Murien model voor selectieve doorsnijding van autonome zenuwen in de darmen

Samenvatting

Dit protocol is bedoeld om precieze, selectieve doorsnijding van sympathische en parasympathische zenuwen die de darm innerveren bij muizen gebruiken, waarbij de arteria superior mesenterica als een consistent anatomisch herkenningspunt dient, en zo een gefocust en reproduceerbaar model biedt om autonome regulatie van darmfysiologie en ziekte te bestuderen.

Samenvatting

Autonome zenuwen bestaan uit het sympathische en parasympathische systeem, die grotendeels antagonistisch werken om diverse fysiologische functies te reguleren. Met de groeiende interesse in de rollen van autonome innervatie in de darmfysiologie en pathologie is er een groeiende behoefte aan experimentele modellen die precieze manipulatie van darmgestuurde sympathische en parasympathische input mogelijk maken. Hier presenteren we een chirurgisch protocol om selectief de sympathische en parasympathische zenuwen die de darm innerveren te transecteren. Met behulp van de arteria superior mesenterica (SMA) als reproduceerbaar anatomisch herkenningspunt maakt deze aanpak een betrouwbare identificatie van intestinale autonome zenuwbundels en de daaropvolgende gerichte doorsnijding mogelijk. In tegenstelling tot bredere denervatiebenaderingen zoals ganglionectomie of subdiafragmatische vagotomie, is deze aanpak bedoeld om een meer anatomisch gelokaliseerde doorsnijding van door de darm gerichte autonome bundels te bereiken, wat kan helpen om extra-darminterferentie te verminderen. De blessure is beheersbaar en gaat meestal gepaard met minimale bloedingen, wat de procedurele consistentie en het herstel na de operatie ondersteunt. Hoewel de operatie passende microchirurgische training vereist, is het protocol aanpasbaar, waardoor gebruikers belangrijke parameters kunnen afstemmen op specifieke experimentele doelen. Belangrijk is dat dit model een praktisch platform biedt om de rollen van sympathische en parasympathische zenuwen bij het reguleren van de darmfunctie onder zowel fysiologische als ziektecondities te onderzoeken. Dit artikel heeft als doel de procedure in detail te beschrijven om de toepassing ervan door nieuwe gebruikers in hun onderzoek te vergemakkelijken.

Inleiding

Het maag-darmkanaal staat onder continue controle van het autonome zenuwstelsel (ANS), met sympathische en parasympathische routes die fundamentele aspecten van de darmfysiologie coördineren, waaronder motiliteit, secretie, functie van de epitheelbarrière en immuunhomeostase ^1,2. In de dikke darm kunnen extrinsieke sympathische inputs regio-afhankelijke effecten uitoefenen over meerdere cellulaire compartimenten, wat onderstreept dat brede ANS-verstoringen locatie-specifieke intestinale fenotypes¹ kunnen verhullen. Omgekeerd worden parasympathische circuits, klassiek gemedieerd door vagale signalering en downstream cholinerge mechanismen, steeds meer erkend als essentieel voor het behouden van het immuunbalans in de intestinale darmen en het vormen van mucosale reacties, wat experimentele strategieën verder motiveert die sympathische versus parasympathische bijdragen met anatomische precisie kunnen ontwarren².

Naast fysiologische regulatie is autonome activiteit naar voren gekomen als een relevante modificator van de darmziektebiologie, waaronder darmkanker (CRC). Recent werk in CRC toont een bidirectioneel sympathisch zenuw–mesenchymal programma aan, waarin β2-adrenerge signalering en NGF-expressieve kankergeassocieerde fibroblasten neurale–stromale interacties versterken en tumorprogressie bevorderen, wat direct bewijs levert dat sympathische circuits functioneel gekoppeld kunnen worden aan CRC-pathogenese³. Tegelijkertijd is cholinerge signalering in verband gebracht met CRC-groei en tumorgeassocieerde immuunkenmerken, zoals aangetoond door farmacologische remming van muscarinereceptor 3 in een orthotope muismodel en door het koppelen van cholinerge signalering met immuuncontrolepuntexpressie en andere kwaadaardige kenmerken ^4,5. Belangrijk is dat autonome invloeden op darmziekten ook kunnen samenkomen met andere modulatoren, zoals psychologische stress en de darmmicrobiota. Het enterisch zenuwstelsel kan stresssignalen doorgeven aan darmontsteking⁶, en microbiële signalen kunnen darm-hersencircuits activeren die darm-extrinsieke sympathische neuronen afstemmen, wat gezamenlijk een multifactorieel kader ondersteunt waarin neurale regulatie samenkomt met immuun- en microbiële ecologie ^6,7.

Deze convergerende bewijzen benadrukken de noodzaak van experimentele benaderingen die darmgestuurde autonome effecten met voldoende anatomische precisie kunnen isoleren om causale inferentie te ondersteunen in zowel fysiologische als pathologische contexten. Ondanks snelle vooruitgang in circuitmapping en neuromodulatie blijven veel veelgebruikte interventies beperkt in orgaanspecificiteit. Systemische farmacologische manipulatie, chemische sympathectomie en subdiafragmatische vagotomie kunnen brede autonome outputs beïnvloeden en daarmee immuun- en metabole setpoints buiten de darm veranderen, waardoor causale toewijzing aan colon-specifieke neurale input^{wordt bemoeilijkt 8}. Zo kunnen vagale circuits de productie van inflammatoire cytokinen^{onderdrukken 9}, en kan vagale stimulatie de endocriene functie van de alvleesklier en de celdynamiek β moduleren, wat illustreert dat upstream of niet-selectieve interventies extra-intestinale effecten kunnen introduceren die de interpretatie van intestinale fenotypes¹⁰ verstoren. Deze beperkingen zijn vooral belangrijk voor studies die proberen colon-beperkte autonome mechanismen in fysiologie en pathologie te isoleren. Het algemene doel van de methode is daarom om anatomisch geleide, selectieve doorsnijding van darmgestuurde sympathische en parasympathische vezels bij muizen mogelijk te maken, waarmee een praktisch model wordt geboden voor het onderzoeken van de autonome regulatie van de intestinale intestinale regulatie met verminderde off-target impact.

Samenvattend rapporteert dit protocol een preciezere autonoome denervatie van de muisintestinale invadering met minimale verstoring van de autonome innervatie van andere buikorganen, waardoor de interpreteerbaarheid wordt verbeterd door mogelijke bias door extra-intestinale orgaaneffecten te verminderen.

Protocol

Alle dierlijke procedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University (nr. 24-2026). Volwassen wildtype mannelijke C57BL/6J muizen werden in deze studie gebruikt (8–10 weken oud, 20–30 g). Gedetailleerde informatie over reagentia en apparatuur is te vinden in de Materiaaltabel.

Inclusiecriteria: Muizen van dezelfde stam, geslacht en leeftijdscategorie werden in elk experiment gebruikt om biologische variabiliteit te minimaliseren. Alleen gezonde dieren die normale activiteit, verzorgingsgedrag, voedsel- en waterinname en ontlasting tijdens de acclimatisatieperiode vertoonden, werden opgenomen. Daarnaast werden muizen minstens 7 dagen gewend aan de dierenfaciliteit voor de operatie.

Exclusiecriteria: Muizen werden uitgesloten bij ongecontroleerde bloedingen of ernstig vasculair letsel tijdens de operatie, darmperforatie of significante weefselschade die onverenigbaar is met overleving. Dieren die niet herstelden van de narcose, gedefinieerd als niet binnen 2 uur na de operatie bewegend, werden ook uitgesloten. Aanvullende uitsluitingscriteria waren postoperatieve complicaties zoals aanhoudende wonddehiscentie, ernstige infectie of gewichtsverlies van meer dan 15% binnen 48 uur of 20% over een periode van 72 uur. Muizen met chirurgische verkeerde identificatie van de zenuwtak, bevestigd door post-hoc histologische evaluatie, werden ook uitgesloten van de studie.

1. Preoperatieve voorbereiding

1. Steriliseer alle chirurgische instrumenten.
2. Dien preventieve analgesie toe aan alle muizen 30 minuten voor de operatie om pijngevoeligheid te voorkomen. Dien meloxicam toe (5 mg/kg lichaamsgewicht) via subcutane injectie.
3. Verwarm het verwarmingskussen voor tot 37 °C en plaats het onder het operatieplatform.
4. Besproei het operatiegebied (inclusief de inductiekamer voor de anesthesie) met 75% ethanol en veeg grondig af met papieren handdoeken. Leg voldoende keukenpapier op de bodem van de inductiekamer.
5. Controleer de anesthesie-inductiekamer en slang om te bevestigen dat er geen lekkages zijn. Vul bij en zorg voor een voldoende voorraad isoflurane. Induceer anesthesie met 3%–3,5% isoflurane toegediend in 1 L/min zuurstof. Houd de muis continu in de gaten; Een chirurgisch vliegtuig wordt meestal binnen 1–2 minuten bereikt.
6. Plaats de muis in rugligging met alle vier de ledematen volledig uitgestrekt en zet vast met hypoallergene tape. Pas de neuskegel vast en zet vast. Verlaag isofluraan tot 1,5%–2,5% voor onderhoud. Beoordeel de anesthesiediepte aan de hand van het ontbreken van een pedaalterugtrekkingsrespons (geen reactie op het knijpen van de teen) en regelmatige ademhaling (55–65 ademhalingen/min).
   OPMERKING: Tijdens langdurige microchirurgische ingrepen wordt de diepte van de anesthesie continu gecontroleerd voorbij het oorspronkelijke chirurgische niveau. Naast het beoordelen van de terugtrekkingsreflex en ademhalingsfrequentie elke 5–10 minuten, monitoren we het ademhalingspatroon (bijv. regelmaat en diepte) en hartslag via visuele observatie of contact met de thoracale wand. De kleur van het slijmvlies (beoordeeld aan de poten of lippen) wordt ook periodiek gecontroleerd om voldoende zuurstofvoorziening te garanderen. Als de muis tekenen vertoont van een lichter wordende anesthesie, zoals een verhoogde ademhalingsfrequentie (>80 ademhalingen/min), spontane bewegingen of een terugkeer van de pedaalreflex, wordt de isofluranconcentratie in stappen van 0,25%–0,5% verhoogd totdat een adequaat chirurgisch vlak is hersteld. Omgekeerd, als de ademhaling oppervlakkig of onregelmatig wordt, of als de hartslag sterk daalt, wordt isofluraan met 0,25%–0,5% verminderd totdat de cardiorespiratoire functie weer stabiel is. Deze dynamische aanpassing zorgt ervoor dat de muis gedurende de procedure op een geschikte anesthesiediepte blijft, terwijl cardiorespiratoire depressie wordt geminimaliseerd.
7. Breng oogzalf aan op beide ogen om hoornvliesuitdroging en letsel onder narcose te voorkomen.
8. Scheer het buikhaar van het niveau van de schaamsymfyse tot het gebied onder de ribrand met een elektrische haarscheerapparaat. Vervolgens verplaats je het operatieplatform onder een stereomicroscoop.
9. Desinfecteer de operatieplaats met povidon-jodiumwattenuitstrijkjes in een naar buiten, concentrisch patroon (van het midden tot de periferie), waarbij het gebied wordt bedekt van onder de xiphoid tot de symfyse pubis en lateraal tot beide flanken. Herhaal het 3 keer. Veeg daarna op dezelfde manier met 70% ethanol. Zorg ervoor dat het veld vrij is van los haar.
10. Draag een chirurgisch mondkapje en wegwerpmuts, draag een steriele operatiejas en doe steriele handschoenen aan.
11. Bedek de muis met een steriel, geënterend doek. Pas de fenestratie aan op ongeveer 2 × 3 cm en lijn deze uit met de buikmiddenlijn om het operatieveld volledig bloot te leggen. Zet de vier hoeken van het gordijn vast.

2. Laparotomie en blootstelling

1. Met steriele tang tilt je voorzichtig een kleine huidplooi net zo schedelend naar de schaamsymfyse op. Met een steriele scherppuntschaar maakt u een kleine initiële incisie bij de top (~0,3 cm), en verlengt vervolgens de huidincisie kraniaal langs de middenlijn met 1,5–2,0 cm.
   OPMERKING: Nadat je de scherpe schaartips in de eerste opening hebt gestoken, draai je de punten omhoog en voer je een gecontroleerde "duw-knip" uit langs de onderzijde van de huid om te voorkomen dat je te diep snijdt en de buikspieren of ingewanden beschadigt. Gebruik een tang en een schaar om het losse subcutane bindweefsel van de onderliggende buikwandspieren bot te ontleden. Dissectie iets breder dan de huidincisie om verdere blootstelling te vergemakkelijken.
2. Ongeveer 0,5 cm caudaal van het xiphoïde uitsteeksel steek je voorzichtig de uiteinden van de steriele fijne pincet in de linea alba en tilt een klein weefsel op.
3. Met steriele, scherppuntige schaar maak je een kleine opening (2–3 mm) op de opgetilde plek. Op dit punt zouden het gladde buikvlies en/of onderliggende organen (bijvoorbeeld een leverkwab) zichtbaar moeten zijn.
4. Steek één mesje van een steriele, stomp getipte schaar in de buikholte in, zodat deze dicht tegenover de buikwand blijft. Bij directe visualisatie verleng je de incisie langs de linea alba richting de schedelrichting totdat de totale lengte overeenkomt met de huidincisie.
   OPMERKING: Houd de schaartip overal naar boven gericht en ga alleen onder direct zicht te werk om te voorkomen dat er darmlussen of bloedvaten onder de schaar zitten.

3. Identificatie van de arteria superior mesenteria en zenuwdoorsnijding

1. Trek de buikwand voorzichtig zijwaarts in met steriele tapestrips om de buikholte bloot te leggen.
2. Oefen matige druk uit met een wattenstaafje op de buikwand zodat de darmen naar buiten kunnen komen. Verplaats voorzichtig de dunne darm, dikke darm en het keek naar de linkerkant van de muis.
   OPMERKING: Bedek de blootgestelde darm met een steriel wattenpad of gaas, bevochtigd met warme (≈37 °C) steriele zoutoplossing om uitdroging van het weefsel en warmteverlies te voorkomen.
3. Met de rechterhand verplaats je voorzichtig de maag, duodenum en colon en bloc naar het linker bovenkwadrant met een steriele, bevochtigde wattenstafje (of stompe micropincet). De abdominale aorta, vooraan de wervelkolom, moet in dit stadium duidelijk zichtbaar zijn, soms gedeeltelijk bedekt door een kleine hoeveelheid retroperitoneale vet.
4. Identificeer de linker nierader en de coeliakie-stam. De arteria superior mesenteria (SMA) ontspringt als een enkele arteriële tak van de voorwand van de abdominale aorta, meestal ~2–4 mm caudaal van de coeliakie en op of iets boven het niveau van de linker nierader.
   OPMERKING: De linker nierader is een donkere, dikke ader die horizontaal over het voorste deel van de abdominale aorta loopt voordat deze afwatert in de inferieure vena cava. De coeliakie stam is meestal de eerste grote arteriële tak die ontspringt uit de voorwand van de buikaorta, net bovenaan de linker nierader ligt, en verdeelt zich vaak in de lever-, splenicale en linker maagslagader. Daarentegen is de SMA een enkele stam zonder lever-/milttakken. Het dringt de wortel van de mesenterie binnen en voorziet het jejunum, ileum en proximale colon; Het volgen van het verloop naar het mesenterium kan helpen om de juiste identificatie te bevestigen.
5. Identificeer de melkachtig-witte, koordachtige bundels die parallel aan de SMA lopen als de doelzenuwvezels. De zenuwbundel die zich boven de SMA bevindt komt overeen met de parasympathische vezels, terwijl de bundel die zich onder de SMA bevindt overeenkomt met de sympathische vezels (Figuur 1A).
6. Gebruik micropincetten en microschaar, om het vet en lymfeweefsel rondom de SMA heel voorzichtig te scheiden om de zenuwvezels volledig bloot te leggen. Tilt voorzichtig de sympathische of parasympathische zenuwbundel op met microtangen om deze van de SMA te scheiden, en snijd deze vervolgens snel en voorzichtig door (Figuur 1).
   OPMERKING: Houd tijdens de dissectie de uiteinden van de tang en schaar gericht op de laterale wand van de slagader en vermijd het verticaal richten van de instrumenten in diepere vlakken. Als er een grote bloeding optreedt (bijvoorbeeld een bloeding uit de SMA of buikaorta die niet binnen 30 seconden onder controle kan worden gehouden door druk uit te oefenen met een steriel wattenstaafje), wordt de procedure onmiddellijk beëindigd. Het dier wordt op humane wijze geëuthanaseerd terwijl het nog onder narcose is en wordt uitgesloten van alle volgende analyses. Dit eindpunt is vooraf gedefinieerd volgens door IACUC goedgekeurde humane eindpunten om onnodig lijden te voorkomen. Aanvullende instructies voor probleemoplossing voor veelvoorkomende intraoperatieve complicaties worden verstrekt in Aanvullend Dossier 1.

4. Sluiting van de buikholte

1. Verwijder alle intraabdominale gaasjes/wattenpadjes. Controleer zorgvuldig de buikholte op actieve bloedingen, met bijzondere aandacht voor het SMA-dissectieveld, de zenuwdoorsnijdingsplaats en de snijranden van de buikwand.
2. Spoel de buikholte voorzichtig met een klein volume warme, steriele zoutoplossing (0,5–1,0 mL) en voer vervolgens voorzichtig overtollig vocht af met een steriele droge wattenspinner.
3. Voer een instrument uit en tel gaas/katoen om te zorgen dat er geen vreemd materiaal in de buikholte blijft zitten.
4. Met 6-0 absorberbare hechtingen sluit je het peritoneum en de spierlaag met een doorlopende steek vanaf één uiteinde van de incisie. Elke beet moet het buikvlies en de buikwandspieren aan beide zijden bevatten.
   OPMERKING: Til de wondranden op met een tang en plaats elke steek onder directe visualisatie om te voorkomen dat de onderliggende darm of omentum blijft haken. Verwijder indien nodig voorzichtig de darmen van de incisie met een bevochtigd wattenstaafje.
5. Sluit de huid met onderbroken hechtingen met 5-0 zijden gevlochten, niet-absorberbare hechtingen. Plaats hechtingen op ~2 mm afstanden en knoop knopen met matige spanning, waarbij je de huidranden benadert (maar niet wurgt) om ischemie te voorkomen.
   OPMERKING: Slechte wondappositie kan leiden tot een incisiebreuk. Zorg ervoor dat de spierlaag goed is afgesloten en dat de huidranden goed uitgelijnd zijn.
6. Maak de gesloten huidincisie voorzichtig nog eens schoon met een povidon-jodiumswab.
7. Markeer de muis (oor of staart) met de datum van de operatie.
8. Verwijder de neusconus en breng de muis naar een schone, zachte herstelkooi die op een 37 °C verwarmingsmat (enkele behuizing) staat. Houd het dier in laterale ligpositie om het risico op aspiratie te verkleinen.
   OPMERKING: Controleer of het verwarmingsplatform stabiel blijft op 37 °C om onderkoeling te voorkomen. Geef indien nodig 1 ml warme, steriele zoutoplossing subcutaan voor volumeondersteuning.
9. Houd de muis continu in de gaten totdat deze volledig bij bewustzijn is en zelfstandig in een buikligging kan blijven.
   OPMERKING: Postoperatieve analgesie werd voortgezet met meloxicam (5 mg/kg, subcutaan, eens per 24 uur tot 48 uur na de operatie), met aanvullende veterinaire beoordeling als er tekenen van aanhoudende pijn of stress werden waargenomen.

5. Postoperatieve monitoringparameters

OPMERKING: Postoperatieve monitoring werd tweemaal daags uitgevoerd gedurende de eerste 72 uur en daarna dagelijks gedurende de duur van de studie. Beoordeelde parameters waren onder andere:

1. Houd het algemene uiterlijk in de gaten, inclusief verzorging, vachtconditie, houding en activiteitsniveau.
2. Meet dagelijks het lichaamsgewicht; Definieer een verlies van meer dan 15% van het preoperatieve lichaamsgewicht binnen 48 uur of 20% over een periode van 72 uur als een humane eindpunt.
3. Controleer de operatieplaats op tekenen van infectie, dehiscence of afscheiding.
4. Houd gedrag in de gaten, waaronder spontane beweging, reactie op het hanteren en tekenen van stress (bijv. vocalisatie en rusteloosheid).
5. Beoordeel elk dier dat aanhoudende tekenen van pijn of stress vertoont ondanks pijnstillende behandeling door dierenartspersoneel en euthanaer het dier indien nodig.

Resultaten

Met de SMA als een consistent anatomisch herkenningspunt kunnen autonome zenuwbundels in de intestinale vezels worden geïdentificeerd als dunne, parelwitte structuren die parallel aan het vat lopen. Op basis van hun anatomische positie ten opzichte van de SMA werd de superieure bundel aangeduid als de veronderstelde parasympathische bundel en de inferieure bundel als de veronderstelde sympathische bundel (Figuur 1A,D). Een positief intraoper...

Discussie

De muis SMA ontspringt uit de voorwand van de abdominale aorta, onder de coeliakie romp, en zorgt voor arteriële instroom naar de grote buikinwendige inwendigen, waaronder de darm¹⁴. Voor de SMA liggen de colon en zijn mesenterium, terwijl deze achteraan nauw verwant is aan de linker niervena en de abdominale aorta; De superieure mesenteriader loopt meestal langs de rechterzijde. Bij muizen is de SMA uiterst delicaat en wordt omringd door kritieke organen en grote...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5-0 zijde gevlochten niet-absorbeerbare hechtdraad	Ethicon	W500
6-0 PGA-naald	Jinhuan	CR631
Anesthesie-inductiekamers	RWD Life Science	V100
Dierlijke anesthesiemachine	RWD Life Science	R500IP
Anti-choline acetyltransferase-antilichaam	Abcam	ab181023
Kunstmatige traan vochtinbrengende oogzalf	Akorn	59399-162-35
C57BL/6J-muizen	Shanghai Model Organisms CenterTechnology	SM-001
Cholera Toxin Subunit B (CTB), Alexa FluorTM 555 Conjugaat	Thermo Scientific	C34776
Samengesteld microscoop	Yuyan Instruments	512
DAPI en Hoechst-nucleïnezuurkleuring	Invitrogen	D3571
Fast Green	Thermo Scientific	F7252
Fijne hemostatische pincet	Jinzhong chirurgisch instrument	JCG020
Hypoallergene chirurgische tape	3M Blenderm	70200419342
Isofluraan	RWD Life Science	R510-22-10
Micro pincet (gebogen)	Jinzhong chirurgisch instrument	WCC200
Micro pincet (recht)	Jinzhong chirurgisch instrument	WCC190
Micro naaldhouders	Jinzhong chirurgisch instrument	WBA050
Micro schaar	Jinzhong chirurgisch instrument	Y3F010
Micro spuit	Hamilton	7632-01
Oogheelkundige schaar (puntige punt)	Jinzhong chirurgisch instrument	JC2303
Oogheelkundige schaar (afgeronde punt)	Jinzhong chirurgisch instrument	JC2303
Povidon-jodium wattenstaafje	Winner Medical	206
Weefsel en celfixeermiddel (4% paraformaldehyde, PFA)	MedChemExpress	HY-DY3003
Weefsel OCT-vriesmiddel	Sakura	C2077
Tyrosine hydroxylase (E2L6M) konijnen monoklonaal antilichaam	Cell Signaling Technology	58844S