Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie

207 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70894

⸱

23 juni 2026

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.

Samenvatting

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn nanosize, lipide-gebonden deeltjes die intercellulaire communicatie bemiddelen via de overdracht van eiwitten, lipiden en ribonucleïnezuren (RNA's). Het isoleren van sEV's uit vaste weefsels zoals skeletspier (SkM) en beenmerg (BM) blijft een uitdaging vanwege lage opbrengst en besmetting door niet-vesiculaire componenten. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare workflow voor het isoleren van sEV's uit muis SkM en BM. SkM wordt enzymatisch verteerd, terwijl BM direct wordt verwerkt en vervolgens wordt onderworpen aan differentiële centrifugatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Voor SkM wordt het leegte volume (~2,5 mL) weggegooid, en de daaropvolgende ~1,6 mL wordt verzameld als EV-verrijkte fracties, doorgaans onderverdeeld in 400 μL sequentiële fracties (F1–F4). Voor BM wordt een leegte van 700 μL weggegooid, gevolgd door het verzamelen van een ~850 μL EV-verrijkte fractie, die kan worden onderverdeeld in ~170 μL sequentiële fracties (F1–F5) en gepoold op basis van EV-markerverrijking. Met deze benadering kunnen sEV's worden geïsoleerd uit kleine weefselvolumes (ongeveer 500 μL uit een enkele quadriceps en 150 μL uit gepoolde femur en tibia-BM), wat resulteert in ~108 deeltjes ·mL−1·mg−1 weefsel met deeltjesdiameters voornamelijk <200 nm. Vesikelintegriteit en zuiverheid worden gevalideerd met transmissie-elektronenmicroscopie, nanodeeltjestrackinganalyse en Western blotting voor canonieke EV-markers, met aanvullende karakterisering door enkeldeeltjesinterferometrische detectie om tetraspanine-gedefinieerde vesikelsubpopulaties te kwantificeren. Deze methode maakt reproduceerbare isolatie van hoogzuivere sEV's uit structureel complexe weefsels mogelijk met minimale inputmaterialen, wat downstream moleculaire en functionele analyses van weefselafgeleide vesikels ondersteunt.

Inleiding

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn nanosize, lipide-gebonden deeltjes die intercellulaire communicatie bemiddelen via de overdracht van eiwitten, lipiden en nucleïnezuren1. Ze worden door alle celtypen vrijgegeven en zijn aanwezig in vrijwel alle biologische vloeistoffen, waar ze functioneren als belangrijke dragers van bioactieve lading, waaronder peptiden en micro-ribonucleïnezuren (RNA's)2. Hun lading wordt selectief gesorteerd, waardoor specifieke signalen nauwkeurig kunnen worden afgeleverd3, en hun vesiculaire structuur stelt hen in staat de typische gradiënt- en verdunningsbeperkingen van vrij afgescheiden factoren te omzeilen door geconcentreerde moleculaire ladingen over lange afstandenaf te leveren 4. Hoewel EV's uit biofluiden (bijv. plasma, serum en speeksel) een handig momentopname van systemische signalering bieden, vertegenwoordigen ze een sterk gemengde populatie die afkomstig is uit veel weefsels5. Dit maakt het lastig om te bepalen welk orgaan een specifiek biologisch signaal produceert of hoe EV-communicatie op weefselniveau wordt gereguleerd. Omdat circulerende EV's samen worden gepoold, kunnen weefselspecifieke veranderingen worden verdund of gemaskeerd, waardoor het vermogen om de werkelijke bron van signalen6 te identificeren beperkt wordt.

Skeletspier (SkM) en beenmerg (BM) zijn belangrijke metabolisch en functioneel actieve weefsels met verschillende cellulaire samenstellingen en signaalfuncties 7,8. Beide weefsels kunnen EV-populaties vrijgeven die verrijkt zijn met unieke, weefselspecifieke lading; deze signalen kunnen echter gemakkelijk in plasma worden overschaduwd door EV's van weefsels met een hoge omzet, zoals immuuncellen 8,9. Het direct isoleren van EV's van spier of stoelgang verhoogt de gevoeligheid en maakt het mogelijk om subtiele, weefselspecifieke aanpassingen te detecteren die mogelijk niet in de circulatie waarneembaar zijn. Weefselafgeleide EV's leveren daarom essentiële aanvullende informatie, waarbij wordt onthuld wanneer een specifiek orgaan EV's afgeeft, hoe lang die signalen aanhouden en welke aanpassingen acuut versus chronisch zijn. Ondanks de toenemende interesse in EV's zijn de meeste gevestigde isolatiemethoden ontwikkeld voor biofluiden (bijv. plasma en serum) of celkweeksystemen. In deze contexten kunnen EV's worden verkregen met relatief hoge opbrengst en minimale structurele verstoring. Het direct isoleren van EV's van vaste weefsels zoals SkM en BM brengt echter aanzienlijke technische uitdagingen met zich mee. Deze weefsels zijn structureel complex en heterogeen, en vereisen mechanische of enzymatische dissociatiestappen die artefacten kunnen introduceren, waaronder hoge niveaus van oplosbare eiwitten, organelfragmenten en niet-vesiculaire nanodeeltjes, waardoor het moeilijk wordt om hoogzuivere EV-preparaten te bereiken.

Een andere grote uitdaging bij weefselgebaseerde EV-isolatie is het ontbreken van gestandaardiseerde workflows voor breukdefinitie en scheiding10. Alleen differentiële centrifugatie resulteert vaak in co-isolatie van eiwitaggregaten en grote vesikels, terwijl ultracentrifugatiemethoden, hoewel veel gebruikt, kunnen leiden tot vesikelaggregatie, vervorming en variabele terugwinning, afhankelijk van rotortype en experimentele omstandigheden. Dichtheidsgradiëntbenaderingen verbeteren de zuiverheid, maar zijn tijdintensief, hebben een lage doorvoer en zijn moeilijk te standaardiseren tussen laboratoria11. Daarom is er momenteel geen breed gebruikte, reproduceerbare methode geoptimaliseerd om kleine EV's te isoleren uit vaste weefsels met een hoge zuiverheid en een consistente opbrengstvan 10.

Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) is uitgegroeid tot een veelbelovend alternatief voor EV-isolatie omdat het deeltjes op basis van grootte scheidt zonder vesikels bloot te stellen aan hoge centrifugale krachten. SEC maakt efficiënte scheiding mogelijk van kleine EV's van oplosbare eiwitten en laagmoleculaire verontreinigingen, terwijl de integriteit van de vesikels en biologische functie behouden blijven. Belangrijk is dat SEC een duidelijke definitie van elusiefracties mogelijk maakt, waardoor EV-verrijkte fracties reproduceerbaar kunnen worden en consistentie verbeterd is tussen experimenten12. Echter, workflows van de SEC vereisen zorgvuldige optimalisatie voor weefselafgeleide monsters, met name met betrekking tot upstream weefselverwerking, afvalverwijdering en fractieverzameling. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een reproduceerbaar en gestandaardiseerd protocol ontwikkeld om sEV's van SkM en BM te isoleren. Deze methode integreert gecontroleerde enzymatische vertering van vezelige weefsels, differentiële centrifugatie voor het verwijderen van afval en SEC-gebaseerde zuivering om blaasjes met hoge zuiverheid te isoleren. De workflow is specifiek geoptimaliseerd om besmetting door intracellulaire componenten te minimaliseren, terwijl de integriteit van de vesikels behouden blijft en consistente herstel uit laag-opbrengst weefsels mogelijk wordt.

Dit protocol vult een cruciale methodologische kloof door een praktische en schaalbare aanpak te bieden voor het isoleren van weefselafgeleide sEV's met gedefinieerde fractionering en gevalideerde zuiverheid, bereikt via nanoparticle tracking analysis (NTA), Western blotting van canonieke EV-markers, elektronenmicroscopie voor morfologische beoordeling en single-particle EV-analyse met antilichaamvangst, interferometrische dimensionering en multikanaalfluorescentiebeeldvorming. Het is bijzonder geschikt voor studies die weefselspecifieke EV-analyse vereisen, waarbij biofluid-afgeleide blaasjes onvoldoende zijn om de cellulaire oorsprong van signalen te onderscheiden. Onderzoekers zouden deze methode moeten gebruiken wanneer het doel is om hoogzuivere sEV's uit vaste weefsels te verkrijgen met minimale verontreiniging en de integriteit van de vesikels te behouden. Daarentegen kunnen ultracentrifugatie-gebaseerde methoden worden geprefereerd voor toepassingen met hoge opbrengst waar zuiverheid minder kritisch is, en dichtheidsgradiëntbenaderingen kunnen worden gekozen bij het isoleren van specifieke EV-subpopulaties ondanks lagere doorvoer. Samen biedt dit protocol een gestandaardiseerd kader voor de isolatie en karakterisering van weefselafgeleide sEV's, waardoor reproduceerbare downstream moleculaire, biochemische en functionele analyses mogelijk zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het McGill University Animal Care Committee (DOUG10029) en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care.

1. SkM-afgeleid sEV (SkM-sEV) isolatieprotocol

  1. Monsterafname en weefseldissociatie
    1. Weefseloogst en behoud
      1. Snap-freeze SkM-weefsel direct na excisie door het onder te dompelen in voorgekoeld methylbutaan.
        OPMERKING: Om voorgekoeld methylbutaan te bereiden, plaats je een container methylbutaan in een droogijsbad en voeg je geleidelijk kleine stukjes droogijs direct toe aan de vloeistof. Laat de oplossing afkoelen, de temperatuur ligt doorgaans tussen −70°C en −80°C. Houd het methylbutaan tijdens gebruik in het droogijsbad om de temperatuur te behouden. Laat het weefsel ongeveer 3–4 seconden onderdompelen tot het volledig bevroren is, wat blijkt uit volledige weefselverharding en verlies van flexibiliteit.
      2. Breng het weefsel over naar cryoviale cellen.
      3. Leg de monsters op droogijs.
        OPMERKING: Bewaar de monsters bij −80°C tot verdere verwerking. Vermijd herhaalde vries-dooicycli. Snelle snap-freezing zorgt er effectief voor dat EV's behouden wanneer monsters correct zijn afgesloten. Uitdroging of blaasmeletsel kan optreden als weefsels blootliggen of meerdere vries-dooicycliondergaan 13.
    2. Weefseldissociatie
      OPMERKING: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast met steriele instrumenten en handschoenen om besmetting te voorkomen, die anders de zuiverheid van EV's kan aantasten.
      1. Weeg weefsel
        1. Steriliseer pincetten met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen.
        2. Breng het bevroren weefsel over op een voorgewogen suspensiekweekschaal.
        3. Weeg het weefsel met een milligrambalans (meestal ~80–120 mg per monster, afhankelijk van de muisleeftijd en geslacht).
          OPMERKING: Het protocol is gevalideerd voor invoerweefselmassa's van ~80–120 mg. Voor monsters binnen dit bereik gebruikt u de reagensvolumes die zijn gespecificeerd in stappen 1.2.3.1, 1.3.1.3 en 1.3.2.1 zonder aanpassing. Voor monsters buiten dit bereik schaal je alle reagensvolumes proportioneel aan de weefselmassa, terwijl je de gevalideerde verhouding van RPMI-1640, collagenase D en DNase I (1000:40:4 μL per 100 mg weefsel) aanhoudt. Dit komt overeen met ongeveer 10 μL RPMI-1640, 0,4 μL collagenase D (100 mg/mL voorraad) en 0,04 μL DNase I (20.000 U/mL voorraad) per mg weefsel. Houd deze verhoudingen aan om de uiteindelijke enzymconcentraties in de reactie te behouden. De verteringsefficiëntie en EV-opbrengst moeten empirisch worden gevalideerd wanneer er aanzienlijk buiten het bereik van 80–120 mg wordt gewerkt.
        4. Zet het monster terug in een voorgekoelde buis en laat het op ijs staan.
      2. Bereid enzymen voor
        1. Ontdooide aliquoten van collagenase D (100 mg/mL voorraad) en DNase I (20.000 U/mL voorraad) op ijs (zie Aanvullend Dossier 1, Stap 1.4 voor enzymvoorraadvoorbereiding). Deze enzymen worden toegevoegd in stap 1.3.2.1 om uiteindelijke inreactieconcentraties van 3,8 mg/mL collagenase D en 77 U/mL DNase I te bereiken. Het uiteindelijke verteringsvolume is 1,044 ml.
        2. Meng DNase I voorzichtig door inversie. Niet vortexen.
      3. Weefselvoorbereiding voor vertering
        1. Voeg 800 μL RPMI-1640 toe aan een steriele suspensiecultuurschaal die op ijs wordt geplaatst.
        2. Breng het weefsel over naar het schaaltje.
        3. Snijd het weefsel in 6–8 stukken van ongeveer gelijke grootte (2–3 mm per zijde) met een steriel wegwerpscalpel. Stabiliseer het weefsel met steriele pincetten tijdens het snijden om een gelijkmatige fragmentatie te garanderen. Voltooi deze stap binnen 1 minuut per monster om consistentie tussen de monsters te behouden.
        4. Houd het gerecht gedurende de hele procedure op ijs om degradatie te minimaliseren.
    3. Weefseloverdracht en enzymatische vertering
      1. Weefseltransfer
        1. Knip het uiteinde van een steriele P1000-pipettip af met een steriel lemmet om een opening van 2–3 mm in diameter te creëren, voldoende om vrije doorgang van de weefselfragmenten uit stap 1.2.3.3 mogelijk te maken.
          OPMERKING: Alternatief gebruik je commercieel verkrijgbare breedboring (brede opening) 1 mL pipettoppen, die een gestandaardiseerde opening bieden (meestal ~2–3 mm interne diameter) en variabiliteit bij handmatig trimmen elimineren.
        2. Breng de weefselfragmenten en het RPMI-1640 medium over in vooraf gelabelde 1,5 mL buizen met behulp van een P1000-pipet die is uitgerust met de aangepaste tip. Voer 2–3 opeenvolgende aspiraties uit om restfragmenten en medium terug te winnen. Controleer visueel de schaal en pipettip na de overdracht en gebruik een steriele tang om eventuele resterende fragmenten over te brengen zodat er geen zichtbaar weefsel meer achterblijft.
        3. Voeg 200 μL RPMI-1640 toe aan elke buis.
      2. Enzymatische vertering
        1. Voeg 40 μL collagenase D-voorraad (100 mg/mL) en 4 μL DNase I-voorraad (20.000 U/mL) toe aan elke buis van aliquots die op ijs zijn ontdooid. Dit levert uiteindelijke inreactieconcentraties op van 3,8 mg/mL collagenase D en 77 U/mL DNase I. Voor monsters buiten het weefselbereik van 80–120 mg, pas de enzymvolumes proportioneel aan zoals beschreven in de NOOT na stap 1.2.1.3.
          OPMERKING: Deze volumes zijn gekalibreerd voor weefselmassa's binnen het gebruikelijke bereik van 80–120 mg. Voor weefselmassa's buiten dit bereik schaal je alle reagensvolumes proportioneel zoals beschreven in de NOTE na stap 1.2.1.3 (0,4 μL collagenase D-voorraad en 0,04 μL DNase I-voorraad per mg weefsel), die dezelfde uiteindelijke in-reactie enzymconcentraties behouden ongeacht weefselmassa.
        2. Voeg de enzymen gelijktijdig toe aan alle monsters bij het verwerken van meerdere monsters.
        3. Houd de buisjes op ijs tijdens de toevoeging van enzymen.
        4. Draai de buizen voorzichtig om te mengen. Niet vortexen.
        5. Incubeer de buizen op 37°C gedurende 30 minuten op een nuteringsmixer (24 tpm, 20° kantelhoek; zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat je tijdens de incubatie gelijkmatig mengt.
          OPMERKING: Digesteer elk monster in een totaalvolume van 1,044 mL (1000 μL RPMI-1640, 40 μL collagenase D en 4 μL DNase I per monster; gelijk aan ~25:1 buffer-naar-collagenase verhouding).
    4. Verwijdering van puin
      OPMERKING: Start de SEC-kolomevenwicht aan het begin van de eerste centrifugatie (stap 1.4.1.1). De SEC-kolom vereist 20–25 minuten voor spoelen en evenwicht. Het starten van de evenwicht op dit punt zorgt ervoor dat de kolom direct na voltooiing van de filtratiestap klaar is voor monsterbelasting (Stap 1.4.3).
      1. Eerste centrifugatie
        1. Centrifugeer de monsters op 300 × g gedurende 10 minuten bij 4°C om onverteerd afval, intacte cellen en resterende weefselfragmenten te pelleteren.
        2. Breng het supernatant voorzichtig over in nieuwe steriele 1,5 mL microcentrifugebuizen zonder de pellet te verstoren.
      2. Tweede centrifugatie
        1. Centrifugeer de monsters op 2.000 × g gedurende 15 minuten bij 4°C om grote puin, dode cellen, apoptotische lichamen en grote blaasjes te pelleteren.
        2. Breng het supernatant voorzichtig over in nieuwe steriele 1,5 mL microcentrifugebuizen zonder de pellet te verstoren.
          OPMERKING: De tweede centrifugatie is optioneel en moet worden opgenomen wanneer extra afvalverwijdering nodig is. Voer deze stap uit als het supernatant zichtbaar troebel lijkt of restmateriaal bevat na de eerste centrifugatie. Deze stap wordt ook aanbevolen als eerdere preparaten besmetting hebben aangetoond door intracellulaire markers (bijv. Calnexine of BiP) in EV-verrijkte SEC-fracties of de aanwezigheid van niet-vesiculaire deeltjes door transmissie-elektronenmicroscopie. De noodzaak van deze stap moet worden gevalideerd tijdens de initiële protocoloptimalisatie voor elk weefseltype.
      3. Filtratie
        1. Pre-nat steriele 30 μm celfilters door ze te spoelen met RPMI-1640 om het membraan in balans te brengen en monsterverlies te minimaliseren. Gooi de spoeling weg.
        2. Filter elk monster door de voorbevochtigde 30 μm celzeef in steriele, laag-eiwitbindende 1,5 mL microcentrifugebuizen om resterende cellulair afval en grote deeltjes te verwijderen vóór SEC.
        3. Laat de monsters door het filter passeren door de zwaartekracht.
        4. Geef 10–15 minuten per monster aan voor filtratie.
          OPMERKING: De filtratie is voltooid wanneer er geen zichtbare vloeistof boven het filtermembraan overblijft en het filtratvolume in de verzamelbuis is gestabiliseerd. Als de filtratie langzamer is of vastloopt, kan dit wijzen op verstopping door restafval; In zulke gevallen overweeg om de verduidelijkingsstap te herhalen of de monsterbelasting te verminderen.
        5. Verzamel 550–600 μL gefilterd supernatant voor latere belasting op de SEC-kolom. Voor consistentie over monsters normaliseert u het laadvolume tot 500 μL per kolom (zie Stap 2.2.1), ongeacht het totale teruggewonnen volume.
  2. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)
    1. Equilibratiekolom SEC.
      OPMERKING: Voer deze stap uit tijdens de centrifugatie indien mogelijk.
      1. Spoel de SEC-kolom met 17 mL 1× PBS (0,22 μm-gefilterd).
      2. Laat het gehele volume door de kolom passeren met de zwaartekracht met een verwachte debiet van 0,75 mL/min (20–25 minuten totaal voor het 17 mL spoelvolume). Snellere of langzamere debieten kunnen wijzen op een onjuiste kolomevenwicht of blokkade.
      3. Houd de kolom en PBS tijdens de evenwicht op kamertemperatuur (RT, 21°C ± 2°C) om een consistente debiet en optimale kolomprestaties te garanderen.
      4. Bereid laag-eiwitbindende 1,5 mL microcentrifugebuizen voor voor het verzamelen van alle fracties.
      5. Bereid indien nodig een extra buis voor voor het opvangen van het leegte volume.
    2. Monsterbelasting en elusie
      1. Laad 500 μL gefilterd supernatant toe op de SEC-kolom.
      2. Laat het monster volledig in de hars komen. Het eindpunt wordt bereikt wanneer de vloeibare meniscus het oppervlak van het harsbed bereikt, zonder zichtbare vloeistof boven de hars terwijl de hars zichtbaar nat blijft.
      3. Laat de meniscus niet onder het harsoppervlak zakken of de kolom drooglopen, omdat dit lucht in het harsbed brengt en de eluatie verstoort. Wanneer de vloeibare meniscus het harsoppervlak bereikt (zoals gedefinieerd in Stap 2.2.2), ga je direct door naar Stap 2.2.4 zonder uitstel.
      4. Voeg onmiddellijk 2 mL PBS toe om de elutie te starten.
      5. Verzamel het leegvolume (~2,5 mL).
      6. Gooi het leegte volume weg of houd het als een niet-EV-fractie.
      7. Begin direct nadat het 2,5 mL voidvolume is geëlueerd met het verzamelen van de EV-verrijkte fractie.
      8. Verzamel in totaal 1,6 mL EV-verrijkt eluaat na het leegtevolume, hetzij als een enkele continue fractie in één buis, hetzij als opeenvolgende fracties die vervolgens worden samengevoegd.
      9. Alternatief kun je sequentiële fracties van 0,4 mL verzamelen om zuiverheid ten opzichte van opbrengst te optimaliseren. Kleinere fractievolumes worden aanbevolen wanneer een hogere zuiverheid vereist is (bijvoorbeeld voor proteomische analyses of gevoelige downstream-toepassingen), terwijl grotere fracties kunnen worden gebruikt om de totale EV-opbrengst te maximaliseren.
      10. Beoordeel fracties voor EV-verrijking met karakteriseringsmethoden (bijv. Western blot voor EV-markers en verontreinigingen, en NTA), en pool EV-verrijkte fracties zoals gedefinieerd in de karakteriseringssectie.
        OPMERKING: Houd de kolom continu in beweging. Terwijl één fractie wordt afgewerkt, voeg je PBS toe om een constante vloeistof boven het harsbed te behouden en te voorkomen dat de kolom droogloopt. Gebruik buisjes met weinig eiwitbinding, nuclease-vrije buisjes voor de verzameling.
    3. Concentratie
      1. Concentreer EV-monsters met behulp van centrifugale filters (100 kDa molecuulgewichtscutoff [MWCO]) voor downstream toepassingen (bijv. RNA-sequencing, proteomics of Western blot).
      2. Spoel de filters vooraf met PBS voordat je ze gebruikt.
      3. Centrifugeer de monsters op 4.000 × g bij 4°C, waarbij elke 2–3 minuten wordt gecontroleerd totdat het gewenste eindvolume (meestal 50–100 μL) is bereikt. Gebruik lagere eindvolumes (bijv. ~50 μL) voor toepassingen die hogere concentraties en hogere volumes vereisen (bijv. ~100 μL), waarbij maximale terugwinning de voorkeur heeft.
        VOORZICHTIG: Voorkom overconcentratie door centrifugatie te stoppen zodra het streefvolume is bereikt.
      4. Herstel het retentaat door zacht te pipetten.
      5. Registreer pre- en postconcentratiemonstervolumes om het herstel te schatten, indien nodig. NTA kan worden gebruikt om de deeltjesconcentratie vóór en na de concentratie te beoordelen, indien beschikbaar.
    4. Opslag
      1. Houd EV-verrijkte fracties op ijs of bij 4°C voor directe assays (bijv. NTA en transmissie-elektronenmicroscopie [TEM]) en verwerk binnen 24 uur voor TEM en binnen 48 uur voor NTA.
      2. Aliquot EV-monsters in buizen met een laag eiwit bindend materiaal voor opslag.
      3. Bewaar monsters bij −80°C voor langdurig gebruik.
      4. Vermijd herhaalde vries-dooicycli.

2. BM-afgeleid sEV (BM-sEV) Isolatieprotocol

  1. Monsterafname en weefseldissociatie
    1. Weefseloogst en behoud
      1. Vries de botten niet direct na de excisie in een snap-free, omdat dit het merg verhardt en de extractie met de geprikte buismethode bemoeilijkt. Houd in plaats daarvan botten op ijs of op 4°C tijdens korte verwerkingsperiodes vóór verwerking of invriezing, zoals beschreven in stap 3.1.1.4 (plaatsing op droogijs vóór −80°C opslag).
      2. Verwijder omliggende spieren en bindweefsel van de gedissectiede botten.
      3. Breng de botten over naar cryovialen.
      4. Leg de monsters op droogijs.
        OPMERKING: Bewaar de monsters bij −80°C tot verdere verwerking.
    2. BM-verwerking
      OPMERKING: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast met steriele instrumenten en handschoenen om besmetting te voorkomen, die anders de zuiverheid van EV's kan aantasten.
      1. Weeg en label 1,5 mL centrifugebuizen voordat je materiaal toevoegt. Bereken de BM-massa door buisgewichten voor en na extractie te vergelijken.
      2. Bereid de gepokte buis voor door een 0,2 mL PCR-buis (dop intact) in een 1,5 mL centrifugebuis met een strakke pasvorm in te brengen. Doorboor de onderkant van de 0,2 mL buis één keer met een steriele 16 G naald loodrecht op de basis, waardoor een enkele uniforme perforatie van ~1,6 mm diameter ontstaat. Bereid één opstelling per been per muis voor.
      3. Plaats het been, schoon van alle spieren en omliggend weefsel, in een steriele Petrischaal.
      4. Scheid het dijbeen en het scheenbeen door door de gewrichtsruimte te snijden.
      5. Snijd beide uiteinden van het dijbeen en het scheenbeen af om het rode merg bloot te leggen. Plaats de botten in de doorboorde PCR-buis die zich in de 1,5 mL buis bevindt en sluit de assemblage af met parafilm om een veilige opstelling tijdens centrifugatie te garanderen.
      6. Centrifugeer de monsters gedurende 10 seconden in een microcentrifuge op ongeveer 8.000 × g, of de dichtstbijzijnde stand op het gebruikte instrument, bij kamertemperatuur.
      7. Controleer succesvolle mergextractie aan de hand van drie criteria: (i) de botten lijken zichtbaar wit zonder restjes rood merg, (ii) de pellet in de onderste buis is donkerrood en compact, waarbij het doorgaans de kegelvormige punt van de 1,5 mL buis vult, en (iii) de gemeten mergmassa (stap 3.1.2.9) valt binnen het verwachte bereik van ~15–30 mg per muis.
      8. Herpositioneer of snijd de botten opnieuw en herhaal de korte spin als er zichtbaar rood beenmerg in het bot blijft.
      9. Weeg de buisjes opnieuw om de massa van het verwijderde merg te bepalen (meestal ~15–30 mg per monster, afhankelijk van de leeftijd, geslacht en extractie-efficiëntie van de muis).
        OPMERKING: Het protocol is gevalideerd voor mergopbrengsten van ~15–30 mg per monster. Omdat het RPMI-1640 resuspensionvolume constant wordt gehouden op 250 μL ongeacht de mergmassa (stap 3.1.2.10), wordt EV-opbrengst genormaliseerd naar de gemeten beginmergmassa tijdens downstream analyse (deeltjes·mL−1·mg−1 weefsel). Voor monsters die aanzienlijk onder de 15 mg komen, moet ik het merg van gematchte muizen (dezelfde leeftijd, geslacht en bot) vóór de re-suspension ophalen om voldoende input te behouden voor downstream karakterisering. Voor monsters die aanzienlijk boven de 30 mg uitkomen, verdeel je het merg over twee afzonderlijke suspensies van elk 250 μL of schaal je het volume van RPMI-1640 evenredig (~12,5 μL per mg merg) om onvolledige resuspension te voorkomen; In beide gevallen pas dezelfde per-massa normalisatie toe tijdens de analyse.
      10. Voeg 250 μL RPMI-1640 toe aan elke buis. Houd een constant volume over de monsters aan, ongeacht de mergmassa, om de EV-opbrengst naar de beginmergmassa te normaliseren. Houd de monsters op ijs.
      11. Suspendeer het merg opnieuw door voorzichtig 10–15 keer op en neer te pipetteren met een P1000-pipet, totdat de suspensie visueel homogeen lijkt, zonder zichtbare klonten of intacte weefselfragmenten. Vermijd geforceerd pipetteren of bellenvorming, omdat dit de integriteit van de blaasjes kan verstoren.
  2. Verwijdering van puin
    1. Eerste centrifugatie
      1. Centrifugeer de monsters op 300 × g gedurende 10 minuten bij 4°C om onverteerd afval, intacte cellen en resterende weefselfragmenten te pelleteren.
      2. Breng het supernatant voorzichtig over in nieuwe steriele 1,5 mL microcentrifugebuizen zonder de pellet te verstoren.
    2. Tweede centrifugatie
      1. Centrifugeer de monsters op 2.000 × g gedurende 15 minuten bij 4°C om groot puin te verwijderen.
      2. Breng het supernatant voorzichtig over in nieuwe steriele 1,5 mL microcentrifugebuizen zonder de pellet te verstoren.
    3. Derde centrifugatie
      1. Centrifugeer de monsters op 10.000 × g gedurende 30 minuten bij 4°C om apoptotische lichamen en grote blaasjes te verwijderen.
      2. Breng het supernatant voorzichtig over in nieuwe steriele 1,5 mL microcentrifugebuizen zonder de pellet te verstoren.
      3. Zorg ervoor dat een eindvolume van 200 μL supernatant wordt verkregen.
  3. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)
    1. Kolomvoorbereiding
      1. Evenwicht de SEC-kolom door te spoelen met 6 mL 1× PBS (0,22 μm-gefilterd).
        OPMERKING: Het equilibratievolume is kolomspecifiek en moet overeenkomen met het kolomtype dat in de Materiaaltabel is vermeld. Deze kolom vereist een equilibratievolume van 6 mL, wat verschilt van de kolom die voor SkM-monsters wordt gebruikt.
      2. Laat het hele volume door de zwaartekracht gaan.
      3. Houd de kolom en PBS tijdens de evenwichtsfase op RT om een optimale debiet en kolomprestaties te waarborgen.
    2. Monsterbelasting en elusie
      1. Laad 150 μL gefilterd supernatant op de SEC-kolom.
      2. Laat het monster volledig in de hars komen. Het eindpunt wordt bereikt wanneer de vloeibare meniscus het oppervlak van het harsbed bereikt, zonder zichtbare vloeistof boven de hars terwijl de hars nat blijft (zoals beschreven in Stap 2.2.2).
      3. Laat de meniscus niet onder het harsoppervlak zakken of de kolom drooglopen (zie eindpunt gedefinieerd in Stap 3.3.2.2), omdat dit lucht in het harsbed brengt en de elusie verstoort. Wanneer de vloeibare meniscus het harsoppervlak bereikt, ga je onmiddellijk door naar stap 3.3.2.4 zonder vertraging.
      4. Voeg onmiddellijk 550 μL PBS toe om de elutie te starten.
      5. Verzamel het leegte volume (700 μL).
      6. Gooi het leegte volume weg of houd het als een niet-EV-fractie.
      7. Begin onmiddellijk nadat het 700 μL voidvolume is geëlueerd met het verzamelen van de EV-verrijkte fractie.
      8. Verzamel 850 μL EV-verrijkt eluaat na het 700 μL leegtevolume.
      9. Alternatief kun je sequentiële fracties van ongeveer 170 μL verzamelen om zuiverheid ten opzichte van opbrengst te optimaliseren.
        OPMERKING: Kleinere fractievolumes worden aanbevolen wanneer een hogere zuiverheid vereist is (bijvoorbeeld voor proteomische analyses of gevoelige downstream-toepassingen), terwijl grotere fracties kunnen worden gebruikt om de totale EV-opbrengst te maximaliseren.
      10. Beoordeel fracties voor EV-markers en zwembad-EV-verrijkte fracties indien nodig.
        OPMERKING: Houd de kolom continu in beweging. Terwijl één fractie wordt afgewerkt, voeg je PBS toe om een constante vloeistof boven het harsbed te behouden en te voorkomen dat de kolom droogloopt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de effectiviteit van dit protocol voor het isoleren van weefselafgeleide sEV's te beoordelen, worden representatieve resultaten van SkM- en BM-monsters gepresenteerd. Succesvolle isolatie werd gedefinieerd door (i) verrijking van canonieke EV-markers (TSG101, CD63, CD81 en CD9) in vroege SEC-fracties, (ii) minimale detectie van intracellulaire verontreinigingen (bijv. Calnexine en BiP), (iii) een unimodale deeltjesgrootteverdeling met de meerderheid van de deeltjes <200 nm), (iv) visu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een robuuste en reproduceerbare benadering om sEV-verrijkte preparaten direct te isoleren uit SkM en BM, twee laag-opbrengst en sterk heterogene weefsels. Hoewel EV-isolatie goed is gevestigd voor biofluiden en celkweeksystemen, blijven gestandaardiseerde methoden voor weefselafgeleide EV's beperkt vanwege de uitdagingen die samenhangen met weefseldissociatie, besmetting door intracellulair materiaal en variabiliteit in opbrengst. Hier beschrijven we cruciale stap...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

Wij danken Jennie Yang, Dariusz Żurawek en Volodymyr Yerko voor de technische hulp en nuttige discussies. We zijn het Center for Applied Nanomedicine-platform, met name Nadim Tawil en Laura Montermini, dankbaar voor de ondersteuning bij extracellulaire blaasjeskarakterisering en gegevensverzameling. We danken ook het personeel van de dierenfaciliteit, Guylaine Gadoury en Tara Thomson, voor hun hulp bij het omgaan met muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL centrifuge tubeSarstedt72.690.300Algemene microcentrifuge tube gebruikt in het hele protocol
1.5 mL low-protein-binding tubeSarstedt72.706.600Gebaat voor EV-verwerking, SEC-fractie-collectie en opslag
0.2 mL PCR tubeFisher Scientific14-222-262Gebaat voor poke-tube beenmerg extractie setup
16 G naaldBD305197Gebaat om de 0.2 mL PCR tube te puncteren
30 µm cel zeefMiltenyi Biotec 130-098-458Gebaat voor filtratie van skeletspiermonsters
70% ethanolSigma-Aldrich1.11727Gebaat om pincetten te steriliseren
BioveiligheidskabinetNANAGebaat voor steriele weefselverwerking
BotsnijinstrumentFisher Scientific10-001-976Gebaat om femur en tibia te scheiden en beenmerg bloot te leggen
Rundserumalbumine (BSA)BioShopALB001Gebaat voor Western blot blokkering en antilichaamverdunning
Calciumchloride dihydraat (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302Gebaat voor HEPES buffer bereiding
Koolstof gecoat koperrooster, 200-meshSigma-Aldrich930342Gebaat voor TEM monster voorbereiding
Centrifugale filter, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096Gebaat voor EV concentratie
Collagenase DRoche11088858001Gebaat voor enzymatische vertering van skeletspieren
CryovialSarstedt72.690.300Gebaat voor weefsel- en botopslag
De-ioniseert water (ultrapuur)NANAGebaat voor buffer voorbereiding en TEM wasstappen
DNase IRoche11284932001Gebaat voor enzymatische vertering van skeletspieren
Droge ijsNANAGebaat voor monsterkoeling en transport
Enhanced chemiluminescence substraatBiorad1705061Gebaat voor Western blot detectie
Filter unit, 0.22 µmSarstedt83.3941.501Gebaat om PBS te filteren waar van toepassing
Pincet / pincettenMilliporeSigmaF3892Gebaat voor weefselverwerking
GlutaraldehydeNANAGebaat voor TEM fixatie
GlycineNANAGebaat in TEM rooster wasstappen
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095Gebaat voor DNase I stock voorbereiding
HEPESBioShopHEP001.500Gebaat voor HEPES-NaOH buffer voorbereiding
Horseradish peroxidase-geconjugeerd streptavidinThermo FisherS911Gebaat voor Western blot detectie
Beeldvormingssysteem voor chemiluminescenceBiorad12003153Gebaat om Western blot membranen te beelden
KClBioShopPOC308Gebaat voor HEPES buffer voorbereiding
Magnesiumchloride (MgCl2)BioShopMAG510.500Gebaat voor HEPES buffer voorbereiding
2-MethylbutaanThermo Fisher78-78-4Gebaat voor skeletspier snap-freezing
Milligram weegschaalMilliporeSigmaZ741359Gebaat voor weefsel- en beenmerg weging
NaClBioShopSOD004.1Gebaat voor HEPES buffer voorbereiding
Nano-deeltjes tracking analyse instrumentMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300 gebruikt voor deeltjesmeting en telling
NaOHBioShopSHY500.500Gebaat voor pH aanpassing
Nitrocellulose membraanBioRad1704271Gebaat voor Western blot overdracht
Nutating mixerLabnet S0500Gebaat tijdens enzymatische vertering
P1000 pipetteMilliporeSigmaFA10006M-1EAGebaat voor weefseloverdracht
Pipettip, 1 mLSarstedt70.3050.275Tip is bijgesneden om opening te verbreden voor overdracht van weefselfragmenten
Fosfaat-gebufferd zout (PBS)WisentINC 811.012-FLGebaat door het hele protocol; ook gebruikt voor SEC equilibratie en elutie
Fosfatase remmerMilliporeSigma4906845001Gebaat voor Western blot lysate voorbereiding
PetrischaaltjeMilliporeSigmaCLS351146Gebaat voor beenmerg voorbereiding
Polyacrylamide gel, 4–20% gradiënt stain-freeBioRad4561094Gebaat voor Western blot scheiding
Protease remmerMilliporeSigma11697498001Gebaat voor Western blot lysate voorbereiding
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR7388-500MLOnaanvuld; geen FBS of antibiotica
RIPA buffer, 10×Merck20-188Gebaat voor eiwitextractie voor Western blotting
Scalpel, steriele wegwerpUltident Paragon02-90000-10Gebaat om skeletspierweefsel te snijden
SEC kolom, originele 70 nmIZONICO70PGebaat voor skeletspier SEC
SEC kolom, enkele 70 nmIZONICS70PGebaat voor beenmerg SEC
NatriumazietSigma-AldrichS2002Toegevoegd aan PBS voor het wassen van de kolom
Natriumcacodylaat bufferNANAGebaat voor TEM fixatie buffer
Luer Slip enkelvoudig gebruik spuit zonder naald MedlineSYR101020Gebaat

Referenties

  1. Whitham, M., et al. Extracellular vesicles provide a means for tissue crosstalk during exercise. Cell Metab. 27 (1), 237-251.e4 (2018).
  2. Kumar, M. A., et al. Extracellular vesicles as tools and targets in therapy for diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 27 (2024).
  3. Fonseka, P., Mathivanan, S. Extracellular vesicles biogenesis, cargo sorting and implications in disease conditions. Cells. 12 (2), (2023).
  4. Taraboletti, G., et al. Bioavailability of VEGF in tumor-shed vesicles depends on vesicle burst induced by acidic pH. Neoplasia. 8 (2), 96-103 (2006).
  5. Dakup, P. P., et al. Challenges and opportunities in state-of-the-art proteomics analysis for biomarker development from plasma extracellular vesicles. Proteomics. , (2025).
  6. Li, Y., et al. EV-origin: Enumerating the tissue-cellular origin of circulating extracellular vesicles using exLR profile. Comput Struct Biotechnol J. 18, 2851-2859 (2020).
  7. Shero, J. A., Lindholm, M. E., Sandri, M., Stanford, K. I. Skeletal muscle as a mediator of interorgan crosstalk during exercise: Implications for aging and obesity. Circ Res. 136 (11), 1407-1432 (2025).
  8. Vanhie, J. J., et al. The role of exercise- and high-fat diet-induced bone marrow extracellular vesicles in stress hematopoiesis. Front Physiol. 13, 1054463 (2022).
  9. Pinto, A. C., et al. Exploiting the therapeutic potential of contracting skeletal muscle-released extracellular vesicles in cancer: Current insights and future directions. J Mol Med (Berl). 102 (5), 617-628 (2024).
  10. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  11. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835 (2023).
  12. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145 (2021).
  13. Ahmadian, S., et al. Different storage and freezing protocols for extracellular vesicles: A systematic review. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 453 (2024).
  14. Watanabe, S., et al. Skeletal muscle releases extracellular vesicles with distinct protein and microRNA signatures that function in the muscle microenvironment. PNAS Nexus. 1 (4), pgac173 (2022).
  15. Magalhaes-Gama, F., et al. Exploring cell-derived extracellular vesicles in peripheral blood and bone marrow of B-cell acute lymphoblastic leukemia pediatric patients: Proof-of-concept study. Front Immunol. 15, 1421036 (2024).
  16. Potter, D. R., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles attenuate pulmonary vascular permeability and lung injury induced by hemorrhagic shock and trauma. J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 245-256 (2018).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Org Biomol Chem. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Kim, T., Hong, J. W., Lee, L. P. Efficient methods of isolation and purification of extracellular vesicles. Nano Converg. 12 (1), 45 (2025).
  19. Bracht, J. W. P., et al. Choice of size-exclusion chromatography column affects recovery, purity, and miRNA cargo analysis of extracellular vesicles from human plasma. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (3), 497-508 (2024).
  20. Mo, W., et al. Extracellular vesicle-mediated bidirectional communication between the liver and other organs: Mechanistic exploration and prospects for clinical applications. J Nanobiotechnology. 23 (1), 190 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van blaasjesdifferenti le centrifugatienanodeeltjes trackingtransmissie elektronenmicroscopieWestern blottingtetraspanine markers
Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.