Een gestroomlijnd protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie in Arabidopsis-kernen

Summary

Dit protocol biedt een efficiënte workflow voor single-molecule localisatie microscopiebeeldvorming van geïsoleerde Arabidopsis-kernen, waarbij geoptimaliseerde isolatie, fixatie en labeling wordt gebruikt om betrouwbare nanoschaalvisualisatie van chromatine en RNA Polymerase II te bereiken. Deze benadering kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine-geassocieerde eiwitten of histonmodificaties voor beeldvorming met hoge resolutie.

Abstract

Hoewel confocale fluorescentiemicroscopie waardevolle inzichten heeft opgeleverd in chromatineorganisatie in plantenkernen, beperkt de diffractiebeperkte resolutie het onderzoek naar chromatinearchitectuur, wat het gebruik van superresolutietechnieken zoals Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM) motiveert. Onder deze benaderingen biedt directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) nanoschaalresolutie in individuele cellen, waardoor nauwkeurige visualisatie van chromatinedomeinen, histonmodificaties en nucleaire organisatie mogelijk is. Hoewel dergelijke methoden steeds vaker worden toegepast in zoogdiersystemen, blijft het gebruik ervan in de plantenbiologie beperkt, grotendeels door technische uitdagingen bij de monstervoorbereiding.

Hier presenteren we een gestroomlijnde en reproduceerbare workflow voor SMLM-beeldvorming van kernen geïsoleerd uit Arabidopsis thaliana. Dit protocol begint met zaailingfixatie om de kernmorfologie te behouden, gevolgd door zacht weefselhakken en centrifugeren om intacte kernen te verrijken. Geïsoleerde kernen worden vervolgens fluorofor-gelabeld in vloeibaar medium en geïmmobiliseerd op laagsmeltende agarose-pads, een strategie die de stabiliteit verbetert tijdens langdurige beeldvormingssessies van één molecuul. Deze stappen minimaliseren samen achtergrondfluorescentie, verbeteren de consistentie van etikettering en vergroten de reproduceerbaarheid tussen biologische replicaties.

De resulterende preparaten bieden verbeterde helderheid bij het visualiseren van chromatinemodificaties en nucleaire architectuur in installaties. Door de technische drempels voor het implementeren van SMLM-beeldvorming in Arabidopsis te verlagen, biedt dit protocol een veelzijdige manier om epigenetische regulatie, chromatineorganisatie en nucleaire topologische variaties op nanoschaal te onderzoeken. Dit werk legt een methodologische basis voor het toepassen van SMLM op planten, overbrugt de kloof met de celbiologie van zoogdieren en opent nieuwe mogelijkheden om te bestuderen hoe nucleaire architectuur bijdraagt aan genoomregulatie als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen in plantsystemen.

Introduction

Microscopie is al lange tijd een hoeksteen voor het bestuderen van chromatineorganisatie en nucleaire architectuur, en heeft aangetoond hoe DNA en histon-geassocieerde eiwitten zich in de 3D-kernruimte schikken en genregulatie beïnvloeden ^1,2. Conventionele fluorescentiemicroscopie heeft waardevolle inzichten opgeleverd in grootschalige chromatinedomeinen zoals chromosoomterritoria, chromocentra en kernlichamen ^3,4, die in situ haalbaar zijn, met name in wortelweefsels voor planten ^3,5,6. Deze technieken worden echter fundamenteel beperkt door de diffractiebarrière van licht, die de ruimtelijke resolutie beperkt tot ongeveer 200 nm lateraal en 500 nm axial⁷. Deze beperking verbergt nanoschaaldetails van chromatinevouwing, histonmodificatiepatronen en transcriptionele compartimentalisatie die ten grondslag liggen aan epigenetische regulatie. Om deze barrière te overwinnen, werden superresolutie-microscopie (SRM)-benaderingen ontwikkeld zoals structured illumination microscopy (SIM)⁸, stimulated emission depletion (STED)^9,10 en single-molecule localization microscopy (SMLM)^11,12 om resoluties te bereiken variërend van 100 nm tot enkele nm¹³.

Onder SRM-technieken biedt SMLM—waaronder PhotoActivated Localization Microscopy (PALM)¹³ en direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM)—uitzonderlijke ruimtelijke resolutie gecombineerd met moleculaire specificiteit¹⁴. Door de posities van individuele fluoroforen in de loop van de tijd te detecteren, reconstrueert SMLM hoogprecisie nanoschaalbeelden van chromatinedomeinen, histonmarkeringen en kernstructuren in individuele cellen^15,16. Deze capaciteit heeft het chromatineonderzoek in zoogdiersystemen getransformeerd, waarbij SMLM is toegepast om nucleosoomclustering, chromatineverdichting en histonmodificatiepatronen met ongekende details te visualiseren 15,16,17. Daarentegen blijft de toepassing van SMLM op plantenkernen beperkt, grotendeels door technische uitdagingen die samenhangen met plantweefseleigenschappen — zoals hoge autofluorescentie, celwandstijfheid en de aanwezigheid van lichtverstrooiende verbindingen zoals zetmeel en chlorofyl¹⁸. Bovendien vereist de kwetsbare aard van kernen tijdens isolatie en labeling geoptimaliseerde workflows om structurele integriteit te behouden en achtergrondfluorescentie tijdens langdurige beeldvormingssessies te minimaliseren.

Het hier beschreven protocol is oorspronkelijk ontwikkeld door Elizabeth Kracik-Dyer en Célia Baroux voor gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie¹⁹. Vervolgens werd het geoptimaliseerd en aangepast om te voldoen aan de specifieke eisen van STORM-beeldvorming, met de integratie van kennis afkomstig uit gepubliceerde microbiologische toepassingen 20,21,22. Het algemene doel is het bieden van een gestroomlijnde en reproduceerbare workflow voor SMLM-beeldvorming van geïsoleerde Arabidopsis thaliana-kernen. Door geoptimaliseerde fixatie, milde mechanische verstoring en fluoroforlabeling in suspensie te integreren, behoudt deze methode de kernmorfologie terwijl cytoplasmatische verontreinigingen efficiënt worden verwijderd die vaak de beeldkwaliteit aantasten. Het immobiliseren van gelabelde kernen op laagsmeltende agarosepads zorgt voor mechanische stabiliteit tijdens de verwerving, waardoor langdurige beeldvorming van één molecuul op nanoschaalprecisie mogelijk is. In vergelijking met eerder beschreven SRM-protocollen voor plantenkernen—met name die gebaseerd op STED-microscopie^19,23—gebruikt deze workflow fotoschakelbare fluoroforen (bijv. AF647, JF549), en vermindert achtergrondfluorescentie dankzij wasstappen die chlorofyl en weefselresten afvoeren, en verbetert de labelingshomogeniteit door de labelingsmoleculen direct toe te voegen aan de vaste en permeabiliseerde kernen. Daardoor maakt het consistente visualisatie van chromatinemodificaties, nucleaire compartimenten en epigenetische patronen in individuele kernen mogelijk. Door de technische barrières voor het implementeren van SMLM in planten te verlagen, verbreedt deze methode de toegankelijkheid van nanoschaalbeeldvorming en biedt het een basis voor het bestuderen van hoe chromatineorganisatie en nucleaire architectuur bijdragen aan genregulatie als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen.

Protocol

OPMERKING: De gedetailleerde informatie over de materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt, is beschikbaar in de Materiaallijst. Tenzij anders gespecificeerd, worden buffers vrijgemaakt op apyrogene 0,2 μm-filters. Dubbel gedistilleerd ultrazuiver H₂O (ddH₂O) wordt gedurende dit protocol gebruikt. Centrifugatiestappen worden uitgevoerd in 1,5 mL microbuizen met een rotor met vaste hoek.

1. Fixatie en afgifte van kernen door zaailingen

1. Plaats een kweekplaat met 6 putten op ijs onder de dampkap en voeg vervolgens aan elke put ongeveer 4 ml ijskoude fixatieoplossing toe die extemporair onder een dampkap wordt bereid (4% (v/v) methanolgestabiliseerde formaldehyde, 0,1% Triton X-100 in 1× fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]).
2. Verwijder met schone pincetten de zaailingen (tussen 8 en 15 dagen na kieming) die zijn gekweekt op vaste (0,8% agar) halfsterke Murashige en Skoog Medium 2,2 g/L MS-zouten, 1% sucrose (w/v), pH 5,7, zoals beschreven voor MS-zaailingen in referentie²⁴, en dompel ze direct onder in de fixatieoplossing. Gebruik één put voor ongeveer 20 zaailingen (3 putten waren nodig om voldoende materiaal per monster te verkrijgen).
3. Plaats de plaat in de vacuümkamer gevuld met ijs en breng een vacuüm aan bij drukken tussen 0,2 bar en 0,8 bar gedurende 15 minuten om de gevangen lucht te verwijderen en diep in het plantweefsel door te dringen²⁵. Laat het vacuüm langzaam los, roer het monster en breng het vacuüm vervolgens nog eens 15 minuten aan.
4. Verwijder onder de afzuigkap de fixatieoplossing met een pipet, en was elke putje 3 keer gedurende 10 minuten onder zachte roering, met 5 ml ijskoude PBS.
5. Verwijder PBS en gebruik een tang om het vastgezette weefsel over te brengen naar een 120 mm × 120 mm petrischaal. Voeg aan de vaste zaailingen 50 μL Nuclei Isolation Buffer (NIB) toe, bereid zoals beschreven door Kracik-Dyer en Baroux (45 mM MgCl₂, 20 mM MOPS, 30 mM natriumcitraat, 0,3% Triton X-100). Stel aan naar pH 7 met 1 N HCl)¹⁹. Chip met een mes.
   OPMERKING: Microtome-mesjes bleken efficiënter te zijn dan conventionele scheermesjes voor deze taak.
6. Schraap gehakt weefsel met hetzelfde mesje aan één rand van de petrischaal en voeg 600 μL NIB toe, waarbij je ook het weefsel dat aan het mes vastzit afwast.
7. Breng weefselslurry over in de 2 mL Dounce-homogenisatorbuis en streek 5–10 keer met de kleinere stamper, en daarna met de grotere stamper totdat deze soepel beweegt in de buis (meestal zijn er weer 5–10 slagen nodig).
8. Filter het resulterende gehomogeniseerde monster door een 30 μm meshfilter in een 1,5 mL microbuis.
9. Centrifugeer de ophanging 10 minuten op 800 × g met de laagste helling voor zowel acceleratie als vertraging. Een klein wit korreltje is zichtbaar tussen het groene weefselafval.
10. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 150 μL NIB.
11. Centrifugeer opnieuw 10 minuten op 800 × g en verwijder het supernatant. Als er zichtbaar groen vuil is, was het dan nog een keer. Suspensie in 50 μL tot 150 μL NIB, afhankelijk van de grootte van de pellet.
12. Bewaar de resulterende geïsoleerde kernsuspensie maximaal 1 week bij 4 °C voordat de kleuring wordt uitgevoerd. Het wordt echter aanbevolen om onmiddellijk door te gaan.

2. (Immuno)kleuring

OPMERKING: In de volgende stappen wordt het protocol toegepast op een volume van 50 μL kernsuspensie, wat typisch overeenkomt met 20 zaailingen. Tenzij anders vermeld, worden de volgende stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur.

1. Centrifugeer de oplossing 10 minuten op 800 × g en gooi het supernatant weg. Wees voorzichtig dat je de pellet niet aanraakt.
2. Sussief de kernen opnieuw door zacht te pipetteren in 50 μL blokkerende buffer (143 mM NaCl, 4% BSA in PBS, opgeslagen bij 4 °C). Incubeer 30 minuten onder zachte agitatie.
3. Centrifugeer de oplossing 10 minuten op 800 × g en gooi het supernatant af zonder de kernpellet aan te raken.
4. Sussief de kernen opnieuw door zacht te pipetteren in 50 μL van 1× PBS. Centrifugeer opnieuw 10 minuten op 800 × g. Gooi het bovenliggende stof zoals hierboven weg.
5. Susseb de kernen opnieuw in 50 μL primaire antilichaamoplossing, bereid in een immunokleuringsbuffer bestaande uit 143 mM NaCl, 1% BSA, 0,05% Tween 20 in PBS (antilichaam- en werkverdunningen zijn beschreven in de Materiaaltabel). Incubeer de monsters 60 minuten onder zachte roering.
6. Ga door met 2 wasbeurten (herhaal stappen 2.3 en 2.4).
7. Sussen de kernen opnieuw in 50 μL geitenantikonijn AF647 secundair antilichaam bij 1/200 verdunning²⁶. Wikkel de buizen in aluminiumfolie om de fluorofoor te beschermen tegen licht. Incubeer de buizen 60 minuten onder zachte roering.
8. Ga door met 2 wasbeurten (herhaal stappen 2.3 en 2.4).
9. Susselt de pellet opnieuw in 50 μL NIB. Bewaar de ophanging in 1,5 mL microbuizen omwikkeld met aluminiumfolie. De etikettering blijft enkele weken stabiel bij 4 °C.

3. Montage

1. Voor STORM-beeldvorming bereid je een laagsmeltende agaroseoplossing voor (LMA 1,5% w/v) door het poeder op te lossen in 1,25× buffer B, bestaande uit 50 mM Tris pH 8, 10 mM NaCl, 10% glucose. Maak 1,25× bouillonoplossing en bewaar bij 4 °C.
2. Verhit het op 90 °C gedurende 1 minuut om het poeder op te lossen en een heldere oplossing te verkrijgen. Koel af en houd de gesmolten LMA-oplossing op 37 °C voordat je doorgaat naar de volgende stap om hittedenaturatie van glucoseoxidase (GLOX) buffer te voorkomen (bereid 10x voorraadoplossing voor die wordt opgeslagen bij -20°C, bestaande uit 100 mM Tris pH 7,5, 25 mM KCl, 1 mM TCEP pH 7,0, 5 mg/mL Glucoseoxidase, 0,4 mg/mL Catalase), 50% v/v glycerol).
3. Nadat de LMA-oplossing 37 °C heeft bereikt, bereidt u de STORM-buffer voor door 100 mM Mercaptoethylamine (MEA) en GLOX toe te voegen aan de warme LMA-oplossing om 1× eindconcentratie te bereiken. Bewaar de MEA 1 M voorraadoplossing tot 1 maand op 4 °C, maar het gebruik van een vers bereide oplossing wordt aanbevolen. Meng voorzichtig.
   OPMERKING: Voor optionele DNA-labeling voeg 1,5 nM toe (eindconcentratie, 1 mM stockoplossing in DMSO) van de JF549 geconjugeerde Hoechst. Houd de vering op 37 °C tot gebruik.
4. Meng de kernsuspensie voorzichtig met nanodiamanten bij 1/1500 verdunning. Breng ze 5 minuten uit met het monster.
   OPMERKING: Nanodiamanten dienen als fiduciale markers om de monsterdrift te corrigeren.
5. Deponeer 10 μL van het mengsel op een ozonbehandelde 1,5H deklaag (20 minuten in ultraviolet ozonreinigingssysteem) en wacht 3 minuten voordat de kernen op de dekmantel kunnen worden afgedrukt.
6. Verwijder het overtollige vocht, wacht 2 minuten. Voeg 10 μL van de LMA die bij stap 3.3 is voorbereid toe aan de coverslip en bedek direct met een microscoopglaasje.
7. Dicht de deklaag af met siliconenafdichting. Meng gelijke hoeveelheden oplossing A en B in een kleine petrischaal met behulp van een micropipettip. Breng het mengsel aan over de randen van de deklaag om het monster af te dichten. Siliconenkit hardt binnen 5 minuten uit.
8. Eenmaal gemonteerd, voer beeldvorming van de glaasjes zonder vertraging uit, uiteindelijk binnen de volgende 4–5 uur, om verlies van de zuurstofabsorberende eigenschappen van het montageplatform te voorkomen.

4. Beeldvorming

OPMERKING: Beeldvormingsparameters moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd op basis van de aard van het monster, de fotofysische eigenschappen van de fluoroforen en de optische configuratie van de microscoop. Het is cruciaal om een hoge signaal-ruisverhouding voor elke fluorofoor te waarborgen, terwijl spectrale doorvloeiing en kruisexcitatie tussen fluorescerende kanalen worden geminimaliseerd. Monsters werden waargenomen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een hoge NA 100x olie-onderdompelingsobjectie, een scherpstellende eenheid en een witte LED voor helderveldbeeldvorming. Fluorescerende labels AlexaFluor647 (AF647) werden geëxciteerd bij 640 nm en JF549-Hoechst bij 561 nm. Het uitgezonden licht werd gefilterd met een compatibele dichroïsche spiegel en banddoorlaatfilter(s), en tenslotte werden beelden verzameld met een wetenschappelijke Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (sCMOS) camera.

1. Bevestig de monsterdia-plaat en vind focus. Activeer een focus-onderhoudende module als het systeem die heeft (sterk aanbevolen voor lange acquisitie).
2. Vind en richt je op een kern. Het is beter om één of enkele nanodiamanten dicht bij de kern van belang te hebben om de drift tijdens de reconstructie efficiënter te corrigeren.
3. (Optioneel) Leg diffractiebeperkte snapshots vast van een helder veld en elk fluorescerend kanaal bij lage laserkracht.
4. Bij het uitvoeren van tweekleurenbeeldvorming begin je met het verkrijgen van het kanaal met een langere golflengte en schakel dan over naar het kanaal met een kortere golflengte (d.w.z. verkrijg het kanaal AF647 vóór JF549).
   OPMERKING: Voorbeeld van verwervingsparameters die in dit werk worden gebruikt:
   Kanaal A - epitoop-labeling - AF647
   Belichtingstijd: 20 ms
   Laserintensiteit: 640 nm – 2,2 kW/cm²
   Excitatiemodus: HiLo²⁷
   Kanaal B - DNA-labeling - JF549-Hoechst
   Belichtingstijd: 50 ms
   Laserintensiteit: 561 nm - 1 kW/cm²
   Excitatiemodus: Epi
   Aantal opgenomen beelden: 10.000-30.000 per kanaal, wat ervoor zorgt dat de dichtheid van fluoroforen per frame schaars genoeg blijft voor nauwkeurige localisatie van één molecuul, terwijl het cumulatieve aantal lokalisaties empirisch werd bepaald met behulp van Super-resolution QUantitative Image Rating and Reporting of Error Locations (SQUIRREL)²⁸, wat ook het voldoende aantal frames aangeeft.

Results

Het hierboven beschreven protocol maakt de bereiding mogelijk van hoogwaardige Arabidopsis thaliana-kernen die geschikt zijn voor SMLM. Er werden verschillende rondes van optimalisatie uitgevoerd om de kernintegriteit te verbeteren en cytoplasmatisch en cellulair afval te verminderen dat de beeldkwaliteit aantast. Na elke optimalisatiestap werd de kwaliteit van de nucleaire voorbereidingen geëvalueerd door confocale beeldvorming met een Olympus IX81 draaiende schijfmicroscoop voordat werd overgegaan tot superres...

Discussion

De voorbereiding van Arabidopsis thaliana-kernen voor single-molecule localization microscopy (SMLM) vereist verschillende cruciale stappen die de kwaliteit van het uiteindelijke monster sterk beïnvloeden. Zoals eerder beschreven^19,35 is grondig en consistent afhakken van weefsel essentieel om het herstel van intacte kernen te maximaliseren. Het gebruik van microtome messen in plaats van standaard scheermesjes zorgt voor...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )
Acquisition software	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Certified Low Melting Agarose	Bio-Rad	1613111
Coverslips thickness 1.5H round	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydrous, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Dichroic mirror	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Dichroic mirror voor excitatie/emissie scheiding
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´	biowest	X0515 - 500	Werken onder steriele omstandigheden
Epredia Ultra Disposable Microtome Blades	FisherScientific	12191830	Laag profiel, eenmalig gebruik
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	Falcon	353046
Formaldehyde solution 37%	Carl Roth	7398	Werken onder de afzuigkast
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Glycerol	VWR	24388.295
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Gebruikt bij 1/200 als secundair antilichaam gekoppeld aan AF647
Hoechst 33258 solution	Sigma-Aldrich	94403	Gebruikt bij 1/500 om het DNA te tegenkleuren, toegevoegd aan de agarose pad
Hydrochloric Acid Solution	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Gebruikt om DNA te tegenkleuren, toegevoegd aan de agarose pad op 1,5 nM eindconcentratie
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL buis met zowel grote (0,0030-0,0050 inch) als kleine (0,0005-0,0025 inch) clearance stampers
Lasers unit	Oxxius	L6Cc	Uitgerust met zes lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW en 730 nm - 30 mW
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	HN03
Mercaptoethylamine (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sodium salt 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Multiband emission filter	Semrock	FF01-446/523/600/677	Multiband emissiefiltratie om laserverstrooiingslicht te blokkeren
Nanodiamonds	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Voorraad 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS camera	Hamamatsu	C14440-20UP
Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterile	Greiner Bio-One	664161	Gebruikt om planten te laten groeien op 1/2 MS medium
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile	Greiner Bio-One	688161	Gebruikt bij het snijden van de plantzaailingen
pluriStrainer Mini cell strainer	pluriSelect	43-10030-50	Maasgrootte 30 µm, geschikt voor 1,5 mL Eppendorf buis
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Single band emission filter	Semrock	FF01-698/70	Specifiek emissiefilter voor AF647 kanaal
Single band emission filter	Chroma	ET600/50m	Specifiek emissiefilter voor JF549 kanaal
Sodium chloride (99,5%)	Euromedex	1112-A
Star-Frost slides 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterile syringe filterø 33 mm porositeit 0,2 µm Luer Lock cone	ClearLine	146560
Super-resolution system	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 uitgerust met 100x NA1.5 olie-immersie objectief
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	Siliconen dichtingsmiddel
Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS oven	UVOCS Inc.	T10X10	20 min blootstelling voor coverslip schoonmaken
Vacuum pump	Vacuubrand	VP 100C
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Scientific		Rotor TX-400 75003629. Centrifugatie uitgevoerd met Eppendorf buisjes.