NetDecoder-protocol voor het bouwen van contextspecifieke eiwitinteractienetwerken uit transcriptomische data met behulp van informatiestroommodellering

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van NetDecoder, een netwerkmodelleringstool, om contextspecifieke eiwitinteractienetwerken te construeren en genutiliteitsmodellen (GUM's) te bouwen. Met behulp van transcriptomics-gegevens, in combinatie met gecureerde eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken, maakt NetDecoder de identificatie van belangrijke doelen en subnetwerken mogelijk.

Samenvatting

Differentiële expressieanalyse is een veelgebruikte techniek om potentiële therapeutische doelen te bepalen, maar het negeert de complexiteit van gennetwerken over biologische routes heen. Vaak verklaren sterk tot expressie gebrachte genen niet noodzakelijk de eigenschappen van een biologisch fenotype. NetDecoder, een netwerkbiologisch hulpmiddel dat transcriptomische data integreert met eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken om contextspecifieke informatiestroom, gennut en sleutelranden en differentieel gebruikte gennetwerken te modelleren, werd ontwikkeld om deze beperking van differentiële expressieanalyse aan te pakken.

Dit protocol is een beginnersvriendelijke, stapsgewijze gids voor het gebruik van NetDecoder, met uitgebreide richtlijnen die betrekking hebben op datapreprocessing, NetDecoder-uitvoering en analyse van output. De workflow omvat softwareconfiguratie, netwerkopbouw en flow-based modelleringsanalyse om gen- (node) en gen-gen-interactie (edge-level) verschillen tussen biologische aandoeningen te kwantificeren. De resulterende outputs omvatten belangrijke doelen en routers, differentiële stroomsubnetwerken en randstroomverdelingen, waardoor belangrijke regulerende genen en routes die geassocieerd zijn met specifieke biologische toestanden kunnen worden geïdentificeerd. Na het volgen van de beschreven stappen kunnen onderzoekers onafhankelijk onderzoek doen om fenotypische genenstroom tussen fenotypen te ontdekken met behulp van transcriptomische data en samengestelde PPI-netwerken.

Inleiding

De selectie van genen en bijbehorende routes voor therapeutisch onderzoek wordt vaak gedreven door differentiële expressieanalyses¹. Deze analysemethode is effectief om te bepalen hoe genexpressie verschilt tussen twee of meer aandoeningen. Genen functioneren echter binnen complexe, onderling verbonden biologische netwerken, wat betekent dat individuele genexpressie niet volledig vastlegt hoe genen in een netwerk interageren en hun gen-genrelaties². Netwerkpropagatiemethoden integreren genexpressie met interactienetwerken om biologisch belangrijke genen te identificeren die mogelijk gemist worden door alleen differentiële expressie³. Huidige benaderingen kwantificeren niet expliciet het functionele belang van genen en hoe biologische informatie wordt herverdeeld binnen eiwit-eiwitinteractie (PPI)-netwerken over biologische condities. Daarom was een methode nodig om conditie-specifiek netwerkgedrag te modelleren en veranderingen in informatiestroom tussen biologische systemen te kwantificeren. Om te verklaren hoe genen interacteren binnen een breder biologisch netwerk, is NetDecoder, een netwerkbiologisch platform, ontwikkeld om genen te ontdekken met het grootste verschil in informatiestroom tussen aandoeningen. NetDecoder gebruikt een procesgeleide flow-algoritme om bestaande kennis van het menselijke PPI-netwerk te vertalen, in combinatie met bulk RNA-sequencingdata, om een model te construeren van informatiestroomgedreven interacties⁴.

Met behulp van informatiestroomgegevens voor fenotypische netwerken kan een genutiliteitsmodel (GUM)⁵ worden ontwikkeld om genen met een hoge informatiestroom te identificeren als de met het hoogste algemene gennut binnen een netwerk, ongeacht hun differentiële expressiewaarden. Deze aanpak ondersteunt effectievere strategieën voor doelprioritering en identificatie, en levert inzichten op die traditionele analyses vaak mist. In tegenstelling tot traditionele differentiële expressie- of correlatiegebaseerde netwerkmethoden, kwantificeert NetDecoder zowel gen- (knooppuntniveau) als interactieveranderingen (randniveau) in de informatiestroom, waardoor functioneel belangrijke genen kunnen worden geïdentificeerd, zelfs bij afwezigheid van grote expressieveranderingen ^4,5. NetDecoder is breed toepasbaar op bulk-RNA-sequencingdatasets die vergelijkende analyses van twee biologische omstandigheden vereisen, waardoor veranderingen in informatiestroom en netwerkorganisatie kunnen worden geïdentificeerd. Hoewel NetDecoder integratie ondersteunt van andere omics-datasets, waaronder proteomics en epigenomics, demonstreert het huidige protocol specifiek de workflow met transcriptomische data. In deze toepassingen kunnen gebruikers brongenen definiëren op basis van eiwitten of epigenetisch gereguleerde genen, waardoor informatiestroomanalyse kan worden gestart vanuit deze moleculaire kenmerken. Deze flexibiliteit maakt het mogelijk om multi-omics bewijs in netwerkgebaseerde analyses te integreren en faciliteert de ontdekking van cross-modale regulerende mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische verschillen.

Veelvoorkomende studieontwerpen omvatten binaire vergelijkingen, waaronder maar niet beperkt tot ziekte versus gezonde aandoeningen, behandelresponders versus niet-responders, medicamenteuze behandelingen, knockdowns of knockouts versus controle-experimenten, en analyses van ontwikkelings- of cellulaire toestandsovergangen. Het doel van dit protocol is om een reproduceerbaar kader te illustreren voor het toepassen van NetDecoder om genen met veranderde netwerkinvloed over biologische condities te ontdekken. Dit wordt bereikt door eenvoudige stappen voor het opzetten en uitvoeren van NetDecoder, evenals voorbeelden voor basisproblemen en probleemoplossingstechnieken, en methoden voor resultaatinterpretatie zijn ook in het protocol uiteengezet.

Protocol

Deze studie maakte gebruik van openbaar beschikbare RNA-sequencingdatasets en betrof niet direct menselijke of dierlijke proefpersonen. Daarom waren goedkeuring van de institutionele beoordelingscommissie en geïnformeerde toestemming niet vereist.

OPMERKING: NetDecoder vereist de volgende invoerbestanden: genormaliseerde genexpressie over twee gedefinieerde biologische condities; een metadatabestand dat de biologische omstandigheden beschrijft; een lijst van brongenen voor netwerkbouw en modellering; een eiwit-eiwit interactie (PPI) netwerk uit het publieke domein; en een edge-weighted network (EWN) gebouwd voor elke biologische conditie.

1. Datavoorbereiding

1. Haal bulk-RNA-sequencing-expressiegegevens en metadata op
   1. Download RNA-sequencinggegevens (matrix van ruwe genexpressietellingen en monsternamen) en bijbehorende metadata (monsternamen, omstandigheden, enz.) uit een openbare repository, zoals de Gene Expression Omnibus (GEO), of gebruik laboratoriumgegenereerde experimentele datasets. Typisch is dit een matrix waarin rijen overeenkomen met gennamen en kolommen met monsternamen.
      OPMERKING: De voorbeelddataset die wordt gebruikt om dit protocol te demonstreren, is verkregen uit de National Omics Data Encyclopedia (NODE) repository (BioSino-database) onder toelating OEP001105⁶. Gebruikers kunnen hun eigen bulk RNA-sequencingdatasets vervangen.
   2. Genereer een voorbeeldannotatiebestand (metadata) door voorbeeldnamen en hun groepen of bijbehorende voorwaarden op te nemen; Zo zijn bijvoorbeeld "controle" en "ziekte" veelvoorkomende aandoeningen. Controleer of de voorbeeldnamen overeenkomen tussen de metadata- en expressiebestanden.
2. Geaggregeerde expressiegegevens en metadata
   1. Zorg ervoor dat de gegenereerde datamatrix expressietellingen, gennamen en een metadatabestand met monsternamen en -voorwaarden bevat. Gebruik indien nodig een R-pakket zoals org. Hs.eg.db (menselijk) of AnnotatieDbi om verschillende genidentificaties te matchen.
   2. Knip niet-essentiële informatie uit het metadatabestand met behulp van R of een vergelijkbare programmeertaal.
   3. Combineer de informatie uit de expression count-bestanden tot één bestand voor eenvoudige manipulatie.
3. Filterexpressiegegevens
   1. Verwerk de genexpressiedatamatrix vooraf door genduplicaten, nulwaarden (NA), lage expressie (<10 totale tellingen) en/of genen met lage variantie, enzovoort, uit te sluiten.
4. Data-voorverwerking
   1. RNA-sequencing normalisatie en differentiële expressieanalyse
      OPMERKING: Deze stap is een (1.4.1) van twee (1.4.2) benaderingen voor het selecteren van genen voor Edge Weighted Network (EWN) creatie en brongenselectie (stappen 1.5–1.6) bij het starten van de analyse van bulk RNA-sequencinggegevens. Als alternatief kan Pearson-correlatiegebaseerde sjabloonmatching worden gebruikt door door te slaan naar stap 1.4.3.
      1. Voer gen-ID-conversies uit in deze fase met het R-pakket, AnnotationDbi, in overeenstemming met individuele organismenpakketten. NetDecoder gebruikt gensymbolen (d.w.z. gen-ID) die overeenkomen met het voorbeeld van PPI.
      2. Voer normalisatie en differentiële expressieanalyse uit tussen twee condities met behulp van de R-pakketten limma, edgeR, DESeq2 of vergelijkbare tools.
      3. Als je DESeq2 gebruikt, construeer dan een DESeq-dataset met de DESeqDataSetFromMatrix()-functie met een telmatrix (genen en monsters) en monstermetadata (voorwaarden) als invoer.
      4. Gebruik de DESeq()-functie met standaardinstellingen op het object dat in stap 1.4.1.3 is aangemaakt om differentiële expressiewaarden te berekenen.
      5. Sla de resultaten op in een datamatrix met genidentificaties (gen-ID) als rijnamen en sleutel-uitvoeren, waaronder log2-voudige verandering (log2FC), p-waarde en aangepaste p-waarde als kolommen.
      6. Filtert optioneel de resultaten op aangepaste p-waarde (<0,05) en/of log2FC-waarden (bijvoorbeeld: |log2FC| > 1) met behulp van dplyr of een vergelijkbaar hulpmiddel.
      7. Zorg ervoor dat alle verwerkte genlijsten en log2fold-wijzigingsmatrices worden geëxporteerd als tab-gescheiden (.txt of .csv) bestanden voor invoer in NetDecoder.
      8. Voer paargewijze vergelijkingen uit voor stap 1.4.1 als meer dan 2 biologische condities worden gebruikt en verkrijg paargewijze resultaten met behulp van de results()-functie van het DESeq-object dat in stap 1.4.1.5 is gegenereerd.
   2. Microarray-expressienormalisatie - Optioneel
      OPMERKING: Als je microarraygegevens gebruikt, voer dan deze stap uit voor datanormalisatie.
      1. Normaliseer data door het NetDecoder-normalisatiescript (HuLiLab/NetDecoder_Example/raw_data/NetDecoder_normalize) te openen. R), toegankelijk vanaf https://github.com/HuLiLab/NetDecoder_Example/tree/main, in een R-ontwikkelingsplatform en het cursieve gedeelte bewerken zodat het overeenkomt met de werkmap met celintensiteitsbestanden (CEL).
         setwd(~/NetDecoder_Example/raw_data/CEL_files)
   3. Sjabloonmatching - Optioneel
      OPMERKING: Dit is de tweede optionele benadering als differentiële expressieanalyse (zoals uiteengezet in stappen 1.1–1.4.1 van "Data Preparation") niet wordt uitgevoerd.
      1. Voor RNA-sequencinggegevens die niet via limma, edgeR en DESeq2 zijn verwerkt, voer je extern normalisatie uit voordat je templatematching toepast. Voor microarraygegevens gebruik je direct de genormaliseerde expressiewaarden die in stappen 1.1–1.4.2 zijn gegenereerd.
      2. Kies de controleconditie als basissjabloon voor genexpressie en vergelijk genormaliseerde genexpressiewaarden met alle andere interessante condities.
      3. Bereken Pearson-correlatiecoëfficiënten tussen het expressieprofiel van elk gen en het geselecteerde sjabloon. Het wordt aanbevolen om genen te behouden die statistisch significante correlaties vertonen (p < 0,05) en een absolute correlatiecoëfficiënt boven een door de gebruiker gedefinieerde drempel (zoals |r| > 0,7).
5. Selectie van brongenen
   OPMERKING: De invoer voor deze stap bestaat uit de genormaliseerde genexpressiematrix die is ontwikkeld in stappen 1.1–1.4.
   1. Kies een set belangrijke genen die als brongenen worden gebruikt. Voor op differentiële expressie gebaseerde workflows kies je aangepaste p-waarde en log2FC-drempels (zoals adj p-waarde < 0,05 en |log2FC| > 2). Voor workflows voor sjabloonmatching selecteert u brongenen uit de significant gecorreleerde genen die in stap 1.4.3.3 zijn geïdentificeerd met behulp van de gekozen correlatie- en significantiedrempels. Drempels moeten worden gekozen om ongeveer 300–1.000 genen te leveren voor downstream netwerkconstructie.
      OPMERKING: Brongenen zijn waar de informatiestroom begint en zich door het netwerk verspreidt.
6. Bouw een edgeweighted network (EWN) voor elk fenotype
   OPMERKING: De volgende invoer is vereist voor deze stap: de genormaliseerde genexpressiematrix ontwikkeld in stappen 1.1–1.4; een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk dat is opgemaakt als een randlijst (genA-genB-paren); een voorbeeldannotatiebestand (metadata) dat biologische conditielabels voor elk monster specificeert. Het PPI-netwerk wordt gedeeld als een R-object en is opgebouwd op basis van de iRefIndex-eiwitdatabase. De versie die in dit protocol wordt gebruikt, omvat alle directe interacties, maar zelflussen en meerdere randen werden uitgesloten. Het PPI-netwerk bevat 15.608 eiwitten en 180.044 interacties. Voor meer details, zie sectie⁴ over NetDecoder-Methods.
   1. Open het NetDecoder Edge Weighted Network (EWN) script (HuLiLab/NetDecoder_Example/input/NetDecoder_Create_EWN. R, toegankelijk via https:/github.com/HuLiLab/NetDecoder_Example/tree/main)⁴, in een R-ontwikkelplatform.
   2. Bewerk de delen van het script die door opmerkingen zijn aangegeven (en hieronder cursief weergegeven), om gebruikersspecifieke paden en invoerbestanden voor EWN-ontwikkeling in te stellen.
      pad<~/NetDecoder_Example/input/
      Dit is het pad naar de werkmap
      expQuery <- get(load("expBreastCancer_15Set2014.R"))
      Dit is een voorbeeld van een genormaliseerde expressiematrix Rdata-object
      stQuery < read.csv("stBreastCancer.csv")
      Dit is de voorbeeldmetadata
   3. Filter de expressiematrix zodat alleen genen behouden blijven die aanwezig zijn in het PPI-netwerk.
   4. Voor elke aandoening worden subsets monsters op fenotype gebruikt en paargewijze gen-gencorrelaties berekend over alle randen die in het PPI-netwerk zijn gedefinieerd met behulp van Pearson-correlatie. Bereken de correlaties met behulp van de verwerkte, genormaliseerde expressiematrix die in stap 1.4 is gegenereerd.
   5. Voor elk genpaar bereken je de correlatiecoëfficiënt, de absolute correlatie en de bijbehorende p-waarde.
   6. Verwijder onvolledige gevallen (bijv. NA-waarden).
   7. Exporteer per conditie één edge-weighted netwerk als een tab-gescheiden bestand (zonder header) met de volgende kolommen: proteinA, proteinB, abs_cor, cor en pvalue.
   8. Voer het R-script uit om co-expressienetwerken te creëren voor alle relevante voorwaarden.

2. Installeren en configureren van NetDecoder

1. Download NetDecoder
   1. Toegang tot de NetDecoder-software op (https://netdecoder.hulilab.org/#ver), waarbij je R of Java kiest.
2. Installeer vereiste software
   1. Installeer Oracle JDK en R voor werk-/analyseomgevingen.
   2. Installeer de vereiste R-pakketten zoals vermeld in de NetDecoder-documentatie, met behulp van Bioconductor (https://netdecoder.hulilab.org/#ver)⁴.
3. Downloadafhankelijkheden
   1. Download de benodigde afhankelijkheden voor NetDecoder, waaronder genontologiegegevens (toegankelijk vanaf https://geneontology.org/docs/download-ontology/), evenals de genassociatiereferentiegids (toegankelijk vanaf https://www.ebi.ac.uk/GOA/human_release).
4. Stel de werkmap in
   1. Verplaats alle gedownloade bestanden (expressiegegevens, gegenereerde co-expressienetwerken voor elke conditie, genontologiegegevens en associatiereferentiegids) naar één map, die de NetDecoder-werkmap zal zijn.
5. Voeg de benodigde map toe
   1. Download de NetDecoder-map (https://netdecoder.hulilab.org/wp-content/uploads/2025/07/NetDecoder_Example.zip) naar de NetDecoder-werkmap.
   2. Pak de NetDecoder-map uit.

3. NetDecoder draaien

1. Open het analyse-bash-script
   1. Open een terminal met GNU Bash en ga naar de NetDecoder-werkmap.
   2. Voer het commando nano NetDecoder_Analysis.sh uit om het bash-script te openen.
2. Wijzig de scripts
   OPMERKING: Het grootste deel van de code is al geschreven. In deze stap worden de vereiste parameters in het script op de aangegeven locaties gespecificeerd.
   1. Maak een korte naam:
      Bewerk het cursieve gedeelte zodat het de vergelijkbare voorwaarden is: myshortname='Your_shortname_here'
   2. Stel softwarepaden in:
      Bewerk de volgende drie paddefinities naar de juiste paden door de cursieve delen te bewerken:
      JAVA="/jouw/pad/hier"
      export R="/jouw/pad/hier"
      alias R="/jouw/pad/hier"
   3. Werkmap instellen:
      Bewerk het cursieve gedeelte tot de werkmap waar alle bestanden worden geraadpleegd: INPUT_DIR="/jouw/pad/hier"
   4. Set de NetDecoder-bibliotheek in:
      Bewerk het cursieve gedeelte zodat het het pad is naar de NetDecoder-bibliotheek die in stap 2.4 is geïnstalleerd vanuit het zipbestand: LIB_DIR="/jouw/pad/hier/netdecoder_lib"
   5. Stel genontologie en associatiepaden in:
      Bewerk de volgende cursieve delen van de twee mappen naar de locaties van de voorkeursgenontologie-/associatiebestanden.
      SYMBOL=$LIB_DIR/gene_association_file
      GO=$INPUT_DIR/gene_ontology_bestand
   6. Stel invoerargumenten in:
      Werk de cursieve delen van de volgende vijf regels bij volgens de gegevens, volgens de gecommenteerde instructies in het referentie NetDecoder-script.
      geneList=$INPUT_DIR/gene_file
      state_trt=Behandelde aandoening
      state_ref=Referentievoorwaarde
      PPI_trt=$INPUT_DIR/treated_co_expression_network_file
      PPI_ref=$INPUT_DIR/referentie_co_expression_network_file
   7. Zet de juiste situatie:
      Verwijder commentaar (door het #-symbool te verwijderen) de gewenste uitvoeringsfase en geef deze opnieuw commentaar zodra de fase is voltooid. Fase één is gen_net_trt, gevolgd door gen_net_ref, daarna de analysefase en tenslotte de verzamelfase.
      Stel de gewenste fase in om uit te voeren, te beginnen met fase één.
      #STAGE="gen_net_trt"
      #STAGE="gen_net_ref"
      #STAGE="analyse"
      #STAGE="verzamelen"
   8. Navigeer naar de hoofdterminal van Bash:
      Druk op Ctrl+X, dan Y, om het bash-script op te slaan en af te sluiten.
3. Execute NetDecoder
   OPMERKING: Als het succesvol werkt, verschijnen er loggberichten in de terminal.
   1. Navigeer naar de terminal en voer ./NetDecoder_Analysis.sh uit.
   2. Voer de fasen uit in de volgorde vermeld in stap 3.2.7 totdat alle vier afzonderlijk zijn voltooid.
4. Resultaten ophalen
   1. Navigeer naar de uitvoerbestanden en grafische samenvattingen.

Resultaten

Zoals weergegeven in Figuur 1, werkt NetDecoder via een gestructureerde workflow bestaande uit gegevensverwerking, netwerkconfiguratie en flow-based analyse, met uitvoeren georganiseerd in aparte mappen die overeenkomen met elke fase van de pipeline. Deze modulaire structuur maakt systematische validatie van de output mogelijk, waardoor de resultaten terug te voeren zijn op elke rekenstap en de algehele reproduceerbaarheid ondersteunt.

Succesvolle uitvoering van NetDecoder (Figuur 2) levert output op over vier directories (analyse, collect, netwerken en "your_shortname") met gegevens die overeenkomen met verschillende condities, waaronder figuren en kwantitatieve outputs voor flowwaarden, subnetwerken en andere flow-interactie outputs (Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3). De aanwezigheid van invulde bestanden en figuren in deze mappen geeft aan dat de pijplijn correct is uitgevoerd. Daarentegen worden mislukte runs gekenmerkt door ontbrekende uitgangen en/of onvolledige cijfers. Omdat NetDecoder duizenden genen binnen een PPI-netwerk evalueert, vereisen succesvolle runs doorgaans meerdere uren rekenkracht, afhankelijk van de grootte van de dataset en beschikbare middelen. Voor de representatieve analyse van menselijke galwegkanker die hier wordt gepresenteerd, vereiste de uitvoering van NetDecoder een runtime van ongeveer 4–6 uur op het Linux-gebaseerde Puget3 (Puget Systems) werkstation. Ongewoon korte runtimes kunnen wijzen op verkeerd geformatteerde invoergegevens of onvolledige pijplijnuitvoering. Verkeerd geformatteerde invoergegevens of mislukte pijplijnuitvoering kunnen resulteren in foutmeldingen die terug te voeren zijn naar de oorzaak van het probleem. Figuur 3 toont representatieve uitvoer die aanwezig zijn na succesvolle uitvoering van de NetDecoder. De hier gepresenteerde representatieve analyse maakte gebruik van RNA-sequencinggegevens van 255 monsters van galwegkanker (OEP001105)⁶, waardoor de vergelijking van stadium I–II en stadium III–IV ziektetoestanden en de veranderde informatiestroom tussen aandoeningen mogelijk is.

De drie heatmaps in Figuur 4 vatten de algehele veranderingen samen in netwerkinformatiestroom tussen genen onder verschillende omstandigheden, waaronder routergenen die aanzienlijke informatiestroom binnen het netwerk verzenden, belangrijke downstream doelgenen of sterk beïnvloede algemene genen. Een brede verdeling van zowel positieve als negatieve differentiële stroming geeft aan dat informatie over het netwerk wordt herverdeeld, in plaats van uniform te verhogen of te verminderen. Deze heterogeniteit en verscheidenheid aan gentypen ondersteunen NetDecoders vermogen om genen met veranderd functioneel belang tussen fenotypen te identificeren.

Figuur 4 toont ook randniveau-balkgrafieken die stroomveranderingen kwantificeren voor individuele gen-genpaarinteracties over condities heen. Deze resultaten tonen aan dat de stroom door specifieke interacties kan variëren tussen omstandigheden, wat een weerspiegeling is van contextafhankelijke netwerkherbedrading. Dus de randstroom vangt veranderingen op interactieniveau in de informatieoverdracht vast, terwijl differentiële stroom een knooppuntniveau samenvatting van deze veranderingen biedt, waardoor prioriteit kan worden gesteld van genen met de grootste algehele verschuiving in netwerkinvloed.

Samen tonen deze outputs aan dat NetDecoder veranderingen in de informatiestroom binnen biologische netwerken vastlegt op gen- (node-niveau), gen-gen (edge-level) en netwerkniveau-veranderingen in de informatiestroom binnen biologische netwerken (Figuur 4). De heatmaps identificeren genen met veranderde informatieverspreiding, routering en ontvangst in het netwerk, terwijl edge-level analyses de specifieke interacties onthullen die deze veranderingen aansturen. De fenotype-specifieke informatienetwerken bieden een visuele weergave van netwerkherbedrading tussen omstandigheden, waarbij knooppunten genen vertegenwoordigen en de randdikte overeenkomt met de hoeveelheid informatiestroom (Figuur 4). Deze representatie op systeemniveau ondersteunt de identificatie van belangrijke regulerende genen en routes die geassocieerd zijn met de onderzochte aandoeningen. Bovendien geeft de succesvolle productie van deze figuren aan dat NetDecoder correct is uitgevoerd.

Omdat NetDecoder een groot aantal uitvoerbestanden produceert, is het identificeren van de meest relevante resultaten essentieel voor interpretatie. Om bijvoorbeeld stroomverschillen tussen omstandigheden te onderzoeken (bijv. lage fase versus hoge trap), kunnen twee sleutelbestanden worden gebruikt (navigatiestappen worden geleid door de bestandsstructuur van Figuur 3). De eerste, "EDGE_CENTERED_SUBNET_flowDifference_Disease.txt" (te vinden in de analyse-/ziektedirectory ), identificeert interacties (randen) met de grootste veranderingen in de flow tussen aandoeningen. De tweede, "flowDifference_PRIORITIZED_NETWORK.txt" (te vinden in de "your_shortname" -directory), identificeert genen (knooppunten) met de grootste stroomverschillen. Samen bieden deze bestanden een uitgebreid overzicht van zowel veranderingen op interactieniveau als op genniveau in netwerkgedrag.

In bredere zin bevat de map "analyse" informatie over netwerkrouters, belangrijke doelen en belangrijke differentiële flowgenen. De map "your_shortname" bevat ruwe tekstbestanden met fenotype-specifieke gegevens, zoals totale flowwaarden en sleuteldoelen en routers. De netwerkmap bevat de subnetwerken die door NetDecoder zijn gegenereerd, die verder geanalyseerd en gevisualiseerd kunnen worden in Cytoscape⁷. Ten slotte bevat de map "collect" geconsolideerde gegevens en cijfers die een algemene samenvatting van de resultaten geven. Verdere visualisatie en analyse van NetDecoder-resultaten kan worden uitgevoerd met R-pakketten zoals ggplot2, igraph, pheatmap, enzovoort.

Figuur 1: Representatie van de NetDecoder-pijplijn en algemene functionaliteit. NetDecoder vereist drie algemene fasen (gele doos): gegevensverwerking, NetDecoder-configuratie en NetDecoder-uitvoering. Elke stap van deze fasen moet nauwlettend worden gevolgd om succesvolle resultaten te garanderen. NetDecoder vereist expressiegegevens uit twee condities (voorbeelden in green box) om te voorspellen welke genen geassocieerd kunnen zijn met een hoge informatiestroom en gennut. In de waterkraan-analogie worden genexpressieniveaus geïllustreerd door de grootte van de kraan, oftewel hoe breed deze open kan gaan, terwijl het gennut of de activiteit van het gen de daadwerkelijke waterstroom weerspiegelt, wat laat zien hoeveel deze route functioneel wordt gebruikt. Zoals in de figuur te zien is, kan een sterk tot expressie gebracht gen (grote kraangrootte) een laag gennut hebben (lage waterstroom), terwijl een gen met een laag expressieniveau (kleine kraangrootte) een hoge genbruikbaarheid kan hebben (hoge waterstroom). Dit illustreert hoe genen in een bepaalde aandoening een hoger algemeen belang kunnen hebben, zelfs als het expressieniveau lager is dan dat van een ander gen. De illustratie in het midden onderaan laat zien hoe genen met elkaar verbonden kunnen zijn en verschillende niveaus van stroom (kleur) kunnen ervaren, ongeacht hoeveel ze tot expressie komen (grootte). Gemaakt in BioRender. Blissenbach, E. (2026) https://BioRender.com/8okynbu. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: NetDecoder Algemene Workflow. Het kernprincipe van het NetDecoder-algoritme is het modelleren van gennut in een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk via informatiestroomanalyse. De workflow begint met voorverwerking van data en het bouwen van edge-weighted network (EWN). Genexpressiegegevens van twee biologische aandoeningen, fenotype 1 (P1) en fenotype 2 (P2), worden verwerkt om brongenen te identificeren via differentiatie-expressie of sjabloon-matching methoden. Genormaliseerde expressiematrices worden vervolgens gebruikt om conditie-specifieke EWN's te bouwen, waarbij randgewichten gen-paarrelaties in elk fenotype weerspiegelen. NetDecoder kwantificeert vervolgens verschillen in informatiestroom tussen condities, waardoor netwerkherbedrading en veranderingen in gennut kunnen worden geïdentificeerd. De uitkomsten omvatten differentiële informatiestroomscores, contextspecifieke informatienetwerken, impactscore-heatmaps en aanvullende netwerk- en genniveaumetrics die downstream biologische interpretatie en mechanistische ontdekkingen vergemakkelijken. Gemaakt in BioRender. Correia, C. (2026) https://BioRender.com/29cmswf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: NetDecoder-uitvoer en mapstructuur. Dit diagram geeft de structuur van de uitvoermappen weer die wordt gebruikt om resultaatbestanden te benaderen voor interpretatie. In cursief worden mapnamen weergegeven (op de mapiconen), waarbij die tussen aanhalingstekens specifiek zijn voor analyse-nomenclatuur. Waarden op inbox-iconen geven bestanden of bestandstypen aan, afhankelijk van de kleurcodering. Rood duidt de bestandstypen aan die in elke map te vinden zijn, terwijl sleutelbestanden vetgedrukt en onderstreept worden weergegeven (flowDifference_PRIORITIZED_NETWORK.txt en EDGE_CENTERED_SUBNET_flowDifference_Disease.txt). Mapiconen werden afkomstig van icons8 (https://icons8.com). Gemaakt in BioRender. Blissenbach, E. (2026) https://BioRender.com/8okynbu. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Voorbeeld van resultaten gegenereerd door NetDecoder. Impactgenen (A), netwerkrouters (B) en key targets (C) heatmaps, evenals contextspecifieke netwerken (D) en edge flow bar-grafieken (E), zijn belangrijke uitvoeren van NetDecoder. In dit voorbeeld werd een dataset galwegkanker expressie (OEP001105) gebruikt om patiënten met vroege ziekte (stadium I-II, laag) en gevorderde ziekte (stadium III-IV, hoog) te vergelijken, en werd NetDecoder toegepast om genen met hoge differentiële informatie tussen beide groepen te identificeren. Elke grafiek toont rood wat een verhoogde stroming aanduidt en blauw wat een verminderde stroming aangeeft. Netwerkrouters (B) zijn belangrijke tussengenen waar grote hoeveelheden stroom doorheen gaan (collect/Disease_Network_routers.pdf), belangrijke doelen (C) belangrijke downstream regulatoren zijn (collect/Disease_Key_targets.pdf), en de flow-verschil heatmap de algehele verandering in gen-niveau informatiestroom tussen condities (analyse/flowDifference_heatmap.pdf) weergeeft. Een fenotype-specifiek informatienetwerk (D) kan worden gevisualiseerd, waarbij elk gen een knooppunt vertegenwoordigt en gen-gen-interacties worden weergegeven als randen (lijnen) (analyse/EDGE_CENTERED_SUBNET_Disease). De dikte van de rand komt overeen met de grootte van de informatiestroom tussen genen. De staafdiagram (E) toont verschillen in randstroom over gen-geninteracties tussen de twee geselecteerde fenotypen, waarbij laagstadiumparen worden weergegeven in teal en hoogstadiumparen in oranje (analyse/Disease_keyEdges.pdf). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol schetst de implementatie van NetDecoder, een netwerk-biologie framework dat genexpressiegegevens integreert met eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken om conditie-specifieke informatiestroom te modelleren en genen te prioriteren op basis van hun functionele invloed binnen biologische systemen. De succesvolle toepassing van deze methode hangt af van verschillende kritieke stappen, zorgvuldige methodologische keuzes en de juiste interpretatie van de output.

De eerste fasen van het protocol omvatten het ophalen van expressiegegevens, het genereren van metadata en het construeren van een uniforme expressiematrix. Deze stappen zijn cruciaal om compatibiliteit met downstream-analyse te waarborgen. De expressiematrix moet worden opgemaakt met genen als rijen en monsters als kolommen, waarbij de namen van samples in de matrix en het metadatabestand identiek overeenkomen. Elke inconsistentie in deze fase (bijv. niet overeenkomende monsteridentificaties of gedupliceerde gennamen) zal zich door de pijplijn verspreiden en leiden tot falen in latere stappen.

Het filteren van data van lage kwaliteit (bijvoorbeeld genen met lage tellingen, ontbrekende waarden of genen met lage variantie) is bijzonder belangrijk, omdat deze kenmerken ruis kunnen introduceren in correlatie-gebaseerde netwerkconstructie. Een succesvolle preprocessingstap wordt aangegeven door een schone expressiematrix zonder ontbrekende waarden en consistente genidentificaties die overeenkomen met die gebruikt in het PPI-netwerk.

Een belangrijk beslissingspunt in het protocol is de keuze tussen differentiële expressieanalyse en sjabloonmatching voor het selecteren van brongenen die worden gebruikt in de constructie van Edge Weighted Network (EWN). Differentiële expressieanalyse is het meest geschikt bij het vergelijken van goed gedefinieerde experimentele groepen met voldoende replicata. Deze benadering identificeert genen met statistisch significante expressieveranderingen tussen condities en levert kwantitatieve outputs zoals log2-voudige verandering (log2FC) en aangepaste p-waarden. Succesvolle uitvoering wordt aangegeven door een verdeling van zowel significante als niet-significante genen, in plaats van uniforme nul resultaten. Daarentegen is sjabloonmatching beter geschikt wanneer het doel is om genen te identificeren met expressiepatronen die gecorreleerd zijn met een continu of referentieprofiel. Deze methode behoudt genen gebaseerd op correlatiesterkte in plaats van op de omvang van differentiële expressie. Een succesvolle sjabloon-matching stap levert een set genen op met statistisch significante correlaties met de referentieconditie. De keuze tussen deze benaderingen beïnvloedt de downstream netwerktopologie; Differentiële expressie benadrukt grootteveranderingen, terwijl sjabloonmatching de nadruk legt op gecoördineerde expressiepatronen.

De EWN-constructiestap is een van de meest kritieke onderdelen van het protocol. Hier worden genormaliseerde genexpressiegegevens geïntegreerd met een PPI-netwerk om paargewijze gen-gencorrelaties te berekenen voor alle interacties in het netwerk. Alleen genen die gedeeld worden tussen de expressiedataset en het PPI-netwerk worden behouden, wat biologische relevantie en computationele consistentie waarborgt. Voor elke voorwaarde worden Pearson-correlatiecoëfficiënten berekend over alle zijden, samen met bijbehorende p-waarden en absolute correlatiewaarden. Deze metrieken definiëren de randgewichten die door NetDecoder worden gebruikt. Succesvolle EWN-constructie blijkt uit duizenden gen-gencorrelaties, een brede verspreiding van correlatiewaarden en minimale ontbrekende waarden na filtering. Falen in deze fase is vaak te wijten aan mismatched genidenticatoren, onvoldoende steekproefgrootte of verkeerd genormaliseerde expressiegegevens. Veelvoorkomende NetDecoder-fouten kunnen vaak worden opgelost door methodische verificatie van invoerbestanden en softwareconfiguraties. Als NetDecoder onverwacht stopt of onvolledige output produceert, moeten gebruikers controleren of de sample-identificaties identiek zijn tussen expressiematrices en metadatabestanden, dat genidentifiers consistent zijn tussen expressiedatasets, brongenlijsten en PPI-netwerken, en dat expressionsmatrices geen ontbrekende waarden bevatten. Als er fouten of afgeknotte resultaten optreden, kunnen gebruikers de software-installatie- en versiecompatibiliteiten verifiëren, logberichten die tijdens de uitvoering zijn gegenereerd inspecteren en bevestigen dat elke tussenstap succesvol is voltooid voordat ze doorgaan met downstream-analyses. Inspectie van de uitvoerbestanden en/of consoleberichten kan helpen om de bron van een fout te lokaliseren voordat vervolganalyses worden geprobeerd. NetDecoder vereist een nauwkeurige configuratie van bestandspaden, invoerargumenten en afhankelijkheden. Belangrijke stappen zijn het specificeren van de werkdirectory- en bibliotheekpaden, genontologie- en annotatiebestanden, condition-specifieke EWN-invoer en brongenlijsten.

Omdat de pijplijn in fasen wordt uitgevoerd (netwerkgeneratie van beide condities, analyse en resultaatverzameling), zullen fouten in eerdere fasen het succesvol afronden van latere fasen verhinderen. Een goed functionerende run levert vier directories op (analyse, collect, netwerken, "your_shortname"), elk met condition-specifieke resultaten. Een andere praktische indicator van correcte uitvoering is runtime. Succesvolle runs kosten doorgaans enkele uren om te verwerken omdat NetDecoder grote interactienetwerken evalueert; Extreem korte runtimes wijzen vaak op verkeerd geconfigureerde invoer of overgeslagen rekenstappen.

NetDecoder verschilt fundamenteel van traditionele genprioritisatie- en netwerkanalyse-benaderingen. Methoden zoals Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA)⁸ clusteren genen op basis van correlatiestructuur, maar nemen geen directionele stroming mee of kwantificeren niet hoe informatie zich door een netwerk verspreidt. Evenzo identificeren pathway-verrijkingsanalyses⁹ functionele overrepresentatie, maar houden geen rekening met interactieniveau-dynamiek of veranderingen in netwerkconnectiviteit.

NetDecoder gebruikt een geïntegreerde aanpak door genexpressiegegevens te combineren met PPI-netwerken om condition-specifieke informatiestroom te modelleren. Door zowel individuele gen- (node-niveau) scores als interactie- (randniveau) stroomveranderingen te kwantificeren, wordt vastgelegd hoe netwerkstructuur en informatierouting tussen condities worden herbedraad. Dit maakt het mogelijk genen te identificeren die mogelijk geen sterke differentiële expressie vertonen, terwijl ze toch een centrale rol spelen in het bemiddelen van netwerkgedrag, in overeenstemming met het genutiliteitsmodel (GUM)⁵, dat stelt dat genen met een hoge differentiële informatiestroom de conditiespecifieke netwerkfunctie aansturen.

Ondanks zijn sterke punten heeft NetDecoder verschillende beperkingen. Ten eerste is het een computationeel kader dat genbelang afleidt op basis van gemodelleerde netwerkinformatiestroom in plaats van direct experimenteel bewijs¹⁰. Als zodanig moeten de voorspellingen worden geïnterpreteerd als hypothesen die validatie vereisen via biologische experimenten. Functionele validatiemethoden, zoals gene knockout studies¹¹ of gerichte perturbatie-assays¹², zijn essentieel om te bevestigen of genen die door NetDecoder als hoog nuttig zijn geïdentificeerd daadwerkelijk invloed hebben op de biologische processen of ziektetoestanden die worden bestudeerd. Ten tweede is de methode sterk afhankelijk van de kwaliteit en volledigheid van het onderliggende PPI-netwerk. Omdat PPI-databases vaak bevooroordeeld zijn ten gunste van goed bestudeerde genen, kunnen minder gekarakteriseerde interacties ondervertegenwoordigd zijn, wat de ontdekking van nieuwe regulatorische relaties mogelijk beperkt. Variabiliteit in steekproefgrootte, experimenteel ontwerp en datakwaliteit kan ook invloed hebben op netwerkconstructie en downstream flowberekeningen. Ten derde gaat NetDecoder er niet van uit dat statische randen de dynamische informatiestroom volledig vastleggen. In plaats daarvan leidt NetDecoder contextspecifieke activiteit af en kwantificeert hij de informatiestroom met behulp van een PPI-netwerk als structurele prior, dat dient als een steiger om de ruimte van biologisch plausibele interacties te definiëren. Dynamisch gedrag wordt vervolgens geïntroduceerd door toestandsspecifieke moleculaire gegevens (bijv. genexpressie) over elkaar te leggen, waardoor subsets van het netwerk effectief worden herwogen of geactiveerd op een contextafhankelijke manier.

Het primaire doel van NetDecoder is het modelleren van informatieverspreiding via een statische PPI-steiger, terwijl kwantitatieve en continue relaties tussen genen (knooppunten) behouden blijven. Daarentegen bieden benaderingen zoals Booleaanse netwerken een vereenvoudigde en interpreteerbare weergave van dynamiek door eiwitactiviteit te modelleren als discrete aan/uit-toestanden die worden beheerst door logische interacties¹³. Deze benaderingen zijn veel gebruikt om genregulatie- en signaalnetwerken onder verschillende omstandigheden te bestuderen 14,15,16. Ze vereisen echter doorgaans vooraf gedefinieerde logische regels en discretisatie van eiwittoestanden, wat lastig kan zijn om op grote schaal te definiëren voor grote, heterogene biologische PPI-netwerken¹⁷. In deze context vertegenwoordigt Booleaanse netwerkmodellering een complementaire richting ten opzichte van NetDecoder. Hoewel NetDecoder continu, kwantitatieve informatiestroom vastlegt, kan het integreren van logische, regelgebaseerde dynamiek of hybride discrete-continue modellen de interpreteerbaarheid van conditie-specifieke signaleringsgedragingen verbeteren. Het ontwikkelen van Booleaanse informatiestroomalgoritmen vormt daarom een veelbelovende weg voor toekomstig werk.

Toekomstige richtingen voor NetDecoder omvatten integratie met extra omic-datatypes en uitbreiding naar single-cell transcriptomics om resolutie en biologische context te verbeteren. Zo zijn deep learning-gebaseerde benaderingen voor ruimtelijke transcriptomische expressievoorspelling en imputatie gericht op het verbeteren van de datakwaliteit en signaalherstel, maar modelleren ze de informatiestroom tussen interactienetwerken^niet expliciet ^18,19. Het integreren van multi-omic analyseniveaus kan zowel de voorspellende kracht verder vergroten als leiden tot betrouwbaardere resultaten. Met voortdurende methodologische ontwikkeling zal NetDecoder in staat zijn meerdere lagen van informatiestromen te produceren, waardoor onderzoekers multi-omic validatie krijgen voor hun data van interesse.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AnnotationDbi	Bioconductor	versie 1.68.0	Annotatie en genmapping
Bioconductor	Bioconductor	versie 3.19	Framework voor transcriptoom gegevensanalyse en package ecosysteem dat DESeq2, edgeR, limma, AnnotationDbi en organisme databases ondersteunt, etc.
Cytoscape	The Cytoscape Consoritum	versie 3.10.4	Netwerkvisualisatie en analyse
DESeq2	Bioconductor	versie 1.46.0	Differentiële expressieanalyse (met negatieve binomiaal modellering)
dplyr	Posit Software, PBC voorheen RStudio, PBC	versie 1.1.4	Gegevensmanipulatie en transformatie
edgeR	Bioconductor	versie 4.4.2	Op tellingen gebaseerde differentiële expressieanalyse
ggplot2	Posit Software, PBC voorheen RStudio, PBC	versie 4.0.0	Gegevensvisualisatie en plotten
GNU Bash	GNU Project	Systeemstandaard	Bash, Uitvoering van NetDecoder pipeline scripts
igraph	igraph Development Team	versie 2.1.4	Netwerkconstructie en grafiekanalyse
Limma	Bioconductor	versie 3.62.2	Lineaire modellering voor genexpressieanalyse
NetDecoder	Hu Li Laboratory, Mayo Clinic	(2024 Hu Li Lab)	Constructie van contextspecifieke eiwitinteractienetwerken via informatiestroommodellering
org.Hs.eg.db	Bioconductor	versie 3.20.0	Menselijke genannotatiedatabase
Oracle JDK	Oracle Corporation	≥ versie 1.8	Runtime-omgeving voor NetDecoder uitvoering
pheatmap	Raivo Kolde	versie 1.0.13	Visualisatie van expressie en correlatiestructuur
R	The R Foundation	versie 4.4.2	Kernomgeving voor transcriptoom en netwerkanalyse