Visualisatie en kwantificering van intermoleculaire RNA-basenparing in in vitro RNA-clusters met behulp van gesplitste broccoli RNA-reporters

Summary

Dit protocol beschrijft een visuele assay waarbij gesplitste broccoli-RNA-reporters worden gebruikt om intermoleculaire basenparingen in vitro te detecteren en te kwantificeren.

Abstract

RNA-clustering, aangedreven door multivalente intermoleculaire RNA–RNA-interacties, kan in vitro plaatsvinden zonder eiwitten. Hoewel chemische probing en computationele simulaties zijn gebruikt om deze interacties te voorspellen, blijven methoden om intermoleculaire basenparing in RNA-clusters direct te beoordelen beperkt. Deze studie presenteert een visuele assay gebaseerd op gesplitste Broccoli RNA-reporters die geconjugeerd zijn met fluorescerend gelabelde RNA's van interesse. De assay maakt het mogelijk om intermoleculaire basenparingen in RNA-clusters te detecteren en te kwantificeren. Het split broccoli-systeem bevat complementaire reportersequenties die dimeriseren om de broccoli RNA-aptameer te vormen. De resulterende gedimeriseerde RNA-structuur bindt aan DFHBI-1T, een fluorofoor die bij binding groene fluorescentie uitzendt. Bij RNA-clustering rapporteert het verschijnen van groene fluorescentie basenparing die wordt gemedieerd door de complementaire reportersequenties tussen de RNA's van belang. De meting van DFHBI-1T-fluorescentie maakt kwantitatieve beoordeling mogelijk van hoe in vitro RNA-clustering condities de intermoleculaire basenparing tussen deze reportersequenties beïnvloeden.

Introduction

In vitro getranscribeerde RNA's kunnen zichzelf assembleren tot zichtbare clusters bij toevoeging van zouten en moleculaire crowding-reagentia 1,2,3,4,5. Opvallend is dat deze RNA-clusters kunnen ontstaan zonder andere cellulaire componenten, waaronder eiwitten, wat aangeeft dat onder specifieke omstandigheden intermoleculaire RNA–RNA-interacties voldoende zijn om RNA-condensatie in vitro aan te sturen.

Onder de verschillende typen intermoleculaire RNA–RNA-interacties heeft intermoleculaire basenparing aanzienlijke aandacht gekregen op het gebied van condensaat^. Deze interacties kunnen worden aangedreven door blootgestelde complementaire sequenties ("postcodes") tussen transcripten, zoals aangetoond door co-clustering van BNI1- en SPA2-mRNA's in de filamenteuze schimmel Ashbya gossypii² of oligomerisatie van oskar mRNA in Drosophila melanogaster ^6,7. Alternatief kan intermoleculaire basenparing worden bevorderd door het hermodelleren van RNA-secundaire structuren, waarbij complementaire sequenties blootgelegd worden die anders structureel zijn ingebed. Dit mechanisme is waargenomen in herhaalde RNA's in silico⁹ en guanidine-riboswitches in vitro¹⁰. Zowel blootgestelde complementaire sequenties als RNA-structurele remodellering kunnen worden gemeten met chemische probing^11,12 of simulatiebenaderingen ^4,9,13,14. Methoden die intermoleculaire basenparing direct visualiseren in in vitro RNA-clusteringsassays blijven echter beperkt.

RNA pull-down assays met basenkoppeling-crosslinkers ^15,16,17 en gelelektroforese ^4,6,7 worden vaak gebruikt om intermoleculaire RNA-basenparing in vitro te bestuderen. Deze methoden missen echter de ruimtelijke resolutie om basisparingen binnen clusters te onderscheiden van die erbuiten. Bovendien is het isoleren van RNA-clusters voor downstream analyse technisch uitdagend, omdat het behoud van clusterstabiliteit vereist en buffercompatibiliteit met latere assays wordt gegarandeerd.

Een visuele assay gebaseerd op gesplitste broccoli-RNA-reporters¹⁸ , geconjugeerd aan fluorescentief-gelabelde RNA's van interesse, is eerder gebruikt om directe detectie van intermoleculaire basenparing tijdens RNA-condensatie in vitro⁴ mogelijk te maken. In deze context rapporteert het split broccoli-systeem over de waarschijnlijkheid van intermoleculaire interacties tussen reporters of tussen RNA's die deze dragen onder gedefinieerde in vitro clusteringcondities. De assay onderzoekt dus hoe sequentiecontext en omgevingsfactoren de neiging tot intermoleculaire basenparing binnen een RNA-clusterachtige omgeving beïnvloeden.

Het split broccoli-systeem bestaat uit twee complementaire RNA-sequenties, boven en onder, die dimeriseren om het broccoli RNA-aptameer te reconstitueren (Figuur 1A–C)¹⁸. Bij dimerisatie bindt het aptameer aan de fluorofore DFHBI-1T, wat resulteert in groene fluorescentie (Figuur 1A–C)¹⁸. Met dit systeem blijkt dat de mate van intermoleculaire basenparing tussen complementaire sequenties van de rapporteur binnen RNA-clusters afhangt van RNA-vouwing. Door de verhouding van DFHBI-1T-fluorescentie tot RNA-niveaus over verschillende experimentele omstandigheden te vergelijken, kan de invloed van in vitro condities op door de reporter gemedieerde intermoleculaire basenparing binnen RNA-clusters kwantitatief worden beoordeeld.

Deze assay vult RNA-pull-down en gelelektroforese aan voor het bestuderen van intermoleculaire basenparing in RNA-clusters. Robuuste signaaldetectie kan echter moleculaire crowding-reagentia vereisen, en de gevoeligheid wordt beperkt door de efficiëntie van dimerisatie en vouwing van de gespleten broccoli-boven- en onder-RNA's .

Protocol

Dit protocol biedt een stapsgewijze methode voor het implementeren van deze assay en bespreekt de toepassingen ervan. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van DNA-sjablonen voor in vitro RNA-transcriptie

1. Voeg een T7-promotorsequentie toe aan het 5′-uiteinde van elk DNA-sjabloon met de gesplitste Broccoli-aptameersequenties voor in vitro RNA-transcriptie. Gebruik alleen de gesplitste Broccoli-aptamersequenties (boven en onder) of plaats ze op elke positie stroomafwaarts van de T7-promotor, met of zonder een aanvullende RNA-sequentie van interesse.
   OPMERKING: De sequenties voor de T7-promotor, split Broccoli-reporters en primers die worden gebruikt om de DNA-sjablonen te amplificeren, staan vermeld in Tabel 1.
   OPMERKING: T7 RNA-polymerase geeft sterk de voorkeur aan transcriptie te initiëren met een "G" op de +1-positie. De aanwezigheid van extra G's direct stroomafwaarts op de +2- en +3-posities kan het transcriptie-resultaat¹⁹ verhogen. Wanneer de downstream-sequentie echter begint met G, zoals bij de boven- en onderconstructies die met twee G's beginnen, kan transcriptie op verschillende posities²⁰ worden geïnitieerd. Als gevolg hiervan kunnen transcripties één, twee of drie G's dragen aan het 5′-uiteinde (bijv. GATCC, GGATCC of GGGATCC), wat de interpretatie van basenparing in de ontworpen constructies kan beïnvloeden.
2. Gebruik commercieel gesynthetiseerde genblokken, plasmiden of DNA-fragmenten als sjablonen voor PCR. Als het originele sjabloon geen T7-promotor bevat, gebruik dan een voorste primer met een 5′ T7 promotoroverhang samen met de juiste omgekeerde primer.
3. Bereid een 50 μL PCR-reactie voor in een 200 μL PCR-buis met elk 2,5 μL van 10 μM voor- en achteruitprimers, een 20 ng DNA-template, 25 μL 2× high-fidelity mastermix en nucleasevrij water. Meng grondig door op en neer te pipetteren en centrifugeer op 2.000 × g gedurende 2 seconden.
4. Voer de PCR-reactie uit in een thermische cycler met het volgende programma: 98 °C voor 30 s (1 cyclus); 98 °C voor 10 s, geoptimaliseerde annealingtemperatuur voor 30 s, en 72 °C voor 30 s per kilobase (35 cycli); 72 °C gedurende 2 minuten (1 cyclus).
   OPMERKING: Bepaal de geoptimaliseerde annealingtemperatuur met een online tool zoals een TM-calculator. PCR-producten kunnen na voltooiing bij 4 °C worden bewaard.
5. Meng 2 μL PCR-producten met 8 μL nucleasevrij water en 2 μL 6× laadkleurstof. Laad het mengsel op een 1% agarosegel voor elektroforese.
   OPMERKING: Het PCR-product zou als één band moeten verschijnen. Als er meerdere banden worden waargenomen, verwijder dan de juiste band en zuiver deze met een gelextractiekit voordat je verder gaat.
6. Zuiver het PCR-product of gel-geëxtraheerd DNA met een DNA-zuiveringskit en elueer in 20–30 μL nucleasevrij water in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
7. Meet de DNA-concentratie en zuiverheid met een microvolumespectrofotometer. Zorg ervoor dat A260/A280 ongeveer 1,8 is en A260/A230 groter dan 2,0.
   OPMERKING: Als A260/A230 onder 2,0 ligt, voer dan een extra zuiveringsstap uit.
8. Bewaar het DNA-sjabloon bij −20 °C tot gebruik.

2. Voorbereiding van in vitro RNA-transcriptiereactie

1. Veeg het werkoppervlak, buisrekken en pipetten af met een RNase-decontaminatieoplossing. Gebruik RNase-vrije, gefilterde tips.
2. Ontdooi-reactiebuffer- en nucleotideoplossingen (ATP, CTP, GTP, UTP) geleverd met de T7-transcriptiekit, samen met UTP-Cy5, op ijs. Centrifugeer alle buizen op 2.000 × g gedurende 2 seconden voorafgaand aan gebruik.
   OPMERKING: Bescherm UTP-Cy5 tegen licht.
3. Bereken het aantal thyminebasen in het DNA-sjabloon (exclusief de T7-promotor) en bepaal de benodigde volumes UTP en UTP-Cy5 voor een transcriptiereactie van 20 μL. Houd een consistente labeldichtheid over alle RNA-soorten heen.
   OPMERKING: Om bijvoorbeeld een RNA met 100 uracilbasen te labelen met ongeveer drie Cy5-gelabelde uracils, voeg je 4,5 μL van 1 mM UTP-Cy5 en 1,9 μL van 75 mM UTP toe.
4. Bereid een transcriptiereactie van 20 μL voor door elk 2 μL ATP, CTP en GTP te combineren, berekende volumes UTP (allemaal meegeleverd met de kit) en UTP-Cy5, 2 μL 10× reactiebuffer, 2 μL enzymmix, 200 ng DNA-template en nucleasevrij water. Meng grondig door op en neer te pipetteren en centrifugeer op 2.000 × g gedurende 2 seconden.
5. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 6 uur.
6. Voeg 1 μL DNase toe die bij de kit wordt geleverd. Meng grondig door op en neer te pipetteren en centrifugeer op 2.000 × g gedurende 2 seconden.
7. Broeden op 37 °C voor nog eens 15 minuten.
8. Breng de reactie (~20 μL) over naar een 1,5 mL buis. Voeg 115 μL nucleasevrij water en 15 μL ammoniumacetaat stopoplossing toe die bij de kit wordt geleverd. Meng grondig door op en neer te pipetteren en centrifugeer op 2.000 × g gedurende 2 seconden.
   OPMERKING: In plaats van stappen 2.9–3.7 kan een commerciële RNA-zuiveringskit worden gebruikt.
9. Voeg 150 μL fenol/chloroform toe en meng voorzichtig.
   VOORZICHTIG: Behandel fenol/chloroform in een chemische dampafzuigkap.
10. Centrifugeer op 16.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
11. Breng de bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis.
    OPMERKING: Vermijd het verstoren van de interfase; De onderste laag kan blauw lijken door niet-ingebouwde kleurstof.
12. Voeg een gelijke hoeveelheid chloroform toe en meng grondig.
    VOORZICHTIG: Hanteer chloroform in een chemische afzuigkap.
13. Centrifugeer op 16.000 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
14. Herhaal stappen 2.11–2.13.
15. Breng de waterige laag (~100–150 μL) over naar een nieuwe buis. Voeg 900 μL isopropanol toe en meng grondig.
16. Aliquot in drie gelijke volumes in aparte buizen.
    OPMERKING: Elke aliquot is voldoende voor meerdere RNA-clusteringsreacties.
17. Bewaar bij −20 °C 's nachts of tot een maand.

3. Zuivering van in vitro getranscribeerd RNA

1. Centrifugeer het RNA-monster in isopropanol bij 16.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
2. Verwijder de isopropanol voorzichtig zonder de RNA-pellet te verstoren.
3. Voeg 1 mL 70% ethanol toe, bereid in nucleasevrij water.
4. Centrifugeer op 16.000 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
5. Verwijder de ethanol en herhaal stappen 3.3–3.4.
6. Tijdens de laatste ethanolwasbeurt verwijder je het grootste deel van de ethanol met een pipet van 1000 μL. Centrifugeer kort op 2.000 × g gedurende 2 seconden in een minicentrifuge op een werkbank en verwijder eventueel resterende ethanol met een 20 μL pipet.
7. Laat de RNA-pellet 1–2 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur (RT).
8. Suspendeer de RNA-pellet opnieuw in 20 μL nucleasevrij water. Bewaar het monster op ijs en bescherm het tegen licht.
9. Meet de RNA-concentratie en zuiverheid met behulp van een microvolumespectrofotometer. Zorg ervoor dat A260/A280 ongeveer 2,0 is en A260/A230 groter dan 2,0.

4. Bereiding van een in vitro RNA-clusteringsreactie

OPMERKING: In dit protocol vereist inductie van RNA-clustering spermine en PEG 8000, gebaseerd op eerdere studies ^2,4,5. Specifiek werd een 100 mM zaadcelige tetrahydrochloride-voorraadoplossing, bereid in nucleasevrij water, gealiquoteerd in meerdere 1,5 mL microcentrifugebuizen en opgeslagen bij −20 °C.

1. Ontdooi een tube met 100 mM spermiene oplossing en 50% PEG 8000 op ijs.
   OPMERKING: Na opening mag 50% PEG 8000 niet langer dan twee maanden worden gebruikt vanwege mogelijke degradatie.
2. Om 500 μL vers gemaakte 10× RNA refold buffer te bereiden, combineert u 50 μL 2M KCl, 50 μL 1M MgCl₂, 50 μL 1M Tris (pH 7,0) en 350 μL nucleasevrij water. Meng grondig door op en neer te pipetten. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 2 seconden in een minicentrifuge op een werkbank.
   OPMERKING: De refold-buffer moet worden voorbereid op de dag van het RNA-clusteringexperiment.
   OPMERKING: Stappen 4.3-4.4 zijn afhankelijk van de experimentele omstandigheden en kunnen indien nodig worden aangepast. Twee voorbeeldcondities voor RNA-clustering die in deze studie worden gebruikt, worden hieronder beschreven. De co-vouwvoorwaarde is aangepast van een methode die wordt gebruikt om antisense-oligonucleotiden naar RNA² te annealen. Bij deze methode worden RNA's gemengd in een zoutbuffer en samen verhit om intermoleculaire basenparing tussen RNA's met complementaire sequenties te bevorderen. Daarentegen wordt bij de aparte vouwvoorwaarde elk RNA afzonderlijk gevouwen voordat het mengt. Deze aandoening is bedoeld om een cellulair scenario te benaderen waarin RNA's worden gevouwen voordat ze interacteren.
3. Co-vouwen
   OPMERKING: Deze aandoening bevordert intermoleculaire basenparing tussen RNA's die de bovenste en onderste sequenties bevatten. Het dient als positieve controle voor door de reporter aangestuurde intermoleculaire basenparing onder de RNA-clusteringconditie.
   1. In een 200 μL PCR-buis combineert u 16 pmol van elk in vitro getranscribeerd RNA met ofwel de bovenste of onderste sequentie, 2 μL van 10× refolding RNA-buffer en nucleasevrij water tot een eindvolume van 14 μL. Meng grondig door op en neer te pipetten. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 2 seconden in een minicentrifuge op het werk.
      OPMERKING: Om de RNA-massa te berekenen die overeenkomt met 16 pmol.
   2. Verwarm het RNA-monster op 90 °C gedurende 2 minuten.
   3. Zet het monster onmiddellijk over naar RT en bescherm het tegen licht. Incubeer de reactie bij RT gedurende 1 uur.
4. Afzonderlijke vouw
   1. Verwarm het RNA-monster tot 90 °C gedurende 2 minuten en leg het daarna minstens 15 minuten op ijs.
   2. In een 200 μL PCR-buis combineert u 16 pmol in vitro getranscribeerd RNA met ofwel de boven- of onderste sequentie, 1 μL van 10× refolding RNA-buffer en nucleasevrij water tot een eindvolume van 7 μL.
      OPMERKING: Om de RNA-massa te berekenen die overeenkomt met 16 pmol.
   3. Incubeer de reactie bij RT gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht.
   4. Combineer de RNA-monsters met de bovenste en onderste sequenties in één enkele PCR-buis. Meng grondig door op en neer te pipetten. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 2 seconden in een minicentrifuge op het werk. Incubeer 30 minuten bij RT.
5. Voeg 6 μL toe van een 1:2 (v/v) premix van 100 mM spermine en 50% PEG 8000. Meng grondig door op en neer te pipetten. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 2 seconden in een minicentrifuge op een werkbank.
   OPMERKING: 50% PEG 8000 is zeer viskeus. Pipette langzaam en voorzichtig.
6. Voeg 2 μL van 1 mM DFHBI-1T toe aan de reactie. Meng grondig door op en neer te pipetten. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 2 seconden in een minicentrifuge op een werkbank. De reactie zou geelgroen moeten lijken.
   OPMERKING: Om een 20 mM DFHBI-1T voorraadoplossing te bereiden uit 1 mg DFHBI-1T (MW: 320,21) gelyofilieerde kleurstof, voeg je 156 μL moleculairbiologisch anhydrous DMSO toe. Aliquot de voorraad in kleine hoeveelheden in meerdere microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 °C. Vermijd herhaalde vries-ontdooicycli voor de kleurstof. Bereid een vers verdund 1 mM DFHBI-1T werkoplossing voor door de 20 mM voorraad te verdunnen in nucleasevrij water en deze op ijs te bewaren.
7. Laad de reactie in een glazen kamerafdekglas.
8. Incubeer de kamer op RT gedurende 4 uur in het donker met de deksel erop om verdamping te minimaliseren.

5. Voorbereiding op beeldvorming

1. Maakt driedimensionale beelden met behulp van een gestructureerde verlichtings- of confocale microscoop uitgerust met geschikte lasers en objectieven.
   OPMERKING: Confocale microscopie is nodig om onscherp licht te minimaliseren.
2. Configureer de microscoop om elk interessegebied (ROI) eerst met het Cy5-kanaal bij elk z-vlak te fotograferen, gevolgd door het afbeelden van dezelfde ROI met het GFP-kanaal.
3. Stel de belichtingstijd in op 500 ms voor alle kanalen. Stel het laservermogen in op 80% voor GFP en 40% voor Cy5.
4. Stel je een coverslipgebied buiten de reactiedruppel bij RT voor met een z-stapgrootte van 150 nm.

6. Kwantificering van intermoleculaire basenparing

1. Importeer afbeeldingen in beeldanalysesoftware²¹. Identificeer GFP (DFHBI-1T) en Cy5 (RNA) kanalen.
2. Teken een ROI van 5 × 5 pixels binnen een RNA-cluster en meet de geïntegreerde dichtheid voor beide kanalen op hetzelfde z-vlak. Selecteer 5–8 ROI's uit verschillende RNA-clusters in elke afbeelding.
   OPMERKING: Pas de ROI-grootte aan afhankelijk van de camera-setup, maar behoud consistentie tussen de experimenten.
3. Selecteer 5–8 ROI's buiten de reactiedruppel voor achtergrondmeting en bereken de gemiddelde geïntegreerde dichtheid voor beide kanalen.
4. Bereken de genormaliseerde DFHBI-1T-intensiteit voor elke ROI met behulp van:
   

7. Veelvoorkomende problemen en probleemoplossing

1. Als er na centrifugatie geen RNA-pellet wordt waargenomen, overweeg dan RNA-afbraak, onvoldoende transcriptietijd, inactieve polymerase, restzouten of lage RNA-concentratie. Gebruik RNase-vrije reagentia, verleng de transcriptietijd, gebruik verse enzymen en zuiver sjablonen.
2. Als er geen Cy5-gelabelde RNA-clusters worden waargenomen, overweeg dan RNA-degradatie of gedegradeerde PEG 8000 of UTP-Cy5. Gebruik verse reagentia en RNase-vrije omstandigheden.
3. Als er geen DFHBI-1T-signaal wordt waargenomen onder co-foldingcondities, overweeg dan een slechte kleurstofkwaliteit, gebrek aan Broccoli-structuurvorming of afgeknotte transcripten. Gebruik verse kleurstof, zorg voor een juiste buffersamenstelling en controleer de transcriptgrootte met gelanalyse.
4. Als het fluorescentiesignaal bleekt, verminder dan het laservermogen en de belichtingstijd, minimaliseer beeldstappen en bescherm monsters tegen licht tijdens de incubatie.

Results

In dit demonstratie-experiment werd het vermogen van alleen de boven- en onder-RNA-reporters om te basepaaren en de Broccoli-structuur te vormen eerst geëvalueerd met behulp van het eerder beschreven in vitro RNA-clusteringprotocol⁴. Basenparing tussen boven en onder genereert twee broccoliarmen, elk in staat om één DFHBI-1T-molecuul te intercaleren (Figuur 1A–C)^18,22.

Bij inductie van RNA-clustering met spermine en PEG 8000 vormden beide RNA's clusters, hetzij afzonderlijk of samen (Figuren 1D–Eii). Wanneer top- of onderste RNA's geïsoleerd werden onderzocht, was DFHBI-1T-fluorescentie binnen RNA-clusters aanzienlijk lager dan in de co-folding-conditie, waarbij de twee RNA's werden gecombineerd vóór warmtedenaturatie en hervouwing (Figuur 1F). In de co-folding conditie werd de molaire verhouding van DFHBI-1T (0,1 mM) tot top (0,8 μM) en onderkant (0,8 μM) geschat op 125:1:1. Dit komt overeen met een ongeveer 62,5-voudig overschot aan DFHBI-1T ten opzichte van het maximale aantal potentiële broccolistructuren.

Het lage maar niet-nul DFHBI-1T-signaal dat alleen voor top en bottom is waargenomen, komt overeen met eerdere rapporten die minimale DFHBI-1T-fluorescentie laten zien wanneer elke reporter individueel¹⁸ wordt uitgedrukt. DFHBI-1T vertoonde ook zeer lage maar detecteerbare achtergrondfluorescentie in afwezigheid van RNA (Figuur 1F). Samen tonen deze resultaten aan dat DFHBI-1T compatibel is met de in vitro RNA-clusteringstest en dat co-folding de intermoleculaire basenparing tussen top- en bottom-RNA's versterkt.

Na normalisatie naar RNA-intensiteit bereikte de genormaliseerde DFHBI-1T fluorescentieintensiteit in de co-folding conditie 1,03, wat significant hoger was dan alleen die van top en bottom (respectievelijk 0,054 en 0,023) (Figuur 1D, Figuur 1Ei en Figuur 1F). RNA-clusters gevormd door het mengen van boven- en onder-RNA's die apart gevouwen waren vóór clustering, werden vervolgens onderzocht (Figuur 1D, Figuur 1EII en Figuur 1F). In deze aparte vouwconditie was het genormaliseerde DFHBI-1T-signaal 0,031, vergelijkbaar met de basisniveaus die werden waargenomen in de negatieve controles (alleen boven of onder) (Figuur 1F). Deze resultaten geven aan dat co-folding intermoleculaire basenparingen tussen top- en bottom-RNA's bevordert, terwijl aparte vouwing dergelijke interacties beperkt.

De bovenste en onderste sequenties werden vervolgens ingebracht in het 3′ niet-vertaalde gebied (UTR) van Drosophila melanogaster shutdown (shu), een kiemgranulet mRNA ^4,23,24, en zijn antisense-tegenhanger (shu^anti). De shu 3′ UTR werd gekozen omdat eerder onderzoek aantoonde dat dit RNA voornamelijk als monomeer voorkomt in Drosophila melanogaster en zelfs bij hoge molaire concentraties in RNA-gelassays ^4,24 niet dimeriseert. Daarnaast vormen shu-top en shu-bottom geen homodimeren in RNA-gels⁴, wat een directere beoordeling mogelijk maakt van intermoleculaire interacties tussen top en bottom en de invloed van flankerende sequenties afgeleid van shu.
De DNA-sjablonen voor shu-top, shu-bottom, shu^anti-top en shu^anti-bottom worden vermeld in Tabel 2. De bovenste en onderste sequenties werden in het midden van de shu of shu^anti 3′ UTR geplaatst, wat structurele herstructurering vereiste om interactie te vergemakkelijken en fysiologische RNA–RNA-interacties beter na te bootsen, waarbij interacterende regio's typisch in transcripten⁴ zijn ingebed.

Bij inductie van RNA-clustering vertoonden shu-top, shu-bottom, shu anti-top en shu anti-bottom individueel minimale DFHBI-1T-fluorescentie, vergelijkbaar met top en bottom alleen (Figuren 2A en 2B). Consequent leverde co-folding van shu-top met shu-bottom of shu^anti-top met shu^anti-bottom een hoger DFHBI-1T signaal op dan apart vouwen (Figuren 2Ci en Cii). Na normalisatie naar RNA-intensiteit en negatieve controles (gedefinieerd als het gemiddelde genormaliseerde DFHBI-1T-signaal van elk RNA alleen), resulteerde co-folding van shu-top en shu-bottom in een 5,63-voudige toename van genormaliseerde DFHBI-1T-fluorescentie (Figuren 2Di en 2Dii). Ter vergelijking: aparte vouwing liet slechts een toename van 1,04 keer zien, vergelijkbaar met de basisniveaus die individueel voor shu-top en shu-bottom werden waargenomen. Vergelijkbare trends werden waargenomen voor shu^anti-top en shu^anti-bottom onder co-folding en aparte vouwomstandigheden (Figuren 2Di en 2Dii). Deze resultaten geven aan dat gescheiden vouwen intermoleculaire basenparingen tussen shu-top en shu-bottom of shu^anti-top en shu^anti-bottom niet bevordert, terwijl co-folding deze interacties versterkt, waarschijnlijk door de ingevoegde reportersequenties.

Om te testen of shu en shu^anti-can basispaar vormden, werd shu-top gemengd met shu^anti-bottom, en shu^anti-top met shu-bottom. Beide combinaties vertoonden een hogere DFHBI-1T-fluorescentie onder zowel co-folding als aparte vouwomstandigheden vergeleken met shu-top met shu-bottom of shu^anti-top met shu^anti-bottom (Figuren 2Ci en 2Cii). Na normalisatie resulteerde co-folding van shu-top met shu^anti-bottom en shu^anti-top met shu-bottom respectievelijk 61,86- en 82,60-voudige toename in DFHBI-1T-fluorescentie (Figuren 2Di en 2Dii). Ter vergelijking: apart vouwen leverde respectievelijk slechts 2,69- en 4,94-voudige toename op (Figuren 2Di en 2Dii). Hoewel aanzienlijk lager dan onder co-folding, waren deze waarden hoger dan die waargenomen voor shu-top met shu-bottom of shu^anti-top met shu^anti-bottom (respectievelijk 1,04 en 1,16).

Samen geven deze resultaten aan dat verslaggevers met aanvullende complementaire sequenties een grotere capaciteit hebben om te base-pairen dan degenen zonder dergelijke sequenties. Dit effect wordt verder versterkt onder de co-foldingconditie, wat intermoleculaire interacties bevordert.

Figuur 1: Voorspelde secundaire structuren van top- en bottom-RNA's en kwantificatie van hun intermoleculaire basenparing in in vitro RNA-clusters. (A–B) Voorbeelden van secundaire structuren van top (A) en bottom (B) vouwen individueel, zoals voorspeld door RNAfold²⁵. Wanneer het afzonderlijk wordt gevouwen, herstellen boven- en onderlaag de Broccoli-aptameer niet, en DFHBI-1T (grijze ster) produceert minimale fluorescentie. (C) Voorbeeld van de secundaire structuur van basengepaarde boven- en onderste RNA's, zoals voorspeld door RNAcofold²⁵. Intermoleculaire basenparing tussen de twee RNA's reconstrueert twee Broccoli-armen¹⁸, waardoor DFHBI-1T-binding mogelijk wordt en resulteert in sterke groene fluorescentie (groene sterren). (D) Beelden van DFHBI-1T alleen (kleurstof-only controle) en in vitro RNA-clusters (magenta) gevormd door boven- en onder-RNA's in aanwezigheid van DFHBI-1T (groen). (Ei, ii) In vitro RNA-clusters (magenta) gevormd door top- en bottom-RNA's onder co-folding (i) en aparte vouwing (ii) condities in aanwezigheid van DFHBI-1T (groen). Voor panelen D en E werden RNA's gelabeld met Cy5, zodat gemiddeld ongeveer een derde van de RNA's een enkele Cy5-gelabelde uracil bevat, terwijl de overige twee derde niet gelabeld is. Beelden vertegenwoordigen gemiddelde Z-projecties van 27 sneden die met een stapgrootte van 150 nm zijn gemaakt, waarbij dezelfde belichting en laserkracht voor elk kanaal onder alle omstandigheden worden gebruikt. DFHBI-1T-fluorescentie werd genormaliseerd tot hetzelfde intensiteitsbereik onder verschillende omstandigheden. Schubbalken: 2 μm. (F) DFHBI-1T intensiteit werd genormaliseerd naar RNA-abundantie, gemeten met Cy5-fluorescentie. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. P-waarden voor tweezijdige t-test (**** versus co-folding): 1,0 × 10⁻²² (alleen kleurstof), 2,3 × 10⁻²² (boven), 4,9 × 10⁻²³ (onder), en 7,0 × 10⁻²³ (aparte vouwing). n = 30 regio's voor de kleurstof-only conditie en 30–31 RNA-clusters voor alle andere aandoeningen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve beelden en kwantificering van intermoleculaire basenparing voor shu en shu^anti-carry top en bottom reporters. (A) Beelden van DFHBI-1T alleen (kleurstof-only controle) en in vitro RNA-clusters (magenta) gevormd door shu-top, shu-bottom, shu^anti-top en shu^anti-bottom RNA's in aanwezigheid van DFHBI-1T (groen). RNA's werden gelabeld met Cy5 zodat gemiddeld drie UTP-Cy5 uracils werden ingebracht tijdens in vitro transcriptie. Beelden vertegenwoordigen gemiddelde Z-projecties van 27 sneden die met een stapgrootte van 150 nm zijn gemaakt, waarbij dezelfde belichting en laserkracht voor elk kanaal onder alle omstandigheden worden gebruikt. DFHBI-1T-fluorescentie werd genormaliseerd tot hetzelfde intensiteitsbereik onder verschillende omstandigheden. Schubbalken: 2 μm. (B) DFHBI-1T-intensiteit werd genormaliseerd tot RNA-abundantie, gemeten met Cy5-fluorescentie. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. n.s., niet significant. P-waarden voor tweezijdige t-test (in tegenstelling tot alleen kleurstof): 3,1 × 10⁻³ (**; shu-top), 1,7 × 10⁻¹ (n.s.; shu-bottom), 2,9 × 10⁻³⁵ (***; shu anti-top), en 2,2 × 10⁻² (; shu anti-bottom). n = 30 regio's voor de kleurstof-only conditie en 30–32 RNA-clusters voor alle andere aandoeningen. (Ci, ii) Afbeeldingen van in vitro RNA-clusters (magenta) gevormd door het mengen van shu-top met shu-bottom, shu^anti-top met shu^anti-bottom, shu-top met shu^anti-bottom, en shu^anti-top met shu-bottom in aanwezigheid van DFHBI-1T (groen) onder co-folding (i) en aparte vouwing ( ii) voorwaarden. Beelden vertegenwoordigen gemiddelde Z-projecties van 27 sneden die met een stapgrootte van 150 nm zijn gemaakt, waarbij dezelfde belichting en laserkracht voor elk kanaal onder alle omstandigheden worden gebruikt. Voor het lage bereik werd DFHBI-1T-fluorescentie genormaliseerd tot hetzelfde intensiteitsbereik als Figuur 1D–Eii en Figuur 2A. Voor het hoge bereik werd DFHBI-1T-fluorescentie genormaliseerd tot een hoger maar consistent intensiteitsbereik onder alle omstandigheden in panelen Ci en Cii. Schaalbalken: 2 μm. (Di, ii) DFHBI-1T-intensiteit werd eerst genormaliseerd naar RNA-intensiteit en daarna naar negatieve controles, gedefinieerd als het gemiddelde genormaliseerde DFHBI-1T-signaal van elk RNA alleen. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. n.s., niet significant. (i) P-waarden voor tweezijdige t-test (**** versus shu-top + shu-bottom): 1,1 × 10⁻³¹ (shu^anti-boven + shu^anti-bottom), 1,1 × 10⁻²² (shu-top + shu^anti-bottom), en 4,3 × 10⁻²⁷ (shu^anti-boven + shu-bottom). (ii) P-waarden voor tweezijdige t-test (versus shu-top + shu-bottom): 2,2 × 10⁻¹ (n.s.; shu anti-top + shu anti-bottom), 1,9 × 10⁻9 (; shu-top + shu^anti-bottom), en 1,3 × 10⁻¹⁵ (; shu anti-top + shu-bottom). n = 29–32 RNA-clusters voor alle omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam	Reeksen (5′-3′)
T7-promotor	TAATACGACTCACTATAG
top	GGATGATGGAGAGACGTGGTCGGGTC CAGGATCATTCATGGCAAGAGAC GGTCGGGTCCAGATGATGCGGAT
Onderaan	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGGGC TCCATCATCC
top-T7 aanvaller	TAATACGACTCACTATAG GGATGATGGAGAGAGGGTCG
boven-Keerzijde	ATCCGCATCATCATCTGGACCC
Onderste T7 aanvaller	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCATCTGTCGA
onderzijde-Achterzijde	GGATGATGGAGCCCACACT
De voorste primers bevatten een T7-promotorsequentieoverhang (vetgedrukt), gevolgd door sequenties die het 5′-uiteinde van het RNA targeten.

Tabel 1: Sequenties van T7-promotor, gesplitste broccoli-reporters en primers gebruikt om DNA-sjablonen voor T7-transcriptie te amplificeren. De vermelde primers werden gebruikt om DNA-sjablonen te genereren voor in vitro transcriptie van de bovenste en onderste RNA's, die vervolgens werden gebruikt in RNA-clusteringsassays zoals beschreven in deze studie.

Naam	Reeksen (5′-3′)
shu-top	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATATCTTACTCAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGAGGGTCGGGTCCAGATGATGATGCGGA TAAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAATTTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATT AGTTATTTCGATATTAGCAACATGAATATCGTAAGCCCAGGAATGTTAACGTTTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAAAAAACCAATAAAAGTAATGCACGGCAGCCTACAT
shu-bottom	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATATCTTACTCAAAAAGGATCCGCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCCCATGTGTGTGTGGGTCAACCCACATACTCTGATG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCAAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATTAGTTATTTCGATATTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTGTTATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGGTGTTAA AAACCACAATAAAAAGTAATGCACGGCAGCCTACAT
shuanti-top	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATGATATTCATGTTGCTAATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAAATTACCTTCATGTTTTTGGTATGTTTTTTTTTGGA TGATGGAGACGGTCGGGTCCAGGATCATGGCAAGAGAGAGGGTCGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATGAAATGATGGGGGGCTGGCTTAGTAAGC
ShuAnti-Bottom	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTATTGTGGTTTTTAACACAACTTAAGGTCTACGTTGGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAAATTACCTTCATGTTTTTGGTGTTTTTTT GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCCCATGTGTGTGTGTGGGTCAAC CCACATACTCTGATGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCTTTTTGAGTAA GATATGAAATATGAAATACTGGGGGGCTCTTAGTAAGC
shu-top of shu-bottom-T7 vooraan	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
Shu-top of shu-bottom-Achterzijde	ATGTAGCTGCCGTGCATTAC
shuanti-top of shu anti-bottom-T7 vooraan	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
Shuanti-top of shuanti-bottom-Achterzijde	GCTTACTAAGAAGCCACTA
De voorste primers bevatten een T7-promotorsequentieoverhang (vetgedrukt), gevolgd door sequenties die het 5′-uiteinde van het RNA targeten. Er werden één of twee extra G's toegevoegd tussen de T7-promotor en shu-top en shu-bottom of shuanti-top en shuanti-bottom, respectievelijk. Dit komt doordat het hebben van G's op de +2 en +3 posities het transcriptie-resultaatvan 19 aanzienlijk kan verhogen. Deze extra G's kunnen echter mogelijk de interpretatie van basisparingen in de ontworpen constructies beïnvloeden. Zie noot in stap 1.1.

Tabel 2: Sequenties van shu-top, shu-bottom, shu anti-top, shu^anti-bottom en primers gebruikt om DNA-sjablonen voor T7-transcriptie te amplificeren. De vermelde primers werden gebruikt om DNA-sjablonen te genereren voor in vitro transcriptie van shu- en shu-anti-RNA's met de boven- en onder-reporters, die vervolgens werden gebruikt in RNA-clusteringsassays zoals beschreven in deze studie.

Discussion

In deze studie werd het split Broccoli aptamersysteem¹⁸ aangepast voor directe visualisatie en kwantificatie van intermoleculaire basenparing onder in vitro RNA-clusteringcondities. Deze benadering maakt het mogelijk om intermoleculaire basenparingen te beoordelen onder verschillende in vitro omstandigheden en complementeert downstream biochemische assays, zoals RNA-pull-down experimenten met basenparingkruisverbinders 15,16,17 en gelelektroforese ^4,6,7. In tegenstelling tot deze biochemische methoden, die niet de ruimtelijke resolutie hebben om basenparingen binnen RNA-clusters te onderscheiden van die buiten hen, maakt deze benadering directe ruimtelijke visualisatie van deze interacties binnen clusters mogelijk. Specifiek maakt het monitoring van basenparing tussen top- en bottom-RNA's, of RNA's die deze reporters dragen, mogelijk onder gedefinieerde RNA-clusteringcondities. Daarnaast biedt het een realtime, kwantitatieve uitlezing van basenparing tussen rapporterende RNA's zonder crosslinking of RNA-extractie, waardoor monsterverlies en bufferincompatibiliteit worden geminimaliseerd.

Met behulp van fluorescentiemicroscopie werd intermoleculaire basenparing tussen de gesplitste Broccoli-aptameersequenties kwantitatief gemeten via het DFHBI-1T-signaal, waarmee de compatibiliteit van DFHBI-1T met het in vitro RNA-clusteringprotocol werd aangetoond. De mate van intermoleculaire basenparing varieerde afhankelijk van de RNA-vouwomstandigheden, zoals waargenomen onder co-vouwing en aparte vouwomstandigheden (Figuur 1F en Figuur 2Di–2Dii). Deze bevindingen geven aan dat RNA-vouwomstandigheden een cruciale invloed hebben op intermoleculaire RNA-interacties en zorgvuldig moeten worden overwogen bij het interpreteren van experimentele resultaten.

Deze test biedt ook een platform om te evalueren of sequenties die de boven- en onder-reporters flankeren de intermoleculaire basenparing versterken, zoals aangetoond met behulp van shu. DFHBI-1T fluorescentie was hoger voor shu-top met shu^anti-bottom en shu^anti-top met shu-bottom dan voor shu-top met shu-bottom of shu^anti-top met shu^anti-bottom, wat aangeeft dat intermoleculaire interacties tussen shu en shu^anti het Broccoli-signaal verder versterken. Deze waarnemingen suggereren dat het DFHBI-1T fluorescentiesignaal, verkregen door het co-vouwen van de boven- en onder-rapportages alleen, niet de bovengrens van de assay vertegenwoordigt.

DFHBI-1T-fluorescentie gemeten in deze experimenten besloeg een breed dynamisch bereik, van een toename van 1,04 keer (shu-top met shu-bottom onder aparte vouwing) tot een 82,60-voudige toename (shu^anti-top met shu-bottom onder co-folding). Dit dynamische bereik maakt het mogelijk verschillen in intermoleculaire RNA-interacties tussen RNA's met deze reporters te detecteren.

Verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal voor de succesvolle detectie van intermoleculaire RNA-basenparing tussen gespleten broccoli-boven- en onder-RNA's in RNA-clusters. Verse aliquoten van PEG 8000 moeten worden gebruikt om RNA-clustering betrouwbaar te induceren, en herhaalde vries-dooicycli moeten worden geminimaliseerd vanwege reagentia-instabiliteit. DFHBI-1T moet worden gealiquoteerd en opgeslagen bij −20 °C om fluorescentie-eigenschappen te behouden. In vitro transcriptieproducten moeten worden geanalyseerd op een denaturerende RNA-gel vóór clustering om de juiste transcriptgrootte te bevestigen. Daarnaast is het behouden van RNase-vrije omstandigheden, inclusief een schone werkomgeving en beeldvormingskamer, essentieel omdat RNA-druppels bij kamertemperatuur gedurende langere periodes worden geïncubeerd vóór de beeldvorming.

Een beperking van deze assay is dat DFHBI-1T specifiek intermoleculaire basenparing rapporteert die wordt gemedieerd door de bovenste en onderste sequentie. Andere intermoleculaire basenparingsgebeurtenissen die in verschillende RNA-regio's plaatsvinden, kunnen niet worden gedetecteerd. Daarnaast is de broccolistructuur gevormd door basenparing tussen de bovenste en onderste strengen thermodynamisch stabiel²⁶ en weerspiegelt mogelijk niet volledig zwakkere of tijdelijke interacties, zoals die gevormd door verstrooide, aan het oppervlak blootgestelde basen, zoals waargenomen in Drosophila kiemgranula mRNA-clusters⁴.

Bovendien kunnen intermoleculaire RNA–RNA-interacties promiscue en niet-specifiek zijn, en sequenties die de boven- en onder-rapporteurs flankeren kunnen invloed hebben op DFHBI-1T-fluorescentie. Deze flankerende gebieden kunnen direct interageren met de reportersequenties, waardoor de vorming van broccoli wordt geremd of de RNA-structuur wordt veranderd, waardoor de interacties tussen RNA's die de reporters dragen worden beïnvloed. Dienovereenkomstig weerspiegelt de assay de gecombineerde effecten van RNA-structuur, top-bottom basenparen, interacties tussen flankerende sequenties en interacties tussen flankerende sequenties en de reporters.

Deze assay biedt mogelijkheden voor toekomstig onderzoek. Zo kan het veranderen van RNA-sequenties die de reporters flankeren, het introduceren van RNA-helicases of chaperonnes, of het aanpassen van zoutcondities invloed hebben op intermoleculaire basenparing in RNA-clusters. Dergelijke effecten kunnen worden beoordeeld door het DFHBI-1T-signaal te meten onder co-folding en aparte vouwomstandigheden. Aangezien vergelijkbare RNA-aptameren zijn gebruikt in cellen, bacteriën en ^{gist, kan} deze benadering worden uitgebreid naar cellulosystemen of modelorganismen om intermoleculaire basenparingen in mRNA-clusters te onderzoeken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	Millipore Sigma	M1028	Used for preparation of 10× RNA refolding buffer.
2M KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	Used for preparation of 10× RNA refolding buffer.
50% PEG 8000	NEB	M0204S	Component of T4 RNA ligase kit; used as a molecular crowding reagent to induce RNA clustering.
Absolute ethanol, 200 proof	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	Used for preparation of RNA wash buffer.
Acid phenol:chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	Thermo Fisher Scientific	AM9722	Used for RNA purification.
Aminoallyl-UTP-Cy5	Jena Bioscience	NU-821-CY5	Used for RNA labeling during in vitro transcription.
Chambered coverglass	Thermo Fisher Scientific	155409PK	Imaging chamber for RNA clustering reactions.
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C298-500	Used for RNA purification.
DFHBI-1T	Lucerna	410	Used as a fluorophore for detection of Broccoli RNA aptamer.
DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345	Anhydrous; molecular biology grade; used for DFHBI-1T preparation.
DNA Clean & Concentrator Kit	Zymo	D4014	Used for cleanup of DNA products prior to T7 transcription.
DNA Gel Extraction Kit	NEB	T1020L	Used for gel extraction.
Dry bath	Benchmark Scientific	BSH1001	Used for heating RNA samples in microcentrifuge tubes.
FIJI/ImageJ	NIH (National Institutes of Health)	N/A	Open-source image analysis software; used for quantification of fluorescence intensity and ROI analysis.
Gel electrophoresis system	Thermo Fisher Scientific	B2-BP	Used for running DNA gel electrophoresis.
Gel loading dye, purple (6×)	NEB	B7024S	Used as a loading dye for DNA gel electrophoresis.
Instant structured illumination microscope	VisiTech international	VT-iSIM	A confocal microscope capable of imaging GFP and Cy5 fluorescence.
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific	327272500	Used for RNA purification.
MEGAscript T7 Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1334	Used for in vitro T7 transcription. The kit includes nucleotide solutions (ATP, CTP, GTP, UTP) and DNase.
Microcentrifuge tubes	Genesee Scientific	22-284	1.5mL tube; used for storing DNA templates for in vitro transcription, RNA products, and aliquots of spermine and DFHBI-1T.
Mini centrifuge	Benchmark Scientific	Z763845	Used for brief centrifugation.
Nanodrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518	Microvolume spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration and quality.
Nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	AM9937	Used for resuspension of RNA pellets, preparation of RNA wash and refolding buffers, and dilution of spermine and DFHBI-1T.
Online molar mass calculator	New England Biolabs (NEB)	N/A	Online tool used to calculate RNA mass from molar quantity (e.g., pmol).
Polypropylene PCR tubes	Corning	3745	200 μL PCR tubes used for PCR, in vitro transcription, and RNA clustering reactions
PowerPac Basic Power Supply	Bio-rad	1645050	Used for running DNA gel electrophoresis.
Proflex PCR thermal cycler	Thermo Fisher Scientific	44-840-73	Used for PCR, in vitro transcription and heating RNA samples in PCR tubes.
Q5 High-Fidelity 2× Master Mix	NEB	M0492S	Used as 2× high-fidelity master mix.
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5424R	Used for RNA purification and pelleting.
RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9782	Used for cleaning lab benches and surfaces to minimize RNase contamination.
Spermine tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	S1141-1G	Used for inducing RNA clustering.
Tris Base	Millipore Sigma	T1503-1KG	Used for preparation of Tris buffer (pH 7.0).
Ultrapure agarose	Thermo Fisher Scientific	16500500	Used for DNA gel electrophoresis.