Mannosereceptor C type 2 voorspelt een slechte uitkomst bij glioom en wordt geassocieerd met invasieve fenotypen en veranderingen β-catenine/EMT-gerelateerde

Samenvatting

Analyses van publieke cohorten en gliomacel-gebaseerde experimenten identificeren MRC2 als een marker met een slechte prognose die geassocieerd is met verhoogde proliferatie, migratie, invasie en β-catenine/EMT-gerelateerde veranderingen in glioma.

Samenvatting

Glioom blijft een dodelijke maligniteit van het centrale zenuwstelsel, en extra biomarkers die de prognostische stratificatie verbeteren en therapeutische verkenning informeren, zijn nog steeds nodig. Deze studie evalueerde mannosereceptor C-type 2 (MRC2/Endo180) door publieke transcriptomische cohorten te integreren met in vitro validatie. Expressieprofielen en gematchte klinische annotaties werden verkregen uit The Cancer Genome Atlas (TCGA) en het Genotype-Tissue Expression (GTEx) project voor tumor-normale vergelijkingen en pankankerscreening, en prognostische verbanden werden verder onderzocht in de Chinese Glioma Genome Atlas (CGGA) cohort. MRC2-expressie werd beoordeeld in gliomacellijnen met reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) en immunoblotting, en stabiele MRC2-knockdown werd gevestigd in U87- en U251-cellen met lentivirale short hairpin RNA's (shRNA's). Celgroei en clonogeniciteit werden geëvalueerd met CCK-8 en kolonievormingsassays, terwijl migratie en invasie werden beoordeeld met poreuze membraaninsert-assays. CDK4, CDK6 en β-catenine/epitheliaal–mesenchymale overgangsmarkers (EMT)-gerelateerde markers werden geanalyseerd met immunoblotting. Over de datasets heen was MRC2 verhoogd in glioom, en een hogere expressie was geassocieerd met een slechtere algehele overleving, ziekte-specifieke overleving en progressievrije interval. In vitro verminderde MRC2-depletie proliferatie, clonogeniciteit, migratie en invasie, gepaard met verlaagde CDK4- en CDK6-eiwitniveaus en veranderingen in β-catenine en EMT-gerelateerde markers. Samen ondersteunen deze bevindingen MRC2 als kandidaat voor prognostische biomarker die geassocieerd is met agressieve gliomafenotypes en rechtvaardigen ze verder mechanistisch en in vivo onderzoek.

Inleiding

Gliomen vormen de meest voorkomende primaire tumoren die ontstaan in het centrale zenuwstelsel en vormen een aanzienlijk deel van de intracraniële neoplasma's ^1,2. Epidemiologische studies schatten een incidentie van ongeveer enkele gevallen per 100.000 mensen per jaar, met geografische en seksegerelateerde verschillen die tussen populaties ^3,4 worden gerapporteerd. Klinisch beslaan gliomen een breed spectrum aan gedrag: laaggradige gliomen kunnen een langdurig verloop verlopen, terwijl hooggradige ziekte—vooral glioblastom—voor de meeste patiënten snel fataal blijft 5,6,7,8. Moderne WHO-classificaties integreren histologie met belangrijke moleculaire kenmerken (bijv. IDH-mutatie, TERT-promotorverandering, MGMT-promotormethylering en 1p/19q co-deletie), die de diagnose verfijnen en de prognose ^9,10 informeren. Ondanks multimodale behandeling die chirurgie, radiotherapie en chemotherapie combineert, is recidief vaak voorkomend en blijven de langetermijnuitkomsten voor hooggradige tumoren slecht. Daarom blijft het identificeren van extra prognostische markers en doelwitteloze kwetsbaarheden een dringende prioriteit.

MRC2 (mannosereceptor C-type 2; ook wel Endo180/CD280/uPARAP genoemd) is een transmembrane lid van de C-type lectinereceptorfamilie¹¹. Het is verrijkt in stromale en immuuncompartimenten, zoals fibroblasten en macrofagen, en neemt deel aan extracellulaire matrix (ECM) omzet, fibrose-gerelateerde remodellering en tumor–micro-omgeving interacties ^12,13. Structureel bevat MRC2 een N-terminal cysteïnerijk gebied, een fibronectine type II-domein dat collageen bindt, meerdere C-type lectine-achtige domeinen, een transmembrane segment en een cytoplasmatische staart^14,15. Door collageeninternalisatie en -remodellering kan MRC2 celmotiliteit en weefselinvasie bevorderen, en verhoogde MRC2 is in verband gebracht met agressief gedrag bij verschillende vormen van kanker, waaronder borstkanker, alvleesklierkanker, prostaat, melanoom en glioblastoom 11,14,16,17,18 . Eerder onderzoek suggereert ook verbanden tussen MRC2 en pro-invasieve signaalprogramma's (bijv. TGF-β-geassocieerde routes), matrix metalloproteïnase activiteit en EMT-achtige fenotypische veranderingen, evenals rollen in kankergeassocieerde fibroblast- en macrofagentoestanden 17,18,19,20,21 . De klinische betekenis van MRC2 bij glioom en de functionele gevolgen van MRC2-disregulatie in gliomacellen blijven echter onduidelijk.

Hoewel MRC2 in verband is gebracht met extracellulaire matrixremodellering en invasief gedrag bij verschillende maligniteiten, is de klinische relevantie bij glioom niet systematisch vastgesteld in onafhankelijke transcriptomische cohorten, en zijn de fenotype-geassocieerde effecten in gliomacellen niet geëvalueerd binnen een geïntegreerd kader dat publieke datasetanalyse combineert met functionele validatie. Deze studie stelde daarom de hypothese dat MRC2 geassocieerd is met nadelige klinische uitkomsten en maligne fenotypen bij glioom. Om deze vraag te beantwoorden werden pankankerscreening, onafhankelijke glioma-cohortvalidatie en stabiele knockdown-experimenten in gliomacellijnen geïntegreerd om de prognostische significantie van MRC2 en de associatie met proliferatie, migratie, invasie en veranderingen in β-catenine/EMT-gerelateerde markers te evalueren. Omdat MRC2 tot de mannosereceptorfamilie behoort en de progressie van het glioom ook wordt gevormd door de tumormicro-omgeving, werd een aanvullende verkennende analyse van MRC1-expressie via IDH-status opgenomen om contextuele informatie te verkrijgen over immuungerelateerde verschillen tussen glioma-subtypes.

De nieuwigheid van dit werk ligt in de gecombineerde beoordeling van MRC2 via publieke gliomadatasets en in vitro functionele assays, waarmee complementair klinisch en experimenteel bewijs wordt geleverd voor de relevantie ervan in glioma. In vergelijking met single-cohort analyses of cel-only studies biedt deze geïntegreerde workflow verschillende praktische voordelen. De integratie van TCGA, GTEx en CGGA maakt cross-cohort validatie mogelijk en vermindert de afhankelijkheid van één enkele dataset. Daarnaast koppelt het koppelen van analyses van publieke cohorten aan gliomacel-knockdown-assays klinische associaties met fenotype-niveau bewijs. Ten slotte maakt het gebruik van complementaire uitlezingen, waaronder RT-qPCR, immunoblotting, CCK-8, kolonievorming en poreuze membraan-inzetassays, het mogelijk om transcriptionele, eiwitniveau-, proliferatieve en motiliteitsgerelateerde veranderingen parallel te beoordelen. Het algemene studiedesign en de analytische workflow worden samengevat in Figuur 1. Samen verbetert deze strategie de robuustheid en biologische interpreteerbaarheid van de bevindingen ten opzichte van bio-informatica-only of single-assay-benaderingen.

Protocol

Deze studie maakte gebruik van publiek toegankelijke, gedeïdentificeerde datasets (TCGA, GTEx en CGGA) en gevestigde commerciële cellijnen. Er waren geen nieuw gerekruteerde menselijke deelnemers, identificeerbare patiëntinformatie of door patiënten afgeleide monsters betrokken. Alle analyses werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante institutionele en internationale richtlijnen voor het gebruik van openbaar beschikbare gegevens. Daarom was voor deze studie geen aanvullende institutionele ethische goedkeuring of geïnformeerde toestemming vereist.

1. Bioinformatische workflow en datapreprocessing

Genexpressieprofielen en gematchte klinische annotaties werden verkregen uit publiek beschikbare bronnen, waaronder The Cancer Genome Atlas (TCGA), het Genotype-Tissue Expression (GTEx) project en de Chinese Glioma Genome Atlas (CGGA). Expressiematrices en klinische metadata werden geïmporteerd in R en geharmoniseerd volgens steekproefidentificaties. Dubbele of niet-gematchte vermeldingen werden verwijderd en monsters zonder essentiële overlevingsinformatie werden uitgesloten van overlevingsanalyses. MRC2-expressiewaarden en bijbehorende klinisch-pathologische variabelen werden geëxtraheerd voor downstream-analyses. Voor tumor-normale vergelijkingen werd MRC2-expressie vergeleken tussen kankertypen met behulp van TCGA-only data wanneer gematchte normale weefsels beschikbaar waren en met geïntegreerde TCGA–GTEx-data wanneer aanvullende normale controles nodig waren. Voor glioma-gerichte analyses werden patiënten in de TCGA-LGG- en CGGA-cohorten gestratificeerd in groepen met hoge en lage expressie op basis van het mediane MRC2-expressieniveau van de cohort. Kaplan-Meier survivalanalyse, tijdsafhankelijke receiver operating characteristic (ROC) analyse en Cox proportional-hazards regressie werden vervolgens uitgevoerd om de prognostische relevantie van MRC2 te evalueren. Cox-modellen omvatten beschikbare covariaten zoals leeftijd, geslacht, WHO-graad en andere klinisch-pathologische variabelen, afhankelijk van de volledig data binnen elke cohort. Subgroepanalyses werden uitgevoerd op basis van variabelen zoals leeftijd, histologisch subtype, WHO-graad, IDH-mutatiestatus, 1p/19q-codeletiestatus en behandelingsgerelateerde informatie, waar beschikbaar. Figuren werden gegenereerd met behulp van standaard statistische plotwerkstromen in R en GraphPad Prism.

2. Pankanker-expressie- en overlevingsanalyses

MRC2-expressie werd vergeleken tussen tumor en normale weefsels over kankertypen heen met behulp van TCGA- en GTEx-datasets. Verschillen werden gevisualiseerd met boxplots en samengevat met radarplots. Cox proportionele hazards regressieanalyses werden uitgevoerd om associaties te evalueren tussen MRC2-expressie en algehele overleving (OS), ziekte-specifieke overleving (DSS) en progressievrije interval (PFI) over kankertypen. Hazard ratio's en bijbehorende significantieniveaus werden gevisualiseerd met behulp van bosplots en heatmaps.

3. Prognostische validatie en subgroepanalyses in gliomacohorten

In de TCGA lagere graad glioom (TCGA-LGG) cohort werden patiënten gestratificeerd in groepen met hoge en lage MRC2-expressie. Kaplan–Meier overlevingsanalyses werden uitgevoerd om OS, DSS en PFI tussen groepen te vergelijken. Tijdsafhankelijke ontvanger-operating characteristic (ROC) curves werden gegenereerd om de voorspellende prestaties te beoordelen. Univariate en multivariate Cox-regressieanalyses werden uitgevoerd om de onafhankelijke prognostische waarde van MRC2 te evalueren. Externe validatie werd uitgevoerd met behulp van de CGGA-gliomadataset, waaronder Kaplan–Meier-overlevingsanalyse, ROC-analyse en Cox-regressie. Subgroepanalyses werden uitgevoerd om MRC2-expressie te evalueren over klinisch-pathologische variabelen, waaronder leeftijd, tumorgradatie, histologisch subtype, IDH-mutatiestatus, 1p/19q-codeletiestatus en behandelingsgerelateerde variabelen.

4. MRC1-expressie in IDH-mutant versus IDH-wildtype gliomen

De associatie tussen MRC1-expressie en IDH-mutatiestatus werd geëvalueerd met behulp van het GlioVis-webplatform en de TCGA GBMLGG-dataset. Gevallen werden gegroepeerd op basis van geannoteerde IDH-status in IDH-mutant- en IDH-wildtype gliomaen. MRC1 mRNA-expressie werd binnen de geselecteerde dataset bevraagd, en de expressieniveaus tussen de twee groepen werden vergeleken met behulp van de ingebouwde statistische analysefunctie van het platform. Groepsgewijze expressieverdelingen werden weergegeven zoals gegenereerd door het platform, en statistische significantie werd gedefinieerd als P < 0,05.

5. Celcultuur

Menselijke gliomacellijnen en normale menselijke astrocyten werden verkregen uit gevestigde celrepositories. Cellen werden gekweekt in Dulbecco's aangepaste Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal rundvleesserum (FBS) en gehouden op 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂ en ongeveer 95% relatieve luchtvochtigheid. U87- en U251-cellen werden geselecteerd voor functieverliesexperimenten omdat basisscreening in het geteste gliomacelpanel aantoonde dat deze twee cellijnen relatief hogere MRC2-niveaus vertoonden en daarom geschikt waren voor knockdown-gebaseerde functionele analyses.

6. Lentivirale knockdown van MRC2

Korte haarspeld-RNA's (shRNA's) die MRC2 en een niet-doelwitte controle aanpakten, werden gekloond tot lentivirale vectoren. Lentivirale deeltjes werden geproduceerd door co-transfecteren HEK293T cellen met transferplasmiden en verpakkingsplasmiden met een standaard transfectie-reagens. Virale supernatanten werden verzameld na 48 en 72 uur na transfectie, gecentrifugeerd op 2.100 × g gedurende 5 minuten om verpakkingscellen en celresten te verwijderen, en vervolgens door een 0,45 μm filter gehaald voordat het direct werd gebruikt of opgeslagen bij −80 °C¹⁹. Virushoudende supernatanten werden onmiddellijk gebruikt of gealiquoteerd en opgeslagen bij −80 °C. Herhaalde vries-dooicycli werden vermeden. Gliomacellen werden geïnfecteerd met lentivirale deeltjes in aanwezigheid van polybrene. Na infectie werden cellen geselecteerd met puromycine om stabiele knockdown-cellijnen te vestigen. De gebruikte sequenties waren als volgt: sh-MRC2-1: 5′-GAAATGAATGAGCAGCAAGAA-3′; sh-MRC2-2: 5′-CCGGTATTGATGATATAAGGTGTT-3′; sh-NC: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′.

7. Validatie van MRC2 knockdown door RT-qPCR en immunoblotting

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagens, en cDNA werd gesynthetiseerd met een reverse-transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met behulp van SYBR Green-chemie onder de volgende cyclische condities: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 5 seconden en 60 °C voor 30 seconden, met een analyse van de dissociatiecurve aan het einde van de versterking. De primersequenties waren als volgt: MRC2 voorwaarts, 5′-GGCAAGGACAAGAAGAAGTGCGTGT-3′; MRC2 achteruit, 5′-CTTTGGTGACGTTGCTGCGCTT-3′; GAPDH vooraan, 5′-TCCACCCATGGCAAATTCC-3′; en GAPDH omgekeerd, 5′-TCGCCCCACTTGATTTTTGG-3′. Relatieve mRNA-expressie werd berekend met de vergelijkende C_t (2^-ΔΔCt) methode met GAPDH als interne controle²⁰. Immunoblotting werd parallel uitgevoerd om de MRC2-knockdown op eiwitniveau te bevestigen. Voor RT-qPCR werden drie onafhankelijke biologische replicaten geanalyseerd en werd elk monster in technische drievoud uitgevoerd.

8. Celproliferatie-assay

De celproliferatie werd beoordeeld met behulp van de CCK-8 assay. Cellen werden in 96-wellplaten met een geschikte dichtheid gezaaid en gekweekt voor de aangegeven tijdsperioden. Op elk tijdstip werd CCK-8 reagens aan elke put toegevoegd en geïncubeerd volgens de instructies van de fabrikant, waarna de absorptie bij 450 nm werd gemeten met een microplaatlezer. Er werden minstens drie onafhankelijke biologische replicaties uitgevoerd.

9. Kolonievormingstest

Cellen werden bij lage dichtheid in zes-wellplaten gezaaid en 10–14 dagen gekweekt. De kolonies werden 15 minuten bij kamertemperatuur vastgesteld met 4% paraformaldehyde en 15 minuten gekleurd met 0,1% kristalviolet. Kolonies werden gewassen met fosfaatgeborrelde zoutoplossing (PBS), aan de lucht gedroogd en handmatig geteld of met behulp van beeldanalysesoftware²¹. Er werden minstens drie onafhankelijke biologische replicaties uitgevoerd.

10. Celmigratie en invasie-assays

Celmigratie en -invasie werden geëvalueerd met behulp van poreuze membraan-inzetassays²². Voor invasietests werden de bovenste inserts vooraf bedekt met extracellulaire matrixgel; Voor migratietests werden ongecoate inzetstukken gebruikt. Cellen die in serumvrij medium waren gesuspendeerd, werden aan de bovenste kamer toegevoegd, en een medium met serum werd in de onderste kamer geplaatst als chemoattractant. Na de incubatie werden niet-gemarcheerde cellen op het bovenste membraanoppervlak voorzichtig verwijderd met een wattenstaafje. Cellen die het onderoppervlak waren geïmporteerd of binnengedrongen, werden 15 minuten vastgezet met 4% paraformaldehyde, 15 minuten gekleurd met 0,1% kristalviolet, afgespoeld met koud fosfaatgeborrde zoutoplossing, aan de lucht gedroogd en onder een omgekeerde microscoop met ×200 vergroting afgebeeld. Cellen werden geteld in vijf willekeurig geselecteerde microscopische velden per insert. Er werden minstens drie onafhankelijke biologische replicaties uitgevoerd.

11. Western blot-analyse

Cellen werden gelyseerd in een RIPA-buffer aangevuld met proteaseremmers, en de eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van een BCA-assay. Gelijke hoeveelheden totaal eiwit werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF-membranen. De membranen werden 1 uur lang geblokkeerd in 5% magere melk bij kamertemperatuur en 's nachts geïncubeerd met primaire antistoffen bij 4 °C. De volgende primaire antilichamen en werkverdunningen werden gebruikt voor western blotting: anti-MRC2 (1:5.000), anti-CDK4 (1:1.000), anti-CDK6 (1:2.000), anti-β-catenine (1:5.000), anti-E-cadherine (1:10.000), anti-N-cadherine (1:3.000) en anti-β-actine (1:5.000). Na het wassen werden membranen geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde geiten-anti-muis IgG of geitenanti-konijn IgG secundaire antilichamen (1:5.000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Signalen werden visualisiert met chemiluminescentie en bandintensiteiten werden gekwantificeerd en genormaliseerd tot β-actine. Er werden minstens drie onafhankelijke biologische replicaties uitgevoerd.

12. Statistische analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van R en GraphPad Prism. Overlevingscurves werden vergeleken met behulp van de log-rank test. Cox proportionele hazards regressiemodellen werden gebruikt voor univariate en multivariate analyses. Voor celgebaseerde experimenten worden gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Voor parametrisch testen werd de normaliteit beoordeeld met behulp van de Shapiro–Wilk-test. Voor normaal verdeelde gegevens werden verschillen tussen twee groepen geëvalueerd met behulp van de Student's t-test, en werden vergelijkingen tussen meerdere groepen uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA. Als aan normaliteitsaannames niet werd voldaan, werden de bijbehorende niet-parametrische tests gebruikt. P-waarden werden aangepast voor meerdere tests met behulp van de Benjamini–Hochberg false discovery rate-procedure^23,24. Een tweezijdige P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Pankankerexpressie en prognostisch landschap van MRC2
Pankankeranalyses werden eerst uitgevoerd om het expressiepatroon en de prognostische relevantie van MRC2 bij menselijke maligniteiten te karakteriseren. Vergelijkingen op basis van TCGA- en GTEx-datasets toonden aan dat MRC2-expressie significant verschilde tussen tumoren en normale weefsels bij meerdere kankertypen (Figuur 2A, 2B). Een radarplot illustreerde verder d...

Discussie

Standaardbehandeling voor glioom is gebaseerd op maximale veilige resectie, gevolgd door radiotherapie en chemotherapie, meestal temozolomide^. Desalniettemin beperkt diffuse infiltratie vaak volledige chirurgische verwijdering en draagt het bij aan onvermijdelijke terugval, vooral bij hooggradige ziekte ^3,25. Verschillende moleculaire kenmerken—waaronder MGMT-promotormethylering, IDH-mutatie, 1p/19q co-del...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
anti-CDK4 antibody	Proteintech Group, Inc., USA	11026-1-AP	Primaire antistof voor western blotting. RRID:AB_2078702.
anti-CDK6 antibody	Proteintech Group, Inc., USA	66278-1-Ig	Primaire antistof voor western blotting. RRID:AB_2881661.
anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc., USA	20874-1-AP	Primaire antistof voor western blotting. RRID:AB_10697811.
anti-MRC2 antibody	Proteintech Group, Inc., USA	86028-1-RR	Primaire antistof voor western blotting. RRID:AB_2879692.
anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc., USA	22018-1-AP	Primaire antistof voor western blotting. RRID:AB_2813891.
anti-β-actin antibody	Proteintech Group, Inc., USA	66009-1-Ig	Loading control antistof voor western blotting. RRID:AB_2687938.
anti-β-catenin antibody	Proteintech Group, Inc., USA	51067-2-AP	Primaire antistof voor western blotting. RRID:AB_2086128.
BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology, China	P0012	BCA-eiwit assay kit voor eiwitconcentratiebepaling.
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories, Japan	CK04-500T	Celviabiliteit/proliferatie assay.
Chemiluminescence imaging system	Uvitec Limited, France	Alliance Q9 Advanced Manual	Beeldverwervingssysteem voor western blot detectie.
CO2 incubator	Generiek laboratoriumapparatuur	Niet gespecificeerd	Bevochtigde CO2 incubator gebruikt voor celcultuur bij 37 °C en 5% CO2.
Crystal violet oplossing (0,1%)	Beyotime Biotechnology, China	C0121-100 mL	Crystal violet kleuringsoplossing gebruikt bij een werkconcentratie van 0,1%.
DMEM, hoge glucose	Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA	C11995500BT	Basaal medium voor glioma celcultuur.
Fetaal bovien serum (FBS)	ExCell Bio, China	FSP500	Serumsupplement voor celcultuur.
GlioVis	gliovis.bioinfo.cnio.es	Niet van toepassing	Web-gebaseerde platform voor visualisatie en analyse van hersentumor expressie datasets, met name gliomen.
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	Versie 10.4.0	Statistische analyse en grafiek software. RRID:SCR_002798.
HEK293T cellen	Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China	GNHu43	Packaging cellijn gebruikt voor lentivirale productie. RRID:CVCL_0063.
HRP-geconjugeerd Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Proteintech Group, Inc., USA	SA00001-1	Secundaire antistof voor western blotting. RRID:AB_2722565.
HRP-geconjugeerd Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Proteintech Group, Inc., USA	SA00001-2	Secundaire antistof voor western blotting. RRID:AB_2722564.
Menselijke astrocyten	Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China	Niet openbaar beschikbaar	Normale menselijke astrocyten gebruikt als niet-tumor controle; catalogusnummer niet openbaar beschikbaar.
Inverteer microscoop	Generiek laboratoriumapparatuur	Niet gespecificeerd	Inverteer microscoop gebruikt voor beeldverwerving in migratie en invasie assays.
Matrigel matrix	Corning, USA	354234	Basaal membraan matrix gebruikt om inserts voor invasie assays te coaten.
Microplaat reader	Generiek laboratoriumapparatuur	Niet gespecificeerd	Microplaat reader gebruikt voor absorptiemeting bij 450 nm in CCK-8 assays.
PAGE Gel Preparation Kit, 10%	EpiZyme, China	PG212	SDS-PAGE gel voorbereidingskit.
PAGE Gel Preparation Kit, 7.5%	EpiZyme, China	PG111	SDS-PAGE gel voorbereidingskit.
Paraformaldehyde oplossing (4%)	Beyotime Biotechnology, China	P0099-100 mL	4% paraformaldehyde fixatief voor kolonievorming en migratie/invasie assays.
Penicilline-Streptomycine oplossing	Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA	15140163	Antibioticum supplement voor celcultuur.
Polybrene	Beyotime Biotechnology, China	C0351-1 mL	Hexadimethrine bromide oplossing (10 mg/mL) gebruikt om lentivirale transductie te faciliteren.
Voorgekleurde eiwit marker	Elabscience, China	E-IR-R331	Eiwit moleculair gewichts marker.
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara Bio Inc., Japan	RR047A	Omgekeerde transcriptie kit voor cDNA synthese.
Puromycin	Beyotime Biotechnology, China	ST551-10 mg	Puromycin dihydrochloride gebruikt voor selectie van stabiele knockdown cellen.
PVDF membraan	Beyotime Biotechnology, China	FFP20	Hydrofiel PVDF membraan (0,45 µm) voor western blot transfer.
R	R Foundation for Statistical Computing, Austria	Versie 4.5.1	Statistisch computer milieu gebruikt voor bio-informatica analyses. RRID:SCR_001905.
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology, China	P0013B	RIPA lysis buffer (sterk) voor eiwit extractie.
SDS-PAGE loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology, China	P0015L	Eiwit monster laad buffer.
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Bio Inc., Japan	RR066A	qPCR master mix.
Transwell inserts, 8,0-µm poriegrootte	Corning, USA	3422	Celcultuur inserts met een 8,0 µm poriegrootte polycarbonaat membraan; standaard 24-wel format voor migratie en invasie assays.
TRIzol reagent	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA	10296010CN	RNA extractie reagent.
U251 glioma cellen	National Collection of Authenticated Cell Cultures, China	SCSP-559	Menselijke glioma cellijn gebruikt voor knockdown en functionele assays. RRID:CVCL_0021.
U87 glioma cellen