Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van de translationele dynamiek van mRNA in levende cellen met split luminescente tagging in HEK293-cellen

67 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70840

⸱

14 augustus 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren wij een flexibele, high-throughput-compatibele methode voor het meten van live mRNA-translatiedynamiek in cellulo in HEK293-cellen, met gebruik van split luminescent tagging. Deze veelzijdige assay maakt onderscheid tussen structurele effecten, ondersteunt de optimalisatie van in vitro transcriptie en stroomlijnt de ontwikkeling van mRNA-therapeutica.

Samenvatting

De snelle ontwikkeling van vaccins om COVID-19 te bestrijden illustreerde het potentieel van therapeutica op basis van messenger RNA (mRNA) om de geneesmiddelenontwikkeling te transformeren. Net als matuur mRNA bezit in vitro getranscribeerd mRNA dezelfde elementen, waaronder een 5’-cap, niet-vertaalde regio's (UTRs), een coderende sequentie en een poly(A)-staart. Eerder werk waarin de effecten van deze componenten op de mRNA-translatie werd bestudeerd, maakte voornamelijk gebruik van sterk gemanipuleerde reportereiwitten die een efficiënte translatie en eiwitstabiliteit vertonen. Omdat de structurele elementen van elk mRNA hun translatie verschillend beïnvloeden, is het essentieel om het optimale ontwerp te identificeren dat relevant is voor het therapeutische eiwit van belang (POI). Om de translatie van het POI te kunnen karakteriseren, werd een split-luciferase-complementatiesysteem gebruikt. Een kort peptide-label (HiBiT), dat aan beide uiteinden van het POI gefuseerd kan worden, associeert met zijn complementaire heterodimeer (LgBiT) om de enzymatische activiteit te herstellen in de aanwezigheid van een cel-permeabel substraat. Tot nu toe is split-luminescente labeling voornamelijk gebruikt voor high-throughput studies naar eiwitomzetting. We hebben eerder aangetoond hoe split-luminescente labeling kan worden ingezet om high-throughput kwantificering van mRNA-translatie temporeel in cellulo mogelijk te maken in HEK293-cellen die het complementaire heterodimeer constitutief tot expressie brengen. Hier demonstreren we verder de veelzijdigheid van de assay en beschrijven we hoe deze assay kan worden gebruikt voor het optimaliseren van in vitro transcriptie om kosten te reduceren. Het assaysysteem kan uniek onderscheid maken tussen wijzigingen in structurele componenten, terwijl de effecten van optimalisatie van de coderende sequentie met niet-gemanipuleerde genen worden benadrukt. Daarnaast tonen we aan dat een 4-voudige reductie in de 5’-cap-concentratie voor in vitro transcriptie resulteert in een equivalente translatie in cellulo. Deze bevindingen illustreren hoe split-luminescente labeling gemakkelijk kan worden geïntegreerd in de workflow voor mRNA-therapeutica, waardoor monitoring van real-time mRNA-gestuurde eiwitexpressiedynamiek in cellulo mogelijk wordt, wat een veelzijdige methode biedt voor de vooruitgang van mRNA-gebaseerde therapeutica.

Inleiding

Therapeutica op basis van messenger-RNA (mRNA) en onderzoekstoepassingen zijn de afgelopen jaren snel uitgebreid, gestuwd door het succes van mRNA-vaccins1,2 en de groeiende erkenning van de veelzijdigheid van RNA als een programmeerbaar biomolecuul. Een centrale uitdaging in dit veld is het vermogen om de translatie-efficiëntie van mRNA kwantitatief en dynamisch te beoordelen in diverse contexten. De hier beschreven methode – waarbij gebruik wordt gemaakt van een split luminescent tagging-systeem – biedt een flexibel en schaalbaar platform voor het bestuderen van live mRNA-translatie in cellulo3. Het overkoepelende doel van deze methode is om onderzoekers in staat te stellen te meten hoe sequentiekenmerken, chemische modificaties en structurele elementen de translatiekinetiek en de daaropvolgende eiwitomzet beïnvloeden, waardoor een krachtig instrument ontstaat voor het optimaliseren van mRNA-constructen voor therapeutische toepassingen en fundamenteel wetenschappelijk onderzoek.

In vitro getranscribeerd mRNA weerspiegelt de essentiële architectuur van rijpe transcripten, met een 5′-cap, niet-vertaalde regio's (UTR's), een coderende sequentie en een poly(A)-staart, waarbij vaak gemodificeerde nucleotiden worden opgenomen om de immunogeniciteit te verminderen4,5. Uit uitgebreid onderzoek is gebleken dat elk van deze elementen – afzonderlijk en in combinatie – zodanig kunnen worden ontworpen dat ze de vertaalefficiëntie en de eiwitopbrengst sterk beïnvloeden6,7. Toch vertrouwden de meeste eerdere studies op sterk geoptimaliseerde reportereiwitten zoals Green Fluorescent Protein (GFP)7, NanoLuc8 of het SARS-CoV-2 spike-eiwit8,9, die zijn ontworpen om met een hoge efficiëntie te vertalen en zeer stabiele eiwitten te produceren, en daarom niet de uitdagingen weerspiegelen die in therapeutische contexten voorkomen. Omdat therapeutische mRNA's diverse eiwitten van belang (POI's) coderen, die elk onderhevig zijn aan unieke structurele beperkingen en celtype-specifieke regulatie, zijn de ontwerpprincipes die de vertaling voor het ene construct maximaliseren mogelijk niet generaliseerbaar naar een ander, zoals eerder is gerapporteerd3. Het identificeren van de optimale configuratie voor een specifieke therapeutische POI is daarom essentieel en vereist methoden die gevoelig en systematisch kunnen evalueren hoe individuele kenmerken van het transcript bijdragen aan de eiwitopbrengst.

Ribosoomgerichte methoden, zoals polysoomprofilering, maken onderscheid tussen translatiefracties via gradiëntcentrifugatie10, terwijl ribosoomprofilering (Ribo-seq) resolutie op nucleotide-niveau biedt van ribosoombezetting, initiatieplaatsen en pauzes11. Net als Ribo-seq karakteriseren andere sequencing-gebaseerde benaderingen, zoals High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Crosslinking Immunoprecipitation (HITS-CLIP) en Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP), verder de translatie van RNA's geassocieerd met RNA-bindende eiwitten of ribosomen12. Hoewel krachtig, vereisen deze technieken complexe preparatie, gespecialiseerde apparatuur en computationele expertise, waardoor ze ongeschikt zijn voor high-throughput therapeutische mRNA-ontwikkeling. Nascent chain immunoprecipitatie13 meet de translatie-efficiëntie met behulp van FLAG-getagde eiwitten die via immunoprecipitatie van ribosomen worden geïsoleerd en gekwantificeerd via Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Hoewel aanpasbaar voor therapeutische mRNA's, is deze assay arbeidsintensief, ontbreekt het aan temporele resolutie en is deze ongeschikt voor high-throughput toepassingen. Het SunTag-systeem14 maakt live-cell metingen mogelijk van de eiwitsynthese-output en translationele regulatie van individuele mRNA-moleculen en werkt via de interactie van een single-chain variable fragment (scFv) gefuseerd aan GFP met tandemherhalingen van het peptide-epitoop. Dit systeem maakt dynamische metingen van translatie en lokalisatie mogelijk met resolutie op single-mRNA-niveau, en is daarom ingezet voor de ontwikkeling van talrijke systemen voor het volgen van nascent chains15,16. Deze benadering heeft echter een lage doorvoersnelheid en vereist het gebruik van krachtige microscopen.

Hoewel het labelen van het nascente eiwit onvermijdelijk is, werd het potentiële gebruik van een kleine peptide-tag geïdentificeerd, afgeleid van NanoLuc-luciferase, om de mRNA-translatie in levende cellen te rapporteren. Het NanoLuciferase werd zodanig ontwikkeld dat het kan worden opgesplitst in een kleine subunit van 11 aminozuren (HiBiT) en een grotere subunit van 158 aminozuren (LgBiT), die snel kunnen dimeriseren en, in de aanwezigheid van een substraat, een functioneel luciferase kunnen reconstitueren17,18. Er zijn verschillende belangrijke voordelen van het gesplitste luminescente tagging-systeem voor studies naar mRNA-dynamiek. Ten eerste zorgt de minimale grootte van de kleine subunit die gefuseerd is aan het POI ervoor dat het gecodeerde construct zo dicht mogelijk bij het natuurlijke eiwit van belang blijft. Aangezien de lengte van de coderende sequentie direct invloed kan hebben op de translatieratio's19, verbetert het minimaliseren van de tag-lengte onze voorspelling van de translatiedynamiek van synthetische mRNA's. Cruciaal is dat deze minimale tagging-strategie het mogelijk maakt om verschillen in translatie te detecteren die worden veroorzaakt door synonieme variaties in de coderende sequentie, waardoor de translationele efficiëntie onafhankelijk van de eiwitsequentie of -stabiliteit kan worden onderzocht3. Om deze reden is het gebruik van grotere tags, zoals fluorescerende eiwitten of volledige luciferases, suboptimaal. Ten tweede maakt het hier gebruikte gesplitste luminescente tagging-systeem onmiddellijke signaalgeneratie mogelijk. De snelle en efficiënte in cellulo complementatiereactie heeft een gerapporteerde hoge affiniteit (KD = 700 pM) en is gebruikt om de modulatie van eiwitomzet te meten met metingen met intervallen van slechts 30 s18. Hoewel het oorspronkelijke gesplitste luminescente tagging-systeem primair werd gebenchmarkt tegen andere gesplitste luciferase-systemen17,18, is het belangrijkste voordeel in deze context dat de signaalgeneratie niet wordt beperkt door eiwitmaturatie. In tegenstelling hiermee vereisen fluorescerende eiwitten chromofoormaturatie, die minuten tot uren kan duren20, waardoor de temporele resolutie wordt beperkt. Ten slotte overwint het hier gebruikte gevestigde gesplitste luminescente tagging-systeem de beperkingen van gesplitste fluorescerende eiwitsystemen, die doorgaans chromofoorvorming na complementatie vereisen21, wat een extra vertraging introduceert en hun geschiktheid voor het vastleggen van snelle, dynamische processen beperkt. Eerdere studies hebben het nut van gesplitste luminescente tagging aangetoond in assays voor eiwitomzet en degradatiestudies22,23,24. De uitbreiding van deze gevestigde technologie naar translatiekinetiek vertegenwoordigt een aanzienlijke methodologische vooruitgang. Zo kan ribosome profiling bijvoorbeeld de ribosoomdichtheid langs transcripten onthullen, maar kan het dynamische veranderingen in translatie-initiatie- of elongatiesnelheden onder verschillende omstandigheden niet eenvoudig vastleggen. Zoals eerder geïllustreerd3, kan dit gesplitste luminescente tagging-systeem verschillen detecteren bij het wijzigen van de cap-structuur, de samenstelling van de 5′ onvertaalde regio (UTR), codon-optimalisatie, nucleotide-modificaties en de lengte van de poly(A)-staart, die allemaal kritieke determinanten van de translationele efficiëntie zijn. Deze breedte van toepasbaarheid maakt de methode uniek krachtig voor het ontleden van de bijdragen van individuele mRNA-kenmerken aan de totale eiwitopbrengst. Het is vermeldenswaardig dat, afhankelijk van het gebruikte instrument, zowel single-cell- als whole-well-data met deze technologie kunnen worden vastgelegd. Imaging-platforms die in staat zijn om luminescentie-gebaseerde beelden te verwerven, kunnen deze technologie in staat stellen om single-cell translatiedynamiek te bestuderen. Hier richten we ons op een plate-reader, well-gebaseerde applicatie vanwege het medium-tot-high-throughput karakter en de minimale vereisten voor data-analyse.

Onderzoekers die deze methode overwegen, dienen de geschiktheid ervan te evalueren in het licht van hun specifieke experimentele doelstellingen. De assay is bijzonder waardevol in contexten waar high-throughput screening van synthetische mRNA-constructen vereist is, zoals in pipelines voor het ontwerp van mRNA-gebaseerde therapeutica. Het is uitermate geschikt voor vergelijkende analyses van kenmerken van synthetische mRNA-sequenties – waaronder niet-vertaalde regio's, codongebruik of nucleotide-modificaties – waarbij subtiele verschillen in translationele efficiëntie kunnen worden gedetecteerd3. Omdat het systeem compatibel is met celvrije translatieplatforms, live-cell assays en een tijdstipspecifieke lytische assay, biedt het flexibiliteit voor onderzoekers die hun experimentele ontwerp willen afstemmen op ofwel mechanistische studies ofwel toegepast onderzoek. Tegelijkertijd is het belangrijk de beperkingen van de techniek te erkennen. Cruciaal is dat de split luminescent tagging assay geen resolutie biedt van de ribosoombezetting, een capaciteit die uniek blijft voor ribosome footprinting-benaderingen, noch meet het direct de RNA-stabiliteit of degradatie, wat mogelijk met aanvullende methoden moet worden beoordeeld. Vanwege de beperkingen van bestaande ribo-centrische technieken zijn onderzoekers echter aangewezen op tag-gebaseerde assays zoals het split luminescentiesysteem om tijdopgeloste, door mRNA aangestuurde eiwitexpressie te onderzoeken als proxy voor translationele dynamiek. Hoewel dit systeem dus een krachtig instrument is voor het monitoren van door synthetisch mRNA aangestuurde eiwitexpressie, hangt de geschiktheid ervan af van de vraag of de onderzoeksvraag zich richt op de dynamische eiwitoutput in plaats van op fijnmazige ribosoompositionering of RNA-afbraak.

Samenvattend vormt het split-luminescent tagging-systeem een krachtige en veelzijdige methode voor het bestuderen van mRNA-translatie. Het algemene doel is om onderzoekers een flexibel, systeem-schaalbaar en high-throughput instrument te bieden dat in staat is om verschillen in eiwitoutput te detecteren die voortvloeien uit synthetisch mRNA met variërende structurele en sequentie-elementen3. De rationale voor de ontwikkeling ligt in het overwinnen van de beperkingen van bestaande technieken, waarbij voordelen worden geboden op het gebied van gevoeligheid, schaalbaarheid en temporele resolutie. Binnen de bredere literatuur over RNA-biologie en therapeutica vormt deze methode een waardevolle toevoeging aan het experimentele repertoire, wat zowel fundamentele inzichten als translationele vooruitgang mogelijk maakt. Door zorgvuldig de sterke punten en beperkingen van de assay af te wegen, kunnen onderzoekers bepalen of deze geschikt is voor hun specifieke toepassingen, om zo de impact in het snel evoluerende veld van de RNA-wetenschap te maximaliseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Een grafische weergave van het volledige protocol wordt getoond in Figuur 1.

1. Templatepreparatie voor in vitro transcriptie (IVT)

OPMERKING: Zorg er bij het voorbereiden van het DNA-template voor IVT voor dat het plasmide-DNA een RNA-polymerase-promotor bevat (over het algemeen T7 of SP6), 5’- en 3’-UTR's, en het open leesraam van het POI (Figuur 1).

  1. Lineariseer het plasmide-DNA met een restrictie-enzym met één enkele knipplaats na de 3’ UTR en stel de reactie samen volgens de instructies van de fabrikant. Reinig na incubatie de restrictie-digestreactie met een DNA-zuiveringskit op basis van spin-kolommen. Kwantificeer het DNA met een spectrofotometer.
  2. Bereid ter bevestiging van de linearisatie een 1% agarose TAE-gel voor met de DNA-kleurstof Ethidiumbromide in een concentratie van 0,1 µg/mL. Meng 150 ng van het gedigesteerde DNA met water en ladingskleurstof. Laad de agarosegel met het monster, niet-geknipt plasmide en een DNA-ladder, en laat de agarosegel 40 min lopen bij 100 V in een 1× Tris-azijnzuur-EDTA (TAE) buffer. Visualiseer dit met een gel-imager.
    WAARSCHUWING: Ethidiumbromide-oplossing is een krachtig mutagen en vereist zorgvuldige hantering met gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
  3. Indien het plasmide-DNA geen poly(A)-staart direct na de 3’ UTR heeft, introduceer deze dan via een PCR. Voer de PCR uit volgens de instructies van de fabrikant met een high-fidelity polymerase en passend ontworpen primers. Zorg ervoor dat het amplicon de T7-promotor, het open leesraam en een poly(A)-staart bevat.
    OPMERKING: Capping-technologieën kunnen specifieke sequentie-eisen hebben bij de T7-promotor; deze eisen kunnen worden vervuld door een passend ontwerp van de forward-primer. De reverse-primer bindt aan het einde van de 3’ UTR en introduceert een poly(A)-staart (aanbevolen lengte van minimaal 80 T). Voor constructen met een hoog GC-gehalte worden step-up PCR en/of 3% DMSO aanbevolen.
  4. Bereid ter bevestiging van een succesvolle PCR een agarose TAE-gel voor met Ethidiumbromide (zie stap 1.2). Als de lengte van het construct ≥1 kb of <1 kb is, bereid dan respectievelijk een 1% of 2% gel. Meng 5 µL van de PCR-reactie met water en ladingskleurstof. Laad de agarosegel met zowel het monster als een DNA-ladder en laat deze 40 min lopen bij 100 V in TAE-buffer. Visualiseer dit met een gel-imager.
  5. Reinig na bevestiging van de PCR-grootte de PCR-reactie met een DNA-zuiveringskit op basis van spin-kolommen. Elueer in 15–20 µL elutiebuffer (vaak meegeleverd bij de DNA-zuiveringskit) of nucleasevrij water om de DNA-template te concentreren voor gebruik in IVT. Kwantificeer het DNA met een spectrofotometer.

2. In vitro transcriptie

  1. Bespuit en veeg vóór aanvang de werkbank, handschoenen en pipetten af met een RNase-decontaminatieloosing. Voer deze procedure uit in een steriele zuurkast om de opbrengst en kwaliteit te verbeteren.
  2. Ontdooi en stel de componenten van een T7-gebaseerde in vitro transcriptie (IVT) kit samen volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Sommige fabrikanten raden het gebruik van dithiothreitol (DTT, 0.1 M) aan om oxidatie van de reactie te beperken en de efficiëntie te verbeteren. Deze stap wordt aanbevolen indien compatibel met de kit. Vervang bij gebruik van gemodificeerde dNTP's het overeenkomstige ongemodificeerde nucleotide door dezelfde hoeveelheid gemodificeerd nucleotide. Evalueer de opbrengst van een halve reactie, aangezien er geen substantiële verbetering in opbrengst werd waargenomen bij een volledige reactie. Bij de synthese van meer dan één mRNA wordt aanbevolen om een mastermix te maken om pipetteerfouten en variabiliteit te verminderen.
  3. Pipetteer en meng grondig en kort, en incubeer vervolgens gedurende 5 h bij 37 °C met een verwarmde dop om condensatie te voorkomen. Verleng de incubatie indien nodig tot overnacht, aangezien dit een minimaal effect heeft op de opbrengst of integriteit van het mRNA.
  4. Voeg 1 µL DNase I toe en pipetteer grondig. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
  5. Zuivering van in vitro getranscribeerd (IVT) RNA
    1. Zuiver de IVT-reactie met een kolomgebaseerde RNA Cleanup kit volgens de instructies van de fabrikant (verschillende kits kunnen leiden tot verschillende herstelpercentages en variërende bindingscapaciteiten hebben). Voeg voor elutie 60 µL nucleasevrij water toe en incubeer 5 min bij kamertemperatuur vóór het centrifugeren.
    2. Gebruik alternatief lithiumchloride-precipitatie als een goedkopere en flexibelere methode.
      1. Voeg een gelijk volume 7,5 M lithiumchloride toe aan de reactie, meng en incubeer overnacht bij -20 °C.
      2. Centrifugeer 20 min bij 18.300 × g bij 4 °C en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant zonder het RNA-pellet te verstoren.
      3. Was met 950 µL 70% ethanol en centrifugeer 5 min bij 18.300 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant, laat het pellet ongeveer 5 min drogen bij kamertemperatuur en resuspendeer in nucleasevrij water (60 µL is standaard; verminder het volume afhankelijk van de grootte van het pellet om de concentratie te verhogen).
        WAARSCHUWING: Lithiumchloride kan huid- of oogirritatie veroorzaken als er geen geschikte PBM worden gebruikt. Draag handschoenen en oogbescherming bijv hantering. Bovendien is ethanol een zeer brandbare vloeistof en kan het oogirritatie veroorzaken. Houd weg van open vuur en draag geschikte PBM, inclusief oogbescherming.
  6. Kwantificeer het mRNA met een spectrofotometer. Zorg dat de A260/A280-ratio voor mRNA ~2,0 is en bevestig dat de A260/A230-ratio tussen 1,8 en 2,2 ligt.
  7. Om een succesvolle IVT te bevestigen, bereid een 1% agarose TAE (niet-denaturerende) gel voor die Ethidiumbromide bevat. Meng 500 ng mRNA met water en laadkleurstof, en volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding van de RNA-ladder en de denatureerinstructies. Laad de agarosegel en laat deze 40 min lopen bij 80 V in TAE-buffer. Visualiseer met een gel-imaging systeem.
  8. Voor verdere bevestiging van de correcte mRNA-grootte kunnen de monsters op een Bioanalyser worden geanalyseerd.
  9. Om vries-dooi cycli te vermijden, wordt het mRNA verdeeld in aliquots van het volume dat vereist is voor het experiment. Gebruik bijvoorbeeld 1,2 pmol mRNA per well in een 96-well plaat. Verdeel daarom het juiste volume voor 1,2 pmol × n replicaten in aliquots en bewaar deze vervolgens bij -80 °C.

3. Reverse transfectie van HEK293

OPMERKING: Voor temporele metingen is een cellijn vereist die constitutief het complementaire luciferase-fragment tot expressie brengt. Dit kan worden bereikt door een stabiele cellijn te creëren via transfectie van een plasmide dat het vereiste luciferase-fragment tot expressie brengt, gevolgd door clonale selectie. Dit stelt de gebruiker in staat om temporeel opgeloste mRNA-translationele dynamiek te meten in elke gewenste cellulaire achtergrond. Alternatief kunnen cellijnen die het vereiste luciferase-fragment tot expressie brengen worden aangeschaft. Deze experimenten werden uitgevoerd met HEK293-cellen die constitutief de complementaire heterodimeer tot expressie brengen.

  1. Ontdooi vóór aanvang het mRNA op ijs om degradatie te voorkomen.
  2. Bereid de transfectiecomplexen voor. Voor een 96-wells plaat is 1,2 pmol mRNA per well vereist. Bij uitvoering in dubbele bepalingen dient er voldoende te worden gemaakt voor 2,5 dubbele bepalingen om pipetteerfouten op te vangen. Combineer daarom 3 pmol mRNA met Opti-MEM Reduced Serum Medium tot een eindvolume van 50 µL (20 µL/well).
  3. Voeg 0,5 µL kationisch lipide-gebaseerd transfectiereagens toe (0,2 µL/well), meng door herhaaldelijk te pipetteren en incubeer bij kamertemperatuur. Meng na een incubatie van 5 min opnieuw door herhaaldelijk te pipetteren en voeg vervolgens 20 µL per well toe aan een witte 96-wells microplaat met vlakke bodem. Het wordt aanbevolen om de transfectiewells in het midden van de plaat te plaatsen en de randwells vrij te laten.
  4. Bereid HEK293-cellen voor door het medium te verwijderen en te wassen met 2 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2+ en Mg2+. Verwijder het wasmiddel en voeg 500 µL Trypsine-EDTA toe, en incubeer vervolgens 3 min bij 37 °C.
  5. Vul tijdens de celdissociatie de randwells van de 96-wells plaat met PBS om verdamping van het medium tijdens de celkweek te verminderen. Indien alle wells nodig zijn, kan de plaat tussen de wells worden gevuld met PBS.
  6. Voeg 4,5 mL Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 1× L-glutamine en 10% foetaal runderserum (FBS), toe om de cellen te verzamelen. Bepaal het celgetal met een hemocytometer of een automatische celsteller.
  7. Breng de benodigde hoeveelheid cellen over (genoeg voor 1 x 105 cellen per well) plus 3 extra wells (voor pipetteerfouten) naar een schone buis en centrifugeer 2 min bij 500 × g.
  8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in het benodigde volume Leibovitz L-15 medium (fenolvrij), aangevuld met 10% FBS en Endurazine Live Cell Substrate (1:200), om een eindconcentratie van 1 × 106 cellen/mL te waarborgen. Meng met een serologische pipet om een grondige menging van Endurazine te garanderen. Pipetteer 100 µL (1 × 105 cellen) van de geresuspendeerde cellen per well.
    OPMERKING: Verhoog bij tijdreeksexperimenten die 72 u lopen het volume naar 200 µL om verdamping te voorkomen.
  9. Plaats de cellen direct na transfectie in een plaatlezer (luminometer) ingesteld op 37 °C. Maak op regelmatige intervallen opnames met een integratietijd van 1 s. Vanwege de efficiënte complementatie van het systeem is het signaal binnen enkele minuten detecteerbaar. Om daarom een nauwkeurige nullijnmeting te verkrijgen, moet deze stap onverwijld worden uitgevoerd. Deze intervallen zijn afhankelijk van het experiment en het instrument; in deze experimenten bleek echter dat metingen elke 12 min voor tijdreeksexperimenten van 18 u, maar slechts elke 48 min voor experimenten van 72 u, optimaal waren. Voor de meting van luminescentie is geen filter vereist; een betere signaal-ruisverhouding werd waargenomen bij gebruik van een filter van 530–540 nm.
    OPMERKING: Een Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-signaal wordt gegenereerd vanuit split-luciferase-gelabeld eGFP, waardoor een filter van 530–540 nm zowel een luminescent als een fluorescent signaal vastlegt. Om detectie van BRET te voorkomen, dient een filter van 460–480 nm te worden gebruikt of alternatief een niet-fluorescerend eiwit zoals MYL3 als referentie.

4. Data-analyse

  1. Bereken de fold changes in relatieve luminescentie-eenheden (RLU's) door het signaal van elke conditie te normaliseren naar het eerste tijdstip (t0, genormaliseerd naar het gemiddelde van de technische replica's), aangezien het signaal aan het begin van de assay het achtergrondniveau vertegenwoordigt.
  2. Verminder de variabiliteit tussen biologische replica's door te normaliseren naar een controleconditie.
  3. Kies de statistische analyse voor de assay, óf een enkel tijdstip óf de oppervlakte onder de curve (AUC)—afhankelijk van de gestelde vraag.
    1. Gebruik voor een enkel tijdstip de tijdstippen waarop de piekexpressie optreedt (wat afhankelijk is van het POI) samen met het eindtijdstip. Zet de RLU die in stap 4.1 is berekend uit voor het specifieke tijdstip (bijv. 240 min) uit en analyseer deze met een geschikte statistische toets.
    2. Meet de dynamiek van eiwittranslatie en -afbraak door de AUC te berekenen voor een specifiek tijdsbestek (bijv. t0 tot 240 min) of voor de gehele duur van de assay (bijv. t0 tot het eindpunt). Normaliseer de AUC-waarde voor elke biologische replica naar het gemiddelde van het referentie-mRNA, waardoor een maat voor de fold change in AUC wordt verkregen die geanalyseerd kan worden met geschikte statistische toetsen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er zijn verschillende manieren waarop de kosteneffectiviteit van dit protocol kan worden geoptimaliseerd. Zo is de IVT-reactie geminiaturiseerd tot de helft van het door de fabrikant aanbevolen volume, waarbij werd vastgesteld dat de resulterende opbrengst voldeed aan de hoeveelheid die nodig is voor in cellulo experimenten. Er moet rekening worden gehouden met het feit dat sequentielengte en complexiteit de IVT-opbrengst beïnvloeden, waardoor een succesvolle protocoloptimalisatie minstens 50 µg mRNA per IVT-rea...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het veld van mRNA-therapeutica is de afgelopen jaren snel gegroeid, wat het belang van sequentieontwerp en optimalisatie als een kritieke fase in de ontwikkelingspijplijn onderstreept. Aanzienlijke inspanningen zijn gericht op het bouwen van computationele tools om de meest effectieve RNA-structuren en -composities te voorspellen, waarbij sequentieoptimalisatie bijzondere aandacht heeft gekregen8,9. Hoewel deze tools krachtig zijn, blijft experimentele validatie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Laura Itzhaki voor de HEK293 LgBiT-cellijn. Dit werk werd ondersteund door een projectsubsidie en een translational award van de British Heart Foundation (G114642 en G919651 aan CHW) en een GenScript Life Science Research Grant (CAPB).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurSigma-AldrichA6283Component van TAE-buffer
AgaroseSigma-AldrichA9539Gelelektroforese
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BBioanalyzer gebruikt voor kwaliteitscontrole van mRNA
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-FPlatenlezer/luminometer gebruikt voor het meten van luminescentie
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-71135'-cap gebruikt voor IVT
DMEM, high glucose, pyruvaatThermo Fisher Scientific41966029Medium gebruikt voor de kweek van HEK293-LgBiT-cellen
DNase INew England BiolabsM0303Degradeert DNA-template na de IVT-reactie
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537Voor het wassen van cellen en toevoeging aan de plaat om verdamping te voorkomen
EDTA, pH 8.0, RNase-vrijThermo Fisher ScientificAM9260Component van TAE-buffer
EthidiumbromideSigma-AldrichE1510Kleurstof voor gelelektroforese
Foetaal runderserum (FBS)Sigma-AldrichF7524Supplement toegevoegd aan DMEM
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040Kit voor in vitro transcriptie (IVT)
Leibovitz L-15 Medium, zonder fenolroodThermo Fisher Scientific21083027Medium gebruikt voor HEK293-LgBiT-kweek tijdens luminescentiemetingen
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-024Supplement toegevoegd aan DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Transfectiereagens op basis van lipiden
Lithiumchloride precipitatie-oplossingThermo Fisher ScientificAM9480Alternatieve methode voor mRNA-zuivering na IVT
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130Zuiveringskit na linearisatie van het plasmide
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrofotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WSpectrofotometer gebruikt voor het kwantificeren van de DNA- en mRNA-concentratie
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratePromegaN2570Substraat vereist voor luminescentie, toegevoegd aan L-15 medium 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612Zuivert mRNA na de IVT-reactie
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Fisher Scientific136101Plaat gebruikt voor het uitplaten van HEK293-LgBiT en daaropvolgende metingen
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985062Medium gebruikt voor de transfectiereactie
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553PCR-kit
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993RNA-ladder voor gelelektroforese
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020Sproei voor RNase-decontaminatie
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066Component van TAE-buffer
Trypsine-EDTA oplossingSigma-AldrichT4174Reagens voor cel-dissociatie
UltraPure DNase/RNase-vrij gedestilleerd waterThermo Fisher Scientific10977035Gebruikt voor de preparatie van de template en voor IVT

Referenties

  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

mRNA translatielive cell imagingin vitro transcriptieprote ne expressiedynamiekluciferase complementatieoptimalisatie van coderende sequenties5 cap modificatiemRNA therapeutica
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.