Een gestroomlijnd protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie in Arabidopsis-kernen

Summary

Dit protocol biedt een efficiënte workflow voor single-molecule localisatie microscopiebeeldvorming van geïsoleerde Arabidopsis-kernen, waarbij geoptimaliseerde isolatie, fixatie en labeling wordt gebruikt om betrouwbare nanoschaalvisualisatie van chromatine en RNA Polymerase II te bereiken. Deze benadering kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine-geassocieerde eiwitten of histonmodificaties voor beeldvorming met hoge resolutie.

Abstract

Hoewel confocale fluorescentiemicroscopie waardevolle inzichten heeft opgeleverd in chromatineorganisatie in plantenkernen, beperkt de diffractiebeperkte resolutie het onderzoek naar chromatinearchitectuur, wat het gebruik van superresolutietechnieken zoals Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM) motiveert. Onder deze benaderingen biedt directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) nanoschaalresolutie in individuele cellen, waardoor nauwkeurige visualisatie van chromatinedomeinen, histonmodificaties en nucleaire organisatie mogelijk is. Hoewel dergelijke methoden steeds vaker worden toegepast in zoogdiersystemen, blijft het gebruik ervan in de plantenbiologie beperkt, grotendeels door technische uitdagingen bij de monstervoorbereiding.

Hier presenteren we een gestroomlijnde en reproduceerbare workflow voor SMLM-beeldvorming van kernen geïsoleerd uit Arabidopsis thaliana. Dit protocol begint met zaailingfixatie om de kernmorfologie te behouden, gevolgd door zacht weefselhakken en centrifugeren om intacte kernen te verrijken. Geïsoleerde kernen worden vervolgens fluorofor-gelabeld in vloeibaar medium en geïmmobiliseerd op laagsmeltende agarose-pads, een strategie die de stabiliteit verbetert tijdens langdurige beeldvormingssessies van één molecuul. Deze stappen minimaliseren samen achtergrondfluorescentie, verbeteren de consistentie van etikettering en vergroten de reproduceerbaarheid tussen biologische replicaties.

De resulterende preparaten bieden verbeterde helderheid bij het visualiseren van chromatinemodificaties en nucleaire architectuur in installaties. Door de technische drempels voor het implementeren van SMLM-beeldvorming in Arabidopsis te verlagen, biedt dit protocol een veelzijdige manier om epigenetische regulatie, chromatineorganisatie en nucleaire topologische variaties op nanoschaal te onderzoeken. Dit werk legt een methodologische basis voor het toepassen van SMLM op planten, overbrugt de kloof met de celbiologie van zoogdieren en opent nieuwe mogelijkheden om te bestuderen hoe nucleaire architectuur bijdraagt aan genoomregulatie als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen in plantsystemen.

Introduction

Microscopie is al lange tijd een hoeksteen voor het bestuderen van chromatineorganisatie en nucleaire architectuur, en heeft aangetoond hoe DNA en histon-geassocieerde eiwitten zich in de 3D-kernruimte schikken en genregulatie beïnvloeden ^1,2. Conventionele fluorescentiemicroscopie heeft waardevolle inzichten opgeleverd in grootschalige chromatinedomeinen zoals chromosoomterritoria, chromocentra en kernlichamen ^3,4, die in situ haalbaar zijn, met name in wortelweefsels voor planten ^3,5,6

Protocol

OPMERKING: De gedetailleerde informatie over de materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt, is beschikbaar in de Materiaallijst. Tenzij anders gespecificeerd, worden buffers vrijgemaakt op apyrogene 0,2 μm-filters. Dubbel gedistilleerd ultrazuiver H₂O (ddH₂O) wordt gedurende dit protocol gebruikt. Centrifugatiestappen worden uitgevoerd in 1,5 mL microbuizen met een rotor met vaste hoek.

1. Fixatie en afgifte van kernen door zaailingen

1. Plaats een kweekplaat met 6 putten op ijs onder de dampkap en voeg vervolgens aan elke ....

Results

Het hierboven beschreven protocol maakt de bereiding mogelijk van hoogwaardige Arabidopsis thaliana-kernen die geschikt zijn voor SMLM. Er werden verschillende rondes van optimalisatie uitgevoerd om de kernintegriteit te verbeteren en cytoplasmatisch en cellulair afval te verminderen dat de beeldkwaliteit aantast. Na elke optimalisatiestap werd de kwaliteit van de nucleaire voorbereidingen geëvalueerd door confocale beeldvorming met een Olympus IX81 draaiende schijfmicroscoop vo.......

Discussion

De voorbereiding van Arabidopsis thaliana-kernen voor single-molecule localization microscopy (SMLM) vereist verschillende cruciale stappen die de kwaliteit van het uiteindelijke monster sterk beïnvloeden. Zoals eerder beschreven^19,35 is grondig en consistent afhakken van weefsel essentieel om het herstel van intacte kernen te maximaliseren. Het gebruik van microtome messen in plaats van standaard scheermesjes zorgt voor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )
Acquisition software	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Certified Low Melting Agarose	Bio-Rad	1613111
Coverslips thickness 1.5H round	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydrous, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Dichroic mirror	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Dichroic mirror for excitation/emission separation
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´	biowest	X0515 - 500	Work in sterile conditions
Epredia Ultra Disposable Microtome Blades	FisherScientific	12191830	Low profile, single use
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	Falcon	353046
Formaldehyde solution 37%	Carl Roth	7398	Work under the fume hood
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Glycerol	VWR	24388.295
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Used at 1/200 as secondary antibody coupled to AF647
Hoechst 33258 solution	Sigma-Aldrich	94403	Used at 1/500 to counterstain the DNA, added to the agarose pad
Hydrochloric Acid Solution	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Used to counterstain DNA, added to the agarose pad at 1.5 nM final concentration
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL tube with both large (0.0030-0.0050 inch) and small (0.0005-0.0025 inch) clearance pestles
Lasers unit	Oxxius	L6Cc	Equipped with six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW and 730 nm - 30 mW
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	HN03
Mercaptoethylamine (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sodium salt 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Multiband emission filter	Semrock	FF01-446/523/600/677	Multiband emission filtration to block laser scatter light
Nanodiamonds	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Stock 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS camera	Hamamatsu	C14440-20UP
Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterile	Greiner Bio-One	664161	Used to grow plants on 1/2 MS medium
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile	Greiner Bio-One	688161	Used when chopping the plant seedlings
pluriStrainer Mini cell strainer	pluriSelect	43-10030-50	Mesh size 30 µm, suitable for 1.5 mL Eppendorf tube
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Single band emission filter	Semrock	FF01-698/70	Specific emission filter for AF647 channel
Single band emission filter	Chroma	ET600/50m	Specific emission filter for JF549 channel
Sodium chloride (99,5%)	Euromedex	1112-A
Star-Frost slides 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock cone	ClearLine	146560
Super-resolution system	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 equipped with 100x NA1.5 oil-immersion objective
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	Silicone sealant
Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS oven	UVOCS Inc.	T10X10	20 min exposure for coverslip cleaning
Vacuum pump	Vacuubrand	VP 100C
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Scientific		Rotor TX-400 75003629. Centrifugation performed with Eppendorf tubes.