Onderzoeksartikel

Effecten van regulerende SPRY2- en miR-590-5p-expressie op autofagie in humane artrosemodel-chondrocyten

DOI:

10.3791/70883

⸱

31 juli 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inflammatoire stress in een IL-1β-geïnduceerd C28/I2-chondrocytenmodel verhoogde miR-590-5p en verminderde de expressie van SPRY2. Het moduleren van deze as veranderde de expressie van Beclin-1, LC3-II en Bcl-2, wat wijst op een vermoedelijke miR-590-5p/SPRY2 regulatieroute die mogelijk autofagie-geassocieerde responsen en chondrocytoverleving bij artrose beïnvloedt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artrose (OA) is een veelvoorkomende degeneratieve gewrichtsaandoening die wordt gekenmerkt door progressieve kraakbeenvernietiging en verlies van chondrocythomeostase. Hoewel gestoorde autofagie bijdraagt aan de pathogenese van OA, blijven de moleculaire mechanismen die autofagie-geassocieerde responsen in chondrocyten aansturen onvolledig begrepen. Deze studie onderzocht de rol van de miR-590-5p/SPRY2 regulerende as in een inflammatoire OA-microomgeving met gebruik van IL-1β-geïnduceerde C28/I2 menselijke chondrocyten. Een in vitro OA-model werd ontwikkeld door C28/I2-cellen te behandelen met IL-1β. De expressie van miR-590-5p en SPRY2 werd geëvalueerd met kwantitatieve PCR en Western blotting. Gain- en -loss-of-function benaderingen werden gebruikt om de effecten van SPRY2 en miR-590-5p op de autofagie-geassocieerde markers Beclin-1 en LC3-II, evenals het overlevingsgerelateerde eiwit Bcl-2, te beoordelen. Bio-informatische analyses en reddingsexperimenten werden gebruikt om de regulatorische relatie tussen miR-590-5p en SPRY2 te onderzoeken. De behandeling met IL-1β verhoogde de expressie van miR-590-5p significant terwijl de SPRY2 mRNA- en eiwitniveaus daalden (P < 0,05). SPRY2-overexpressie verminderde de expressie van Beclin-1 en LC3-II aanzienlijk, met reducties van respectievelijk ongeveer 65% en 77% (P < 0,05). Daarentegen verhoogde de overexpressie van miR-590-5p de expressie van Beclin-1, LC3-II en Bcl-2, terwijl remming van miR-590-5p deze effecten omkeerde en de SPRY2-expressie herstelde. Functionele analyses ondersteunden SPRY2 als een verondersteld downstream reguleringsdoel van miR-590-5p. Deze bevindingen identificeren de miR-590-5p/SPRY2-as als een belangrijke regulator van autofagie-geassocieerde markerexpressie en chondrocytoverleving onder ontstekingsomstandigheden en suggereren de mogelijke relevantie ervan als therapeutisch doelwit bij OA.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als de meest voorkomende vorm van artritis wereldwijd is artrose (OA) een belangrijke oorzaak van pijn, mobiliteitsbeperkingen en lichamelijke beperkingen, wat een aanzienlijke last legt op zorgsystemen en de samenleving1. Pathologisch wordt OA gekenmerkt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen, synoviale ontsteking en pathologische remodellering van subchondrale botten1. Epidemiologische schattingen geven aan dat wereldwijd ongeveer 303 miljoen mensen getroffen zijn door OA, en dit aantal zal naar verwachting toenemen met de vergrijzing van de bevolking en stijgende obesitaspercentages2. In China wordt de prevalentie van symptomatische knieartrose geschat op 8,1%, met een onevenredig hogere prevalentie onder vrouwen en plattelandsbevolkingen3. Ondanks de hoge prevalentie blijven de huidige behandelopties grotendeels beperkt tot symptoombeheer via niet-steroïde ontstekingsremmers (NSAID's) en chirurgische ingrepen bij gevorderde ziekte4. De afwezigheid van ziekte-modificerende artrosegeneesmiddelen (DMOAD's) weerspiegelt een onvolledig begrip van de moleculaire mechanismen die de homeostase en overleving van chondrocyten reguleren.

De structurele en functionele integriteit van gewrichtskraakbeen hangt af van residente chondrocyten, die de extracellulaire matrix (ECM) omzet behouden door een balans tussen anabole en katabole activiteiten6. Tijdens de progressie van OA worden chondrocyten blootgesteld aan abnormale mechanische stress en pro-inflammatoire mediatoren, met name interleukine-1β (IL-1β) en tumornecrose factor-α (TNF-α), die een verschuiving bevorderen van matrixsynthese naar matrix degradatie6. IL-1draagt β bij aan de afbraak van kraakbeen door de productie van matrixmetalloproteïnasen (MMP's) en aggrecanasen te stimuleren, terwijl het de synthese van type II collageen en proteoglycanenonderdrukt 7. Daarnaast veroorzaaktIL-1 β oxidatieve stress en mitochondriale disfunctie, wat leidt tot chondrocytapoptose en senescence8. Daarom blijft het identificeren van intracellulaire signaalroutes die de overleving van chondrozyten onder ontstekingsomstandigheden reguleren een prioriteit voor OA-onderzoek.

Autophagie is een evolutionair geconserveerde lysosomale afbraakroute die de cellulaire homeostase in stand houdt door het verwijderen en recyclen van beschadigde organellen en eiwitaggregaten9. Basale autophagie is essentieel voor het cellulaire overleven en de energiebalans; echter kan ontregelde autofagie bijdragen aan de ziekteprogressie9. Bij OA wordt autofagie over het algemeen beschouwd als een beschermende respons die chondrocyten helpt zich aan te passen aan celstress en apoptosete weerstaan 10. Eerdere studies suggereren dat autofagische activiteit afneemt tijdens de progressie van OA, vooral bij vergevorderde ziekte, wat resulteert in verminderde celkwaliteitscontrole en verhoogd chondrocytenverlies11. Verschillende eiwitten worden vaak gebruikt als indicatoren van autofagie-geassocieerde activiteit. Beclin-1 neemt deel aan de initiatie van autofagosoomen, terwijl de omzetting van microtubuli-geassocieerd eiwit 1 lichte keten 3 (LC3-I naar LC3-II) veel wordt gebruikt als marker voor de vorming van autofagosoom12. Daarentegen remt B-cel lymfoom 2 (Bcl-2) de Beclin-1-afhankelijke autofagie terwijl het ook anti-apoptotische effecten uitoefent13. Desalniettemin vereist de interpretatie van autofagie-geassocieerde markers voorzichtigheid omdat statische metingen van LC3-II en Beclin-1 niet onafhankelijk kunnen onderscheiden van versterkte autofagosoomvorming van verstoorde lysosomale degradatie. Ondanks deze beperkingen blijft modulatie van autofagie-gerelateerde routes een veelbelovende therapeutische strategie voor artrose.

MicroRNA's (miRNA's) zijn korte niet-coderende RNA's die genexpressie post-transcriptioneel reguleren door te binden aan complementaire sequenties binnen de 3′-niet-vertaalde regio's (3′-UTR's) van doel-messenger RNA's, wat resulteert in mRNA-degradatie of translationele repressie14. Abnormale miRNA-expressie is in verband gebracht met de pathogenese van OA door effecten op ontsteking, apoptose en ECM-remodellering15. Onder deze moleculen heeft miR-590-5p aandacht getrokken vanwege zijn regulerende rol in het botmetabolisme en andere pathologische processen. Eerdere studies hebben aangetoond dat miR-590-5p osteogene differentiatie bevordert en adipogenese onderdrukt in mesenchymale stamcellen16. In kankermodellen vertoont miR-590-5p contextafhankelijke functies als een oncogene of tumorsuppressieve regulator17. Bovendien zijn veranderde microRNA-expressieprofielen, waaronder leden van de miR-590-familie, betrokken bij de pathologische remodellering van gewrichtsweefsels tijdens OA18. Bewijs verkregen uit stamcel- of kankermodellen kan echter niet direct worden geëxtrapoleerd naar volwassen articulaire chondrocyten. Daarom blijft de rol van miR-590-5p bij het reguleren van chondrocytresponsen binnen de inflammatoire OA-microomgeving onvolledig begrepen.

Om mogelijke downstream-mechanismen van miR-590-5p in OA te onderzoeken, werden in silico doelvoorspellingsanalyses uitgevoerd, waarbij Sprouty2 (SPRY2) werd geïdentificeerd als een vermoedelijk downstream-doel. SPRY2 behoort tot de Sprouty-familie van eiwitten, die de signaalwisseling van receptortyrosine (tyrosine sinas) negatief reguleren en de activatie van de RAS/MAPK/ERK-route19 onderdrukken. Omdat MAPK-signalering invloed heeft op de differentiatie van chondrocyten, ontstekingsreacties en autophagie, kan SPRY2 een belangrijke regulerende knoop zijn in de OA-pathofysiologie20. Eerdere studies geven aan dat SPRY2 ontstekingsreacties kan onderdrukken in reumatoïde artritis modellen21, deelneemt aan apoptose-gerelateerde regulatie in epitheelsystemen22, en geassocieerd is met autophagie-gerelateerde responsen in ischemische letselmodellen23. Hoewel deze waarnemingen suggereren dat SPRY2 deelneemt aan de regulatie van zowel apoptose als autophagie, blijft de rol ervan in articulaire chondrocyten slecht gekarakteriseerd. Er werd daarom verondersteld dat miR-590-5p en SPRY2 een regulerende as vormen die de overleving van chondrozyten onder inflammatoire stress beïnvloedt.

Op basis van deze observaties werd voorgesteld dat miR-590-5p autofagie-geassocieerde responsen in chondrocyten moduleert door de expressie van SPRY2 te reguleren. Hoewel miR-590-5p en SPRY2 elk afzonderlijk zijn bestudeerd in andere biologische contexten, is hun functionele relatie in OA-chondrocyten niet vastgesteld. In de huidige studie werd een IL-1β-geïnduceerd OA-model in C28/I2 menselijke chondrocyten gebruikt om de expressiepatronen van miR-590-5p en SPRY2 te onderzoeken en hun effecten op de expressie van Beclin-1, LC3-II en Bcl-2 te evalueren. Door het onderzoeken van de miR-590-5p/SPRY2 regulatieas biedt deze studie inzicht in epigenetische mechanismen achter de overleving van chondrozyten en identificeert het een mogelijk therapeutisch doelwit voor artrose.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitsluitend uitgevoerd met de commercieel verkrijgbare humane chondrocytencellijn C28/I2. Er waren geen menselijke deelnemers, menselijke weefselmonsters, door patiënten afgeleide materialen of levende dieren betrokken bij dit onderzoek. Daarom waren goedkeuring door de Institutional Review Board (IRB) en goedkeuring door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) niet vereist volgens institutionele en nationale richtlijnen. De gereedschappen, chemicaliën, kits en reagentia die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Celcultuur en OA-modelconstructie

De humane chondrocytcellijn C28/I2 (details vermeld in de Materiaalkunde) werd verkregen van een commerciële leverancier. Om experimentele reproduceerbaarheid te waarborgen, werden cellen geauthenticeerd met behulp van short tandem repeat (STR) profilering en routinematig getest om de afwezigheid van mycoplasma-contaminatie te bevestigen. Cellen tussen passages 3 en 8 werden voor alle experimenten gebruikt. Cellen werden in DMEM gehouden, aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (alle kweekreagentia zijn beschreven in de Materiaaltabel) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5%CO2.

Om het in vitro artrose (OA) model vast te stellen, werden C28/I2-cellen gestimuleerd met recombinant humaan IL-1β. Op basis van gevestigde literatuur 6,7, voorlopige dosis-responsoptimalisatie-experimenten die bedoeld zijn om een robuuste katabole toestand te induceren zonder overmatige onmiddellijke cytotoxiciteit, werden de cellen behandeld met 20 ng/mL IL-1β gedurende 24 uur.

2. Experimentele groepering en transfectie

Om de mechanistische paden te verduidelijken, werd de studie verdeeld in drie hoofdexperimentele modules, elk met minimaal drie onafhankelijke biologische replica's:

  1. SPRY2 Winst/Verlies van functie:
    Cellen werden toegewezen aan controle, OA-model, OA + lege vector (NC), OA + SPRY2 overexpressieplasmide (OE-SPRY2) en bijbehorende kleine interfererende RNA-groepen (si-NC en drie specifieke si-SPRY2-constructies: si-695, si-800, si-896) om te screenen op interferentie-efficiëntie.
  2. miR-590-5p modulatie:
    Cellen werden verdeeld in controlegroepen, OA-model, OA + nabootsing NC, OA + miR-590-5p mimic, OA + inhibitor NC, en OA + miR-590-5p inhibitorgroepen.
  3. Functionele validatie van de miR-590-5p/SPRY2 regulatorische relatie:
    Om de voorgestelde regulatorische relatie tussen miR-590-5p en SPRY2 verder te evalueren, werden cellen onderworpen aan miR-590-5p mimic- en inhibitorcondities om te bepalen of miR-590-5p-modulatie de SPRY2-expressie in het OA-model veranderde.
    Voor transfectie werden C28/I2-cellen in 6-wellplaten geplaatst bij 2 × 10 5-cellen per put. Bij het bereiken van 70%–80% confluentie werden transfeties uitgevoerd met een commerciële lipide-gebaseerde transfectiereagens volgens het protocol van de fabrikant en werden procedures vastgesteld voor de levering van kleine RNA's in chondrocyten24. Kort gezegd werden plasmiden (OE-SPRY2 en NC; 2 μg/well) en oligonucleotiden (miR-590-5p mimic/inhibitor en siRNA's; 50 nM) verdund in een gereduceerd serummedium. De lipide-DNA/RNA-complexen werden 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd voordat ze druppelwijs aan cellen in serumvrije DMEM werden toegevoegd. 6 uur na transfectie werd het medium vervangen door volledige DMEM met 10% FBS, en werden cellen nog eens 48 uur gekweekt voordat RNA en eiwit werden geëxtraheerd.

3. qPCR-detectie

Total RNA en miRNA werden geïsoleerd met behulp van een speciale miRNA-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant. De zuiverheid en concentratie van RNA werden beoordeeld met een UV-Vis spectrofotometer, en monsters met A260/A280-verhoudingen van 1,8–2,0 werden gebruikt voor downstream-analyses. Commerciële reverse-transcriptie reagentia werden gebruikt om cDNA te synthetiseren. De qPCR-cyclusprocedure was als volgt: 95 °C gedurende 10 minuten; 40 cycli van 95 °C voor 10 seconden, 58 °C voor 30 seconden en 72 °C voor 30 seconden; gevolgd door smeltcurveanalyse om de specificiteit van primers en de afwezigheid van primerdimeren te verifiëren. β-actine en U6 dienden respectievelijk als interne controles voor mRNA en miRNA. Relatieve genexpressie werd berekend met behulp van de 2-ΔΔCt methode25. Alle primersequenties, inclusief die voor Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p en referentiegenen, zijn vermeld in Tabel 1.

Naam van de primer Voorste primer (5′-3′)Achterste primer (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGCGGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actineTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAACAAGG
Bcl-2TGGGATTCCTGCGGATTGACTCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1TCCCGTGGAATGGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-IICATCCAACCAAAATCCCGGTGAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

Tabel 1: Primersequenties gebruikt voor kwantitatieve PCR (qPCR) analyse. Voor- en achteruitprimersequenties gebruikt voor de amplificatie en kwantificering van doeltranscripten en interne referentiecontroles door qPCR.

Tenzij anders gespecificeerd, worden gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De statistische significantie werd bepaald met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door de S-N-K post hoc test. Symbolen geven aan: *P < 0,05 vs. Controle; #P < 0,05 versus het aangegeven model of de negatieve controlegroep; &P < 0,05 vs. OA+Remmer-NC.

4. Western blotdetectie

Cellen werden geoogst en gelyseerd met behulp van een RIPA-buffer aangevuld met protease- en fosfataseremmercocktails, na vastgestelde eiwitextractie- en immunoblottingprocedures. Na centrifugatie bij 14.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om cellulair afval te verwijderen, werd het supernatant verzameld en werden eiwitconcentraties gekwantificeerd met behulp van een BCA-eiwitassaykit. Gelijke hoeveelheden eiwitlysaat (30 μg) werden gedenatureerd, 1,5 uur door SDS-PAGE opgelost en 1,5 uur26 uur overgebracht op PVDF-membranen bij 300 mA. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie bij 4 °C gedurende 16 uur met specifieke primaire antilichamen (bijv. anti-SPRY2, 1:1000 verdunning). Na drie washes in TBST werden membranen geïncubeerd met geschikte HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Eiwitbanden werden gevisualiseerd met een ECL-detectiesysteem en gekwantificeerd met ImageJ-software.

5. Statistische analyse

De gegevens werden geanalyseerd met behulp van statistische analysesoftware. Alle experimenten werden uitgevoerd met ten minste drie onafhankelijke biologische replicaten (n ≥ 3), en kwantitatieve gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Voor parametrisch testen werd de normaliteit van de data beoordeeld met de Shapiro-Wilk-test en werd de homogeniteit van variantie beoordeeld. De statistische significantie tussen meerdere groepen werd geëvalueerd met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de Student-Newman-Keuls (S-N-K) post hoc-test voor meervoudige vergelijkingen. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vaststelling van het in vitro chondrocyt-inflammatoire model

Om de moleculaire mechanismen achter de pathologie van artrose te onderzoeken, werd een in vitro ontstekingsmodel ontwikkeld met C28/I2 menselijke chondrocyten gestimuleerd met IL-1β. De validiteit van dit model werd bevestigd door het beoordelen van de expressie van collageen type II alfa 1-keten (Col-II), een primaire component van de extracellulaire matrix van het hyaliene kraakbeen en een kenmerk van gezonde chondrocyten. Kwantitatieve analyse toonde aan dat blootstelling aan IL-1β leidde tot een statistisch significante vermindering van Col-II mRNA-expressie ten opzichte van de controlegroep. Deze fenotypische verandering duidt op een initiële verschuiving naar een katabole toestand die lijkt op de osteoartritische microomgeving, en biedt daarmee een fundamenteel model voor latere mechanistische studies (Figuur 1).

figure-results-1
Figuur 1: Vaststelling van het in vitro artrose (OA) model in C28/I2 menselijke chondrocyten. De cellen werden behandeld met 20 ng/mL IL-1β gedurende 24 uur. De relatieve mRNA-expressie van Col-II werd bepaald door qPCR, waarbij β-actine als normalisatiecontrole diende. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van drie onafhankelijke biologische replicaten (n = 3). Statistische analyse werd uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA. *P < 0,05 vergeleken met de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Validatie van SPRY2-overexpressie-efficiëntie in C28/I2-cellen

Voordat de functionele rol van Sprouty2 (SPRY2) in dit model werd beoordeeld, werd de transfectie-efficiëntie van de SPRY2-overexpressievector geverifieerd. Chondrocyten werden getransfecteerd met ofwel het overexpressieplasmide (OE) of een negatieve controle lege vector (NC). Zowel qPCR- als Western blot-analyses toonden robuuste upregulatie van SPRY2 op mRNA- en eiwitniveaus in de OE-groep vergeleken met de NC- en onbehandelde controlegroepen. Deze gegevens, weergegeven in Figuur 2, bevestigen dat het experimentele systeem verhoogde SPRY2-niveaus handhaafde, waardoor onderzoek naar de specifieke biologische effecten mogelijk is.

figure-results-2
Figuur 2: Validatie van SPRY2-overexpressie in C28/I2-chondrocyten. Cellen werden getransfecteerd met ofwel een lege vector (NC) of een SPRY2-overexpressieplasmide (OE). De relatieve mRNA- en eiwitniveaus van SPRY2 werden respectievelijk geëvalueerd via qPCR en Western blot. β-actine werd gebruikt als interne belastingregeling. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD (n = 3). *P < 0,05 vergeleken met de NC-groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

SPRY2-overexpressie vermindert autofagie en moduleert apoptosemarkers onder inflammatoire omstandigheden

Vervolgexperimenten probeerden te bepalen of SPRY2 functioneert als regulator van autofagie en apoptose binnen de inflammatoire context. Na de oprichting van het OA-model veroorzaakte alleen de behandeling met IL-1β een duidelijke toename van de autofagiemarkers Beclin-1 en LC3-II, wat wijst op een compenserende autofagische respons op inflammatoire stress. Tegelijkertijd was de expressie van Bcl-2 verhoogd in de modelgroep. De introductie van de SPRY2-overexpressievector veranderde dit profiel echter aanzienlijk. Zoals weergegeven in Figuur 3, vertoonde de Model+OE-SPRY2-groep een significante vermindering van zowel Beclin-1 als LC3-II mRNA-niveaus vergeleken met de Model- en Model+NC-groepen. Bovendien verminderde SPRY2-overexpressie de door ontsteking veroorzaakte verhoging van Bcl-2. Deze bevindingen suggereren dat SPRY2 de expressie van autofagie-geassocieerde markers in inflammatoire chondrocyten negatief reguleert.

figure-results-3
Figuur 3: SPRY2-overexpressie verzwakt autofagie en moduleert apoptosemarkers onder door IL-1β veroorzaakte ontstekingstoestanden. De relatieve mRNA-expressieniveaus van SPRY2, Bcl-2, Beclin-1 en LC3-II werden gekwantificeerd door qPCR in de groepen Control, Model (IL-1β-behandeld), Model+NC en Model+OE-SPRY2. β-actin diende als interne controle. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD (n = 3). De statistische significantie werd bepaald door eenrichtings-ANOVA, gevolgd door de S-N-K post hoc-test. *P < 0,05 vergeleken met de controlegroep; #P < 0,05 vergeleken met de Model+NC-groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

miR-590-5p reguleert autofagie-geassocieerde markers en bevordert de overleving van chondrocyten

Vervolgens werd de functionele impact van miR-590-5p op autofagie-geassocieerde en overlevingsgerelateerde markers onderzocht. Zoals weergegeven in Figuur 4, verhoogde transfectie met een miR-590-5p-mimic in het OA-model de expressie van Bcl-2, Beclin-1 en LC3-II significant, in tegenstelling tot de remmende effecten die werden waargenomen na SPRY2-overexpressie. Omgekeerd verminderde de remming van miR-590-5p de expressie van Bcl-2 en Beclin-1 aanzienlijk, terwijl de vermindering van LC3-II geen statistische significantie bereikte. Deze resultaten suggereren dat miR-590-5p de expressie van autofagie-geassocieerde markers en overlevingsgerelateerde Bcl-2 in chondrozyten verhoogt, wat verder onderzoek naar mogelijke nastroomse regulatiedoelen vereist.

figure-results-4
Figuur 4: miR-590-5p verhoogt de expressie van autofagie-geassocieerde markers en de overlevingsgerelateerde Bcl-2-expressie. De relatieve mRNA-expressieniveaus van Bcl-2, Beclin-1 en LC3-II werden gemeten met qPCR in het OA-model na transfectie met een miR-590-5p-mimic, remmer of hun respectievelijke negatieve controles (NC). β-actine diende als normalisatiecontrole. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD (n = 3). *P < 0,05 vergeleken met de Model+Mimic-NC groep; #P < 0,05 vergeleken met de Model+Inhibitor-NC groep (voor Bcl-2 en Beclin-1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

IL-1β moduleert de miR-590-5p/SPRY2-as en de autofagie-geassocieerde markerexpressie

Om de upstream regulerende mechanismen die SPRY2 controleren en de relatie met miR-590-5p te verduidelijken, werden hun expressieprofielen onderzocht onder inflammatoire omstandigheden. Na morfologische observatie van het IL-1β-geïnduceerde C28/I2-celmodel (Figuur 5A) werden de transfectie-efficiënties voor SPRY2 genetische manipulatie geverifieerd. Zowel qPCR- als Western blot-analyses bevestigden robuuste SPRY2-upregulatie in de overexpressiegroep (OE) en succesvolle knockdown over de kleine interfererende RNA (siRNA) groepen vergeleken met hun respectievelijke controlegroepen (Figuren 5B en 5C). Omgekeerd werden de miR-590-5p-niveaus significant verhoogd na behandeling met IL-1β.

figure-results-5
Figuur 5: Morfologische observatie en validatie van SPRY2-transfectie-efficiënties. (A) Morfologische observatie van C28/I2-cellen na IL-1β-behandeling (20×, fasecontrastmicrograaf). (B) Relatieve mRNA- en eiwitexpressieniveaus van SPRY2 in Control-, NC- en SPRY2-overexpressie (OE)-groepen. (C) Representatieve Western blot-beelden die SPRY2-overexpressie bevestigen (links) en SPRY2-knockdown door specifieke siRNA's (si-896, si-800, si-695) vergeleken met controles (rechts). β-actine diende als interne belastingcontrole. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD (n = 3). *P < 0,05 vergeleken met de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om te bepalen of dit omgekeerde expressiepatroon een mogelijke regulatorische relatie weerspiegelde, werd TargetScan Human 7.1 gebruikt om een 8mer veronderstelde bindplaats voor has-miR-590-5p binnen de 3′-UTR van menselijke SPRY2 (nucleotiden 236–243) te identificeren. De sequentie-uitlijning in Figuur 6 illustreert de voorspelde complementariteit tussen zaadregio's. Vervolgens werden reddingsexperimenten uitgevoerd om functioneel te onderzoeken of miR-590-5p-modulatie de SPRY2-expressie in het OA-model heeft veranderd. Na bevestiging van de transfectie-efficiënties van de miR-590-5p-mimic en -inhibitor (Figuren 7A, B), toonden rescue-assays aan dat miR-590-5p-remming de OA-geassocieerde suppressie van SPRY2 mRNA-expressie omkeerde (Figuur 7C). De miR-590-5p-mimic verminderde de SPRY2-expressie niet verder dan de sterke onderdrukking die door IL-1β werd geïnduceerd, terwijl miR-590-5p-remming de SPRY2-expressie significant verhoogde ten opzichte van de negatieve controle van de inhibitor. Deze bevindingen ondersteunen een omgekeerde, veronderstelde regulatieve relatie tussen miR-590-5p en SPRY2 in inflammatoire chondrocyten.

figure-results-6
Figuur 6: In silico voorspelling van de veronderstelde miR-590-5p/SPRY2 regulerende interactie. Bio-informatische analyse werd uitgevoerd met TargetScan Human 7.131,32 om veronderstelde miRNA-bindingsplaatsen te identificeren. Het schema illustreert de voorspelde sequentie-uitlijning en zaadregio-complementariteit tussen has-miR-590-5p en de 3′-UTR van menselijke SPRY2 (nucleotiden 236–243). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Effecten van miR-590-5p-modulatie op SPRY2-expressie in chondrocyten. Transfectie-efficiënties werden bevestigd door qPCR voor de miR-590-5p-mimic (A) en inhibitor (B) ten opzichte van hun respectievelijke controlegroepen. (C) Relatieve SPRY2 mRNA-expressie werd gemeten over de aangegeven experimentele groepen na miR-590-5p-modulatie in het OA-model. U6 en β-actine werden gebruikt als interne controles voor respectievelijk miRNA- en mRNA-kwantificatie. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3). *P < 0,05 vergeleken met de controlegroep; #P < 0,05 vergeleken met de respectievelijke Mimic-NC of Inhibitor-NC groep; &P < 0,05 vergeleken met de OA+Inhibitor-NC groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In overeenstemming met de resultaten in Figuur 4 liepen veranderingen in autofagie-geassocieerde markers parallel aan de effecten die werden verwacht bij verminderde SPRY2-expressie, wat suggereert dat miR-590-5p hun expressie kan versterken door SPRY2-gemedieerde remming te verlichten. Gezamenlijk ondersteunen deze bevindingen een veronderstelde signaalas waarin IL-1β miR-590-5p upreguleert, miR-590-5p de expressie van SPRY2 onderdrukt, en een verminderde SPRY2 geassocieerd is met een verhoogde markeringsexpressie van Beclin-1 en LC3-II.

BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:

De gegevens voor deze studie zijn beschikbaar in Aanvullend Bestand 1.

Aanvullend Bestand 1: De datasets die voor deze studie zijn gebruikt, inclusief qPCR-brongegevens, Western blot-bronbeelden en statistische analyse-outputs.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eerdere studies hebben aangetoond dat miRNA's autofagie in meerdere stadia reguleren, waaronder initiatie, blaasverlenging en rijping27. De betrokkenheid van miRNA bij de pathogenese van OA is steeds vaker gedocumenteerd, met name door effecten op ontsteking, apoptose, extracellulaire matrixremodellering en autophagie-gerelateerde routes. miR-590-5p is in verband gebracht met cellulaire homeostase en kankergerelateerde processen 28,29,30. In skelet- en kraakbeengerelateerde contexten is gerapporteerd dat miR-590-5p de chondrogene differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen 16 bevordert, terwijl het in OA-chondrocytenmodellen proliferatie, apoptose en ontstekingsreacties kan reguleren door FGF18,24 te targeten. Het blijft echter onduidelijk of miR-590-5p autofagie-gerelateerde responsen in OA-chondrocyten beïnvloedt.

Daarom werden RNAInter en TargetScan gebruikt om potentiële downstream mediators te onderzoeken, en beide analyses suggereerden SPRY2 als een vermoedelijk miR-590-5p-geassocieerd doelwit. TargetScan Human 7.131,32 identificeerde een voorspelde 8mer zaadregio-bindingsplaats bij nucleotiden 236–243 van de SPRY2 3′-UTR (Figuur 6). SPRY2 is een negatieve regulator van receptor tyrosinekinase/MAPK-signalering en wordt tot expressie gebracht in meerdere weefsels19. Intra-articulaire SPRY2-genoverdracht is gerapporteerd als verzwakking van adjuvant-geïnduceerde artritis bij ratten21. SPRY2-overexpressie kan HGF/SF-gemedieerde celgroei, invasie, migratie en cytokinese33 remmen, terwijl verlies van Spry2-functie in verband is gebracht met hyperactivatie van MAPK-ERK en verhoogde B-celproliferatie34. SPRY2 is ook betrokken bij apoptose-gerelateerde regulatie22, miRNA-geassocieerde migratiecontrole35 en autofagie-gerelateerde responsen in ischemische modellen23. Samen ondersteunen deze studies SPRY2 als een regulerend knooppunt dat ontstekingssignalering, overlevingsgerelateerde routes en autofagie-geassocieerde responsen verbindt.

Gezien de eerder niet-gerapporteerde relatie tussen miR-590-5p en SPRY2 in OA-chondrocyten, leidde bio-informatische voorspelling van hun potentiële interactie tot verder experimenteel onderzoek. De huidige resultaten toonden aan dat SPRY2 significant werd gedownreguleerd, terwijl miR-590-5p werd opgereguleerd in IL-1β-gestimuleerde C28/I2-chondrocyten, wat deze as in inflammatoire chondrocytresponsen impliceert. Functioneel verminderde SPRY2-overexpressie de expressie van Beclin-1 en LC3-II, wat een remmend effect op autofagie-geassocieerde markerexpressie ondersteunt. Omgekeerd verminderde remming van miR-590-5p de expressie van Beclin-1 en Bcl-2 en herstelde SPRY2-expressie, wat consistent is met een veronderstelde inverse regulatieve relatie. Omdat Bcl-2 de Beclin-1-afhankelijke autophagie kan remmen terwijl het ook anti-apoptotische effecten uitoefent13, moet de gelijktijdige verhoging van Bcl-2 met Beclin-1 en LC3-II op een contextspecifieke manier worden geïnterpreteerd. In dit inflammatoire OA-model kan de upregulatie van Bcl-2 voornamelijk een overlevingsgerelateerde anti-apoptotische respons weerspiegelen, terwijl verhoogde expressie van Beclin-1 en LC3-II kan leiden tot verlichting van SPRY2-geassocieerde suppressie. Deze bevindingen suggereren een model waarin miR-590-5p coördineert over chondrocytenoverlevingsgerelateerde signalering en de expressie van autofagiemarkers door SPRY2 onder inflammatoire stress te onderdrukken.

Hoewel deze studie waardevolle mechanistische inzichten biedt in de miR-590-5p/SPRY2-as, moeten verschillende beperkingen worden erkend. Ten eerste werden alle experimenten uitgevoerd in een 2D in vitro systeem met behulp van de geïmmortaliseerde C28/I2-cellijn. Dit vereenvoudigde model kan de biomechanische stress, meercellige interacties en inflammatoire micro-omgeving van gewrichtskraakbeen in vivo niet volledig recapituleren, waardoor de directe translationele toepasbaarheid van de bevindingen beperkt wordt. Ten tweede, hoewel bio-informatische voorspellingen en reddingsassays een veronderstelde regulatorische relatie tussen miR-590-5p en SPRY2 ondersteunen, verhindert de afwezigheid van een dual-luciferase reporter assay definitieve bevestiging van directe fysieke binding tussen miR-590-5p en de SPRY2 3′-UTR. Ten derde kunnen statische metingen van Beclin-1 en LC3-II geen onderscheid maken tussen verhoogde autofagosoomvorming en verminderde autolysosomale afbraak; daarom moeten toekomstige studies autofagische flux beoordelen met methoden zoals Bafilomycine A1-behandeling of tandem fluorescent reporter-assays. Toekomstig werk moet ook een breder panel van OA-fenotypische markers omvatten (bijv. MMP13 en ADAMTS5), primaire menselijke chondrocyten, 3D-kraakbeenexplantmodellen en in vivo OA-modellen zoals destabilisatie van de mediale meniscus om de langetermijneffecten van miR-590-5p en SPRY2-modulatie te evalueren.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken de afdeling Geriatrie van het Ruikang Ziekenhuis, Guangxi Universiteit voor Chinese Geneeskunde, voor het bieden van experimentele faciliteiten en technische ondersteuning voor deze studie. De auteurs bedanken ook het laboratoriumpersoneel en collega's voor hun hulp bij het verzamelen en analyseren van gegevens. Dit werk werd ondersteund door het Natural Science Research Project van de Guangxi University of Chinese Medicine (Subsidienummer 2022MS039; LncRNA-GAS5 mediaert SPRY2-expressie om autofagie te remmen in muisknie-argitroschondrocyten: Mechanismestudie en vroegtijdig interventie-effect van Huayu Qushi-voorschrift) en de National Natural Science Foundation of China (Regionale Stichting) (Subsidie nr. 82160912; Mechanismebespreking over Skp2-ubiquitinatie, degradatie van FoxO1, remming van knie-OA, chondrocytautofagie en vroege interventie-effect van Huayu Qushi-recept.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-β-actin antilichaamProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Interne laadcontrole voor Western blot-analyse
Anti-SPRY2 antilichaamProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324Detectie van SPRY2-eiwitexpressie
BCA-eiwitanalysekitThermo Fisher Scientific23225Bepaling van de totale eiwitconcentratie
C28/I2 menselijke chondrocytcellijnPunocelCP-H107In vitro chondrocytmodel voor osteoartritisstudies
Complete DMEMKeyGen BiotecKGM12800SBasismedium voor routinecellencultuur
CWBIO Ultrapure miRNA-extractiekitCWBIOCW0627SIsolatie van totaal RNA en miRNA
ECL-detectiesysteemThermo Fisher Scientific32106Chemiluminescentievisualisatie van eiwitbanden
Foetaal runder serum (FBS)Gibco1891605Celcultuur groeisuplement
GraphPad Prism versie 9.0GraphPad SoftwareN/AStatistische analyse en grafiekgeneratie
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01Omgekeerde transcriptie van mRNA naar cDNA
ImageJ softwareNational Institutes of HealthN/AKwantificering van Western blot bandintensiteit
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015Transfectie van plasmiden en oligonucleotiden
miR-590-5p nabootser, remmer en NC'sRiboBioOp bestelling gesynthetiseerdModulatie van miR-590-5p expressie
miRNA 1st Strand cDNA SynthesekitVazymeMR101-02Omgekeerde transcriptie van miRNA naar cDNA
Opti-MEM mediumGibco31985-062Bereiding van transfectiecomplexen
Penicilline-streptomycineGibco15140122Voorkomen van bacteriële besmetting in cellencultuur
Protease- en fosfataseremmercocktailsMedChemExpressHY-K0010Bescherming van eiwitten tijdens extractie
PVDF-membranenMillipore SigmaISEQ00010Eiwittransfermembraan voor immunoblotting
Recombinant humaan IL-1βMedChemExpressHY-P78459Inductie van OA-achtige inflammatoire omstandigheden
RIPA-bufferBeyotimeP0013BCellyse en eiwitextractie
si-SPRY2 constructies en si-NCGenePharmaOp bestelling gesynthetiseerdKnockdown van SPRY2 expressie
SPRY2 overexpressieplasmide (OE) en lege vector (NC)GeneChemOp bestelling geconstrueerdEvaluatie van SPRY2 overexpressie effecten
UV-VIS spectrofotometer (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000Meting van RNA-concentratie en zuiverheid

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hunter DJ, Bierma-Zeinstra S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393:1745-59.
  2. GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 2020;396:1204-22.
  3. Tang X, et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in China: Results from the China Health and Retirement Longitudinal Study. Arthritis Rheumatol. 2016;68:648-53.
  4. Latourte A, Kloppenburg M, Richette P. Emerging pharmaceutical therapies for osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2020;16:673-88.
  5. Glyn-Jones S, et al. Osteoarthritis. Lancet. 2015;386:376-87.
  6. Kapoor M, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:33-42.
  7. Goldring MB, Otero M. Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2011;23:471-8.
  8. Lepetsos P, Papavassiliou AG. ROS/oxidative stress signaling in osteoarthritis. Biochim Biophys Acta. 2016;1862:576-91.
  9. Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: Renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728-41.
  10. Caramés B, Olmer M, Kiosses WB, Lotz MK. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis Rheumatol. 2015;67:1568-76.
  11. Lotz MK, Caramés B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:579-87.
  12. Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19:5720-8.
  13. Pattingre S, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell. 2005;122:927-39.
  14. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116:281-97.
  15. Miyaki S, Asahara H. Macro view of microRNA function in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2012;8:543-52.
  16. Wu Z, Lin Y, Zhang Z, Pan Y. Melatonin-mediated miR-526b-3p and miR-590-5p upregulation promotes chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Pineal Res. 2018;65:e12483.
  17. Chen M, Wang S, Chen Y. miR-590-5p suppresses hepatocellular carcinoma chemoresistance by targeting YAP1 expression. EBioMedicine. 2018;35:142-54.
  18. Endisha H, Rockel J, Jurisica I, Kapoor M. The complex landscape of microRNAs in articular cartilage: biology, pathology, and therapeutic targets. JCI Insight. 2018;3:e98630.
  19. Guy GR, Jackson RA, Yusoff P, Chow SY. Sprouty proteins: Modified modulators, matchmakers or missing links? J Endocrinol. 2009;203:191-202.
  20. Loeser RF. Integrins and chondrocyte-matrix interactions in articular cartilage. Matrix Biol. 2014;39:11-6.
  21. Zhang W, Chen L, Xiong Y. Intraarticular gene transfer of SPRY2 suppresses adjuvant-induced arthritis in rats. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99:6727-35.
  22. Liu Y, et al. MicroRNA-124 facilitates lens epithelial cell apoptosis by inhibiting SPRY2 and MMP-2. Mol Med Rep. 2021;23:381.
  23. Wu Y, Gao Z, Zhang J. Transcription factor E2F1 aggravates neurological injury in ischemic stroke via microRNA-122-targeted Sprouty2. Neuropsychiatr Dis Treat. 2020;16:2633-47.
  24. Jiang P, Zheng Z, Tang Y. miR-590-5p affects chondrocyte proliferation, apoptosis, and inflammation by targeting FGF18 in osteoarthritis. Am J Transl Res. 2021;13:8728-41.
  25. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001;25:402-8.
  26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:4350-4.
  27. Panagopoulos PK, Lambrou GI. The involvement of microRNAs in osteoarthritis and recent developments: A narrative review. Mediterr J Rheumatol. 2018;29:67-79.
  28. Barwal TS, Sharma P. miR-590-5p: A double-edged sword in the oncogenesis process. Cancer Treat Res Commun. 2022;32:100593.
  29. Mou K, Chen M. miR-590-5p inhibits tumor growth in malignant melanoma by suppressing YAP1 expression. Oncol Rep. 2018;40:2056-66.
  30. D'Adamo S, et al. Autophagy in osteoarthritis: a target for new therapies. Curr Rheumatol Rep. 2020;22:37.
  31. Agarwal V, Bell GW, Nam JW, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 2015;4:e05005.
  32. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009;19:92-105.
  33. Lee CC, et al. Overexpression of sprouty 2 inhibits HGF/SF-mediated cell growth, invasion, migration, and cytokinesis. Oncogene. 2004;23:5193-202.
  34. Frank MJ, et al. Expression of sprouty2 inhibits B-cell proliferation and is epigenetically silenced in mouse and human B-cell lymphomas. Blood. 2009;113:2478-87.
  35. Cui S, et al. Hsa-miR-22-3p inhibits liver cancer cell EMT and cell migration/invasion by indirectly regulating SPRY2. PLoS One. 2023;18:e0281536.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GeneeskundeEditie 233Editie 233Lege waardeEditieC28 I2 cellenhumaan artrosemodel OAmiRNA 590 5pBeclin 1LC3IIBcl 2

Gerelateerde artikelen