Olijfolie-gebaseerde lipidemulsie verbetert immuuncheckpoint-remmer-geïnduceerde myocarditis via inhibitie van de NF-κB/NLRP3/IL-1β-route

Samenvatting

Olijfolie-gebaseerde lipidemulsies beperken door de immuuncheckpoint-remmer veroorzaakte myocarditis door de NF-κB/NLRP3/IL-1β-route te targeten, waarmee ze hun potentieel aantonen in het onderdrukken van inflammatoire cascades. Deze bevindingen benadrukken de belofte ervan als aanvullende therapie voor immuungerelateerde hartschade.

Samenvatting

De huidige studie was bedoeld om de therapeutische werkzaamheid en het onderliggende mechanisme van olijfolie-gebaseerde lipidemulsies (OOLE) te onderzoeken bij het verminderen van door de immuuncheckpoint-remmer (ICI)-geïnduceerde myocarditis veroorzaakt door ipilimumab (IPI) en nivolumab (NIVO). Een in vitro model van inflammatoire cardiomyocyten werd ontwikkeld door HL-1-cellen te cocultiveren met CD4⁺/CD8⁺ T-cellen geïsoleerd uit met ICI behandelde muizen. Cellen werden behandeld met 10% OOLE, gevolgd door flowcytometrie voor apoptose, ELISA voor cytokineprofilering (TNF-α, IL-1β, IL-6) en Western blot/qPCR voor routeanalyse (NF-κB, NLRP3, IL-1β). In vivo werd myocarditis bij muizen geïnduceerd door toediening van IPI/NIVO. De hartfunctie werd beoordeeld met echocardiografie en ontstekingsmarkers werden getest in serum- en myocardweefsel. De resultaten toonden aan dat OOLE significant de door T-cellen geïnduceerde apoptose verminderde en de productie van inflammatoire cytokines in HL-1-cellen onderdrukte, terwijl de expressie van NF-κB, NLRP3 en IL-1β werd gedownreguleerd. In vivo verbeterde OOLE de functionele parameters van de linker ventrikel en verminderde systemische ontsteking. Moleculaire analyses bevestigden dat deze beschermende effecten werden gemedieerd via de remming van de NF-κB/NLRP3/IL-1β signaalas. Samenvattend vermindert OOLE acute door ICI veroorzaakte myocarditis door de NF-κB/NLRP3/IL-1β-route te targeten, waarmee het potentieel aantoont om vroege inflammatoire cascades te onderdrukken en snelle cardioprotectie te bieden. Deze bevindingen benadrukken de belofte ervan als aanvullende therapie voor immuungerelateerde hartschade.

Inleiding

Immuuncontrolepuntremmers (ICI's), zoals die gericht zijn op geprogrammeerde celdood-1 (PD-1) en cytotoxisch T-lymfocyt-geassocieerd eiwit 4 (CTLA-4), hebben het behandellandschap voor verschillende maligniteiten gerevolutioneerd. De brede klinische toepassing van ICI's wordt echter vaak bemoeilijkt door immuungerelateerde bijwerkingen (irAE's). Onder deze gevallen is door ICI veroorzaakte myocarditis een zeldzame maar potentieel fatale complicatie, gekenmerkt door een snel klinisch verloop en hoge sterftecijfers variërend van 25% tot 50^%. Ondanks de ernst blijven de huidige therapeutische opties voor door ICI veroorzaakte myocarditis grotendeels beperkt tot hoge doses corticosteroïden en niet-specifieke immunosuppressiva ^3,4. Deze traditionele interventies leveren vaak suboptimale responsen op en kunnen de antitumoreffectiviteit van ICIs¹ aantasten, waardoor er een cruciale kenniskloof ontstaat in de zoektocht naar veiligere en gerichtere cardioprotectieve strategieën die hartontsteking kunnen verminderen zonder systemische immunosuppressie.

Het NOD-achtige receptorproteïne 3 (NLRP3) inflammasoom, geactiveerd via de NF-κB-signaalroute, is uitgegroeid tot een centrale drijfveer van de cytokinestorm die wordt waargenomen bij ICI-geïnduceerde myocarditis ^5,6. Overmatige productie van pro-inflammatoire cytokines, met name IL-1β en IL-6, leidt tot ernstige cardiomyocytletsel en hartfalen⁷. Hoewel verschillende op lipiden gebaseerde interventies zijn onderzocht bij hart- en vaatziekten, blijft het potentieel van olijfolie-gebaseerde lipidemulsies (OOLE) in deze specifieke context ononderzocht. OOLE is rijk aan oleïnezuur, een enkelvoudig onverzadigd vetzuur dat bekendstaat om zijn unieke vermogen om membraanvloeibaarheid te moduleren en ontstekingscascades ^8,9 te onderdrukken. Of OOLE echter specifiek de hyperinflammatoire toestand die kenmerkend is voor door ICI veroorzaakte myocarditis kan verzachten, is niet vastgesteld.

In deze studie willen we deze kloof dichten door het therapeutische potentieel van OOLE te onderzoeken. Wij stellen de hypothese op dat OOLE een krachtig cardioprotectief effect uitoefent door de NF-κB/NLRP3/IL-1β signaalas te remmen, waardoor de ontstekingsgolf wordt onderdrukt en de hartfunctie behouden blijft. Door een in vitro co-cultuurmodel van HL-1 cardiomyocyten en T-cellen te combineren met een in vivo muismodel van door ICI geïnduceerde myocarditis, tonen we aan dat OOLE-interventie zorgt voor snel functioneel herstel en myocardletsel vermindert. Deze studie levert het eerste bewijs voor OOLE als een nieuwe, gerichte nutritionele farmacologische benadering voor het beheersen van ICI-gerelateerde cardiotoxiciteit.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd., met goedkeuringsnummer IACUC-MIS2023076. Het genoemde bedrijf is een dierenexperimentcentrum; Onze dierproeven worden hier uitgevoerd en zijn daarom onderworpen aan beoordeling door de ethische commissie van het centrum.

Dieren en experimenteel ontwerp
Dertig BALB/c-muizen (mannelijk, 8 weken oud, 22 ± 2 g) werden commercieel gekocht. Modelinductie- en validatiecriteria: Een door de immuun checkpoint-remmer (ICI)-geïnduceerde myocarditismodel werd vastgesteld door intraveneuze injectie van ipilimumab (5 mg/kg) en nivolumab (10 mg/kg) gedurende 2 opeenvolgende weken. De dosering vond elke 3 dagen plaats gedurende een totale modelduur van 2 weken. Dit protocol is eerder aangetoond significant immuungemedieerd hartletsel¹⁰ te induceren. 24 uur na de laatste injectie werden bloedmonsters afgenomen via de retro-orbitale plexus en 15 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd op 300 x g bij 4 °C om het serum te isoleren; vervolgens werden serum cTnT-niveaus gekwantificeerd met een specifieke ELISA-kit, waarbij opeenvolgende stappen van monsterlading, HRP-geconjugeerde antilichaamincubatie, geautomatiseerde wasbeurt en TMB-chromogeenreactie werden omvat, waarbij de optische dichtheid werd gemeten op 450 nm om concentraties te berekenen op basis van een logistische curve met vier parameters, en een cTnT-concentratie ≥10 ng/mL werd als een succesvolle modelopstelling beschouwd.

Zes modelmuizen met het dichtstbijzijnde lichaamsgewicht en cTnT-concentratie werden willekeurig verdeeld in twee groepen: een controlegroep en een behandelgroep (n=3 voor beide, biologische replicatie). De controlegroep kreeg dagelijks intraveneuze injecties van normale zoutoplossing in een dosis van 5 mL/kg. De behandelgroep kreeg dagelijks intraveneuze injecties van 5% olijfolie-gebaseerde lipidemulsie (OOLE) in een dosis van 5 mL/kg via de staartader gedurende 6 dagen (dit is de dosering die we binnen onze instelling gebruiken voor klinische behandeling; deze is geëxtrapoleerd voor gebruik bij muizen op basis van de lichaamsoppervlakteverhoudingen). De volgende tests werden uitgevoerd binnen een observatieperiode van 6 dagen: de hartfunctie werd beoordeeld bij de uitgangslijn (dag 0) en na de behandeling (dag 6) met behulp van een ultrasone fotoakoestische beeldvorming. Bloed werd op dag 6 via de retroorbitale ader afgenomen en serumcytokines werden gekwantificeerd met ELISA. Na het inslapen van de dieren met een overdosis narcose werd het hartweefsel ingevroren voor eiwitanalyse.

T-celisolatie
De muizen in de controlegroep werden geëuthanaseerd met een overdosis narcose. De milten werden aseptisch verwijderd na een oppervlaktesterilisatie van 5 minuten in 75% ethanol, en alle bindweefsels werden verwijderd. De milten werden mechanisch gedissocieerd met een 70 μm celfilter met PBS aangevuld met 2% FBS om een single-cell suspension te creëren. Deze suspensie werd vervolgens gecentrifugeerd op 300 x g., 4 °C gedurende 5 minuten, en erytrocyten werden gelyseerd met 1 mL ACK Lysing Buffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Het lysisproces werd beëindigd door het wassen met PBS. T-cellen werden negatief verrijkt om activatie te voorkomen met behulp van een muis T-cel isolatiekit. Voor elke 10 miljoen cellen werd 50 μL selectiecocktail toegevoegd en 10 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd. Hierop volgde de toevoeging van 75 μL streptavidine magnetische kralen per 10 miljoen cellen, met een incubatie van 5 minuten. Kralengebonden cellen werden 3 minuten met een magneet vastgehouden, en de verrijkte T-cellen (met meer dan 94% zuiverheid) werden uit het supernatant verzameld. Voor het sorteren van de CD4⁺- en CD8⁺-subsets werden de verrijkte cellen 15 minuten in het donker gekleurd met anti-CD3ε-PE, anti-CD4-APC en anti-CD8-FITC antilichamen, waarna ze 3 keer werden gewassen met voorgekoeld PBS. Sortering werd uitgevoerd op een flowcytometer met de volgende gatingstrategie: lymfocyten (FSC/SSC), daarna CD3⁺, vervolgens CD4⁺ of CD8⁺ subsets. Cellen werden in zuiverheidsmodus gesorteerd in verzamelbuizen die vooraf gevuld waren met 200 μL PBS, wat resulteerde in doelgroepen met meer dan 98% zuiverheid.

Constructie en behandeling van het myocarditiscelmodel
De HL-1-cellen werden gekweekt in DMEM/F12-medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (PS) onder standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO₂). Cellen werden verdeeld in drie groepen: controlegroep (onbehandeld), modelgroep (HL-1-cellen behandeld met CD4+/CD8+ T-cellen gedurende 24 uur) en OOLE-groep (modelgroep co-behandeld met 10% OOLE gedurende 24 uur).

ELISA voor serumdetectie van eiwitten gerelateerd aan myocardbeschadiging
Incubeer 50 μL serummonster in de voorgecoate, antilichaamrijke microplaatputten van de kit gedurende 30 minuten, en spoel daarna drie keer met PBST om losstaande componenten te verwijderen. Voeg de voorbereide mierikswortelperoxidase (HRP)-gelabelde avidin-oplossing toe voor een tweede incubatie. Spoel drie keer opnieuw met PBST, voeg 100 μL van 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substraat toe om de colorimetrische reactie te initiëren, en beëindig de reactie met 100 μL stopoplossing binnen 30–45 minuten na start. Meet de absorptie (OD) bij 450 nm met een microplaatlezer en kwantificeer de concentratie van de doelanalyte met behulp van een standaardcurve die is uitgezet met bekende referentiestandaarden.

Westelijk vlek
Hartweefsels werden vermalen met een weefselhomogenisator met vloeibare stikstof. Vervolgens werden zowel weefsel- als cellulaire monsters gelyseerd in 200 μL RIPA-buffer op ijs gedurende 30 minuten. De lysaten werden gecentrifugeerd op 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om eiwitsupernatanten te verzamelen. De eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van een BCA-eiwitassaykit. Na het aanpassen van de eiwitconcentratie naar 5 μg/μL werden de monsters gemengd met een 5× laadbuffer en gedenatureerd door verhitting op 95 °C gedurende 10 minuten. Eiwitten werden gescheiden op 10% SDS-PAGE gels (90 minuten op 100 V uitgevoerd) en vervolgens via semi-droge elektroblotting bij 15 V gedurende 30 minuten overgedragen aan PVDF-membranen. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk en vervolgens 's nachts getest bij 4 °C met primaire antilichamen (waaronder IL-1β, NLRP3, MyD88, NF-κB p65 en Tubulin; 1:1.000 verdunning)². Na het drie keer wassen van de membranen gedurende 10 minuten elk met Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween 20 (TBST) bevat, werden ze geïncubeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:10.000 verdunning) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Eiwitbanden werden visualiseerd door het toepassen van een versterkt chemiluminescentie (ECL) substraat, en de signalen werden vastgelegd met een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem. Ten slotte werden de relatieve expressieniveaus kwantitatief geanalyseerd door de densitometrische waarden van de doel-eiwitbanden te normaliseren naar de interne controle van Tubulin met behulp van ImageJ-software.

Celapoptose-assay met flowcytometrie
De HL-1-cellen werden twee keer gewassen met fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS). Voor celdissociatie werd 1 ml trypsine toegevoegd en 1 minuut geïncubeerd, gevolgd door neutralisatie met 2 ml complete kweekmedium. De celsuspensie werd vervolgens 5 minuten gecentrifugeerd op 250 x g bij 4 °C, waarna het supernatant werd afgevoerd. De verzamelde celpellet werd 2x gewassen met ijskoude PBS en opnieuw gesuspendeerd in 1x bindingsbuffer om een celdichtheid van 1 x 10^{6 cellen} /mL te bereiken. Een aliquot van 100 μL van deze celsuspensie werd overgebracht in een flowcytometriebuis, gevolgd door de toevoeging van 5 μL FITC-Annexine V en 5 μL propidiumjodide (PI). Na een zachte vortex werd het mengsel 15 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur (25 °C) in het donker. Ten slotte werd 400 μL van 1 x bindingsbuffer aan elke buis toegevoegd, en de celapoptose werd vervolgens geanalyseerd met een flowcytometer. Voor de gatingstrategie werden gebeurtenissen eerst gegated op forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) om subcellulair afval uit te sluiten en de intacte HL-1-celpopulatie te isoleren. Binnen deze primaire poort werden apoptotische cellen gekwantificeerd met kwadrantanalyse, waarbij vroege apoptotische cellen werden gedefinieerd als FITC-Annexine V⁺/PI⁻ en late apoptotische cellen als FITC-Annexine V⁺/PI⁺.

Statistische analyse
Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd en statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van statistische software. Verschillen tussen twee groepen werden geanalyseerd met behulp van de onafhankelijke steekproef t-test; verschillen tussen drie of meer groepen werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door de Bonferroni post-hoc test. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout (SEM). p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Ipilimumab en Novolumab in combinatie induceren door ICI geïnduceerde myocarditis in een diermodel
Om een door ICI geïnduceerd myocarditismodel vast te stellen, kregen BALB/c-muizen intraveneuze injecties van ipilimumab (5 mg/kg) en nivolumab (10 mg/kg) via de staartven. Serumniveaus van cardiale troponine T (cTnT) werden vervolgens gemeten met behulp van een enzym-gekoppelde immunosorbentassay (ELISA). Een cTnT-niveau ≥ 10 ng/mL werd gedefinieerd als de drempel voor ...

Discussie

In deze studie toonden we voor het eerst aan dat olijfolie-gebaseerde lipidemulsies (OOLE) effectief de door de immuuncheckpoint inhibitor (ICI)-geïnduceerde myocarditis verzwakken door de IL-1β/NLRP3/NF-κB-signaalweg te onderdrukken. Onze resultaten leveren zowel mechanistisch als functioneel bewijs dat OOLE niet alleen de hartfunctie verbetert, maar ook myocardontsteking verlicht in zowel in vivo als in vitro. modellen van door ICI geïnduceerde myocarditis.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22um PVDF-membranes	Millipore	ISEQ00010
4% paraformaldehyde	Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd.	BL539A
BALB/c muizen	Guangdong Zhiyuan Biomedicine Technology Co., Ltd.
BCA-assaykit	Dingguo Biotech	BCA02
helderveldmicroscopie	MSHOT	ml31
cTnT elisa-kit	lunchangshuobiotech	ED-28107
Elektroforese-apparaat	WIX	miniPro4
Volledig geautomatiseerd chemiluminescentie beeldanalysesysteem	FUJIFILM	LAS-3000
hematoxyline-eosine kit	Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd.	BL2236A
IFN-γ ELISA-kits	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-10284
IL-1β antilichaam	affinity	BF8021
IL-1βELISA-kits	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-10351
IL-6 ELISA-kits	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-10377
ImageJ 1.54-software	NIH
Ipilimumab	MCE	CAS: 477202-00-9
MyD88 antilichaam	affinity	AF5195
NF-κB p65 antilichaam	affinity	BF8005
nivolumab	MCE	CAS: 946414-94-4
NLRP3 antilichaam	affinity	BF8029
Op olijfolie gebaseerde lipidemulsie	de voedingsafdeling van Guangzhou Fuda Cancer Hospital
Rapide semi-droge rotatiefilmapparaat	Bio-Rad	788BR04132
Real-time fluorescentie qPCR-kwantitatieve systeem	YARUI	MA-6000
RIPA-lysebuffer	Beyotime	P0013B
roterende microtoom	Leica	RM2235
SDS-PAGE-gels	Beyotime	P0052A,P0053A
The Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit	Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.	MA0220-1
the EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit	Stemcell	19765
The HL-1 rat cardiomyocyte cellijn	Guangzhou All-perfect Biotechnology Co., Ltd.	TCM-C783
TNF-α ELISA-kits	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-11776
Ultrasoon fotoakoestisch beeldvormingssysteem	Fujifilm VisualSonics	VEvo3100
Urodynamisch testsysteem	Techman	BL-420