Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Computationeel protocol om artesunaat-geassocieerde transcriptomische verschuivingen in experimenteel cerebraal malaria-hersenweefsel te kwantificeren met DESeq2

75 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70870

⸱

31 juli 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Experimentele cerebrale malaria (ECM) veroorzaakt neuro-inflammatie en een dysfunctie van de bloed-hersenbarrière. Met behulp van GSE162535 vergelijkt deze reproduceerbare R-gebaseerde RNA-seq workflow controle- (CB), ECM (MB) en artesunate-behandelde (AB) hersenen, waarbij QC-, PCA- en DESeq2-analyses worden uitgevoerd. Het identificeert door ECM gedreven transcriptieveranderingen en evalueert artesunaat-gemedieerde modulatie van inflammatoire en neurovasculaire routes.

Samenvatting

RNA-sequencing (RNA-seq) wordt veel gebruikt om ziekte-geassocieerde transcriptieprogramma's te definiëren, maar consistente, end-to-end workflows zijn vereist om reproduceerbare vergelijkingen tussen experimentele groepen te garanderen en biologisch interpreteerbare output te faciliteren. Hier wordt een volledig RNA-seq analyseprotocol gepresenteerd voor het evalueren van hersentranscriptomische veranderingen in experimentele cerebrale malaria (ECM) en de opvolgende artesunate behandeling met behulp van de publieke dataset GSE162535. De workflow analyseert drie groepen—controlebrein (CB), ECM-brein (MB) en met artesunat behandelde ECM-hersenen (AB)—beginnend met een HTSeq-tellingsmatrix. Na het importeren en opmaken van ruwe tellingen construeert het protocol een DESeq2-dataset met CB als referentieniveau, filtert genen met een laag aantal en voert kwaliteitscontrole uit met behulp van bibliotheekgrote visualisatie, analyse van hoofdcomponenten en clustering van monsterafstanden. Differentiële expressie wordt vervolgens berekend voor drie primaire contrasten (MB versus CB, AB versus MB, AB versus CB), waarbij log2-voudige veranderingskrimp wordt toegepast voor stabiele effectgrootteschatting. Het protocol exporteert volledige en significante tabellen met differentiële expressie, genereert vulkaangrafieken en MA-grafieken, en produceert heatmaps van de meest variabele genen en hooggeplaatste differentieel expressieve genen per contrast. Om mechanistische interpretatie te ondersteunen, omvat de workflow gerichte immuunmarker-extractie (bijv. cytokines, chemokines, microgliale activatiemarkers, BBB/endotheelgenen) en voert het genontologie- en KEGG-verrijkingsanalyses uit voor significant op- en neergereguleerde gensets. Dit protocol biedt een reproduceerbaar sjabloon voor het karakteriseren van ECM-geassocieerde neuro-inflammatoire transcriptieprogramma's en voor het kwantificeren van artesunaat-geassocieerde modulatie van deze signaturen.

Inleiding

Cerebrale malaria (CM) is een levensbedreigende neurologische complicatie van een infectie met Plasmodium falciparum en blijft ondanks vooruitgang in casemanagement een belangrijke bijdrage aan malariasterfte. CM wordt gekenmerkt door acute encefalopathie, microvasculaire disfunctie, endotheelactivatie en verstoring van de bloed-hersenbarrière (BBB), met downstream neuro-ontsteking die coma kan veroorzaken en, bij overlevenden, aanhoudende neurocognitieve gevolgen1. De pathogenese van CM is multifactorieel en omvat ontstekingsreacties van de gastheer die interageren met parasite- en gastheerafgeleide factoren aan de neurovasculaire interface, waardoor het moeilijk is om causale mechanismen af te leiden uit alleen klinische eindpunten1.

Experimentele cerebrale malaria (ECM)-modellen, met name Plasmodium berghei ANKA-infectie bij C57BL/6-muizen, bieden een hanteerbaar platform om hersenspecifieke immunopathologie, BBB-letsel en neuro-inflammatoire signalering in een gecontroleerde settingte onderzoeken 2,3. Deze modellen zijn gebruikt om cellulaire en moleculaire responsen over ziektestadia in kaart te brengen en om aanvullende interventies in vivote testen 2,3. ECM-pathobiologie is echter complex en zeer dynamisch, en gerichte assays kunnen gecoördineerde verschuivingen op padniveau missen die optreden over meerdere immuun- en neurovasculaire programma's.

Artesunaat is de aanbevolen eerstelijns parenterale therapie voor ernstige malaria en heeft een aanzienlijk overlevingsvoordeel aangetoond ten opzichte van kinine op belangrijke bewijsbases4. Hoewel snelle parasietenopruiming centraal staat voor artesunate effectiviteit, weerspiegelen neurologische uitkomsten waarschijnlijk zowel parasietreductie als secundaire modulatie van inflammatoire en neurovasculaire routes 1,4. Begrijpen hoe artemisinine de transcriptieprogramma's in de hersenen tijdens ECM hervormt, kan daarom mechanistische inzichten bieden die klinische effectiviteitsgegevens aanvullen en kandidaatpaden voor aanvullende neuroprotectieve strategieën kunnen identificeren.

RNA-sequencing (RNA-seq) maakt onbevooroordeelde, genoombrede profilering van transcriptieresponsen in ziekte- en behandelingstoestanden mogelijk, wat differentiële expressieanalyse en downstream functionele interpretatie ondersteunt. Openbare archieven zoals de NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) bieden gecureerde datasets die geschikt zijn voor reproduceerbare heranalyse, waaronder GSE162535, die RNA-seq van controlehersenen (CB), ECM-hersenen (MB) en met artesunate behandelde ECM-hersenen (AB)5 bevat. Om reproduceerbare ontdekking uit dergelijke datasets te ondersteunen, zijn robuuste statistische kaders nodig voor tellinggebaseerde differentiële expressie, en zijn verrijkingstools nodig om genniveauveranderingen te interpreteren in termen van biologische routes en processen.

Deze studie presenteert een reproduceerbare, end-to-end RNA-seq analyseworkflow voor hersenweefsel over control (CB), experimentele cerebrale malaria (MB) en artesunate behandelde (AB) groepen. De nieuwigheid van dit artikel ligt in de gestandaardiseerde DESeq2-gebaseerde pijplijn, die vooraf gedefinieerde biologisch relevante contrasten (MB vs CB, AB vs MB, en AB vs CB), rigoureuze kwaliteitscontrole-outputs (bibliotheekgrootte-beoordeling, analyse van hoofdcomponenten en sampleafstandsheatmaps) en geïntegreerde downstream-interpretatie via Gene Ontology (GO) en KEGG-routeverrijking met clusterProfiler 6,7 bevat. Daarnaast implementeert de workflow gestructureerde interpretatie gebaseerd op het immuunpaneel, waardoor systematische karakterisering van neuro-inflammatoire, immuun- en neurovasculaire transcriptieresponsen mogelijk is. Door statistische nauwkeurigheid, transparantie en publicatieklare resultaten te combineren, biedt dit protocol een robuust en herbruikbaar kader voor het analyseren van ECM-geassocieerde transcriptomische dysregulatie en het beoordelen van therapiegedreven modulatie in preklinische malariastudies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie maakte gebruik van openbaar beschikbare RNA-seq-gegevens en bevatte geen nieuwe menselijke of dierlijke experimenten. Daarom waren ethische goedkeuring en geïnformeerde toestemming niet vereist (Materiaaltabel).

1. Bereid de computeromgeving en mapstructuur voor

  1. Hardware en besturingssysteem opzetten
    1. Gebruik een werkstation of laptop met minstens 8 GB RAM (16 GB aanbevolen) en ≥10 GB vrije schijfruimte voor downloads en uitvoer.
    2. Gebruik Windows, macOS of Linux met toestemming om R-pakketten te installeren en bestanden naar de werkmap te schrijven.
  2. Installeer vereiste software
    1. Installeer R (versie 4.2 of later). Installeer RStudio Desktop (aanbevolen) om de workflow interactief uit te voeren en de projectmap te beheren.
  3. Maak een projectmap en uitvoer-mappen aan
    1. Maak een nieuwe map aan voor de analyse (bijvoorbeeld GSE162535_RNAseq_DESeq2). Stel deze map in als de R-werkmap.
    2. Maak de uitvoermappen precies als volgt aan:
      1. Resultaten creëren/. Maak resultaten/fig/. Maak resultaten/tabellen/.
  4. Installeer vereiste R-pakketten
    1. Installeer CRAN-pakketten: tidyverse, pheatmap en RColorBrewer. Installeer Bioconductor-pakketten: DESeq2, apeglm (optioneel), clusterProfiler en org. Mm.eg.db.
    2. Laad de benodigde pakketten aan het begin van het script: DESeq2, tidyverse, pheatmap, RColorBrewer, clusterProfiler, org. Mm.eg.db, en ggplot2. Stel een seed in voor reproduceerbaarheid door set.seed(123) uit te voeren.
  5. Pas data-integriteit en privacywaarborgen toe
    1. Sla gedownloade bestanden alleen op in de projectmap. Beperk de toegang tot de projectmap als de omgeving gevoelige of geembargode gegevens bevat. Registreer softwareversies door sessionInfo() te exporteren naar resultaten/sessionInfo.txt aan het einde van de workflow.
      OPMERKING: Dit protocol voert een in silico-analyse uit van openbare RNA-seq tellingsgegevens en vereist geen hantering van biologische monsters.

2. Verkrijg de RNA-seq count-matrix en definieer de experimentele groepen

  1. Download de GEO-datasetbestanden voor GSE162535
    1. Download het HTSeq-tellingbestand voor GSE162535 van GEO en sla het op in de projectmap als GSE162535_All.HTSeq.counts.txt.gz. Controleer de integriteit van het bestand door te bevestigen dat het bestand zonder fout opent met gzfile() en read.delim().
  2. Laad de HTSeq-tellingen in R
    1. Importeer de gecomprimeerde teltabel met read.delim(gzfile(...), header = TRUE, check.names = FALSE, quote = "", comment.char = ""). Inspecteer het geïmporteerde object met str(), head() en colnames() om te bevestigen dat:
      1. De eerste kolom bevat genidentificaties (bijv. AccID). De overige kolommen bevatten tellingen op steekproefniveau.
  3. Standaardiseer datatypen en los gedupliceerde genidentificaties op
    1. Definieer voorbeeldkolommen als alle kolommen behalve de kolom genidentificatie (AccID). Dwing alle steekproefkolommen tot gehele getallen tellingen. Vouw gedupliceerde genidentificaties in door tellingen op te tellen over rijen die dezelfde AccID delen.
    2. Converteer de opgevouwen tabel naar een standaard dataframe. Stel rijnamen in op de genidentificatie en verwijder de identificatiekolom uit de telmatrix.
  4. Controleer de structuur van de telmatrix
    1. Bevestig dat de telmatrix 12 voorbeeldkolommen heeft. Bevestig dat de voorbeeldkolomnamen het formaat AB_1..AB_4, CB_1..CB_4 en MB_1.MB_4 volgen.
    2. Stop de uitvoering als de telmatrix niet uit 12 kolommen bestaat.
  5. Maak en valideer voorbeeldmetadata
    1. Maak een voorbeeld metadatatabel (colData) met de volgende kolommen:
      1. Voorbeeld: unieke steekproefidentificaties die overeenkomen met de kolomnamen van de telmatrix. Groep: Biologische aandoening toegewezen aan elk monster.
    2. Haal de bijbehorende voorbeeldannotaties voor dataset GSE162535 op uit de Gene Expression Omnibus (GEO).
    3. Controleer elke steekproefidentiteit met behulp van GEO-toelatingsinformatie en voorbeeldannotatievelden die de experimentele conditie beschrijven. Koppel elke monsteridentificatie in de telmatrix aan de geverifieerde GEO-annotatie.
    4. Ken elk geverifieerd monster toe aan een van de volgende groepen: controlehersenen (CB), experimentele cerebrale malariahersenen (MB), of met artesunate behandelde experimentele cerebrale malariahersenen (AB).
    5. Rangschik de metadatatabel zodat de volgorde van de steekproef overeenkomt met de kolomvolgorde van de telmatrix.
    6. Vergelijk de voorbeeldidentificaties in de metadatatabel met de telmatrix om één-op-één correspondentie te bevestigen. Codeer de groepsvariabele als factor met niveaus geordend als CB, MB en AB.
    7. Stel CB in als referentieniveau om de controlegroep te definiëren als basis voor downstream differentiële expressieanalyse.
    8. Stel de rijnamen van de metadatatabel gelijk aan de voorbeeldidentificaties.
      OPMERKING:Groepslabels werden niet uitsluitend toegekend op basis van de volgorde van de monsters in de telmatrix. Steekproefidentiteiten werden onafhankelijk geverifieerd met behulp van GEO-metadata en accessie-informatie voordat ze werden uitgelijnd met de expressiematrix om de reproduceerbaarheid te verbeteren en het risico op misclassificatie van steekproeven te verminderen.

3. Bouw de DESeq2-dataset op en voer basiskwaliteitscontrole uit

  1. Saneer de telmatrix
    1. Vervang ontbrekende waarden in de telmatrix door nul. Bevestig de afwezigheid van ontbrekende waarden met kolomwijze is.na()-samenvattingen.
  2. Maak de DESeq2-dataset aan
    1. Maak een DESeqDataSet aan met DESeqDataSetFromMatrix() met: countData = counts; colData = sample_info; Design = ~ groep.
  3. Filtergenen met een laag aantal
    1. Verwijder genen met totale tellingen <10 over alle monsters met behulp van dds <- dds[rowSums(counts(dds)) >= 10, ]. Noteer het aantal behouden genen door de objectsamenvatting af te drukken.
  4. Evalueer de grootte van bibliotheken
    1. Bereken de bibliotheekgroottes als de kolomsommen van de gefilterde telmatrix. Genereer een balkplot ter grootte van een bibliotheek en sla die op als results/fig/library_sizes.pdf.
    2. Inspecteer de bibliotheekgrootte plot en bevestig dat geen enkel monster een extreme sequencingdiepte heeft die niet overeenkomt met het onderzoeksontwerp.

4. Voer DESeq2 uit en genereer transformatieobjecten voor visualisatie

  1. Paste het DESeq2-model
    1. Voer differentiële expressiemodellering uit met dds <- DESeq(dds). Bebehoud het fitted DDS-object voor alle extractie van downstream resultaten.
  2. Maak getransformeerde expressiematrices
    1. Bereken de geregulariseerde logtransformatie met rld <- rlog(dds, blind = FALSE). Bereken de variantie-stabiliserende transformatie met vsd <- vst(dds, blind = FALSE). Gebruik RLD en VSD voor PCA, clustering en heatmaps.
      OPMERKING: Gebruik blind = FALSE om de groepsafhankelijke variantiestructuur te behouden.

5. Voer globale kwaliteitscontrole uit met PCA en clustering van monster-naar-sample afstand clustering

  1. Genereer hoofdcomponentanalyse (PCA)
    1. Bereken PCA met plotPCA(rld, intgroup = "groep", returnData = TRUE). Extract-procentvariantie uitgelegd voor PC1 en PC2. Plot PC1 versus PC2 met ggplot2, labelen punten op monsternaam en kleur op groep.
    2. Bewaar de PCA-grafiek als resultaten/afb. PCA_samples.pdf. Bevestig dat biologische replicaties clusteren per groep en dat geen enkel monster als uitschieter gescheiden wordt.
  2. Genereer een sampleafstandsheatmap
    1. Bereken paargewijze steekproefafstanden met behulp van dist(t(assay(vsd))). Zet het afstandsobject om in een matrix voor visualisatie. Maak een kolomannotatietabel met de groepsfactor voor elk monster.
    2. Plot de afstandsmatrix met pheatmap() en sla op als results/fig/sample_distance_heatmap.pdf. Bevestig dat de monsters voornamelijk per groep clusteren.

6. Bereken de differentiële expressie voor de drie primaire contrasten

  1. Definieer de contrasten
    1. Definieer het ziekte-effect als ECM versus controle: MB versus CB. Definieer het behandeleffect binnen ECM als artesunate-behandeld versus ECM: AB versus MB. Definieer behandeling versus baseline als artesunate-behandeld versus controle: AB versus CB.
  2. Extraheren DESeq2-resultaten met log2-fold-change shrinkage
    1. Haal ruwe resultaten voor elk contrast uit met behulp van resultaten(dds, contrast = c("groep", groepA, groepB)). Verklein log2-vouwveranderingen met lfcShrink(dds, contrast = c("groep", groepA, groepB), res = res, type = "normaal").
    2. Converteer resultaten naar een dataframe en sla de genidentificatie op als een kolom genaamd gene_id. Volgorde resultaten op nominale p-waarde voor stabiele rapportage.
    3. Sla elke volledige resultaattabel op in resultaten/tabellen/ als:
      1. DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv
        OPMERKING: Als krimp faalt door de pakketconfiguratie, voer dan opnieuw uit met een alternatief krimptype dat in de lokale installatie wordt ondersteund.
  3. Definiër significantiedrempels en exporteer significante gensets
    1. Definieer differentieel uitgedrukte genen (DEGs) met behulp van: aangepaste p-waarde (FDR) < 0,05 en absolute log2-voudige verandering ≥ 1. Filter elk contrast om genen met ontbrekende aangepaste p-waarden uit te sluiten.
    2. Exporteer belangrijke DEG-tabellen naar: resultaten/tabellen/DESeq2_MB_vs_CB_sig.csv, resultaten/tabellen/DESeq2_AB_vs_MB_sig.csv, resultaten/tabellen/DESeq2_AB_vs_CB_sig.csv
  4. Vat DEG-tellingen per contrast samen
    1. Bereken het aantal significante genen per contrast. Sla de samenvattingstabel op als resultaten/tabellen/DE_summary_counts.csv.

7. Genereer vulkaangrafieken voor elk contrast.

  1. Maak een vulkaanplotfunctie.
    1. Bereken -log10 (aangepaste p-waarde) voor elk gen. Classificeer elk gen als Up, Down of Niet Significant met behulp van de drempels: FDR < 0,05 en |log2FC| ≥ 1.
    2. Plot log2FC (x-as) versus -log10(FDR) (y-as) met ggplot2. Voeg gestreepte drempellijnen toe bij log2FC = ±1 en -log10(0,05).
  2. Exportvulkaanpercelen
    1. Sla elke grafiek op als PDF in results/fig/: volcano_MB_vs_CB.pdf, volcano_AB_vs_MB.pdf, volcano_AB_vs_CB.pdf.
      OPMERKING: Gebruik consistente aslimieten over contrasten om visuele vergelijking tussen figuren te ondersteunen.

8. Genereer MA-grafieken voor elk contrast

  1. Exporteer MA-plots naar één enkele PDF.
    1. Open een PDF-apparaat genaamd results/fig/MA_plots.pdf. Plot MA-plots voor elk ruwe DESeq2-resultaatobject met behulp van plotMA(). Label elk perceel met de contrastnaam. Sluit het PDF-apparaat.

9. Genereer expressie-heatmaps voor globale variabiliteit en contrastspecifieke DE-genen.

  1. Plot de genen met de hoogste variabele over alle monsters.
    1. Bereken rijwijs variantie over monsters uit de VSD-assaymatrix. Selecteer de top 100 meest variabele genen. Gemiddeld elk gen over de monsters heen.
    2. Genereer een heatmap met pheatmap() met voorbeeldgroepannotaties. Bewaar de figuur als resultaten/fig/heatmap_top100_variable_genes.pdf.
  2. Plot de bovenste differentieel tot expressie gebrachte genen voor elk contrast.
    1. Selecteer de top 50 genen op aangepaste p-waarde voor elk contrast. Extraheer hun VSD-expressiematrix en het gemiddelde centrum per gen. Genereer een heatmap voor elk contrast en sla op als:
    2. Resultaten/Fig/heatmap_top50_MB_vs_CB.pdf, Resultaten/Fig/heatmap_top50_AB_vs_MB.pdf, Resultaten/Fig/heatmap_top50_AB_vs_CB.pdf
      OPMERKING: Verhoog de breedte en hoogte van de PDF als rijlabels zijn ingeschakeld.

10. Gerichte immunomarker-analyse uitvoeren.

  1. Vat geselecteerde immuungenen samen over contrasten.
    1. Definieer een immuunmarkerset: Il6, Il1b, Il10, Tnf, Ifng, Il21 en Icam1. Haal log2FC, p-waarde en aangepaste p-waarde voor deze genen uit elke contrastresultaattabel.
    2. Voegt de drie contrastsamenvattingen samen op genidentificatie. Sla de samengevoegde tabel op als resultaten/tabellen/immune_genes_summary.csv.
  2. Genereer een immuunmarker-heatmap (rlog).
    1. Identificeer immuungenen die aanwezig zijn in de getransformeerde assaymatrix. Extraheer de rlog-expressiematrix voor de aanwezige immuungenen.
    2. Middelpuntexpressie door gen. Genereer en sla de heatmap op in results/fig/heatmap_immune_genes.pdf.

11. Uitgebreide immuunpanelanalyse uitvoeren op functionele categorie

  1. Definieer immuunpanelen.
    1. Definieer immuunmarkerpanelen per categorie, waaronder: Pro-inflammatoire cytokines en interferonresponsgenen, anti-inflammatoire en regulatoire genen, chemokines, microgliale activatiemarkers, astrocytenmarkers, BBB- en endotheelactivatiemarkers, T-celmarkers en uitputtingsmarkers, monocyten/macrofagen, complementroutegenen en genen voor oxidatieve stress en celdood.
  2. Haal de immuunpaneel DE-resultaten uit voor elk contrast.
    1. Maak een mappingtabel van gensymbolen naar immuuncategorieën. Filter elke contrastresultaattabel op de genen van het immuunpaneel. Voeg de categoriemapping aan bij elke gefilterde resultaattabel.
    2. Verbind de drie contrast-specifieke immuuntabellen tot één tabel. Sla de gecombineerde tabel op als resultaten/tabellen/immune_panels_DE_all_contrasts.csv. Genereer een geclassificeerde immuunpaneel-expressie-heatmap.
    3. Identificeer immuunpanelgenen die aanwezig zijn in de rld-assaymatrix. Voeg categorielabels toe aan rijnamen om de panelclassificatie in de figuur te behouden. Plot de rlog-heatmap met voorbeeldgroepannotaties.
  3. Sla de output op.
    1. Sla op als: results/fig/heatmap_immune_panels_all.pdf, results/fig/heatmap_immune_panels_all.png

12. Genereer immune-overlay vulkaanplotten

  1. Maak vulkaanplots met immune-overlay.
    1. Markeren genen als immuun of niet-immuun door het immuunpaneel te koppelen aan elke contrastresultaattabel. Plot alle niet-immuungenen als grijze achtergrondpunten. Plot immuungenen gekleurd op immuuncategorie op de voorgrond. Voeg drempellijnen toe bij log2FC = ±1 en -log10(0,05).
  2. Exporteer immune-overlay vulkaanplotten.
    1. Bewaar MB vs CB immune-overlay vulkaanplots als:
      1. Resultaten/fig/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.pdf
      2. Resultaten/Fig/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.png
    2. Sla AB versus MB immune-overlay vulkaangrafieken op als:
      1. Resultaten/fig/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.pdf
      2. Resultaten/fig/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.png
        OPMERKING: Gecureerde immuungenpanelen werden vooraf gedefinieerd en gegroepeerd in functionele categorieën; de volledige lijst van gensymbolen met annotaties is opgenomen in Aanvullende Tabel S1. Deze tabel zorgt voor transparantie en reproduceerbaarheid, waardoor direct hergebruik en validatie van panelgebaseerde analyses over de studies heen mogelijk is.

13. Functionele verrijkingsanalyse uitvoeren (GO en KEGG)

  1. Definieer gensets voor verrijking
    1. Voor elk contrast (MB versus CB en AB versus MB) wordt significant differentieel tot expressie gedrukte genen (DEGs) geëxtraheerd met een aangepaste p-waarde drempel van < 0,05 en een absolute log₂ fold-change drempel ≥ 1.
    2. Splits DEG's in opgereguleerde genen (log₂FC > 0) en downreguliere genen (log₂FC < 0).
  2. Definieer de achtergrondgenset (universum)
    1. Gebruik alle genen die na telfiltering in de DESeq2-dataset zijn behouden als achtergronduniversum. Haal gensymbolen uit het gefilterde DESeq2-object. Converteer achtergrondgensymbolen naar Entrez-identifiers met behulp van de bitr()-functie met org. Mm.eg.db.
      OPMERKING: Het gebruik van een consistente achtergrondgenenset zorgt voor onbevooroordeelde verrijkingsresultaten.
  3. Kaartgenidentificaties voor verrijking
    1. Converteer gensymbolen van elke DEG-set naar Entrez-identifiers met behulp van bitr(). Behoud alleen succesvol gemapte genen voor KEGG-verrijking. Sla verrijkingsanalyse over voor een genenset als er geen genen succesvol zijn gemapt.
      OPMERKING: Verrijking van genontologie (GO) gebruikt gensymbolen, terwijl KEGG-verrijking Entrez-identificaties vereist.
  4. Genontologie (GO) verrijking uitvoeren (Biologisch Proces)
    1. Voer GO-verrijking uit met enrichGO() met OrgDb = org. Mm.eg.db. Set keyType = "SYMBOL" en ontologie (ont) = "BP". Specificeer het universum als alle gefilterde gensymbolen uit de DESeq2-dataset.
    2. Gebruik pAdjustMethod = "BH" voor meervoudige testcorrectie. Pas significantiedrempels toe van pvalueCutoff = 0,05 en qvalueCutoff = 0,05. Beperk de grootte van gensets met minGSSize = 10 en maxGSSize = 500.
    3. Exporteer GO-verrijkingsresultaten naar de results/tables/directory. Genereer barplots van top-verrijkte GO-termen en sla op tot resultaten/fig/.
  5. Voer KEGG-padverrijking uit
    1. Voer KEGG-verrijking uit met enrichKEGG() met organisme = "mmu". Geef Entrez-identificaties van DEG-sets als invoergenen. Gebruik de gemapte Entrez-achtergrond als het universum.
    2. Apply pAdjustMethod = "BH". Gebruik significantiedrempels van pvalueCutoff = 0,05 en qvalueCutoff = 0,05. Beperk de grootte van gensets met minGSSize = 10 en maxGSSize = 500.
    3. Exporteer KEGG-verrijkingstabellen naar resultaten/tabellen/. Genereer barplots van verrijkte KEGG-paden en sla op tot resultaten/fig/.
      OPMERKING: KEGG-verrijking levert mogelijk geen resultaten op als genmapping onvoldoende is; Dergelijke gevallen worden afgehandeld zonder de workflow te onderbreken.

14. Voer uitsluitend immuunverrijkingsanalyse uit (optionele module)

  1. Construeer immuun-specifieke gensets
    1. Definieer immuunpanelgenen op basis van gecureerde functionele categorieën. Kruis DEG-lijsten met immuunpanelgenen. Splits immuun-specifieke DEG's op in upregulatie- en downgereguleerde sets voor elk contrast.
  2. Verrijking uitvoeren op immuunspecifieke genensets.
    1. Pas dezelfde GO- en KEGG-verrijkingsprocedures toe die in Sectie 13 zijn beschreven. Gebruik identieke achtergrond-universum en parameterinstellingen. Sla uitvoeren op met bestandsnamen die het label "immuun" bevatten om ze te onderscheiden van globale verrijkingsresultaten.

15. Genereer verrijkingspuntplots (optionele module)

  1. Resultaten van belastingverrijking.
    1. Importeer GO- of KEGG-verrijkingstabellen uit de resultaten/tabellen/directory.
  2. Transformeer verrijkingsmetrics.
    1. Converteer GeneRatio-waarden van fractioneel formaat (x/y) naar numerieke verhoudingen. Bereken −log₁₀(aangepaste p-waarden) voor visualisatie.
  3. Genereer dot plots.
    1. Plot de genverhouding op de x-as en beschrijvingen van verrijkte termen op de y-as. Schaal de stippengrootte op genentelling en kleur op −log₁₀ (aangepaste p-waarde).
    2. Selecteer de beste verrijkte termen op basis van aangepaste p-waarderangschikking. Sla dotplots op als PDF- en PNG-bestanden in de resultaten/fig/directory.

16. Sessie-informatie opslaan en de run afronden

  1. Sessie-informatie exporteren.
    1. Sla sessionInfo()-output op in results/sessionInfo.txt om R-versie en pakketversies te documenteren.
  2. Bevestig succesvolle voltooiing
    1. Bevestig dat de workflow het volgende genereerde: Figuren in resultaten/fig/, tabellen in resultaten/tabellen/.
    2. Bevestig dat de drie primaire contrastuitgangen bestaan en niet leeg zijn: DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Datakwaliteitsbeoordeling en globale transcriptomische structuur

RNA-seq-gegevens uit 12 hersenmonsters (CB, MB, AB; n = 4 per groep) werden verwerkt met behulp van de gestandaardiseerde workflow. Na het filteren van genen met een laag aantal (≥10 totale tellingen), werd de dataset behouden voor downstream analyses. Principal component analyse (PCA) van rlog-getransformeerde tellingen toonde scheiding van monsters per experimentele groep aan, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie presenteert een reproduceerbare, op DESeq2 gebaseerde workflow voor de analyse van bulk RNA-seq-gegevens over vooraf gedefinieerde biologische contrasten. Het protocol integreert gestandaardiseerde preprocessing, geverifieerde metadata-toewijzing, normalisatie, differentiële expressietesten en gestructureerde downstream-outputs, waardoor consistente en transparante generatie van transcriptomische resultaten mogelijk is. Door expliciet analytische stappen en parameters te defi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs hebben geen erkenningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
clusterProfiler (R-pakket)BioconductorRRID:SCR_016884Functionele verrijkingsanalyse (GO en KEGG-paden)
DESeq2 (R-pakket)BioconductorRRID:SCR_015687Differentiële expressieanalyse van op tellen gebaseerde RNA-seq-gegevens
ggplot2 (R-pakket)CRANRRID:SCR_014601Visualisatie van PCA-plots, vulkaanplots en samenvattingsfiguren
GitHub (optioneel)GitHub Inc.RRID:SCR_002630Versiebeheer en delen van reproduceerbare scripts
HTSeq-count RNA-seq-dataset (GSE162535)NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)RRID:SCR_005012Bulk RNA-seq-tellingmatrix gebruikt als invoer voor analyse
matrixStats (R-pakket)CRANRRID:SCR_016361Efficiënte berekening van rij-/kolomstatistieken (bijv. variantie)
openxlsx (R-pakket)CRANRRID:SCR_019215Export van resultaattabelen naar Excel-formaat
BesturingssysteemMicrosoft / Apple / LinuxN/AWindows 10+, macOS of Linux ondersteund
org.Mm.eg.db (R-pakket)BioconductorRRID:SCR_002815Muisgen-annotatiedatabase voor gen-ID-toewijzing
PDF-viewerWillekeurigN/ABekijk uitvoerfiguren (PCA, heatmaps, vulkaanplots)
Persoonlijke computer of werkstationWillekeurigN/AMinimaal 16 GB RAM aanbevolen voor RNA-seq-analyse
pheatmap (R-pakket)CRANRRID:SCR_016418Heatmapvisualisatie van genexpressie en clustering
R Statistisch Software (versie ≥ 4.2)R Foundation for Statistical ComputingRRID:SCR_001905Kernberekeningsomgeving voor alle RNA-seq-analyse
RColorBrewer (R-pakket)CRANRRID:SCR_015742Kleurenpaletten voor heatmaps en plots
RStudio DesktopPosit SoftwareRRID:SCR_000432Geïntegreerde ontwikkelomgeving (IDE) voor scripting en reproduceerbaarheid
Voorbeeldbeschrijvingsbestand (CSV-indeling)Gegenereerd / GEO-annotatieN/AGezonde voorbeeldannotatie die monsters koppelt aan CB-, MB- en AB-groepen
stringr (R-pakket)CRANRRID:SCR_019195Stringverwerking voor verrijkingsvisualisatie en -opmaak
tibble (R-pakket)CRANRRID:SCR_019186Gegevensframeverwerking en nette gegevensstructuren
tidyverse (R-pakketsuite)CRANRRID:SCR_019186Gegevensmanipulatie, transformatie en visualisatie
```

Referenties

  1. Storm J, Craig AG. Pathogenesis of cerebral malaria—inflammation and cytoadherence. Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:100.
  2. Hinduja S, Kunieda M. Modelling of ECM and EDM processes. CIRP Annals. 2013 Jan 1;62(2):775–97.
  3. Soares SMA, Gualberto ACM, da Costa AC, Gonçalves DA, Gameiro J. A high-fat diet protects C57BL/6 mice from Plasmodium berghei ANKA infection in an experimental malaria study. Front Trop Dis. 2023;4:1188902.
  4. Manzoni G, Try R, Guintran JO, Christiansen-Jucht C, Jacoby E, Sovannaroth S, Zhang Z, Banouvong V, Shortus MS, Reyburn R, Chanthavisouk C. Progress towards malaria elimination in the Greater Mekong Subregion: perspectives from the World Health Organization. Malaria Journal. 2024 Mar 1;23(1):64.
  5. Wang Q, Tang Y, Pan Z, Yuan Y, Zou Y, Zhang H, et al. RNA-seq-based transcriptome analysis of the anti-inflammatory effect of artesunate in early treatment of a mouse cerebral malaria model. Mol Omics. 2022;18(8):716–30.
  6. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15(12):550.
  7. Anders S, Huber W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 2010;11(10):R106.
  8. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40.
  9. McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(10):4288–97.
  10. Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 2016;17:13.
  11. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284–7.
  12. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013 Jan 16;14(1):7.
  13. Shen-Orr SS, Gaujoux R. Computational deconvolution: extracting cell type–specific information from heterogeneous samples. Curr Opin Immunol. 2013;25(5):571–8.
  14. Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545–50.
  15. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNA sequencing: the teenage years. Nat Rev Genet. 2019;20(11):631–56.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Immunologie en InfectieEditie 233Editie 233Lege waardeEditieBulk-RNA-sequencingTranscriptomische analyseneuro-inflammatieArtesunaatbehandelingDifferentiële genexpressieProfilering van immuunroutes

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.