extra wells (voor pipetteerfouten) naar een schone buis en centrifugeer 2 min bij 500 × g.
  8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in het benodigde volume Leibovitz L-15 medium (fenolvrij), aangevuld met 10% FBS en Endurazine Live Cell Substrate (1:200), om een eindconcentratie van 1 × 106 cellen/mL te waarborgen. Meng met een serologische pipet om een grondige menging van Endurazine te garanderen. Pipetteer 100 µL (1 × 105 cellen) van de geresuspendeerde cellen per well.
    OPMERKING: Verhoog bij tijdreeksexperimenten die 72 u lopen het volume naar 200 µL om verdamping te voorkomen.
  9. Plaats de cellen direct na transfectie in een plaatlezer (luminometer) ingesteld op 37 °C. Maak op regelmatige intervallen opnames met een integratietijd van 1 s. Vanwege de efficiënte complementatie van het systeem is het signaal binnen enkele minuten detecteerbaar. Om daarom een nauwkeurige nullijnmeting te verkrijgen, moet deze stap onverwijld worden uitgevoerd. Deze intervallen zijn afhankelijk van het experiment en het instrument; in deze experimenten bleek echter dat metingen elke 12 min voor tijdreeksexperimenten van 18 u, maar slechts elke 48 min voor experimenten van 72 u, optimaal waren. Voor de meting van luminescentie is geen filter vereist; een betere signaal-ruisverhouding werd waargenomen bij gebruik van een filter van 530–540 nm.
    OPMERKING: Een Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-signaal wordt gegenereerd vanuit split-luciferase-gelabeld eGFP, waardoor een filter van 530–540 nm zowel een luminescent als een fluorescent signaal vastlegt. Om detectie van BRET te voorkomen, dient een filter van 460–480 nm te worden gebruikt of alternatief een niet-fluorescerend eiwit zoals MYL3 als referentie.

4. Data-analyse

  1. Bereken de fold changes in relatieve luminescentie-eenheden (RLU's) door het signaal van elke conditie te normaliseren naar het eerste tijdstip (t0, genormaliseerd naar het gemiddelde van de technische replica's), aangezien het signaal aan het begin van de assay het achtergrondniveau vertegenwoordigt.
  2. Verminder de variabiliteit tussen biologische replica's door te normaliseren naar een controleconditie.
  3. Kies de statistische analyse voor de assay, óf een enkel tijdstip óf de oppervlakte onder de curve (AUC)—afhankelijk van de gestelde vraag.
    1. Gebruik voor een enkel tijdstip de tijdstippen waarop de piekexpressie optreedt (wat afhankelijk is van het POI) samen met het eindtijdstip. Zet de RLU die in stap 4.1 is berekend uit voor het specifieke tijdstip (bijv. 240 min) uit en analyseer deze met een geschikte statistische toets.
    2. Meet de dynamiek van eiwittranslatie en -afbraak door de AUC te berekenen voor een specifiek tijdsbestek (bijv. t0 tot 240 min) of voor de gehele duur van de assay (bijv. t0 tot het eindpunt). Normaliseer de AUC-waarde voor elke biologische replica naar het gemiddelde van het referentie-mRNA, waardoor een maat voor de fold change in AUC wordt verkregen die geanalyseerd kan worden met geschikte statistische toetsen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende manieren waarop de kosteneffectiviteit van dit protocol kan worden geoptimaliseerd. Zo werd de IVT-reactie geminiaturiseerd tot de helft van het door de fabrikant aanbevolen volume, waarbij werd vastgesteld dat de resulterende opbrengst voldeed aan de hoeveelheid die vereist is voor in cellulo experimenten. Er moet worden opgemerkt dat de sequentielengte en complexiteit de IVT-opbrengst beïnvloeden, waardoor een succesvolle optimalisatie van het protocol ten minste 50 µg mRNA per IVT-reactie moet opleveren. Net als IVT-reactiekits zijn ook capping-reagentia vaak zeer kostbaar. Aangezien er slechts één cap per mRNA-molecuul nodig is, hypothetiseren wij dat de IVT-reactie een overschot aan cap-moleculen bevat ten opzichte van het resulterende aantal mRNA-moleculen. Daarom werd onderzocht of het protocol verder geoptimaliseerd kon worden door de hoeveelheid capping-reagens die aan de IVT-reactie werd toegevoegd te titreren; de resultaten hiervan worden getoond in Figuur 2. 100% (10 mM cap eindconcentratie), 50%, 25% of 0% (niet-gecapped) van het capping-reagens werd toegevoegd aan 10 µL IVT-reacties en het resulterende eGFP-mRNA werd getransfecteerd in HEK293-cellen die constitutief de complementaire heterodimeer tot expressie brengen. Als normalisatiecontrole werd ook MYL3 (100% gecapped) getransfecteerd, aangezien dit endogene gen, dat codeert voor een in spieren verrijkt structureel eiwit, vergelijkbare translatiedynamiek vertoont als eGFP, maar met een signaal dat dichter bij dat van andere endogene genen ligt3. In overeenstemming met eerdere gegevens3 leidde niet-gecapped eGFP-mRNA tot een gebrek aan translatie, analoog aan de mock-controle (Figuur 2A). eGFP-mRNA gesynthetiseerd met 25% of 50% van het aanbevolen capping-reagens vertoonde vergelijkbare expressieniveaus als bij 100% (Figuur 2A), wat resulteerde in geen verschillen in de waarden van de oppervlakte onder de curve (AUC) over het tijdsverloop van 18 u (Figuur 2B). Deze resultaten geven aan dat, onder deze omstandigheden, het capping-reagens in overmaat aanwezig is en dat het verlagen van de concentratie de translationele output niet bemmert, wat consistent is met een voldoende inbouw van de cap. De bevindingen gepresenteerd in Figuur 2 zijn specifiek voor het gebruikte merk capping-reagens en moeten worden geoptimaliseerd voor andere reagentia.

Hoewel vooruitgangen in cap-technologie en de incorporatie van gemodificeerde nucleotiden de mRNA-expressie hebben verbeterd, heeft de ontwikkeling van mRNA-ontwerpalgoritmen de expressie verder verhoogd. Deze algoritmen richten zich op het optimaliseren van de mRNA-stabiliteit en het codongebruik door respectievelijk de minimale vrije energie (MFE) en de codon adaptability index (CAI) te verbeteren. Om het effect van optimalisatie op de mRNA-expressie te testen, werd LinearDesign9 gebruikt. Dit algoritme is afhankelijk van de invoer van een lambda-waarde, een schalingsparameter in optimalisatieformules die bepaalt hoe sterk een algoritme de voorkeur geeft aan MFE of CAI. Dezelfde optimalisatie-instellingen (d.w.z. dezelfde lambda-waarde) werden toegepast op vier transcriptiefactoren: HAND2, GATA4, MEF2C en TBX5. Figuur 3 onderzoekt de effecten van optimalisatie op de translatiesnelheden. Optimalisatie verbeterde de waarden voor zowel MFE als CAI voor alle transcriptiefactoren, waarbij MEF2C de grootste veranderingen in beide parameters vertoonde (Figuur 3A). Een split luminescent tag werd gefuseerd aan de C-terminus van elk construct, voorafgegaan door een GS-linker, en mRNA werd gesynthetiseerd voor alle vier de transcriptiefactoren voor zowel de niet-geoptimaliseerde als de geoptimaliseerde vormen. Om er zeker van te zijn dat elk mRNA vertaald kan worden en een eiwit van het verwachte molecuulgewicht produceert, werd het celvrije translatiesysteem met konijnenreticulocytenlysaat3 gebruikt. De resulterende eiwitten werden gescheiden via western blot onder gebruik van de enzymatische subunit van het split luciferase-eiwit en het juiste substraat om de split luminescent tag te detecteren. Western blotting toonde aan dat optimalisatie nog steeds eiwitten produceerde die overeenkwamen met hun verwachte molecuulgewicht (Figuur 3B). HEK293-cellen werden getransfecteerd met de niet-geoptimaliseerde of geoptimaliseerde vormen van elke transcriptiefactor, en er werden live-celopnames gemaakt gedurende 18 h. Voor alle 18 h experimenten werden metingen van drie biologische replica's genomen, en drie technische replica's per monster werden gebruikt in elk herhaald experiment. Optimalisatie van HAND2 (Figuur 3C) en GATA4 (Figuur 3D) had geen effect op de expressie (bepaald door een ongepaarde t-toets voor twee steekproeven), met respectievelijk een 1,07-voudige toename en 1,25-voudige afname vergeleken met hun niet-geoptimaliseerde tegenhangers. Ondertussen leidde optimalisatie van MEF2C (Figuur 3E) en TBX5 (Figuur 3F) tot een statistisch significante toename in expressie, met een 2,25 (P = 0,0486, n = 3, ongepaarde t-toets voor twee steekproeven) en 1,72-voudige (P = 0,0379, n = 3, ongepaarde t-toets voor twee steekproeven) verhoging in AUC ten opzichte van hun respectievelijke niet-geoptimaliseerde versie. In overeenstemming hiermee worden verschillen waargenomen niet alleen in de eindpunt-expressie, maar ook in de vorm en snelheid van de expressiecurven, wat aangeeft dat de assay veranderingen in de translationele dynamiek in de loop van de tijd detecteert. Om vast te stellen of deze toename in expressie over een langere periode behouden blijft, werden HEK293-cellen getransfecteerd met MEF2C mRNA en werden er opnames gemaakt gedurende 72 h (Figuur 3G). Net als bij de 18 h experimenten werden metingen van drie biologische replica's genomen, en drie technische replica's per monster werden gebruikt in elk herhaald experiment. Vergelijkbaar met wat werd waargenomen na 18 h, verhoogde geoptimaliseerd MEF2C de expressie significant met een 2,5-voudige (P = 0,0061, n = 3, ongepaarde t-toets voor twee steekproeven) verbetering in AUC vergeleken met de niet-geoptimaliseerde versie. Hoewel er een aanzienlijke toename in expressie is bij optimalisatie, tonen deze resultaten aan dat optimalisatie in dit geval het verval over 72 h niet voorkomt, waarbij beide MEF2C-vormen vergelijkbare hellingen vertoonden vanaf 24 h. Dit verval is waarschijnlijk te wijten aan lineaire mRNA-degradatie en/of celdeling. Samen tonen deze resultaten het potentieel van mRNA-ontwerpalgoritmen aan om de mRNA-expressie te verbeteren; ze benadrukken echter dat optimalisatie op een POI-afhankelijke manier moet worden uitgevoerd.

figure-results-1
Figuur 1: Workflow voor mRNA-synthese en split luminescent tag assay in HEK293-cellen. Voor het uitvoeren van IVT voor de split luminescent tag assay moet het plasmide een RNA-polymerasepromotor (T7 of SP6), 5’- en 3’-UTR's en de coderende sequenties voor het eiwit van interesse bevatten, gefuseerd aan een korte luciferase-subeenheid HB (HiBiT). Het plasmide wordt gelineariseerd met een restrictie-enzym dat op één enkele site knipt, wat het template vormt voor de Poly T PCR, die vervolgens als template voor IVT wordt gebruikt. Het mRNA wordt gesynthetiseerd, gecomplexeerd met liposomen en via reverse-transfectie ingebracht in HEK293-cellen die constitutief de grotere luciferase-subeenheid (LB) tot expressie brengen; deze kunnen direct in een plaatlezer worden geplaatst waarbij live metingen worden verricht. Na voltooiing van het experiment wordt data-analyse uitgevoerd voor normalisatie en daaropvolgende statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Een viervoudige verlaging van de concentratie van het capping-reagens produceert een vergelijkbare expressie van eGFP als bij de volledige concentratie. (A) Live cellulaire kinetische assay in HEK293-cellen getransfecteerd met eGFP mRNA met variërende concentraties capping-reagens, MYL3 of Mock, data genormaliseerd naar t0; stippen representeren het gemiddelde van ten minste drie biologische replicaten per tijdspunt. (B) De fold change in AUC van de curven voor een tijdreeks van 18 u van ten minste drie biologische replicaten werd verkregen door te normaliseren naar de referentiemonster MYL3 en vergeleken via eenweg-ANOVA met de multiple-vergelijkingstest van Tukey. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM), waarbij elke stip het gemiddelde van een biologisch replicaat representeert. ***P < 0,001. (eGFP – enhanced green fluorescent protein; AUC – oppervlakte onder de curve; RLU – relatieve luminescentie-eenheden) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Sequentieoptimalisatie verbetert de mRNA-translatie op een POI-afhankelijke wijze. (A) LinearDesign-optimalisatie van de mRNA-sequentie resulteerde in een respectievelijk afname van de minimale vrije energie (MFE) en een toename van de codonadaptatie-index (CAI) waarden voor elke transcriptiefactor. (B) RRL-reacties werden 120 min lang uitgevoerd met mRNA dat codeert voor niet-geoptimaliseerd en geoptimaliseerd HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5, of zonder RNA. De resulterende eiwitten werden verwerkt voor western blotting en gedetecteerd via chemiluminescentie door incubatie van het membraan met de enzymatische subeenheid in het split-luciferasesysteem en het geschikte substraat. Live cellulaire kinetische assay in HEK293-cellen getransfecteerd met niet-geoptimaliseerd of geoptimaliseerd HAND2 (C), GATA4 (D), MEF2C (E), of TBX5 (F), samen met MYL3 en Mock. Gegevens werden genormaliseerd naar t0, en stippen vertegenwoordigen het gemiddelde van drie biologische replica's per tijdstip. De fold-change in de AUC van curven voor een tijdsverloop van 18 u van drie biologische replica's werd verkregen door normalisatie naar de referentiemonster MYL3 en vergeleken met een ongepaarde t-test met Welch-correctie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, waarbij elke stip het gemiddelde van een biologische replica vertegenwoordigt. *P < 0.05. (G) Live cellulaire kinetische assay in HEK293-cellen getransfecteerd met niet-geoptimaliseerd of geoptimaliseerd MEF2C, MYL3 en Mock; gegevens genormaliseerd naar t0, stippen vertegenwoordigen het gemiddelde van drie biologische replica's per tijdstip. De fold-change in de AUC van curven voor een tijdsverloop van 72 u van drie biologische replica's werd verkregen door normalisatie naar de referentiemonster MYL3 en vergeleken met een ongepaarde t-test met Welch-correctie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM waarbij elke stip het gemiddelde van een biologische replica vertegenwoordigt. **P < 0.01. (MFE – minimale vrije energie; CAI – codonadaptatie-index; RRL – konijn reticulocytenlysaat; AUC – oppervlak onder de curve, RLU – relatieve luminescentie-eenheden) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het veld van mRNA-therapeutica is de afgelopen jaren snel gegroeid, wat het belang van sequentieontwerp en optimalisatie als een kritieke fase in de ontwikkelingspijplijn onderstreept. Aanzienlijke inspanningen zijn gericht op het bouwen van computationele tools om de meest effectieve RNA-structuren en -composities te voorspellen, waarbij sequentieoptimalisatie bijzondere aandacht heeft gekregen8,9. Hoewel deze tools krachtig zijn, blijft experimentele validatie van deze ontwerpen een essentieel onderdeel van de pijplijn. Deze validatie is echter grotendeels gebaseerd op reportereiwitten, waaronder GFP7, NanoLuc8 en het SARS-CoV-2 spike-eiwit9 die reeds extreem stabiele, zeer translatable eiwitten zijn. Om deze beperking te overwinnen, is een split-luciferasesysteem geïntegreerd in een pijplijn om de translatiedynamiek van in vitro getranscribeerd mRNA in HEK293-cellen te bestuderen, wat temporele resolutie mogelijk maakt3, en werd aangetoond dat het gebruik van reportereiwitten beperkingen heeft bij het detecteren van veranderingen in de translatie na mRNA-engineering. Het artikel van deze methode demonstreert de stappen die nodig zijn om deze assay uit te voeren, illustreert dat de IVT-reactie geminiaturiseerd kan worden en dat de 5’-cap-concentratie kan worden verlaagd zonder translationaire gevolgen, waardoor de kosten worden gereduceerd. Voortbouwend op onze eerdere observaties, benadrukken we dat een POI-afhankelijke benadering van mRNA-sequentieoptimalisatie vereist is om een verhoogde expressie te bereiken.

Zoals hier beschreven, is de split luminescent tag assay een relatief eenvoudige pijplijn die medium-throughput meting van mRNA-translatie mogelijk maakt, waardoor gebruikers de temporele expressie van hun POI in real-time kunnen onderzoeken. Er zijn echter meerdere kritieke stappen en overwegingen nodig om robuuste resultaten te behalen. Ten eerste zijn alle downstream resultaten afhankelijk van de kwaliteit van het mRNA, wat begint bij de IVT en de descontaminatie van de hiervoor gebruikte apparatuur. Na synthese is de opslag van het mRNA essentieel: het wordt na elutie op ijs bewaard en, na bevestiging van de mRNA-grootte, wordt het mRNA verdeeld in aliquots van werkvolumes om vries-dooi cycli te voorkomen, waarna het mRNA bij -80°C bewaard blijft. Ten tweede is de gebruikte 96-wells plaat van cruciaal belang en moet deze consistent zijn tussen experimenten. Gebruik voor dit protocol een volledig witte 96-wells plaat. Platen met een transparante bodem en witte wanden kunnen worden gebruikt als monitoring van de celmorfologie vereist is; deze resulteren in een veel lager signaal, waardoor de twee plaattypen niet uitwisselbaar kunnen worden gebruikt. Er is waargenomen dat bij het meten van de translatie van dezelfde mRNA's in een plaat met transparante bodem en witte wanden, het resulterende luminescentiesignaal 5-voudig lager was dan dat van een parallelle volledig witwandige plaat. Deze technische opmerking kan van grote impact zijn bij het beoordelen van genen met inefficiënte translationele dynamiek. Naast het introduceren van inconsistentie in de data, kan de vermindering van het signaal de detectie van subtiele verschillen veroorzaakt door mRNA-sequenties of structurele perturbaties belemmeren. Ten derde is het gebruik van L-15 medium essentieel voor deze assay, omdat het celviabiliteit mogelijk maakt in een omgeving zonder CO2-suppletie25, wat flexibiliteit biedt bij de keuze van de luminometer. Daarnaast reduceert het gebruik van fenolvrij L-15 het achtergrondsignaal tijdens het meten van de luminescentie. Tot slot: het kweken en het meten van de luminescentie bij 37°C (of de kweekconditie van uw specifieke celtype). Het uitvoeren van dit experiment bij kamertemperatuur zal de resultaten sterk beïnvloeden, aangezien de translatie-elongatiesnelheid wordt verlaagd26, waardoor normale kinetiek niet zal worden waargenomen.

De veelzijdigheid van het ontwerp van in vitro getranscribeerd mRNA kan worden overgebracht naar het syntheseproces, waardoor talrijke modificaties mogelijk zijn. Zoals waargenomen, kan de concentratie van de 5’-cap met een factor 4 worden verlaagd en toch een vergelijkbare expressie bereiken, waardoor onderzoekers de kosten kunnen verlagen. Hoewel de capping-efficiëntie na IVT niet direct is gemeten, zou een toenemend aandeel niet-gecapte mRNA binnen de IVT-pool leiden tot een verminderd signaal, zoals aangetoond bij niet-gecapte mRNA; dit werd niet waargenomen. Bovendien, aangezien eGFP een relatief klein eiwit is van slechts 27 kDa, zou deze modulatie van de cap-concentratie gemakkelijk vertaalbaar moeten zijn naar grotere genen, omdat er na IVT minder transcripten te cappen zullen zijn. Er zijn meerdere cap-analogen met verschillende methyleringsmodificaties, wat invloed heeft op de immunogeniciteit3 en eiwitexpressie27. Daarnaast kan het capping-proces co-transcriptioneel worden uitgevoerd (zoals hier gedemonstreerd) of post-transcriptioneel met behulp van het Vaccinia-virus, wat resulteert in een capping-efficiëntie van 100%28, maar extra zuiveringsstappen vereist. Voor de productie van mRNA op laboratoriumschaal worden veelvuldig zuiveringskolommen gebruikt, omdat deze snel en efficiënt zijn, maar kostbaar. Een goedkopere en veelzijdigere benadering is precipitatie met lithiumchloride, die, hoewel tijdrovender, de gebruiker in staat stelt het mRNA te concentreren en de opbrengst niet beperkt tot de bindingscapaciteit van de kolom; daarom is het geschikt voor opschaling. Net als bij de zuiveringskolommen verwijdert deze benadering dubbelstrengs RNA en getrunceerde RNA-fragmenten niet volledig, wat immunogeniciteit veroorzaakt29. Net als bij de 5’-cap kan de incorporatie van de poly(A)-staart op andere manieren worden bereikt dan hier beschreven. Analoog aan de introductie van de staart via PCR, kan plasmide DNA zodanig worden ontworpen dat het een poly(A)-staart bevat; deze lange sequenties kunnen echter recombineren, wat resulteert in heterogene en verkorte poly(A)-sequenties. Echter, poly(A)-segmentatie – de insertie van heteronucleotide-spacers – heeft deze effecten geminimaliseerd30,31. Alternatief kan de poly(A)-staart worden gegenereerd met behulp van een template-onafhankelijke poly(A)-polymerase, wat de generatie van langere poly(A)-staarten mogelijk maakt32, maar met het risico dat heterogeniteit de regelgevende vereisten beïnvloedt33.

Hoewel de beschreven split-luminescente tag-assay uiterst effectief is voor het meten van de eiwitexpressie van exogeen afgeleverd mRNA, zijn er enkele beperkingen waar rekening mee moet worden gehouden, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Ten eerste is het nodig om een cellijn te maken die constitutief één helft van de split-luciferase tot expressie brengt. Hoewel dit kant-en-klaar kan worden gekocht, is dit momenteel beperkt tot uitsluitend HEK293-cellen. Als het creëren van een stabiele lijn in het gewenste celtype uitdagend is, bestaat er een lytische assay waarvan we hebben vastgesteld dat deze hetzelfde resultaat illustreert tussen HEK293-cellen, humane embryonale stamcellen en gedifferentieerde cardiomyocyten3. Echter, het tijdstip dat voor de lytische assay is gekozen in deze eerder gepubliceerde studie3, werd bepaald op basis van de live-cell HEK293-data. Ten tweede biedt de assay temporele resolutie in levende cellen, maar is deze niet in staat om ruimtelijke resolutie in levende cellen te bieden, wat voor bepaalde onderzoekers van belang kan zijn. Er is echter een primaire antistof beschikbaar die goed werkt voor fluorescente immunocytochemie tegen de korte luciferase-peptide-tag die in deze experimenten wordt gebruikt, waardoor ruimtelijke analyse van het vertaalde POI mogelijk wordt. Daarnaast zou een microscoop die in staat is tot luminescente imaging data met enkelcelresolutie kunnen leveren. Een benadering die spatiotemporele informatie biedt is SunTag, waarmee actieve translatie en lokalisatie worden gemeten met behulp van live-cell imaging via interacties tussen GFP-getagde scFv die binden aan peptide-epitopen14,34. Er zijn echter 24 tandem-herhalingen van deze epitopen vereist, wat potentieel de translatie kan verstoren, terwijl de workflow relatief een lage throughput heeft. Ten derde maakt de split-luminescente tag de meting van de mRNA-overvloed mogelijk, maar niet in levende cellen. In ons vorige werk3 werd qRT-PCR uitgevoerd op geëxtraheerd RNA met behulp van primers die specifiek zijn voor het exogeen afgeleverde transcript, wat de mRNA-niveaus bevestigde voor de transfectie-efficiëntie tussen constructen en de afbraak tussen tijdstippen. Een andere benadering is het gebruik van Northern blotting om de mRNA-stabiliteit te meten35. Beide benaderingen zijn echter arbeidsintensief en kunnen geen continue metingen leveren. Momenteel bestaat er geen methode die gelijktijdige metingen van mRNA-translatie en overvloed in levende cellen mogelijk maakt, wat een potentiële weg opent voor de verdere ontwikkeling van assays in dit gebied.

Het split-luciferasesysteem werd aanvankelijk toegepast om proteïnedynamiek te bestuderen, maar het is hier duidelijk dat deze assay belangrijke implicaties heeft voor andere onderzoeksgebieden. Nu mRNA-therapeutica in de voorhoede staan van nieuwe benaderingen voor gentherapie, is deze assay uitermate geschikt om onderzoekers in staat te stellen de expressie van hun potentiële therapeuticum te karakteriseren en deze te optimaliseren voor een verhoogde expressie. Zoals eerder vermeld, is codonoptimalisatie een krachtige nieuwe tool geworden in mRNA-ontwerp met de ontwikkeling van meerdere instrumenten8,9,36. Wanneer een uniforme benadering van sequentieoptimalisatie werd toegepast op vier transcriptiefactoren, verbeterde dit zowel de MFE als de CAI voor alle genen, maar vertoonden alleen MEF2C en TBX5 een verhoogde expressie. Opmerkelijk is dat deze benadering, door de detectie mogelijk te maken van expressieverschillen die uitsluitend voortkomen uit synonieme variaties in de coderende sequentie, een uniek platform biedt voor het onderzoeken van de translationele efficiëntie in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Deze bevindingen laten zien dat sequentieoptimalisatie rekening moet houden met het initiële GC-gehalte, het codongebruik en de RNA-secundaire structuur op een POI-afhankelijke manier om een verhoogde expressie te bereiken. Hoewel er mogelijk meer constructen getest moeten worden, heeft de split-luminescent tag-assay het potentieel voor high-throughput analyse om de optimale kandidaat voor de POI te identificeren. Daarnaast kan deze assay, zoals eerder aangetoond3, de effecten meten van het verstoren van elk sequentie- of structureel onderdeel van mRNA, wat de toepassingen verder onderstreept. Naast het onderzoeken van wijzigingen in het mRNA, zou de split-luminescent tag-assay ook kunnen worden ingezet in onderzoek naar aflevering en formulering. Zelfs met verbeteringen in 5’-caps en het gebruik van gemodificeerde nucleotiden, vereist exogeen afgeleverd mRNA een verpakkingssysteem om degradatie te voorkomen en cellulaire opname te faciliteren37. Hoewel lipidenanodeeltjes38, extracellulaire blaasjes39 en biomimetica40 in de voorhoede staan van mRNA-aflevering, is verdere ontwikkeling nog steeds vereist. Encapsulatie van split-luminescent-tagged mRNA in een van deze dragers zou de karakterisering van hun afleverefficiëntie mogelijk maken en onderzoekers in staat stellen om gemodificeerde dragers op een medium-tot-high-throughput manier te testen. Buiten translationeel gericht onderzoek is de split-luminescent tag-assay gemakkelijk bruikbaar voor fundamentele biologie. Of het nu gaat om het beoordelen van de effecten van perturbaties van sequentie- en structurele elementen op mRNA-translatie, het interfereren met de functie van de translationele machinerie, of het onderzoeken van het proteasoom, het split-luminescent tagging-systeem biedt een aantrekkelijke optie.

Over het algemeen biedt het hier beschreven gesplitste luminescente tag-systeem een flexibele, robuuste assay om de door synthetisch mRNA aangestuurde eiwitexpressie temporeel te monitoren als readout voor translationele dynamiek. De implementatie van een live-cell assay overwint veel van de eerdere beperkingen in het veld van mRNA-translatie en onthult cruciale informatie over de dynamiek van eiwitsynthese en de degradatie van het POI. Aangezien transcripten verschillende regulatoire en expressieprofielen bezitten, is het essentieel dat het therapeutische POI wordt gekarakteriseerd, wat de verdere evolutie van mRNA-therapeutica en de vertaling naar de kliniek zal mogelijk maken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Laura Itzhaki voor de HEK293 LgBiT-cellijn. Dit werk werd ondersteund door een projectsubsidie en een translational award van de British Heart Foundation (G114642 en G919651 aan CHW) en een GenScript Life Science Research Grant (CAPB).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurSigma-AldrichA6283Component van TAE-buffer
AgaroseSigma-AldrichA9539Gelelektroforese
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BBioanalyzer gebruikt voor kwaliteitscontrole van mRNA
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-FPlatenlezer/luminometer gebruikt voor het meten van luminescentie
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-71135'-cap gebruikt voor IVT
DMEM, high glucose, pyruvaatThermo Fisher Scientific41966029Medium gebruikt voor de kweek van HEK293-LgBiT-cellen
DNase INew England BiolabsM0303Degradeert DNA-template na de IVT-reactie
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537Voor het wassen van cellen en toevoeging aan de plaat om verdamping te voorkomen
EDTA, pH 8.0, RNase-vrijThermo Fisher ScientificAM9260Component van TAE-buffer
EthidiumbromideSigma-AldrichE1510Kleurstof voor gelelektroforese
Foetaal runderserum (FBS)Sigma-AldrichF7524Supplement toegevoegd aan DMEM
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040Kit voor in vitro transcriptie (IVT)
Leibovitz L-15 Medium, zonder fenolroodThermo Fisher Scientific21083027Medium gebruikt voor HEK293-LgBiT-kweek tijdens luminescentiemetingen
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-024Supplement toegevoegd aan DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Transfectiereagens op basis van lipiden
Lithiumchloride precipitatie-oplossingThermo Fisher ScientificAM9480Alternatieve methode voor mRNA-zuivering na IVT
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130Zuiveringskit na linearisatie van het plasmide
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrofotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WSpectrofotometer gebruikt voor het kwantificeren van de DNA- en mRNA-concentratie
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratePromegaN2570Substraat vereist voor luminescentie, toegevoegd aan L-15 medium 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612Zuivert mRNA na de IVT-reactie
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Fisher Scientific136101Plaat gebruikt voor het uitplaten van HEK293-LgBiT en daaropvolgende metingen
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985062Medium gebruikt voor de transfectiereactie
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553PCR-kit
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993RNA-ladder voor gelelektroforese
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020Sproei voor RNase-decontaminatie
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066Component van TAE-buffer
Trypsine-EDTA oplossingSigma-AldrichT4174Reagens voor cel-dissociatie
UltraPure DNase/RNase-vrij gedestilleerd waterThermo Fisher Scientific10977035Gebruikt voor de preparatie van de template en voor IVT

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

mRNA translatielive cell imagingin vitro transcriptieprote ne expressiedynamiekluciferase complementatieoptimalisatie van coderende sequenties5 cap modificatiemRNA therapeutica

Gerelateerde artikelen