Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwitlokalisatie in de caenorhabditis elegans (C. elegans) kiemlijn is centraal bij het interpreteren van genfunctie tijdens gametogenese, maar conventionele transgenbenaderingen leveren vaak variabele expressie op en kunnen in kiemcellen worden geneutraliseerd. Hier wordt een praktische CRISPR/Cas9-workflow beschreven waarbij een fluorescerende tag in een endogene locus wordt geplaatst, waardoor stabiele knock-in allelen kunnen worden gegenereerd die eiwitdistributie rapporteren onder native regulatie. Het protocol omvat de belangrijkste fasen van de procedure: het kiezen van een taggingstrategie die geschikt is voor het doeleiwit, het toedienen van CRISPR-reagentia via gonadale microinjectie aan jonge volwassen hermafrodieten, en het terughalen van geïnjecteerde dieren voor screening. Knock-in kandidaten worden geïdentificeerd via PCR-gebaseerde genotypering over twee generaties om homozygote wormen te isoleren en het bewerkte allel te verifiëren. Tot slot wordt confocale microscopie gebruikt om de fluorescentie van de kiemlijn te verifiëren en subcellulaire lokalisatie in vivo te beoordelen. De workflow is ontworpen om reproduceerbaar en breed toepasbaar te zijn op genen die met kiemlijnen verrijkt zijn, en biedt een eenvoudige route om homozygote getagde stammen vast te stellen voor ontwikkelings- en celbiologische analyses.
Inleiding
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed gevestigd model voor het bestuderen van voortplantingsontwikkeling en gametogenese, vanwege zijn korte levenscyclus, transparante lichaam en hoge genetische tractabiliteit1. C. elegans bestaat voornamelijk als zelfbevruchtende hermafrodieten, waarvan de gonade eerst spermatogenese ondergaat en vervolgens overschakelt naar oogenese. Deze voortplantingsmodus vereenvoudigt het onderhoud van de spanning en maakt het eenvoudig om homozygote lijnen2 te verkrijgen. Recente ruimtelijke transcriptomics hebben de lijst van genen die in de gonade zijn verrijkt aanzienlijk uitgebreid en uitgesproken geslachtsspecifieke expressiepatronen in het voortplantingssysteem bij C. elegans3 aan het licht gebracht. Meer recentelijk heeft single-cell RNA-sequencing reconstructie van kiemcelontwikkelingstrajecten en het afleiden van genregulatienetwerken die spermatogenese beheersenmogelijk gemaakt. Samen genereren deze datasets rijke kandidatenlijsten, maar functionele interpretatie vereist vaak het observeren van eiwitgedrag in vivo—specifiek het definiëren wanneer en waar de overeenkomstige eiwitten zich lokaliseren en hoe hun patronen veranderen gedurende de ontwikkeling van de kiemlijn.
Conventionele transgenese bij C. elegans is vaak afhankelijk van gonadale micro-injectie van plasmide-DNA, die gemakkelijk multi-kopie extrachromosomale arraysgenereert 5. In de kiemlijn worden deze arrays echter vaak robuust gedempt, een mechanisme waarvan wordt gedacht dat het helpt de integriteit van de kiemlijn te behouden door expressie van repetitief DNA te beperken, waardoor de kiemlijnfunctie en de stabiliteit van genetische informatie over generaties 6,7 behouden blijven. Als gevolg hiervan kunnen transgenexpressieconstructies die gemakkelijk tot expressie komen in somatische weefsels zwak of inconsistent zijn in de kiemlijn. Zelfs wanneer expressie detecteerbaar is, kunnen copy-number-effecten en geengineerde regulerende elementen de eiwitdosering en timing verschuiven, wat mogelijk conclusies over native localisatie en dynamiek kan verwarren. Om deze beperkingen aan te pakken, worden microdeeltjesbombardement en Mos1-gemedieerde Single Copy Insertion (MosSCI) veel gebruikt om geïntegreerde transgene lijnen 8,9,10 met lage of enkele kopie te genereren. Deze benaderingen kunnen de expressie in de kiemlijn verbeteren, maar verschillen in kosten, doorvoer en hoe goed ze endogene regulatie reproduceren. CRISPR/Cas9-genoombewerking biedt een directere route door een fluorescerende tag in te brengen op het endogene locus via homologiegerichte reparatie, waarmee stabiele knock-in allelen worden gegenereerd die eiwitlokalisatie en -dynamiek rapporteren onder native regulatiecontrole 11,12,13,14.
Hier wordt een praktische workflow beschreven voor CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging in C. elegans , toegepast op genen die zijn geselecteerd op basis van gerapporteerde door kiemlijnen verrijkte expressiepatronen. Het protocol beschrijft doelselectie, het ontwerp van donortemplate en -guide-RNA, gonadale micro-injectie en downstream screening om homozygote knock-in lijnen te isoleren, gevolgd door validatie met genotypering. Deze benadering is breed toepasbaar op door kiemlijnen uitgedrukte genen over ontwikkelingsstadia heen en maakt kwantitatieve analyses van eiwitlokalisatie en -dynamiek in vivo mogelijk. Deze workflow biedt een praktische strategie voor het taggen van genen die in de kiemlijn worden uitgedrukt en voor het analyseren van eiwitlokalisatie en -dynamiek in vivo onder native regulatiecontrole.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten met Caenorhabditis elegans werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumorganismen aan de Beijing Normal University.
Figuur 1: Overzicht van CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging bij C. elegans. Schematische workflow die de belangrijkste fasen van endogene fluorescerende knock-in generatie en validatie illustreert. In de ontwerp- en constructiefase worden een door kiemlijn verrijkt doelgen en insertieplaats geselecteerd, pDD162 wordt gebruikt als CRISPR/Cas9-plasmide voor Cas9- en gidsRNA-expressie, en pPD95.75 als donorruggengraat waarin de fluorescerende tag (bijv. GFP) en de linker- en rechterhomologiearmen worden gesubkloond. In de micro-injectiefase wordt het CRISPR/Cas9-injectiemengsel (inclusief het gRNA/Cas9-plasmide, donortemplate en co-injectiemarkers) toegediend in de gonade van jonge volwassen hermafrodieten, gevolgd door herstel op zaadplaten. In de validatiefase worden marker-positieve nakomelingen geselecteerd voor downstream genotypering, inclusief PCR-gebaseerde identificatie van knock-in gebeurtenissen en bevestiging door DNA-sequencing, en succesvolle knock-in lijnen worden vervolgens onderzocht met fluorescentiemicroscopie om de kiemlijnexpressie en subcellulaire lokalisatie van het getagde eiwit te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Selecteer een kiemlijnverrijkt doelgen
- Identificeer kandidaatgenen met overheersende expressie in de gonade of kiemcellen met behulp van openbare databases en gepubliceerde literatuur.
- Kies een geschikte taggingplaats op basis van eiwitkenmerken. Noteer de geselecteerde isoform en de plek van de tag-insertie voor downstream guide RNA en donorsjabloonontwerp (Figuur 1).
2. Ontwerp het gids-RNA en donortemplate
- Identificeer een 20 nt geleide-RNA (gRNA) sequentie stroomopwaarts van een protospacer-aangrenzend motief (PAM; NGG), de sequentie die nodig is voor Cas9-herkenning, en plaats deze zo dicht mogelijk bij de beoogde tag-invoegplaats.
- Evalueer kandidaat-gRNA's met behulp van een online ontwerptool (bijvoorbeeld de IDT CRISPR-ontwerptool) met het C . elegans-genoom geselecteerd. Kies een gids met een sterke voorspelde efficiëntie van het sneden op doel en zonder risicovolle voorspelde off-target locaties.
- Klon de gRNA-sequentie in het gebied tussen de U6-promotor en de gRNA-steiger binnen de CRISPR-expressieplasmide-ruggengraat.
OPMERKING: Ontwerpprimers waarin de gRNA-sequentie als overhangen wordt verwerkt. Voer PCR-amplificatie uit gevolgd door homologe recombinatie-gebaseerde assemblage, een ligatie-onafhankelijke kloonmethode die de digestie van restrictie-enzymen elimineert en eenstapsklonen direct in de expressievector15 mogelijk maakt. - Bevestig correcte invoeging door Sanger-sequencing.
- Bouw het donorplasmide met behulp van een fluorescerende tag, geflankeerd door ongeveer 1.000 bp linker en 1.000 bp rechter homologiearmen afgeleid van de doellocus.
OPMERKING: Versterk homologiearmen van N2-genomisch DNA dat als wormlysaat is voorbereid met behulp van proteïnase K-vertering. Ontwerpprimers met 15–20 bp overlappen met de lineariseerde vector- en fluorescentietag. Assembleer de homologiearmen en tag in de ruggengraat via homologe recombinatie in één enkele reactie. Plaats de fluorescerend tag direct na het ATG-startcodon voor N-terminale tagging of vóór het stopcodon voor C-terminal tagging. Voeg een linkersequentie toe tussen het doelgen en de fluorescerende tag om een correcte eiwitvouwing en -functie te behouden. Gebruik de linker om sterische interferentie tussen de fusiepartners te verminderen en zorg ervoor dat zowel de linker als de tag in het frame met de coderingssequentie worden geplaatst. Selecteer de insertieplaats zorgvuldig om te voorkomen dat bekende of voorspelde functionele domeinen, signaalpeptiden of transmembrane gebieden worden verstoord (Aanvullend Dossier 1). - Introduceer stille substituties in de donorhomologe templatesequentie om de PAM- of guide-bindingssequentie te verstoren zonder de eiwitsequentie te veranderen en Cas9 herknipping na integratie te voorkomen.
OPMERKING: Integreer synonieme puntmutaties in primers die worden gebruikt voor homologiearmamplificatie, gericht op codons binnen de PAM-regio. - Bevestig de integriteit van donorsequenties over zowel homologiearmen als tagverbindingen door Sanger-sequencing.
OPMERKING: Bewaar geverifieerde plasmiden bij −20 °C voor kortdurende opslag of −80 °C voor langdurige opslag.
3. Bereid het injectiemengsel voor
- Stel het injectiemengsel samen door het CRISPR-expressieplasmide, het donorplasmide (geconstrueerd op basis van pPD95.75) en co-injectiemarkers in steriele ddH₂O te combineren tot een eindvolume van 10 μL bij de concentraties vermeld in Tabel 1.
OPMERKING: Optimaliseer concentraties empirisch om de leesbaarheid van markers, kandidaatherstel en overleving na injectie in balans te brengen. - Centrifugeer het injectiemengsel op 10.000 × g gedurende 10–20 minuten om het deeltjesmateriaal te pelleten en verstopping van de microinjectie-capillair te voorkomen.
| Component | Functie | Werksconcentratie (ng/μL) |
| pDD162 | CRISPR/Cas9-plasmide (Cas9- en gRNA-expressie) | 50-100 |
| Donor plasmide (pPD95,75 ruggengraat) | HDR-donortemplate met fluorescerende tag, geflankeerd door ~1 kb homologiearmen | 50-100 |
| pRF4 | Co-injectiemarker (Rollerfenotype) | 50-100 |
| pPD122.11 | Co-injectiemarker (GFP-expressie) | 5-10 |
| Steriel ddH2O | Breng naar het laatste deel | – |
Tabel 1: Samenstelling van injectiemengsels en plasmidfuncties. Het injectiemengsel bevat CRISPR-expressieplasmide, donorplasmide, pRF4 en pPD122.11 bij de aangegeven concentraties, voor een totaal volume van 10 μL.
4. Laad en bereid de injectienaald voor
- Trek glazen haarvaten naar microinjectienaalden met een naaldtrekker die zo is ingesteld dat een lange taps toelopende punt met een scherpe punt wordt geproduceerd, geschikt voor gonadale injectie.
OPMERKING: Optimaliseer de parameters van de trekker empirisch. Voorbeelden van startparameters: warmte = 540, trek = 20, snelheid = 100.
VOORZICHTIG: Behandel getrokken naalden voorzichtig om steekwonden te voorkomen. Gebruik een tang bij het hanteren van naalden en gooi gebruikte naalden weg in een scherpe verpakking. - Verhit een microcapillaire pipet en klik deze in twee stukken om een laadinstrument te maken.
OPMERKING: Commerciële laadtippen kunnen als alternatief worden gebruikt. - Bevestig een rubberen aspiratorbol aan het brede uiteinde van de verkorte microcapillaire pipet.
- Aspireer ongeveer 1 μL geklaarde injectiemengselsupernatant in de lader.
OPMERKING: Het exacte volume is niet cruciaal. Zorg ervoor dat de oplossing de naaldpunt vult. - Steek de loader in de achterkant van de injectienaald en doseer voorzichtig het injectiemengsel.
- Plaats de geladen naald horizontaal gedurende 10 minuten zodat de oplossing richting de punt kan zakken en bevestig een doorlopende kolom.
- Bevestig de naald op de injectiemicroscoop en breng de punt scherp in beeld met brightfield-optiek.
- Open de naaldtip door deze voorzichtig te raken met de rand van een deklaag in halocarbonolie en test de stroming.
OPMERKING: Pas de injectiedruk aan (30–80 psi) om binnen 1 s16 een bel te genereren die ongeveer gelijk is aan de diameter van de gonade.
5. Bereid wormen voor op injectie
OPMERKING: Bereid Nematode Growth Medium (NGM) platen en M9-buffer voor zoals eerder beschreven17. Houd wormen op platen die zijn ingezaaid met Escherichia coli OP50 (hierna OP50) en voer injecties uit in de N2-achtergrond.
- Selecteer L4-hermafrodieten van een gezonde plaat en breng ze 10 uur uit bij 20 °C om jonge volwassenen met goed ontwikkelde kiembanden te verkrijgen.
- Breng wormen over naar een niet-ingezaaide plaat om bacteriële overdracht te verminderen.
- Bereid een droog 2% agarosekussen voor op een glazen glaasje en breng een druppel halocarbonolie aan.
- Breng een worm over op het agarose-kussentje met een wimperplukker.
- Immobiliseer de worm en oriënteer de gonade voor injectie.
VOORZICHTIG: Voltooi de injecties binnen 20–30 minuten om uitdroging te voorkomen.
6. Voer gonadale micro-injectie uit
Figuur 2: Lokalisatie van het distale gonadesyncytium voor micro-injectie bij jonge volwassen hermafrodieten van C. elegans. (A) Lichtveldafbeelding met lage vergroting van een gemonteerde jonge hermafrodiet. Beide gonadarmen zijn zichtbaar; De injectieplaats wordt aangegeven voor één arm (pijl) als representatief voorbeeld. Het ingebakte gebied markeert het gebied dat bij hogere vergroting in paneel B wordt weergegeven. (B) DIC-weergave met hogere vergroting van de distale gonade die overeenkomt met het ingebakte gebied in paneel A. De pijl geeft de injectiepositie aan binnen het distale gonadale syncytium, waar het injectiemengsel wordt toegediend. Schaalbalken: 100 μm (A) en 20 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Zoek een geïmmobiliseerde worm en identificeer de gonade met een objectief met lage vergroting.
- Plaats de naald met behulp van micromanipulatoren.
- Oriënteer de worm onder een hoek van 20–40° ten opzichte van de naald.
- Focus op de distale kiemlijn met een hogere vergroting.
- Beweeg de worm naar de naald en plaats de punt binnen het gonadale syncytium (Figuur 2).
- Injecteer de oplossing en bevestig de levering door zichtbare zwelling van de geslachtsvlees.
OPMERKING: Optimaliseer injectiedruk (30–80 psi), compensatiedruk (0,1–0,5 psi) en injectieduur (0,1–0,3 s).
VOORZICHTIG: Overmatige druk of volume kan een wormruptuur veroorzaken. - Trek de naald terug en herplaats hem voor de volgende injecties.
OPMERKING: Voer een unilaterale injectie uit om de overleving te maximaliseren, of een bilaterale injectie om de montage-efficiëntie te verhogen. - Voeg M9-buffer toe om wormen vrij te laten en breng elke worm over naar een individuele herstelplaat.
- Herhaal injecties voor 20–25 wormen.
OPMERKING: Vervang de naald als deze verstopt raakt of beschadigd raakt. - Incubeer geïnjecteerde wormen bij 20 °C gedurende 2–3 dagen om herstel mogelijk te maken.
7. Screenen F1-kandidaten om knock-in-positieve lijnen te identificeren
- Screen F1-nakomelingen op co-injectiemarkers en selecteer marker-positieve dieren.
OPMERKING: Voorbeelden van alternatieve fluorescentie co-injectiemarkers met verschillende weefselspecificiteit en spectrale eigenschappen zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 1.
OPMERKING: Selecteer dieren die beide markers uitdrukken voor een hogere betrouwbaarheid. Prioriteer broeds met een hoge markerfrequentie ("jackpot broods"). - Breng elke F1-worm over op een apart bord en laat het eierleggen gedurende 1–2 dagen toe.
- Lys elke F1-worm in een proteïnase K-buffer om PCR-templates voor te bereiden.
OPMERKING: Bewaar lysaten bij −80 °C als ze niet direct worden verwerkt. - Voer junction PCR uit met één genomische primer buiten de homologiearm en één interne tagprimer.
OPMERKING: Houd de bijbehorende platen van PCR-positieve F1-dieren behouden.
8. Screenen F2-nakomelingen om homozygote knock-in lijnen te isoleren en integratie te bevestigen
- Isoleer F2-nakomelingen van PCR-positieve F1-lijnen op individuele platen.
- Laat F2-wormen nakomelingen produceren en de volwassen mensen steriliseren voor genotypering.
OPMERKING: bewaar lysaten op −20 °C indien nodig. - Voer PCR uit met primers die de homologiearmen flankeren om wildtype- en knock-in allelen te onderscheiden op productgrootte.
- Bevestig correcte integratie door Sanger-sequencing over beide insertieverbindingen.
- Controleer de expressie en lokalisatie van de kiemlijn met behulp van fluorescentiemicroscopie.
- Breid bevestigde homozygote lijnen uit en houd voorraden aan.
OPMERKING: Cryopreserve gevalideerde lijnen voor langdurige opslag.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Volgens het protocol werden jonge volwassen hermafrodieten gonadaal microgeïnjecteerd met een CRISPR/Cas9-plasmide (pDD162), een plasmidedonor die codeert voor een GFP knock-in tag geflankeerd door ongeveer 1 kb homologiearmen (pPD95.75), en co-injectiemarkers (pRF4 en pPD122.11). Een kiemlijnverrijkt doelgen werd gebruikt als representatief voorbeeld om een stabiel, homozygoot knock-in allel te genereren dat eiwitlokalisatie rapporteert onder native regulatiecontrole.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze workflow is ontworpen om stabiele, homozygote knock-in-lijnen te genereren waarin een fluorescerende tag wordt ingebracht op de endogene locus om eiwitlokalisatie te rapporteren onder native regulatory control 5,6,7,8,9,10. In de praktijk wordt succes het beste beoordeeld door een sequen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program van China (2023YFA1801100 tot L.M.), de Natural Science Foundation of China (32400698 tot P.W., 32270774 tot L.M.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | Component voor het bereiden van NGM agar platen |
| Agarose | NOVON | ZZ14011 | Bereid 2% agarose pads |
| Caenorhabditis elegans stam N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Injectie achtergrondstam | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425 | Helder maken van injectiemix |
| Cholesterol | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | Component voor het bereiden van NGM agar platen |
| Co-injectie marker plasmid rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | Roller marker om kandidaten te verrijken | |
| Confocale microscoop | ZEISS | LSM880 + Airyscan | Valideer GFP expressie/lokalisatie |
| Di-Kaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | Component voor het bereiden van NGM agar platen |
| Di-Natriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | Component voor het bereiden van M9 buffer |
| DNA ladder | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | Grootte referentie voor agarose gels |
| Donor plasmid backbeen (pPD95.75) | Addgene | 1494 | Backbeen voor HDR donor constructie |
| Elektroforese Systeem | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | Scheiding van PCR amplicons op agarose gels voor junction screening en zygositeit genotypering |
| Escherichia coli OP50 stam | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Voedselbron voor wormen | |
| Fluorescente co-injectie marker plasmid (pPD122.11) | Fire Lab | GFP co-marker om kandidaten te verrijken | |
| Fluorescente stereomicroscoop | SOPTOP | SZX12-HT | Screen live wormen voor fluorescente co-injectie markers |
| GelRed Nucleïnezuur Gel Stain | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF079-plus-01 | Visualisatie van DNA banden |
| Glazen capillairen | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Gebruikt met naaldpuller om injectienaalden te maken |
| Halocarbon olie 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | Voorkomen van uitdroging tijdens injectie |
| Incubator | Wuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd. | HP400S | Bewaar wormen op standaard temperatuur |
| Magnesiumsulfaat (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | Component voor het bereiden van NGM agar platen en M9 buffer |
| Microcapillaire pipetten | KIMBLE | 71900-50 | Verwarmd en gebroken om laadtool te maken |
| Microinjector eenheid | Eppendorf | FemtoJet 4i | Lever gecontroleerde drukpulsen van injectiemix in de distale gonade via een microinjectienaald (voetpedaal getriggerd) |
| Microscoop dekvlakjes | Fisherbrand | 12545A 22×30-1 | Bereid 2% agarose pads voor montage en immobilisatie van wormen tijdens micro-injectie; Open injectienaald tips tegen de rand van het dekvlakje |
| Microscoop voor micro-injectie | ZEISS | Axio Observer.A1 | Injectie microscoop |
| Naald puller | Sutter Instrument Company | Model P97 | Trek glas capillairen in injectienaalden |
| PCR thermocycler | Bio-Rad | C1000 Touch Thermal Cycler | PCR amplificatie |
| pDD162 (Peft-3::Cas9 + Lege sgRNA) | Addgene | 47549 | Cas9 + sgRNA expressie |
| Peptone | Gibco | 308723 | Component voor het bereiden van NGM agar platen |
| Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | Component voor het bereiden van NGM agar platen en M9 buffer |
| Natriumchloride (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | Component voor het bereiden van NGM agar platen en M9 buffer |
| Stereomicroscoop | Motic | K400L | Plakken en monteren wormen op agarose pads en uitvoeren van post-injectie herstel stappen |
Referenties
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).
- Ebbing, A., et al. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).
- Li, L., et al. Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells. Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Fire, A. Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans. Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).
- Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences. Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).
- Merritt, C., Seydoux, G. Transgenic solutions for the germline. WormBook. , 1-21 (2010).
- Frøkjær-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
- Vallin, E., et al. A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community. PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
- Wang, P., et al. Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).
- Khan, A. A., et al. A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants. Plant Methods. 13, 86 (2017).
- Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).
- Rieckher, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans microinjection. Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).
- Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), e833 (2008).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Sci Rep. 6, 20889 (2016).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121-122, 86-93 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
