$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle experimenten met Caenorhabditis elegans werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumorganismen aan de Beijing Normal University.
Figuur 1: Overzicht van CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging bij C. elegans. Schematische workflow die de belangrijkste fasen van endogene fluorescerende knock-in generatie en validatie illustreert. In de ontwerp- en constructiefase worden een door kiemlijn verrijkt doelgen en insertieplaats geselecteerd, pDD162 wordt gebruikt als CRISPR/Cas9-plasmide voor Cas9- en gidsRNA-expressie, en pPD95.75 als donorruggengraat waarin de fluorescerende tag (bijv. GFP) en de linker- en rechterhomologiearmen worden gesubkloond. In de micro-injectiefase wordt het CRISPR/Cas9-injectiemengsel (inclusief het gRNA/Cas9-plasmide, donortemplate en co-injectiemarkers) toegediend in de gonade van jonge volwassen hermafrodieten, gevolgd door herstel op zaadplaten. In de validatiefase worden marker-positieve nakomelingen geselecteerd voor downstream genotypering, inclusief PCR-gebaseerde identificatie van knock-in gebeurtenissen en bevestiging door DNA-sequencing, en succesvolle knock-in lijnen worden vervolgens onderzocht met fluorescentiemicroscopie om de kiemlijnexpressie en subcellulaire lokalisatie van het getagde eiwit te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Selecteer een kiemlijnverrijkt doelgen
- Identificeer kandidaatgenen met overheersende expressie in de gonade of kiemcellen met behulp van openbare databases en gepubliceerde literatuur.
- Kies een geschikte taggingplaats op basis van eiwitkenmerken. Noteer de geselecteerde isoform en de plek van de tag-insertie voor downstream guide RNA en donorsjabloonontwerp (Figuur 1).
2. Ontwerp het gids-RNA en donortemplate
- Identificeer een 20 nt geleide-RNA (gRNA) sequentie stroomopwaarts van een protospacer-aangrenzend motief (PAM; NGG), de sequentie die nodig is voor Cas9-herkenning, en plaats deze zo dicht mogelijk bij de beoogde tag-invoegplaats.
- Evalueer kandidaat-gRNA's met behulp van een online ontwerptool (bijvoorbeeld de IDT CRISPR-ontwerptool) met het C . elegans-genoom geselecteerd. Kies een gids met een sterke voorspelde efficiëntie van het sneden op doel en zonder risicovolle voorspelde off-target locaties.
- Klon de gRNA-sequentie in het gebied tussen de U6-promotor en de gRNA-steiger binnen de CRISPR-expressieplasmide-ruggengraat.
OPMERKING: Ontwerpprimers waarin de gRNA-sequentie als overhangen wordt verwerkt. Voer PCR-amplificatie uit gevolgd door homologe recombinatie-gebaseerde assemblage, een ligatie-onafhankelijke kloonmethode die de digestie van restrictie-enzymen elimineert en eenstapsklonen direct in de expressievector15 mogelijk maakt.
- Bevestig correcte invoeging door Sanger-sequencing.
- Bouw het donorplasmide met behulp van een fluorescerende tag, geflankeerd door ongeveer 1.000 bp linker en 1.000 bp rechter homologiearmen afgeleid van de doellocus.
OPMERKING: Versterk homologiearmen van N2-genomisch DNA dat als wormlysaat is voorbereid met behulp van proteïnase K-vertering. Ontwerpprimers met 15–20 bp overlappen met de lineariseerde vector- en fluorescentietag. Assembleer de homologiearmen en tag in de ruggengraat via homologe recombinatie in één enkele reactie. Plaats de fluorescerend tag direct na het ATG-startcodon voor N-terminale tagging of vóór het stopcodon voor C-terminal tagging. Voeg een linkersequentie toe tussen het doelgen en de fluorescerende tag om een correcte eiwitvouwing en -functie te behouden. Gebruik de linker om sterische interferentie tussen de fusiepartners te verminderen en zorg ervoor dat zowel de linker als de tag in het frame met de coderingssequentie worden geplaatst. Selecteer de insertieplaats zorgvuldig om te voorkomen dat bekende of voorspelde functionele domeinen, signaalpeptiden of transmembrane gebieden worden verstoord (Aanvullend Dossier 1).
- Introduceer stille substituties in de donorhomologe templatesequentie om de PAM- of guide-bindingssequentie te verstoren zonder de eiwitsequentie te veranderen en Cas9 herknipping na integratie te voorkomen.
OPMERKING: Integreer synonieme puntmutaties in primers die worden gebruikt voor homologiearmamplificatie, gericht op codons binnen de PAM-regio.
- Bevestig de integriteit van donorsequenties over zowel homologiearmen als tagverbindingen door Sanger-sequencing.
OPMERKING: Bewaar geverifieerde plasmiden bij −20 °C voor kortdurende opslag of −80 °C voor langdurige opslag.
3. Bereid het injectiemengsel voor
- Stel het injectiemengsel samen door het CRISPR-expressieplasmide, het donorplasmide (geconstrueerd op basis van pPD95.75) en co-injectiemarkers in steriele ddH₂O te combineren tot een eindvolume van 10 μL bij de concentraties vermeld in Tabel 1.
OPMERKING: Optimaliseer concentraties empirisch om de leesbaarheid van markers, kandidaatherstel en overleving na injectie in balans te brengen.
- Centrifugeer het injectiemengsel op 10.000 × g gedurende 10–20 minuten om het deeltjesmateriaal te pelleten en verstopping van de microinjectie-capillair te voorkomen.
| Component | Functie | Werksconcentratie (ng/μL) |
| pDD162 | CRISPR/Cas9-plasmide (Cas9- en gRNA-expressie) | 50-100 |
| Donor plasmide (pPD95,75 ruggengraat) | HDR-donortemplate met fluorescerende tag, geflankeerd door ~1 kb homologiearmen | 50-100 |
| pRF4 | Co-injectiemarker (Rollerfenotype) | 50-100 |
| pPD122.11 | Co-injectiemarker (GFP-expressie) | 5-10 |
| Steriel ddH2O | Breng naar het laatste deel | – |
Tabel 1: Samenstelling van injectiemengsels en plasmidfuncties. Het injectiemengsel bevat CRISPR-expressieplasmide, donorplasmide, pRF4 en pPD122.11 bij de aangegeven concentraties, voor een totaal volume van 10 μL.
4. Laad en bereid de injectienaald voor
- Trek glazen haarvaten naar microinjectienaalden met een naaldtrekker die zo is ingesteld dat een lange taps toelopende punt met een scherpe punt wordt geproduceerd, geschikt voor gonadale injectie.
OPMERKING: Optimaliseer de parameters van de trekker empirisch. Voorbeelden van startparameters: warmte = 540, trek = 20, snelheid = 100.
VOORZICHTIG: Behandel getrokken naalden voorzichtig om steekwonden te voorkomen. Gebruik een tang bij het hanteren van naalden en gooi gebruikte naalden weg in een scherpe verpakking.
- Verhit een microcapillaire pipet en klik deze in twee stukken om een laadinstrument te maken.
OPMERKING: Commerciële laadtippen kunnen als alternatief worden gebruikt.
- Bevestig een rubberen aspiratorbol aan het brede uiteinde van de verkorte microcapillaire pipet.
- Aspireer ongeveer 1 μL geklaarde injectiemengselsupernatant in de lader.
OPMERKING: Het exacte volume is niet cruciaal. Zorg ervoor dat de oplossing de naaldpunt vult.
- Steek de loader in de achterkant van de injectienaald en doseer voorzichtig het injectiemengsel.
- Plaats de geladen naald horizontaal gedurende 10 minuten zodat de oplossing richting de punt kan zakken en bevestig een doorlopende kolom.
- Bevestig de naald op de injectiemicroscoop en breng de punt scherp in beeld met brightfield-optiek.
- Open de naaldtip door deze voorzichtig te raken met de rand van een deklaag in halocarbonolie en test de stroming.
OPMERKING: Pas de injectiedruk aan (30–80 psi) om binnen 1 s16 een bel te genereren die ongeveer gelijk is aan de diameter van de gonade.
5. Bereid wormen voor op injectie
OPMERKING: Bereid Nematode Growth Medium (NGM) platen en M9-buffer voor zoals eerder beschreven17. Houd wormen op platen die zijn ingezaaid met Escherichia coli OP50 (hierna OP50) en voer injecties uit in de N2-achtergrond.
- Selecteer L4-hermafrodieten van een gezonde plaat en breng ze 10 uur uit bij 20 °C om jonge volwassenen met goed ontwikkelde kiembanden te verkrijgen.
- Breng wormen over naar een niet-ingezaaide plaat om bacteriële overdracht te verminderen.
- Bereid een droog 2% agarosekussen voor op een glazen glaasje en breng een druppel halocarbonolie aan.
- Breng een worm over op het agarose-kussentje met een wimperplukker.
- Immobiliseer de worm en oriënteer de gonade voor injectie.
VOORZICHTIG: Voltooi de injecties binnen 20–30 minuten om uitdroging te voorkomen.
6. Voer gonadale micro-injectie uit
Figuur 2: Lokalisatie van het distale gonadesyncytium voor micro-injectie bij jonge volwassen hermafrodieten van C. elegans. (A) Lichtveldafbeelding met lage vergroting van een gemonteerde jonge hermafrodiet. Beide gonadarmen zijn zichtbaar; De injectieplaats wordt aangegeven voor één arm (pijl) als representatief voorbeeld. Het ingebakte gebied markeert het gebied dat bij hogere vergroting in paneel B wordt weergegeven. (B) DIC-weergave met hogere vergroting van de distale gonade die overeenkomt met het ingebakte gebied in paneel A. De pijl geeft de injectiepositie aan binnen het distale gonadale syncytium, waar het injectiemengsel wordt toegediend. Schaalbalken: 100 μm (A) en 20 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Zoek een geïmmobiliseerde worm en identificeer de gonade met een objectief met lage vergroting.
- Plaats de naald met behulp van micromanipulatoren.
- Oriënteer de worm onder een hoek van 20–40° ten opzichte van de naald.
- Focus op de distale kiemlijn met een hogere vergroting.
- Beweeg de worm naar de naald en plaats de punt binnen het gonadale syncytium (Figuur 2).
- Injecteer de oplossing en bevestig de levering door zichtbare zwelling van de geslachtsvlees.
OPMERKING: Optimaliseer injectiedruk (30–80 psi), compensatiedruk (0,1–0,5 psi) en injectieduur (0,1–0,3 s).
VOORZICHTIG: Overmatige druk of volume kan een wormruptuur veroorzaken.
- Trek de naald terug en herplaats hem voor de volgende injecties.
OPMERKING: Voer een unilaterale injectie uit om de overleving te maximaliseren, of een bilaterale injectie om de montage-efficiëntie te verhogen.
- Voeg M9-buffer toe om wormen vrij te laten en breng elke worm over naar een individuele herstelplaat.
- Herhaal injecties voor 20–25 wormen.
OPMERKING: Vervang de naald als deze verstopt raakt of beschadigd raakt.
- Incubeer geïnjecteerde wormen bij 20 °C gedurende 2–3 dagen om herstel mogelijk te maken.
7. Screenen F1-kandidaten om knock-in-positieve lijnen te identificeren
- Screen F1-nakomelingen op co-injectiemarkers en selecteer marker-positieve dieren.
OPMERKING: Voorbeelden van alternatieve fluorescentie co-injectiemarkers met verschillende weefselspecificiteit en spectrale eigenschappen zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 1.
OPMERKING: Selecteer dieren die beide markers uitdrukken voor een hogere betrouwbaarheid. Prioriteer broeds met een hoge markerfrequentie ("jackpot broods").
- Breng elke F1-worm over op een apart bord en laat het eierleggen gedurende 1–2 dagen toe.
- Lys elke F1-worm in een proteïnase K-buffer om PCR-templates voor te bereiden.
OPMERKING: Bewaar lysaten bij −80 °C als ze niet direct worden verwerkt.
- Voer junction PCR uit met één genomische primer buiten de homologiearm en één interne tagprimer.
OPMERKING: Houd de bijbehorende platen van PCR-positieve F1-dieren behouden.
8. Screenen F2-nakomelingen om homozygote knock-in lijnen te isoleren en integratie te bevestigen
- Isoleer F2-nakomelingen van PCR-positieve F1-lijnen op individuele platen.
- Laat F2-wormen nakomelingen produceren en de volwassen mensen steriliseren voor genotypering.
OPMERKING: bewaar lysaten op −20 °C indien nodig.
- Voer PCR uit met primers die de homologiearmen flankeren om wildtype- en knock-in allelen te onderscheiden op productgrootte.
- Bevestig correcte integratie door Sanger-sequencing over beide insertieverbindingen.
- Controleer de expressie en lokalisatie van de kiemlijn met behulp van fluorescentiemicroscopie.
- Breid bevestigde homozygote lijnen uit en houd voorraden aan.
OPMERKING: Cryopreserve gevalideerde lijnen voor langdurige opslag.