Universeel drukbelastingsapparaat voor live-celbeeldvorming onder aanhoudende fysiologische mechanische belasting

Summary

Het hier beschreven drukbelastende apparaat maakt timelapse optische beeldvorming van gekweekte cellen mogelijk en is compatibel met standaard celkweekschotels en omgekeerde microscopen. Met dit apparaat is bevestigd dat de tumorhydrostatische drukmicroomgeving calciumsignaaltransductie versterkt, wat een haalbaar platform biedt voor het bestuderen van mechanische signaaltransductie in de tumormicroomgeving.

Abstract

Dit protocol beschrijft een hydrostatisch drukbelastend apparaat dat realtime microscopische observatie van hechtende cellen tijdens langdurige hydrostatische drukstimulatie mogelijk maakt, en compatibel is met 3,5 cm commerciële celkweekschotels. Het apparaat bestaat uit een luchtdichte kweekkamer vervaardigd uit een aluminium basis, een optisch transparante poly(methylmethacrylaat) afdekking, gasinlaat-/uitlaatpoorten geïntegreerd in de afdekking, en een afgesloten observatieraam. Door verbinding te maken met een gereguleerde gasbron behoudt het apparaat een stabiele hydrostatische druk (0–200 kPa, instelbaar) terwijl continue fasecontrast- of fluorescentiebeeldvorming mogelijk is. Met dit drukverhogende apparaat kunnen druk-geïnduceerde dosisafhankelijke effecten op celfenotype en gedrag, zoals morfologie, proliferatie en migratie, worden geregistreerd. Bovendien kunnen fluorescentiesignalen ook in real time worden opgenomen. Hier werden drukgetriggerde Ca^2⁺ -signaleringsheterogeniteit en dynamiek in borstkanker MDA-MB-231-cellen en halskanker HeLa-cellen waargenomen en gekwantificeerd door inverteerde fluorescentiemicroscopie met behulp van time-lapse imaging. Dit platform integreert mechanische belasting met live-cell imaging om beperkingen van conventionele eindpuntsystemen te overwinnen en biedt een universeel hulpmiddel voor mechanobiologische studies.

Introduction

Talrijke cellen, weefsels en organen ervaren aanhoudende of intermitterende compressieve krachten als onderdeel van hun fysiologie¹. Zo worden alveolaire cellen tijdens ademhaling onderworpen aan cyclische druk², terwijl blaasepitheelcellen mechanische belastingen ondergaan tijdens urineretentie³. In pathologische contexten zoals solide tumoren worden kankercellen voortdurend blootgesteld aan drukkende krachten die voortkomen uit ruimtelijke opsluiting en verhoogde interstitiële vloeistofdruk⁴. Evenzo ondergaan meniscuscellen⁵ en alveolaire epitheelcellen⁶ bij andere ziekten zoals meniscusdegeneratie en pulmonale fibrose ook aanhoudende mechanische spanningen door spanning en matrixstijfheidsafgeleide druk.

Er is groeiend bewijs dat bevestigt dat mechanische druk werkt als een krachtige regelaar van celfenotype en gedrag ^7,8. In niet-maligne cellen bevordert compressieve stress de proliferatie van parodontale stamcellen en induceert het osteoclastfusie via invasieve uitsteeksels⁹. Omgekeerd vertoont compressie in kankermodellen janus-effecten: het onderdrukt de proliferatie en migratie van melanoomcellen terwijl het tegelijkertijd transcriptomische reprogrammering activeert die chemoresistentie^{bevordert 10,11}. Bovendien kan volumetrische compressie veroorzaakt door hyperosmotische druk intracellulaire ophoping veroorzaken en de herverdeling van eiwitconcentratie en ionensterkte stimuleren via vloeistof-vloeistof fasescheiding (LLPS), wat het celgedrag en het lot ingrijpend verandert. Deze fysieke verstoring bevordert de expansie van intestinale organoïden via geactiveerde Wnt/β-catenine-signalering en verhoogde zelfvernieuwing van darmstamcellen¹². Daarnaast is in de celkern LLPS, geïnduceerd door volumeveranderingen, betrokken bij de transcriptiecontrole van genen via de coördinatie van transcriptieinitiatie, verlenging en beëindiging^13,14.

Om deze door druk veroorzaakte biologische effecten kwantitatief te onderzoeken, zijn experimentele systemen die goed gedefinieerde en homogene compressieve prikkels kunnen toepassen essentieel. Voor cellen die in vitro worden gekweekt en omgeven zijn door een waterig medium, dient hydrostatische druk als een primaire en fysiologisch relevante manier om dergelijke drukkrachten toe te passen, wat breed is toegepast om cellulaire mechanotransductie¹⁵ te bestuderen. Hydrostatische druk kan de activiteit van alkalische fosfatase verhogen en de osteogenese van menselijke vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen versnellen zonder suppletie van osteoinductieve factoren¹⁶. Bij niet-alcoholische levervetting kunnen mechanische krachten zoals hydrostatische druk bijdragen aan portale hypertensie zonder significante fibrose, wat de rol ervan in weefseldiversiteit¹⁷ onderstreept. Hoewel hydrostatische druk een belangrijke rol speelt in pathofysiologische regulatie, ondervinden mechanistische studies van hydrostatische druk een kritieke beperking: conventionele drukkamers sluiten realtime waarneming van levende cellen tijdens stimulatie uit. De meeste experimentele systemen staan alleen eindpuntanalyse toe, waarbij ruimtelijke en temporele dynamiek van mechanotransductiegebeurtenissen worden gemaskeerd, zoals Piezo1-mechano-activatie, Ca²⁺ fluxheterogeniteit en cytoskeletreorganisatie. Deze kloof beperkte het begrip van hoe hydrostatische druk de diversiteit van fenotypen in tumoren of andere weefsels aanstuurt.

Om deze technologische kloof te dichten, werd een nieuw experimenteel platform ontwikkeld dat realtime observatie mogelijk maakt van cellulaire reacties op nauwkeurig gecontroleerde hydrostatische druk via optische beeldvorming. Dit systeem integreert drie belangrijke mogelijkheden: (1) het toepassen van een aanhoudende hydrostatische druk binnen een bereik van 0–100 kPa via een instelbare gasdrukregelaar (De drukmeter heeft een bereik van 0–200 kPa, en de toegepaste drukken kunnen worden geselecteerd op basis van fysiologische parameters. Bijvoorbeeld, op basis van de gerapporteerde compressieve spanningen van verschillende celtypen: 8-16 kPa voor stromale cellen^van menselijk beenmerg, 12–24 kPa voor vaatvormige gladde spiercellen¹⁹, en 0–15 kPa voor menselijke melkepitheelcellen²⁰.); (2) continue live-cell imaging met hoge temporele resolutie tijdens hydrostatische druktoepassing; en (3) het handhaven van fysiologische kweekcondities gedurende uitgebreide experimenten. Deze aanpak maakt directe visualisatie mogelijk van dynamische processen, waaronder de rekrutering en activatie van Piezo1-kanaals, calciumsignaleringsgolven en cytoskeletremodellering die plaatsvinden als reactie op mechanische stimulatie. Daarnaast is dit apparaat compatibel met de meeste commercieel verkrijgbare kweekschotels en omgekeerde microscopen, waardoor het zeer handig is om in laboratoria te gebruiken. Het vermogen om deze intracellulaire biochemische gebeurtenissen in realtime te monitoren biedt ongekende inzichten in hoe cellen hydrostatische druk waarnemen en zich aanpassen aan deze druk. Door de temporele volgorde van mechanotransductiegebeurtenissen vast te leggen, waaronder de initiële waarneming van kracht, downstream signalering en fenotypische veranderingen, biedt dit platform een krachtig hulpmiddel om de fundamentele mechanismen te onderzoeken waarmee hydrostatische druk het celgedrag beïnvloedt in fysiologische en pathologische contexten.

Protocol

1. Materialen

1. Apparaatspecificaties (zie Figuur 1)
   1. Bereid de componenten voor op basis van de onderstaande specificaties:
      Voet: aluminium (Ø 56 mm, hoogte 15 mm), centraal raam Ø 40 mm.
      Afdekking: PMMA (Ø 56 mm) met: 6 × M3 schroefgaten, Luer-lock gaspoort, siliconen pakking (binnendiameter 25 mm, buitendiameter 32 mm, dikte 0,8 mm)
      Drukregelaar: (0–200 kPa bereik)
2. Cellen en reagentia
   1. Gebruik MDA-MB-231 en HeLa-cellen in deze studie. Gebruik L-15 medium, RPMI 1640 medium, newborn calf serum (NCS), 1% anti-mycoticum oplossing en een calcium imaging probe voor celkweek en Ca²⁺ labeling.

2. Apparaatvoorbereiding

1. Productie
   1. Ontwerp op maat het centrale onderdeel van deze studie. Precisiebewerking van de aluminium basis en PMMA-bedekking volgens de specificaties (zie Figuur 1 en Aanvullende Figuur 1).
   2. Knip de siliconen pakking door en verwerk deze tot de benodigde grootte.
      OPMERKING: De optische transmissie van PMMA-materiaal is voldoende voor standaard beeldvorming van doorgetrokken licht. Alle componenten waren steriliseerbaar en biocompatibel voor latere celkweekexperimenten. Er worden geen speciale eisen gesteld aan de productietoleranties van deze kamer (in deze studie werd een tolerantie van ±0,1 mm aangenomen).
2. Sterilisatie
   1. Om de basis (aluminium) te steriliseren, autocaaf deze bij 121 °C gedurende 20 minuten.
   2. Om de hoes te steriliseren (PMMA), veeg je hem af met 75% ethanol en doe je daarna 30 minuten UV-steriliseer.
   3. Steriliseer de siliconen pakking door te autoclaveren bij 121 °C gedurende 20 minuten.

3. Celverwerking

1. Celkweek
   1. Zaadcellen in 35 mm schieten met 30%–70% confluentie. Kweek de cellen gedurende 24 uur in RPMI-1640 of L15 medium (aangevuld met 10% NCS) in een CO2-incubator bij 37 °C en 5% CO₂.
   2. Voor celpassing dissocieer je de cellen met 0,25% trypsine en beëindig je de vertering met een volledig medium. Gebruik de cellen voor herzaaien zodra ze 70%–80% samenvloeiing bereiken.
2. Ca²⁺ kleuring
   1. Verwijder het medium en was de cellen vervolgens twee keer met voorverwarmde Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in een bioveiligheidskast.
   2. Kleur de intercellulaire Ca²⁺ met een 5 μM calciumbeeldvormingsprobe in serumvrij medium. Incubeer de cellen 20 minuten op 37 °C in een lichtbeschermde omgeving.
   3. Verwijder de kleurstof, was de cellen drie keer met HBSS en de-esterify vervolgens 30 minuten in serumvrij medium.

4. Apparaatassemblage (Figuur 2)

1. Breng de kweekschotel naar het centrale venster van de drukkamer en verwijder vervolgens het kweekmedium.
2. Plaats de gesteriliseerde pakking in de kweekschaal.
3. Lijn de deksel uit over de schotelpakking.
4. Draai de schroeven diagonaal aan door ze eerst met de hand aan te draaien totdat er weerstand voelt te zijn, en voeg vervolgens 1,5 extra omwentelingen toe met een koppelgestuurde draaier.
5. Verbind de siliconen gasbuis met de Luer-lock poort en injecteer gemengd gas in het apparaat om lekkages te controleren.
6. Koppel de siliconen gasbuis los en injecteer vers medium in de celkweekschotel via de Luer-lock poort met een 5 mL steriele spuit.

5. Drukbelasting en beeldvorming

1. Verbind siliconen gasslang (binnendiameter 4 mm) van de Luer-lock poort op de siliconen pakking naar de digitale drukmeter en de gastank.
2. Bevestig het gemonteerde apparaat op het microscooppodium.
3. Kalibreer de druk.
   1. Valideer de stabiliteit van het 0–200 kPa-bereik met behulp van de meter.
      OPMERKING: Voor de HeLa-celkweek wordt een gemengd gas gebruikt dat 75% stikstof, 20% zuurstof en 5% kooldioxide bevat. Een gemengd gas dat 80% stikstof en 20% zuurstof bevat, wordt gebruikt voor MDA-MB-231 celkweek. Het type gas dat in het drukbelastingsexperiment wordt gebruikt, kan worden vervangen afhankelijk van het celtype, het mediumtype of specifieke experimentele eisen. Geen enkele component is modelspecifiek, en de afmetingen van de drukdetectiemodule en de inlaatbuis kunnen naar wens worden geselecteerd.
4. Stel de doeldruk in (bijv. 100 kPa) via de digitale drukregelaar.
5. Start beeldvorming zodra de doeldruk is bereikt.
6. Beeldvorming
   1. Stel het podium bij, bevestig het beeldgebied en zorg dat de cellen scherp zijn.
   2. Maakt fluorescentiebeelden van gekleurde cellen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20× objectief, met de volgende parameters: 400 ms belichtingstijd, 5 seconden time-lapse intervallen en een totale beeldduur van 10 minuten (FITC-filter: Ex/Em = 490/525 nm, cutoff = 515 nm).
   3. Beeld onder niet-drukte omstandigheden gedurende 10 minuten om de juiste werking van het systeem te waarborgen en om basissignaalgegevens te verkrijgen.
   4. Na het openen van het gasventiel om de belastingdruk te hebben geopend, stel je de traphoogte opnieuw af om te zorgen dat de cellen scherp zijn, en begin je vervolgens met het beelden van dynamische calciumsignalen.
   5. Kies de objectieflens op basis van de bodemdikte van de kweekschaal en de werkafstand van het objectief. Kies de belichtingstijd die wordt gebruikt om de oscillaties van het calciumsignaal te monitoren, terwijl overmatige fotobleaching en fotoschade worden voorkomen.
   6. Pas parameters aan volgens het type probe en de experimentele eisen bij het waarnemen van andere dynamische signalen.

6. Probleemoplossing

1. Raadpleeg Tabel 1 voor advies over probleemoplossing.

7. Statistische analyse

1. Presenteer alle gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). GraphPad Prism-software (VS) werd gebruikt om resultaten tussen twee groepen te vergelijken met de ongepaarde Student's t-test. Beschouw verschillen als statistisch significant wanneer **p < 0,01, ***p < 0,001, of ****p < 0,0001.

Results

Om de realtime beeldvormingsfunctie van dit hydrostatische drukbelastingsapparaat te verifiëren, werden de dynamiek van calciumsignalen in tumorcellen na het aanbrengen van hydrostatische druk waargenomen. Confluente MDA-MB-231, HeLa en A549-cellen werden in 35 mm kweekschalen gezaaid voor later gebruik. Na het inkleuren met een calciumbeeldvormende sonde werden de serumvrije gekweekte cellen onderworpen aan een hydrostatische druk van 40 kPa. Na 10 minuten hydrostatische drukbelasting n...

Discussion

Dit protocol toonde een universeel aanpasbaar drukbelastingsapparaat dat realtime observatie van mechanotransductiedynamiek onder afstembare hydrostatische druk mogelijk maakte. Door een optisch transparante PMMA-afdekking te integreren met een precisie-bewerkte aluminium basis, overwint het systeem de kritieke beperking van conventionele kamers, die alleen eindpuntanalyse kunnen uitvoeren. Dit drukbelastende apparaat, dat werkt met een standaard omgekeerde microscoop, kan dynamische inf...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122	1% concentratie in compleet medium
Autoclaaf	Panasonic, Japan	MLS-3751-PC	Voor het steriliseren van de aluminium basis en siliconen pakking
Bioveiligheidskabinet	Thermo Fisher Scientific, USA	1300 Series A2 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinets	Biedt een steriele omgeving voor celbehandeling
Cal-520 AM, celdoordringbare calciumindicator	AAT Bioquest, USA	21131	Voor dynamische detectie van calciumionconcentratie in levende cellen
Cell Culture Dish (35 mm)	BIOFIL, China	TCD010035	Standaard 35 mm schaal gebruikt voor het zaaien van cellen
Kamerbasis (aluminium)	Quanyi, China	/	Op maat ontworpen Ø 56 mm, H 15 mm, centraal venster Ø 40 mm
Kamerdeksel (PMMA)	Quanyi,  China	/	Op maat ontworpen Ø 56 mm, met 6× M3 draadgaten, Luer-lock gaspoort
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, USA	HERAcell 3111	Onderhoudt kweekcondities op 37°C met of zonder 5% CO2
HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)	Beyotime, China	C0219	Voor het wassen van cellen voor en na het kleuren
HeLa-cellijn	Cell Resource Center, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS/PUMC, China	CRM-CCL-2	Menselijke cervixcarcinoomcellen
Omgekeerde fluorescentiemicroscoop	Nikon, Japan	Eclipse Ti2	Voor fluorescentiebeeldvorming
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, USA	41300039	Voor MDA-MB-231 celkweek
MDA-MB-231-cellijn	Cell Resource Center, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS/PUMC, China	CRM-HTB-26	Menselijke borstkankercellen
Newborn Calf Serum (NCS)	Thermo Fisher Scientific, USA	16010142	10% concentratie in compleet medium
Drukregelaar	Hongrun, China	DP20	Bereik: 0-200 kPa
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific, USA	31800022	Voor MDA-MB-231 celkweek
Steriele spuit (5 mL)	KDL, China	1101010198	Voor het injecteren van medium of reagentia door de Luer-lock poort
Trypsine (0,25%)	Thermo Fisher Scientific, USA	2520056	Voor het dissociëren van aanhechtende cellen voor passageren