Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Celvrije in vitro mRNA-translatie in Drosophila-lysaten

380 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70844

⸱

12 juni 2026

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

In dit artikel

Samenvatting

Hier geven we details over hoe lysaten bereid kunnen worden en in vitro-vertaling worden uitgevoerd met behulp van Drosophila-embryo's .

Samenvatting

Celvrije mRNA-translatie in vitro heeft een cruciale rol gespeeld in het begrip van het eiwitsyntheseproces tijdens genexpressie bij eukaryoten. De ontwikkeling van lysaten uit verschillende systemen voor in vitro-vertaling is van cruciaal belang geweest bij het bestuderen van de rollen van de meeste componenten van de translatiemachine en bij het ontleden van vele stappen van het eiwitsyntheseproces. Verschillende aspecten van translatie en translationele controle zijn bestudeerd met behulp van Drosophila melanogaster-lysaten. Dit artikel biedt gedetailleerde protocollen voor het voorbereiden van synthetische mRNA-sjablonen, het kweken van grootschalige levende vliegenculturen, het bereiden van translatie-competente lysaten uit Drosophila-embryo's en het uitvoeren van celvrije in vitro translatiereacties. Dit protocol is geschikt voor elke soort van het geslacht Drosophila—melanogaster, virilis, pseudoscura, grimshawi, hydei, enzovoort. We vergelijken dit protocol verder met andere vertaalsystemen en bespreken beperkingen, kritieke stappen en probleemoplossing. Representatieve uitkomsten worden opgenomen om te helpen bij het beoordelen van de prestaties en reproduceerbaarheid van het protocol. Tot slot bespreken we mogelijke toepassingen in biotechnologie en onderzoek.

Inleiding

Al meer dan een eeuw heeft Drosophila bewezen een krachtig, genetisch hanteerbaar modelorganisme te zijn om vele biologische fenomenen en moleculen te bestuderen, waaronder translationele controle en de vertaalmachine 1,2,3,4. Drosophila-celvrije in vitro-translatie is een krachtig hulpmiddel geworden om eiwitsynthese te bestuderen, omdat het veel gebeurtenissen die in vivo zijn waargenomen kan recapituleeren. Drosophila is dus een ideaal systeem voor het ontdekken van nieuwe functies en moleculen die translatie en translationele controle uitvoeren. Vroege studies vestigden een in vitro, translationeel competent systeem in de vlieggerelateerde geleedpotige Artemia salina5 en later in Drosophila hydei6.

Later werden lysaten ontwikkeld die reageren op exogene mRNA's in Drosophila melanogaster. De meeste studies naar Drosophila in vitro-vertaling zijn uitgevoerd in embryo's van verschillende leeftijden, hoewel sommige variaties van de translatiereactiebuffer door verschillende onderzoeksgroepen zijn gebruikt. Ter vergelijking worden de verschillende bestudeerde fenomenen en de translatiereactiecondities in Tabel 1 vermeld. Naast embryo's zijn ook protocollen ontwikkeld voor celvrije in vitro translatie met behulp van Drosophila-oocyten 10,22,23,24,25,26 en gekweekte Schneider- of Kc-cellen lysaten. Een beschrijving van de componenten die nodig zijn voor in vitro vertaling en een vergelijking tussen lysaten van verschillende soorten worden beschreven in referenties33,34.

Hoewel het proces van mRNA-translatie behouden blijft over eukaryoten, worden significante verschillen tussen taxa vooral gevonden in de initiatiefase van de translatie, waar verschillende moleculen translatie onderdrukken of bevorderen gedurende de ontwikkeling op een taxon- of soortspecifieke manier35,36. Dit protocol is zeer geschikt om mRNA-translatie in insecten gedurende de hele ontwikkeling te bestuderen, waarvoor lysaten van fylogenetisch verre Metazoan niet kunnen worden gebruikt, inclusief de commerciële lysaten van tarwe of konijn. Dit protocol kan inderdaad de translatiegebeurtenissen die tijdens embryogenese plaatsvinden recapituleeren, iets wat niet mogelijk is bij het gebruik van oocytlysaten23. Tot nu toe is er geen vergelijking gemaakt tussen embryo-, oocyt- en gekweekte-cel Drosophila-systemen. Het toevoegen van posttranslationele modificaties aan de in vitro gesynthetiseerde eiwitten is een beperking van dit protocol in zijn huidige staat. Bovendien levert deze methode geen preparatieve hoeveelheden eiwit op in vergelijking met methoden voor het produceren van recombinante eiwitten in bacteriën.

Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen om routinematig grootschalige kooien met Drosophila-vliegen te kweken, synthetische mRNA-templates voor te bereiden, translatie-competente lysaten uit embryo's te maken en celvrije in vitro translatie-assays uit te voeren. De Materiaaltabel toont de benodigde reagentia gedurende het hele protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1) Templateplasmideconstructie voor in vitro transcriptie

  1. Selecteer plasmiden die een 5' niet-vertaald gebied (UTR), een reporter cistron, een 3' UTR en een poly(A) staart stroomafwaarts van een T7-, T3- of SP6 RNA-polymerasepromotor bevatten. Zorg ervoor dat elk construct een unieke restrictieplaats direct stroomafwaarts van de poly(A)-staart bevat voor plasmidelinearisatie vóór transcriptie (Figuur 1).
    OPMERKING: De gebruikte restrictie-enzymplaats moet zorgvuldig worden gekozen zodat de herkenningsplaats buiten de getranscribeerde sequentie ligt of een plek die het lineariseerde DNA in A laat eindigen. Bovendien moet het restrictie-enzym een bot of 5' overhang achterlaten aan het 3'-uiteinde van de template. 3'-overhangen kunnen resulteren in afwijkende transcriptieproducten. Als een enzym met een overhang van 3 voet wordt gebruikt, moet het fragment voor gebruik afgestompt worden.
  2. Controleer alle constructen door sequencing voordat je ze gebruikt als sjablonen voor in-vitro transcriptie.
    OPMERKING: Firefly luciferase (FLuc) reporterconstructies met een poly(A)71-staart zijn voor deze workflow gebruikt. De FLuc-constructies zijn afgeleid van de pLUC-cassette12. Vector- en kitinformatie staan vermeld in de Materiaaltabel.

2) In vitro transcriptie van gecappeerde en polyadenyleerde mRNA's

  1. Lineariseer elk plasmide-construct met behulp van de unieke restrictieplaats stroomafwaarts van de poly(A)-staart (hier KpnI).
  2. Verdeel het gelineariseerde DNA met 1%-agarosegelelektroforese, uitgevoerd op 100 V gedurende 1 uur.
  3. Gel het DNA en controleer de integriteit en correcte linearisatie door identieke agarosegelelektroforese.
    OPMERKING: Het is niet nodig om het lineariseerde DNA te gelzuiveren—als het DNA volledig is gesneden, is een kolomzuivering of fenolextractie/ETOH-precipitatie voldoende.
  4. Transcribeer het gezuiverde, lineariseerde DNA met een in vitro transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant. Voeg een 5' cap-analoge toe aan de transcriptiereactie om het RNA te stabiliseren en de translatie te stimuleren.
    OPMERKING: Een functioneel kap-analogo, zoals m7G(5′)ppp(5′)G RNA, ondersteunt transcriptstabilisatie en translatiestimulatie. Een niet-functionele cap-analogie, zoals G(5′)ppp(5′)A, ondersteunt transcriptstabilisatie maar geen translatiestimulatie. Deze remmer van translatie wordt gebruikt wanneer bicistronische transcripten worden vertaald om te testen op de aanwezigheid van interne ribosoom-ingangsplaatsen (IRES) die de translatie van het tweede cistron7 aansturen. Om te testen op de afhankelijkheid van een poly(A)-staart, kan deze worden verwijderd in het template-plasmide voordat de transcriptie wordt uitgevoerd.
  5. Behandel alle transcriptiereacties met RNase-vrije DNase om het DNA-sjabloon na transcriptie te verwijderen volgens de instructies van de fabrikant. Alle in vitro transcriptiekits leveren de RNase-vrije DNase.
  6. Zuiver het transcript door lithiumchlorideprecipitatie of kolomgebaseerde RNA-opruiming volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Alle in vitro transcriptiekits leveren lithiumchloride-reagentia.
  7. Kwantificeer het gezuiverde transcript met spectroscopie en beoordeel de mRNA-integriteit met 1%-agarosegelelektroforese uitgevoerd bij 100 V gedurende 1 uur.
  8. Aliquot het mRNA en bewaar het bij -70 °C tot gebruik.

3) Routinematig onderhoud van een grootschalige Drosophila-cultuur

  1. Gebruik de referentie Drosophila melanogaster wildtype-stam Oregon-R.
  2. Bereid vliegenvoer volgens een vastgesteld referentierecept.
    OPMERKING: De auteurs gebruikten het Bloomington Drosophila Stock Center recept37 als referentie voor voedselbereiding. Details van dit recept zijn te vinden in Tabel 237. Figuur 2 toont de algemene workflow van embryo-verzameling tot en met de kwantificatie van luciferase-activiteit.
  3. Zet een kubusvormige of cilindrische acrylkooi van ongeveer 1 m lang en 50 cm in diameter.
  4. Maak een gat van ongeveer 30 cm diameter in het bovenste deel van de kooi en sluit dit af met gaas (Figuur 3).
  5. Leg nat papier bovenop het gaas om water te bieden aan de vliegen, en vervang het natte papier elke dag (Figuur 3).
  6. Houd het voorste deel van de kooi open en bedekt met stof om toegang tot de binnenkant van de kooi mogelijk te maken. Plaats acryl aan de achterkant van de plastic vliegenkooi, volledig afgesloten.
  7. Versterk de vliegenpopulatie vóór het innemen van embryo's en plaats ~1.000 jonge vliegen in de kooi. Houd de kooi van de vliegen constant op 22–25 °C.
    OPMERKING: Meerdere vliegkooien van dezelfde afmetingen en vliegdichtheid kunnen tegelijkertijd worden onderhouden. Vliegen leggen ongeveer 15 dagen eieren en beginnen rond dag 20 te sterven.
  8. Voer de vliegen elke dag met agar-vruchtensapborden, belegd met een lepel gehydrateerde bakkersgist met 200 μL azijnzuur of azijn.
  9. Om de volgende generatie vliegen te vestigen, verzamel je verschillende platen van 0–12 uur oude embryo's. Plaats de embryo's in 22 cm × 17 cm × 10 cm plastic dozen met vliegenvoer tot een diepte van 3 cm. Zorg ervoor dat de dozen een gat hebben dat met gaas is afgesloten, zodat luchtcirculatie mogelijk is en larven niet ontsnappen (Figuur 4). Voeg droge actieve gist bovenop het voer toe en laat de embryo's groeien bij 25 °C.
  10. Na 3 dagen leg je gevouwen papier van 5 cm hoog in de dozen zodat larven van het derde stadium kunnen klimmen en poppen worden.
  11. Na 10 dagen plaats je de dozen met pas uitgekomen volwassen vliegen in de kooi. Laat de vliegen uit de bakken komen en paren in de kooi gedurende 2 dagen.
  12. Om embryo's van een specifieke leeftijd te verkrijgen voor lysaatbereiding, open je de kooi zorgvuldig en plaats je agar-sapplaten in de kooi voor de vereiste legperiode.
  13. Verwijder de borden en verzamel de eieren met een stapel zeef.
    OPMERKING: Voor 0–12 h-oude embryolysaten, plaats je om 8:00 uur twee agar-sapplaten in de kooi en verwijder je ze om 20:00 uur voor embryo-inhaal.
    1. Verzamel embryo's voor lysaatvoorbereiding tussen dag 3 en 10 nadat volwassen vliegen uitkomen.
    2. Tegelijkertijd verzamel je embryo's op dag 2–4 en vestig je een nieuwe generatie vliegen in voedselhoudende dozen zoals hierboven beschreven.

4) Bereiding van translatielysaten uit 0–12 h-oude Drosophila-embryo's

OPMERKING: Dit protocol omvat geen behandeling met micrococcale nuclease. Deze stap werd weggelaten om mogelijke afbraak van het exogene rapporterende mRNA te voorkomen als nuclease-inactivatie onvolledig is. Achtergrondtranslatie moet in elk experiment worden gemonitord met behulp van een no-mRNA-controle.
OPMERKING: Deze methode is afgeleid van eerder beschreven protocollen 7,12,14,15,16,17,22.

  1. Bereid de embryo-lysebuffer voor zoals beschreven in Tabel 2 en bewaar deze bij -20 °C in 1 mL aliquots.
    OPMERKING: Ontdooi elke aliquot tot 2x voor direct gebruik.
  2. Verzamel embryo's met een zeef.
    OPMERKING: Het standaardprotocol gebruikt embryo's van 0–12 h-oud, maar andere embryo-leeftijden kunnen ook geschikt zijn voor lysaatbereiding.
  3. Was embryo's uitgebreid met kraanwater en vervolgens met een embryobuffer die 0,9% NaCl + 0,03% Triton X-100 bevat.
    OPMERKING: Embryo's kunnen tot 24 uur op 4 °C worden bewaard voordat ze worden verwerkt.
  4. Dechorioneert embryo's gedurende 5 minuten in 50% embryobuffer en 50% huisbleekmiddel (natriumhypochloriet [NaOCl] 4–6% en natriumhydroxide [NaOH] 0,02–0,1%).
    VOORZICHTIG: Gebruik handschoenen en doorzichtige plastic bril bij het hanteren van bleekmiddel.
  5. Was het grondig met kraanwater. Droog embryo's met papier en weeg ze.
  6. Overbreng verpakte embryo's naar een glasweefselslijpfilter op ijs. Voeg 1 ml embryo-lysebuffer toe per 1 g embryo's. Homogeniseer de embryo's op het ijs met 20 slagen.
  7. Breng het homogenaat over naar 1,5 mL microcentrifugebuizen. Centrifugeer op 15.900 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  8. Herstel de interfase in 50 μL aliquots op ijs. Vries aliquots in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
    OPMERKING: De interfase is een troebele vloeistofoplossing tussen de boven- en bodemfase. De bovenste fase is een laag van zeer viscouse, ondoorzichtig witte lipiden. De onderste fase is een vaste pellet.
    VOORZICHTIG: Vermijd het besmetten van de interfase-oplossing door aangrenzende fasen.
    VOORZICHTIG: Gebruik handschoenen en doorzichtige plastic bril bij het hanteren van vloeibare stikstof.

5) In vitro translatiereactie

  1. Stel de translatiereacties op in een 96-wellplaat of individuele 0,2 mL PCR-buizen op een PCR-thermocycler. Bereid elke translatiereactie voor in een eindvolume van 17 μL, inclusief 5 μL embryolysaat en de resterende reactiecomponenten beschreven in Tabel 2.
    OPMERKING: Embryolysaat vertegenwoordigt 30% vol./vol. van het totale reactievolume.
  2. Als recombinante eiwitten aan de translatiereactie worden toegevoegd, dialyseer het eiwit dan tegen 20 mM HEPES-KOH pH 7,4. Selecteer het volume van de dialysecassette en de moleculaire gewichtsgrens op basis van het monstervolume en de eiwitgrootte.
    OPMERKING: De toevoeging van recombinante eiwitten is relevant voor het bestuderen van translationele repressoren of dosisafhankelijke assays met initiatiefactoren. Vermijd het toevoegen van PBS aan recombinante eiwitten die in de translatiereactie worden gebruikt. Houd glycerol op of onder 5% in het eiwitmonster of de translatiereactie. Vermijd indien mogelijk het toevoegen van glycerol aan de reactie.
  3. Denatureer het mRNA door het 2 minuten te verhitten tot 65 °C en het 2 minuten snel te koelen op ijs voorafgaand aan de in vitro translatiereactie.
  4. Voer translatie uit van elk mRNA in drievoud exemplaar. Stel de reactie als volgt op: 2,7 μL reactiecocktail (Tabel 2) + 5 μL embryolysaat + mRNA (30 ng) + H2O tot 17 μL eindvolume. Als basis-mastermix volg je de Reactie-cocktail voor één reactie in Tabel 2 en schaal je op naar het aantal uit te voeren reacties. Incubeer de reactie bij 25 °C gedurende 60 minuten.
    OPMERKING: ATP en GTP worden niet apart toegevoegd aan de hier beschreven standaardreactie. In onze handen verbeterde het aanvullen van de reactie met extra ATP/GTP de FLuc-output niet en verminderde de translatie onder de geteste omstandigheden. Daarom wordt de reactie uitgevoerd met het energieregenererende systeem beschreven in Tabel 2 zonder extra nucleotidesupplementatie.
  5. Programmeer de thermocycler met een initiële stap van 5 minuten bij 4 °C, gevolgd door 60 minuten bij 25 °C en een laatste stap van 10 minuten bij 4 °C.
  6. Stop de reactie door 20 μL koude 1× passieve lysisbuffer toe te voegen. Leg de reactie nog eens 10 minuten op ijs.
  7. Bewaar de monsters bij -20 °C of ga door met luciferase-kwantificatie.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

6) Kwantificatie van gesynthetiseerde luciferase

  1. Breng de reacties 20 minuten op kamertemperatuur voordat je de activiteit van de Flora kwantificeert.
  2. Breng 10 μL van elke translatiereactie en 50 μL luciferasesubstraat (minstens 2 uur voor gebruik) op kamertemperatuur.
  3. Voeg het luciferasesubstraat toe aan de translatiereactie. Noteer relatieve lichtunits met een automatische of handmatige luminometer. Programmeer de luminometer om 10 metingen te nemen die 1 seconden uit elkaar staan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We voerden translatiereacties uit om de efficiëntievariabiliteit te analyseren tussen zes onafhankelijke lysaatpreparaten (d.w.z. biologische herhalingen) met 0–12-h-oude embryo's. Elke maat vertegenwoordigt een technische drievoud (Figuur 5). Vergelijkbare translatie-efficiëntie werd waargenomen, zij het met enige variabiliteit. We vergeleken ook de vertaalefficiëntie tussen embryo's van verschillende leeftijden. Daarom testten we lysaten van embryo's van 0...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Drosophila-lysaten voor celvrije in vitro-translatie kunnen reproduceerbare resultaten opleveren. Embryo's op verschillende leeftijden en variaties in buffersamenstelling zijn gebruikt om een breed scala aan fundamentele fenomenen in eiwitsynthese en de bijbehorende mechanismen te onderzoeken (Tabel 1). Hier beschreven we een standaardmethode die geschikt is voor embryo's van elke leeftijd om studies op een precieze, kwantitatieve manier uit te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

N.B-Á en G.H. werden ondersteund door het intramurale financieringsprogramma van het Nationaal Instituut voor Kanker (Instituto Nacional de Cancerología, INCan), Mexico; D.E.V. is een posdoctoraal fellow van het Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) programma "Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022". Wij danken Fannis Missirlis en Bety Osorio (CINVESTAV, Mexico) voor de vliegen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AluminiumfolieReynoldsN/AStandaard huishoudelijke aluminiumfolie; elk equivalent commercieel merk acceptabel.
Mengsel van aminozurenPromegaL4461N/A
Appelcider azijnHeinzN/ACommerciële appelcider azijn (5% zuurheid); elk equivalent merk acceptabel.
Appel- of druivensapJumexN/ACommercieel druivensap; of elk equivalent commercieel merk.
Bacteriologische agarMerck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
Boorzuur (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, Molecular Biology grade, ≥99.5%, poeder; gebruikt voor de bereiding van TBE-buffer.
Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3’-O-Me-m7G(5’ )ppp(5’ )G RNA cap structuurBioLabsS1411SN/A
Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structuur analoogNew England BiolabsS1404SN/A
Cap: Niet-functionele cap analoog G(5’ )ppp(5’ )ANew England BiolabsS1406N/A
Centrifugebuis (15 mL)Corning430053N/A
Complete, EDTA-vrije protease-remmercocktailRoche11836170001N/A
Creatinefosfokinase uit konijnsspierMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
Creatinefosforzuur, dinatriumzoutMerck1120A47950N/A
Gedehydrateerde bakkersgistFleischmann’sN/ACommerciële actieve droge gist; elk equivalent merk acceptabel.
Di-ethylpyrocarbonaatMerck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
Drosophila melanogaster wild-type stam Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; mutante stammen van Drosophila melanogaster, evenals wild-type referentiestammen van andere Drosophila-soorten, zoals virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, enz. worden ook door dit Stock Center geleverd.
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS reagent, 99,4-100,6%, poeder; gebruikt voor de bereiding van TBE-buffer.
HEPESSigmaSLBH4583V99,5%(titratie)
Waterstofperoxide (H2O2)EquateN/ACommercieel (~2,5-3,5% waterstofperoxide-oplossing; elk equivalent merk acceptabel.
In vitro transcriptie mMessage mMachine T7, T3 of SP6 KitThermo Fisher ScientificAM1344 en AM1348N/A
KOAc, ook wel KCH3COO genoemdMerck/Sigma-AldrichMeerdereN/A
Lb-bouillon (lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg
Luciferase-assaysysteemPromegaE1501N/A
MAXIscript T7, T3 of SP6 in vitro transcriptiekitInvitrogenAM1316 en AM1312N/A
Mg(OAc)2, ook wel Mg(CH3COO)2 genoemdMerck/Sigma-AldrichMeerdereN/A
NaCl (natriumchloride)J.T BakerB17W53ACS Reagens
OligonucleotidenElk bedrijfN/AReeksspecifiek.
Passieve lysis 5X-bufferPromegaE1941N/A
PipetpuntenAxygenT-200-Y200 microliter gele punten.
PipetpuntenAxygenT-1000-B1 ml blauwe punten.
PipetpuntenAxygenT-3000,5-10 microliter heldere punten.
PropionzuurMerck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS reagent-kwaliteit, ≥99,5%, vloeistof.
PYREX® 5 mL glazen mortel weefselmolenPYREX®7724-5N/A
QIAprep spin plasmid miniprep-kitQiagen27106N/A
QIAquick gelextractiekitQiagen28704N/A
Konijnsreticulocytenlysaat (RRL)PromegaL4960N/A
Renilla luciferase (RLuc) assaysysteemPromegaE2820N/A
RNasin ribonuclease-remmerPromegaN2111AN/A
RNeasy minielute RNA clean up-kitQiagen74204N/A
Slide-A-Lyzer dialysecassettesThermo Scientific87735 (Hangt echter af van de moleculaire grootte van de cut-off).N/A
Natriumhypochloriet (bleekmiddel)CloroxN/ACommercieel bleekmiddel (~5-6% NaOCl); elk equivalent commercieel merk met vergelijkbare concentratie acceptabel.
SpermidineMerck85558N/A
Roestvrijstalen zeefN/AN/AElke commerciële leverancier.
Taq plus precision DNA-polymeraseStratagene600211-51N/A
Transfer ribonucleïnezuur (tRNA) uit bovien lever type XIMerck/Sigma-Aldrich9014-25-9 of R4752N/A
Tris (Tris-base)IBI ScientificIB70145Moleculair biologie kwaliteit poeder; gebruikt voor de bereiding van TBE-buffer.
Triton X-100SigmaSLBX9437Labor

Referenties

  1. Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.
  2. Hernández G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.
  3. Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.
  4. Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.
  5. Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5′-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.
  6. Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.
  7. Hernández G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.
  8. Zapata JM, Martínez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.
  9. Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.
  10. Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.
  11. Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.
  12. Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5′ and 3′ UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.
  13. Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.
  14. Vázquez-Pianzola P, Hernández G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.
  15. Hernández G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.
  16. Hernández G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.
  17. Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.
  18. Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.
  19. Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.
  20. Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.
  21. Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.
  22. Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.
  23. Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.
  24. Hernández G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.
  25. Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.
  26. Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.
  27. Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.
  28. Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.
  29. Krüger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.
  30. Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.
  31. Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.
  32. Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.
  33. Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.
  34. Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.
  35. Hernández G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.
  36. Hernández G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.
  37. Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Celvrije translatiein vitro translatieeiwitsynthesetranslatieapparaatsynthetische mRNA-templatestranslationele controleDrosophila-embryo'stranslatieprotocol
Celvrije in vitro mRNA-translatie in Drosophila-lysaten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.