Een goedkope, markerloze DeepLabCut-gebaseerde workflow voor spontane loop- en bewegingsanalyse bij vrij bewegende muizen

Samenvatting

We presenteren een goedkope, markerloze workflow met DeepLabCut om spontane gang en voortbeweging bij vrij bewegende muizen te kwantificeren. Dit protocol integreert single-camera video-opname, markerloze tracking van anatomische herkenningspunten en het extraheren van ruimtelijke temporale locomotorische parameters, waardoor een niet-invasief en toegankelijk kader wordt geboden voor motorische gedragsanalyse zonder gespecialiseerde apparatuur.

Samenvatting

Gait is een veelgebruikte functionele biomarker voor het detecteren van motorische veranderingen bij verschillende ziekten en aandoeningen, omdat het veranderingen in coördinatie, kracht, balans en sensorimotorische integratie weerspiegelt. Traditionele methoden om het loopgedrag in diermodellen te analyseren vereisen echter vaak dure apparatuur, complexe opstellingen of invasieve procedures die het natuurlijke gedrag kunnen veranderen. Hier presenteren we een goedkope, markerloze workflow gebaseerd op DeepLabCut, een open-source pose estimation software, voor de kwantitatieve analyse van gang en spontane voortbeweging bij vrij bewegende muizen. De methode is afhankelijk van enkelvoudige camera-video-opname, markerloze tracking van anatomische herkenningspunten en het extraheren van ruimtelijke temporale locomotorische parameters, zonder de noodzaak van fysieke markers of gespecialiseerde hardware. Om de toepasbaarheid van het protocol aan te tonen, werd het geïmplementeerd in het drievoudige transgene muismodel van de ziekte van Alzheimer (3xTg-AD) als een representatief voorbeeld van toepassing. Deze aanpak behoudt vrije beweging en minimaliseert stress door het hanteren, waardoor een niet-invasieve beoordeling van motorisch gedrag mogelijk is. Het protocol is compatibel met standaard gedragstestomgevingen. Al met al biedt deze methode een toegankelijk en niet-invasief kader voor kwantitatieve analyse van gang en voortgang in preklinisch onderzoek.

Inleiding

Gang is een complex motorisch proces dat ontstaat uit de realtime interactie van motorische, sensorische en cognitieve systemen, en vereist gecoördineerde verwerking van sensorische feedback, houdingscontrole, motorische planning en spieractivatie om stabiele, adaptieve beweging^{te genereren 1}. Vanwege dit integratieve karakter worden gangveranderingen steeds vaker erkend als functionele indicatoren van neurologische disfunctie, zowel in de klinische praktijk als in experimenteel onderzoek. In mensen en diermodellen maakt ganganalyse het mogelijk veranderingen in mobiliteit, valrisico, kwetsbaarheid en functionele capaciteit te detecteren, en is het voorgesteld als biomarker voor ziekteprogressie en interventieeffectiviteit bij meerdere aandoeningen ^2,3,4.

In fundamenteel onderzoek, met name in muismodellen, is het beoordelen van spontane gang en locomotorische activiteit een veelgebruikte strategie om motorische fenotypen te karakteriseren en de impact van fysiologische verstoringen en therapeutische interventies te evalueren. Objectieve kwantificering van locomotorische parameters maakt het mogelijk subtiele motorische veranderingen te detecteren die niet betrouwbaar worden vastgelegd door alleen visuele inspectie, een beperking die vooral relevant is in preklinische studies gericht op vroege of milde fenotypes⁵. In deze context is ganganalyse uitgegroeid tot een waardevol hulpmiddel om veranderingen in motorisch gedrag te onderzoeken en functionele veranderingen te identificeren die samenhangen met verschillende experimentele aandoeningen, zoals neurologische en neurodegeneratieve ziekten⁶.

De analyse van motorisch gedrag en gang in muismodellen is traditioneel gebaseerd op gespecialiseerde technologische platforms die zijn ontworpen om ruimtelijke en temporele kinematische variabelen te kwantificeren. Systemen zoals verlichte loopbruggen, instrumentatieve platforms en commerciële bewegingsvolgsoftware worden vaak gebruikt; hun afhankelijkheid van dure hardware en speciale infrastructuur beperkt echter de toegankelijkheid voor veel laboratoria ^aanzienlijk. Naast economische overwegingen brengen deze benaderingen extra experimentele beperkingen met zich mee. Verschillende systemen vereisen dat dieren smalle gangen of sterk verlichte rijstroken doorkruisen, waarbij ze geforceerde bewegingspatronen opleggen die spontaan gedrag verminderen, terwijl andere afhankelijk zijn van fysieke markeringen, verfplekken of plaklabels die aan de ledematen worden bevestigd. Dergelijke interventies kunnen stress veroorzaken, de loopmechanica veranderen en de fysiologische interpretatie van motorische uitkomsten verstoren 11,12,13,14. Gezamenlijk benadrukken deze beperkingen de noodzaak van methodologieën die in staat zijn om gang vast te leggen onder natuurlijke, vrij bewegende omstandigheden zonder gebruik te maken van invasieve procedures of dure infrastructuur.

Het evalueren van het looptempo tijdens onbeperkte voortbeweging maakt het mogelijk om meer natuurlijke motorische patronen te observeren, waarbij externe beperkingen worden vermeden die kunstmatig snelheid, traject of houding reguleren. Deze benadering vergemakkelijkt de karakterisering van locomotorisch gedrag onder minimaal beperkte omstandigheden. DeepLabCut is een open-source, op deep learning gebaseerd frame voor houdingsschatting dat convolutionele neurale netwerken gebruikt om door de gebruiker gedefinieerde anatomische herkenningspunten te volgen zonder fysieke markeringen. Door anatomische punttracking van standaard video-opnames mogelijk te maken, maakt DeepLabCut het mogelijk om kinematische parameters te extraheren, terwijl de kosten en experimentele complexiteit aanzienlijk worden verminderd 15,16,17,18. Belangrijk is dat markerloze tracking experimentele interferentie minimaliseert, waardoor het geschikt is voor studies naar spontaan gedrag. Deze enkelcamera-markerloze benadering is het meest geschikt voor studies die toegankelijke, niet-invasieve kwantificering van spontane locomotorische activiteit en tweedimensionale ganggerelateerde kenmerken onder vrij bewegende omstandigheden vereisen. Echter, instrumentele gangplatforms of driedimensionale motion capture-systemen zijn nodig wanneer directe biomechanische variabelen, zoals grondreactiekrachten, plantaire druk, gewrichtshoeken of volledige driedimensionale ledemaatkinematica, nodig zijn.

Het doel van dit artikel is om een goedkope, markerloze workflow te presenteren gebaseerd op DeepLabCut voor de niet-invasieve kwantificering van gang en spontane voortbeweging bij vrij bewegende muizen, waarbij single-camera video-opname, anatomische mijlmarkeringstracking en extractie van ruimtelijk-temporele locomotorische parameters wordt geïntegreerd binnen een toegankelijke workflow die geen gespecialiseerde hardware of invasieve manipulatie vereist. Dit protocol richt zich op de methodologische implementatie en representatieve output van de workflow.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Bio-ethische Commissie van het Instituut voor Neurobiologie, Nationale Autonome Universiteit van Mexico, onder protocol nummer 117.

1. Studiecontext

1. Gebruik muizen onder de experimentele omstandigheden die voor het onderzoek vereist zijn. In dit protocolartikel gebruiken we het drievoudige transgene muismodel van de ziekte van Alzheimer (3xTg-AD), waarbij de transgenen van APPSwe en tauP301L op een PS1M146V knock-in achtergrond worden gehuisvest, samen met niet-transgene muizen als controles, als representatief voorbeeld van workflow-implementatie.
2. Genotype alle dieren voordat de studie begint.
3. Houd muizen met voedsel en water ad libitum onder gecontroleerde omstandigheden, bestaande uit een licht-donkercyclus van 12:12 uur, een temperatuur van 22 °C ± 2 °C en een relatieve luchtvochtigheid van 60% ± 5%, onder veterinaire supervisie.
4. Opnames maken tijdens de lichtfase na een habituatieperiode van 60 minuten, waarbij per dier één openveldsessie wordt gebruikt om spontaan verkennend gedrag te behouden en verminderde activiteit door herhaalde blootstelling aan de arena te voorkomen.
   OPMERKING: In dit protocolartikel presenteren we representatieve opnames uitsluitend om de workflow en het type lokomotorische en ganguitgangen die door de methode worden gegenereerd te illustreren, in plaats van om biologische vergelijkingen tussen groepen te ondersteunen.

2. Materialen

1. Gebruik de materialen en apparatuur die in de Tabel van Materialen en Apparatuur zijn vermeld voor het vastleggen en analyseren van spontane voortbeweging en gang. Zie Figuur 1 voor de algehele assemblage van de experimentele opstelling.

3. Habituatie en registratie van spontane voortbeweging

1. Diervoorbereiding en habituatie
   1. Breng de muis zorgvuldig over van zijn verblijfsruimte naar de gedragstestruimte minstens 60 minuten voor het experiment om omgevingswenning mogelijk te maken.
   2. Houd de gedragstestruimte onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden, waaronder een constante temperatuur van 20 °C–22 °C, gestandaardiseerde lichtintensiteit (120–150 lux gemeten op arenaniveau) en continue witte ruis om externe auditieve prikkels te minimaliseren.
   3. Houd het dier tijdens de gewenningsperiode in zijn eigen kooi zonder extra prikkels of verrijking toe te voegen. Behandel dieren volgens de institutionele richtlijnen voor dierenwelzijn om stress-geïnduceerde gedragsvariabiliteit te minimaliseren.
   4. Behandel het dier met schone handschoenen en langzame, bedachtzame bewegingen. Til het dier voorzichtig op bij de basis van de staart en ondersteun het lichaam met de andere hand voordat je het in de open veld plaatst.
      Opmerking: KRITIEKE STAP: Inconsistente behandeling of onvoldoende gewenningstijd kan angstgerelateerd gedrag vergroten en variabiliteit in de bewegingsparameters introduceren. Zorg voor identieke habituatieprocedures bij alle dieren en sessies.
2. Open veld arena en cameravoorbereiding
   1. Maak voor elke opnamesessie de acryl open veld arena grondig schoon met 70% (v/v) ethanol om restgeuren en eerdere geursignalen te verwijderen. Laat het oppervlak volledig drogen voordat je het gebruikt.
   2. Hanteer 70% ethanol in een goed geventileerde ruimte, houd het uit de buurt van warmte of ontstekingsbronnen, en laat de arena volledig drogen voordat je het gebruikt.
   3. Plaats de open veld arena stevig op het houten platform, zodat de constructie stabiel en vrij van trillingen is.
   4. Controleer de transparante acrylwanden en het matte vloeroppervlak om te bevestigen dat ze vrij zijn van stof, vocht of reflecterende resten die videotracking kunnen verstoren.
   5. Plaats externe laterale witte lichtlampen aan beide zijden van de arena onder een ongeveer 30–45° hoek ten opzichte van het arenavlak om een uniforme verlichting over het opnamegebied te bieden en schaduwen, reflecties of overmatige helderheid te minimaliseren. Pas de lampplaatsing aan voor elke sessie en controleer of de verlichting op arena-niveau binnen het streefbereik van 120-150 lux blijft.
   6. Plaats de camera onder de arena in een bottomview-configuratie op een vaste afstand van ongeveer 80 cm van het arenavlak, zodat het opnamegebied volledig zichtbaar is. Let op dat deze optimale afstand mogelijk aangepast moet worden afhankelijk van het diafragma en het gezichtsveld (FOV) van de specifieke camera om volledige arenadekking te behouden.
   7. Verbind de camera met het computersysteem en start de video-opnamesoftware voordat het dier wordt geïntroduceerd.
   8. Pas de camerafocus en het gezichtsveld aan om ervoor te zorgen dat het hele arena-oppervlak zichtbaar en scherp wordt afgebeeld.
   9. Verkrijg een referentiebeeld voor ruimtelijke kalibratie door het schaakbordraster of kalibratiepatroon met bekende afmetingen op het arenavlak te plaatsen.
      OPMERKING: KRITIEKE STAP: Nauwkeurige camera-uitlijning, vaste cameraafstand en consistente verlichting zijn essentieel voor een betrouwbare schatting zonder markers. Afwijkingen in geometrie of lichtomstandigheden kunnen de nauwkeurigheid van het volgen verminderen en de gegevensvergelijkbaarheid tussen sessies verminderen.
      OPMERKING: Alternatieve materialen, waaronder roestvrij staal, kunnen worden gebruikt voor de externe steunconstructie, mits de opstelling stabiel blijft en de uitlijning van de registratie behouden blijft.
      OPMERKING: Een ondoorzichtige arena of alternatieve wandmaterialen kunnen ook worden gebruikt, vooral wanneer extra controle over externe visuele input wenselijk is, mits de opname-opstelling stabiel blijft en externe visuele interferentie wordt geminimaliseerd.
      OPMERKING: De arena-afmetingen die in dit protocol worden gebruikt, komen overeen met de configuratie die wordt gebruikt voor het opnemen van vrij bewegende muizen. Deze afmetingen kunnen worden aangepast volgens het gebruikte knaagdier en het aangenomen open-veld protocol, mits volledige dierzichtbaarheid, ruimtelijke kalibratie en consistente acquisitieomstandigheden worden gehandhaafd.
3. Opname van spontane locomotorisch gedrag
   1. Voordat je de muis in de arena plaatst, toon je kort de dierenidentificatie in het videoframe om een directe visuele associatie te garanderen tussen de opname en de bijbehorende experimentele sessie.
   2. Start video-opname voordat je de muis in het midden van de open veld arena plaatst, zodat het eerste verkennende gedrag vanaf het begin van de sessie wordt vastgelegd.
   3. Plaats de muis voorzichtig in het midden van de open veldarena.
   4. Neem spontane voortbeweging continu 3 minuten op zonder visuele, auditieve of tactiele verstoringen te introduceren. In het huidige protocol werd per muis slechts één opnamesessie uitgevoerd.
   5. Monitor de live videofeed op het computerscherm om ononderbroken opname en correcte opname van de bewegingen van het dier te bevestigen.
   6. Controleer periodiek de uitlijning van de camera en de uniformiteit van verlichting tussen sessies om consistente opnamecondities tussen dieren te waarborgen.
   7. Aan het einde van de opnameperiode stop je met de video-opname en haal je het dier voorzichtig uit de arena met dezelfde hierboven beschreven behandelingsprocedure.
   8. Breng het dier terug naar zijn thuiskooi en laat het rusten voordat verdere ingrepen plaatsvinden.
      OPMERKING: Vermijd het verplaatsen van het dier tijdens de opname, omdat externe interferentie spontane looppatronen kan veranderen en de downstream analyse kan beïnvloeden.
4. Opschonen, gegevensopslag en sessievoltooiing
   1. Maak de open arena na elke sessie opnieuw schoon met 70% (v/v) ethanol en laat het volledig drogen voordat je het volgende dier introduceert.
   2. Zorg ervoor dat er geen restanten van ethanol of geur op het arenaoppervlak achterblijven voordat je het volgende dier introduceert.
   3. Documenteer direct na elke opname de dieridentificatie, sessiedatum en -tijd, experimentele toestand en operatornaam.
   4. Als extra dieren worden getest, herhaal je de procedure vanaf stap 3.1.1 onder identieke omgevings- en experimentele omstandigheden.
   5. Sla elk videobestand op in een speciale map met behulp van een gestandaardiseerde naamgevingsconventie (bijvoorbeeld AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
   6. Aan het einde van de experimentele dag schakel je het camerasysteem en de verlichtingsapparatuur uit om drift in de verlichtingsinstellingen tussen sessies te voorkomen.
      OPMERKING: Hoewel 70% ethanol werd gebruikt in het huidige protocol omdat het een veelgebruikt desinfectiemiddel is in dit type procedure, kunnen acrylcompatibele desinfectiemiddelen ook worden gebruikt om progressieve oppervlaktedegradatie te voorkomen, mits de arena volledig droog en vrij is van restgeur vóór de volgende opname.
      OPMERKING: Indien mogelijk kunnen meerdere arena's worden voorbereid om direct wisselen tussen sessies mogelijk te maken en om de continue voortgang van het experiment tussen dieren te faciliteren.
      Zie Figuur 1 voor de materialen en assemblage van de experimentele opstelling, inclusief het houten platform (Figuur 1A), de acrylarena (Figuur 1B), het laterale verlichtingssysteem (Figuur 1C), de positie van de onderste camera (Figuur 1D) en de volledige experimentele opstelling (Figuur 1E).

Figuur 1: Experimentele opstelling voor video-opname van voortbeweging in de open veldarena. (A) ondersteuningsstructuur voor de arena; (B) acryl open veld arena geplaatst op het platform; (C) laterale verlichting om gelijkmatige verlichting te waarborgen; (D) camerapositionering voor het opnemen van beweging van onderaf; (E) complete opzet. Witte pijlpuntjes geven de orientatie van de lichtbron in Figuur 1C aan en van de camera in Figuur 1D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Videoverwerking en kinematische analyse

1. Videovoorbereiding en kwaliteitscontrole
   1. Verzamel ruwe video's in . MOV-formaat en deze omzetten naar .avi formaat voor compatibiliteit met DeepLabCut, terwijl constante framerate- en resolutieparameters behouden blijven.
   2. Baacte direct na de acquisitie alle ruwe videobestanden in een speciale map op de analysecomputer en paste een gestandaardiseerde naamgevingsconventie toe (bijvoorbeeld AnimalID_Session_Date).
   3. Bekijk elke video in zijn geheel om te bevestigen dat de opname compleet is en vrij van onderbrekingen, weggelaten frames of corruptie. Video's met acquisitiefouten moeten worden uitgesloten van de analyse.
   4. Converteer de video's naar MP4 (H.264) of ongecomprimeerd AVI-formaat als het originele formaat niet compatibel is met DeepLabCut.
   5. Optioneel kun je temporele bijsnijden van het videomateriaal om niet-experimentele intervallen aan het begin en einde van de sessie te elimineren (bijvoorbeeld tijdens het introduceren of verwijderen van het dier uit de experimentele arena).
   6. Bevestig dat de resolutie en framerate overeenkomen met de tijdens de opname gebruikte acquisitieparameters en consistent blijven over alle sessies.
   7. Controleer dat het gehele arena-oppervlak zichtbaar is binnen het videoframe en dat geen lichaamsdelen permanent worden geblokkeerd tijdens het voortbewegen.
   8. Place alle geverifieerde en verwerkte video's in een aangewezen projectmap voor DeepLabCut-analyse.
      OPMERKING: KRITIEKE STAP: Inconsistente framerates, gedeeltelijke zichtbaarheid van de arena of bewegingsonscherpte verminderen direct de nauwkeurigheid van de tracking. Video's die niet aan kwaliteitscriteria voldoen, mogen niet worden opgenomen in modeltraining of inferensie.
2. Projectcreatie en configuratie
   1. Wijs een videobibliotheek aan voor het project, waarbij je ofwel dezelfde video's gebruikt die bedoeld zijn voor analyse of een representatieve subset voor netwerktraining.
   2. Start de Python-omgeving en importeer het DeepLabCut-pakket.
   3. Maak een nieuw DeepLabCut-project aan met het commando:
   4. deeplabcut.create_new_project('ProjectNaam','Auteur','VideoPad').
   5. Definieer de anatomische herkenningspunten (lichaamsdelen) van belang in het config.yaml-bestand, zodat duidelijke en anatomisch consistente definities worden gegarandeerd.
   6. Definities van lichaamsdelen moeten geoptimaliseerd zijn voor de experimentele vraag en identiek blijven bij alle dieren en sessies.
3. Frame-extractie en labeling van carrosseriedelen
   1. Specificeer start, stop, numframes2extract en cropping_parameters in het config.yaml-bestand volgens videolengte en ruimtelijke indeling.
   2. Haal representatieve frames uit met behulp van: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'automatisch', 'kmeans'/'uniform').
   3. Bekijk de geëxtraheerde frames om te bevestigen dat er variatie in lichaamshouding, oriëntatie, ledemaatpositie en loopfasedekking over de opname heen is opgenomen. Als specifieke houdingen, ledemaatconfiguraties of bewegingsfasen ondervertegenwoordigd zijn, haal dan extra frames uit om deze omstandigheden beter te representeren.
   4. Wanneer specifieke loopcyclusfasen nodig zijn, haal handmatig frames uit met behulp van: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'handmatig').
   5. Start de grafische labelinterface met: deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. Label alle vooraf gedefinieerde anatomische herkenningspunten die in Figuur 2 worden getoond, inclusief het representatieve videoframe tijdens de verwerving (Figuur 2A), de geautomatiseerde lichaamspuntdetectie die op het originele frame is gelegd (Figuur 2B), en de schematische weergave van de gedefinieerde lichaamsherkenningspunten en arenareferentiepunten die voor de analyse zijn gebruikt (Figuur 2C). Volg consistente anatomische criteria (bijv. neus: voorste punt van de snuit; staartbasis: verbinding tussen de wervelkolom en de staart)
   7. Label alle vier de ledematen consequent door elk herkenningspunt in het midden van de poot boven de plantaire pads bij het contact van de grond te plaatsen.
   8. Sla de labels op en inspecteer ze met: deeplabcut.check_labels(config_path), en corrigeer indien nodig onnauwkeurige annotaties.
   9. Vraag indien mogelijk een tweede getrainde evaluator om een subset frames te labelen om de consistentie tussen de beoordelaars te beoordelen.
      OPMERKING: KRITIEKE STAP: Inconsistente of anatomisch onnauwkeurige etikettering is een belangrijke bron van downstream trackingfouten. Zorg voor strikte naleving van landmark-definities over alle frames.
4. Neuraal netwerktraining
   1. Train het poseschattingsmodel voor 200 epochs en verkrijg een definitieve gemiddelde trainingsfout (RMSE) van 3,27 pixels en een gemiddelde testfout van 3,59 pixels, wat overeenkomt met stabiele trackingprestaties onder de beschreven acquisitieomstandigheden.
   2. Maak de trainings- en evaluatiedatasets aan met behulp van: deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. Pas de Training Fraction-parameter in config.yaml aan om het aandeel afbeeldingen te definiëren dat voor training wordt gebruikt.
   4. Controleer de beschikbaarheid van de GPU door te draaien: nvidia-smi.
   5. Begin met netwerktraining met: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, epochs=200).
   6. Monitor het trainingsverlies en stop de training zodra de verlieswaarden stabiel zijn en er geen verdere verbetering wordt waargenomen.
   7. Als de training wordt onderbroken, ga je verder vanaf het laatst opgeslagen checkpoint.
   8. Evalueer het getrainde model met: deeplabcut.evaluate_network(config_path) en registreer de gemiddelde pixelfout.
   9. Als de fout de acceptabele drempel voor de experimentele opstelling overschrijdt, voeg dan extra gelabelde frames toe of verfijn de annotaties en herhaal de training.
      OPMERKING: Acceptabele pixelfoutdrempels kunnen variëren afhankelijk van de cameraresolutie en de grootte van de arena, maar moeten consistent blijven tussen experimenten.
5. Videoanalyse en gangkwantificatie
   1. Beschouw punten met een likelihoodwaarde onder 0,3 als ontbrekend.
   2. Lineaire interpolatie van ontbrekende punten alleen wanneer de gaten ≤3 opeenvolgende frames beslaan; Sluit langere gaten uit de analyse.
   3. Definieer bewegingsbewegingen met een lichaamsmiddensnelheidsdrempel van 10 cm/s.
   4. Sluit bewegingen onder deze drempel en tijdelijke gebeurtenissen korter dan 3 frames uit.
   5. Voer inferentie uit op experimentele video's met: deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=Waar).
   6. Genereer gelabelde video's met: deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]) om de trackingkwaliteit visueel te bevestigen (Figuur 2).
   7. Stel de pcutoff-parameter in config.yaml in op 0.6 om een betrouwbaarheidsdrempel toe te passen tijdens het volgen van visualisatie en evaluatie.
   8. Importeer de uitvoer-CSV-bestanden in de statistische computeromgeving die in de Materiaaltabel is vermeld, samen met het bijbehorende analysepakket en de aangepaste scripts die in Aanvullend Materiaal 1 zijn geleverd voor gedragskwantificatie.
   9. Converteer frame-indices naar tijd met behulp van de oorspronkelijke videosamplefrequentie.
   10. Kalibreer ruimtelijke afmetingen door pixelcoördinaten om te zetten in fysieke eenheden met behulp van de bekende arena-afmetingen en de getrackte oriëntatiepunten van de arenahoek.
   11. Voer kwaliteitscontrole uit op de gevolgde coördinaten vóór metrische extractie.
   12. Beschouw punten met een likelihoodwaarde onder 0,3 als ontbrekend en vervang ze indien nodig door lineaire interpolatie.
   13. Identificeer uitschieters tijdens visuele inspectie en corrigeer of sluit ze uit wanneer nodig.
   14. Definieer gangsegmenten met behulp van gesynchroniseerde kinematische criteria op basis van lichaamscentrumverplaatsing en beweging van de achterpoot.
   15. Sluit niet-locomotorisch gedrag uit, zoals opstaan, draaien en verzorgen.
   16. Kalibreer en verfijn handmatig de definitiedrempels volgens de experimentele omstandigheden en het diermodel om alleen robuuste, continue bewegingsbewegingen voor analyse te behouden.
   17. Bereken gangmeetwaarden afgeleid van geometrische en temporele relaties tussen gevolgde herkenningspunten met behulp van de gefilterde continue locomotorsegmenten (Tabel 1). Deze omvatten paslengte, staplengte, stapbreedte, cadens, pasduur, stapduur, stancetijd, swingtijd, ipsilaterale amplitude en ledemaat-specifieke verplaatsingsmetingen.
   18. Haal open veld-metrics uit de volledige registratie met dezelfde trackinggegevens (Tabel 1). Deze omvatten de totale afgelegde afstand, gemiddelde snelheid, tijd besteed aan bewegen, percentage van de tijd die aan bewegen wordt besteed, het aantal en de duur van wandelsessies, en de cumulatieve afstand die in het midden, de periferie en de hoek wordt afgelegd.
   19. Compileer alle uitvoer in een gestructureerd masterbestand voor downstream statistische analyse.
   20. Genereer visuele representaties (bijv. trajecten, heatmaps, tijdgebaseerde verplaatsing, looppatronen en coördinatieplots tussen ledematen) met behulp van de computationele omgevingen die in de Table of Materials en de hierboven beschreven plottscripts zijn vermeld.
   21. Vertegenwoordigende gesynchroniseerde visualisaties van puntvertrouwen, detectie van gangpartijen, classificatie van verkennende zones en coördinatie tussen ledematen zijn beschikbaar in de Aanvullende Video 1 en Aanvullende Video 2 om de interpretatie van de analytische workflow te vergemakkelijken.
6. Kwaliteitscontrole en data-back-up
   1. Bekijk visueel een willekeurige subset van gelabelde video's om de anatomische consistentie tussen frames en sessies te bevestigen.
   2. Vergelijk voorspelde mijlpaalposities met geannoteerde labels om de stabiliteit en generalisatie van het model te verifiëren.
   3. Sla een volledige kopie van het project op, inclusief config.yaml, originele labels, getrainde netwerkgewichten en uitvoerbestanden.
   4. Documenteer de softwareversies die in de workflow worden gebruikt, waaronder DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA en de statistische computeromgeving, samen met GPU-specificaties en de analysedatum.
   5. Genereer een samenvattend rapport van gemiddelde fouten en verwerkingstijden uit evaluation-results.csv.
   6. Maak een back-up van het hele project naar een lokaal archief en naar een institutionele server of beveiligde cloudopslag.
7. Computationele omgeving en reproduceerbaarheidsbronnen
   1. Leg originele video-opnamen vast in . MOV-formaat met een resolutie van 1080 × 1920 pixels en ongeveer 60 FPS.
   2. Vooraf verwerken en transcoderen van de video's naar .avi formaat.
   3. Tijdens deze conversiestap snijd je het interessegebied bij, verander je het formaat naar een vierkante resolutie van 720 × 720 pixels, en standaardiseer je de framerate naar een constante 60 FPS om een nauwkeurige temporele kwantificering te garanderen tijdens de daaropvolgende kinematische analyse.
   4. Implementeer de markerless tracking workflow met DeepLabCut versie 3.0.0rc13 in een Python-omgeving geconfigureerd met Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 en CUDA 11.8.
   5. Train het poseschattingsmodel voor 200 epochs en verkrijg een uiteindelijke gemiddelde trainingsfout (RMSE) van 3,27 pixels en een gemiddelde testfout van 3,59 pixels.
   6. Voer post-tracking analyse uit met behulp van de statistische computeromgeving en de aangepaste scripts die in Supplementary Material 1 zijn verstrekt voor gang- en open-veld kwantificatie.
   7. Gebruik een lichaamsmiddensnelheidsdrempel van 10 cm/s om wandelsessies te identificeren. Vul gaten tot 3 frames tussen de lokomotorische epochs op en sluit transiënte bewegingen korter dan 3 frames uit om continue loopsegmenten voor analyse te behouden.
   8. Geef de relevante config.yaml-instellingen, representatieve analysescripts, voorbeeldvideo- en trackingbestanden, en modelgewichten in Supplementary Material 1.
   9. Geef aanvullende implementatiedetails, modelevaluatiemetrics, hardwarespecificaties en case-specifieke analyseparameters in Aanvullende Materiaal 1, waar van toepassing.
      OPMERKING: Pas deze parameters aan volgens de verwervingsvoorwaarden die in elk experiment worden gebruikt.

Figuur 2: Representatieve workflow voor markerloze lichaamspunttracking en loopanalyse op basis van video-opnames. (A) Representatief videoframe van een muis die vrij beweegt binnen de open veldarena tijdens acquisitie. (B) Voorbeeld van geautomatiseerde lichaamspuntdetectie overgelegd op het oorspronkelijke videoframe na pose-schatting, waarbij de anatomische herkenningspunten worden geïllustreerd die voor de analyse worden gebruikt. (C) Schematische weergave van de gedefinieerde lichaamsherkenningspunten en arena-referentiepunten die worden gebruikt voor gangreconstructie, ruimtelijke kalibratie en kwantitatieve locomotorische analyse. Herkenningspunten en arena-referentiepunten: snuit, keel, lichaamsmidden, lichaamsmidden links (bcl), lichaamsmidden rechts (bcr), linkerheup (hipl), rechterheup (hipr), staartbasis, staartmidden, staartpunt, linker voorpoot (lfp), linkerachterpoot (lhp), rechtervoorpoot (rfp), rechterachterpoot (rhp), linkerboven links (tl), bovenboven rechts (tr), onderste linker (bl), en onderste rechter (br). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Na toepassing van de volg- en analyseworkflow reconstrueerde geautomatiseerde verwerking spontane openveld-locomotie met behulp van het gedefinieerde lichaamsmidden en genereerde kwantitatieve output die geschikt waren voor downstream analyse. Representatieve trajectgrafieken illustreren hoe het protocol ruimtelijke verplaatsing over de arena, temporele bezetting en snelheidsdynamiek tijdens vrije verkenning vastlegt. De open veldvariabelen die in deze sectie worden getoond, zijn berekend uit de volledige opname, en repr...

Discussie

Deze studie presenteert een goedkope, markerloze benadering voor het analyseren van spontane voortbeweging en gang bij vrij bewegende muizen met behulp van standaard video-opname en DeepLabCut-gebaseerde poseschatting binnen een toegankelijke workflow. De workflow maakt het mogelijk om bewegings- en ganggerelateerde variabelen uit video-opnames te halen, terwijl natuurlijk bewegingsgedrag behouden blijft en experimentele interferentie wordt verminderd. In die zin biedt het protocol een p...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
70% ethanol	Generic	N/A	Arena schoonmaken tussen sessies
Instelbare witte lichtlampen	Generic	N/A	Constante verlichting handhaven (100–150 lx)
Zwarte gordijnen/reflectiecontrole	Generic	N/A	Verminder extern licht/reflecties
Vierkantjesraster sjabloon	Generic	N/A	Referentieafbeelding voor ruimtelijke kalibratie
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	Open-source	N/A	Pose-schattingssoftware
Digitale videocamera (HD, 16:9; ≥60 fps)	Generic	N/A	Vaste instellingen voor alle sessies
Nvidia GPU-werkstation	Op maat gemaakt	N/A	Hardware voor modeltraining/inferentie
Luxmeter	Generic	N/A	Verlichting controleren op arena-niveau
PyTorch	Pytorch Foundation	N/A	Framework vereist door DeepLabCut
Transparante acryl open-veldarena (42 × 42 × 42 cm)	Op maat gemaakt / Intern	N/A	Open-veldarena
Camerabeugel onder de arena (90° zicht)	Op maat gemaakt / Intern	N/A	Stabile montage voor onderste opname
CUDA	Nvidia Corporation	N/A	GPU-versnelde parallelle verwerking
R programmeertaal	R Foundation	N/A	Programmeertaal voor gegevensanalyse