Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn nanosize, lipide-gebonden deeltjes die intercellulaire communicatie bemiddelen via de overdracht van eiwitten, lipiden en ribonucleïnezuren (RNA's). Het isoleren van sEV's uit vaste weefsels zoals skeletspier (SkM) en beenmerg (BM) blijft een uitdaging vanwege lage opbrengst en besmetting door niet-vesiculaire componenten. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare workflow voor het isoleren van sEV's uit muis SkM en BM. SkM wordt enzymatisch verteerd, terwijl BM direct wordt verwerkt en vervolgens wordt onderworpen aan differentiële centrifugatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Voor SkM wordt het leegte volume (~2,5 mL) weggegooid, en de daaropvolgende ~1,6 mL wordt verzameld als EV-verrijkte fracties, doorgaans onderverdeeld in 400 μL sequentiële fracties (F1–F4). Voor BM wordt een leegte van 700 μL weggegooid, gevolgd door het verzamelen van een ~850 μL EV-verrijkte fractie, die kan worden onderverdeeld in ~170 μL sequentiële fracties (F1–F5) en gepoold op basis van EV-markerverrijking. Met deze benadering kunnen sEV's worden geïsoleerd uit kleine weefselvolumes (ongeveer 500 μL uit een enkele quadriceps en 150 μL uit gepoolde femur en tibia-BM), wat resulteert in ~108 deeltjes ·mL−1·mg−1 weefsel met deeltjesdiameters voornamelijk <200 nm. Vesikelintegriteit en zuiverheid worden gevalideerd met transmissie-elektronenmicroscopie, nanodeeltjestrackinganalyse en Western blotting voor canonieke EV-markers, met aanvullende karakterisering door enkeldeeltjesinterferometrische detectie om tetraspanine-gedefinieerde vesikelsubpopulaties te kwantificeren. Deze methode maakt reproduceerbare isolatie van hoogzuivere sEV's uit structureel complexe weefsels mogelijk met minimale inputmaterialen, wat downstream moleculaire en functionele analyses van weefselafgeleide vesikels ondersteunt.
Inleiding
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn nanosize, lipide-gebonden deeltjes die intercellulaire communicatie bemiddelen via de overdracht van eiwitten, lipiden en nucleïnezuren1. Ze worden door alle celtypen vrijgegeven en zijn aanwezig in vrijwel alle biologische vloeistoffen, waar ze functioneren als belangrijke dragers van bioactieve lading, waaronder peptiden en micro-ribonucleïnezuren (RNA's)2. Hun lading wordt selectief gesorteerd, waardoor specifieke signalen nauwkeurig kunnen worden afgeleverd3, en hun vesiculaire structuur stelt hen in staat de typisc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het McGill University Animal Care Committee (DOUG10029) en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care.
1. SkM-afgeleid sEV (SkM-sEV) isolatieprotocol
- Monsterafname en weefseldissociatie
- Weefseloogst en behoud
- Snap-freeze SkM-weefsel direct na excisie door het onder te dompelen in voorgekoeld methylbutaan.
OPMERKING: Om voorgekoeld methylbutaan te bereiden, plaats je een container methylbutaan in een droogijsbad en voeg je geleidelijk kleine stukjes droogijs direct toe aan de vloeistof....
- Snap-freeze SkM-weefsel direct na excisie door het onder te dompelen in voorgekoeld methylbutaan.
- Weefseloogst en behoud
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de effectiviteit van dit protocol voor het isoleren van weefselafgeleide sEV's te beoordelen, worden representatieve resultaten van SkM- en BM-monsters gepresenteerd. Succesvolle isolatie werd gedefinieerd door (i) verrijking van canonieke EV-markers (TSG101, CD63, CD81 en CD9) in vroege SEC-fracties, (ii) minimale detectie van intracellulaire verontreinigingen (bijv. Calnexine en BiP), (iii) een unimodale deeltjesgrootteverdeling met de meerderheid van de deeltjes <200 nm), (iv) visu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een robuuste en reproduceerbare benadering om sEV-verrijkte preparaten direct te isoleren uit SkM en BM, twee laag-opbrengst en sterk heterogene weefsels. Hoewel EV-isolatie goed is gevestigd voor biofluiden en celkweeksystemen, blijven gestandaardiseerde methoden voor weefselafgeleide EV's beperkt vanwege de uitdagingen die samenhangen met weefseldissociatie, besmetting door intracellulair materiaal en variabiliteit in opbrengst. Hier beschrijven we cruciale stap.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs geven geen belangenconflicten aan.
Dankbetuigingen
Wij danken Jennie Yang, Dariusz Żurawek en Volodymyr Yerko voor de technische hulp en nuttige discussies. We zijn het Center for Applied Nanomedicine-platform, met name Nadim Tawil en Laura Montermini, dankbaar voor de ondersteuning bij extracellulaire blaasjeskarakterisering en gegevensverzameling. We danken ook het personeel van de dierenfaciliteit, Guylaine Gadoury en Tara Thomson, voor hun hulp bij het omgaan met muizen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL centrifuge tube | Sarstedt | 72.690.300 | Algemene microcentrifuge tube gebruikt in het hele protocol |
| 1.5 mL low-protein-binding tube | Sarstedt | 72.706.600 | Gebaat voor EV-verwerking, SEC-fractie-collectie en opslag |
| 0.2 mL PCR tube | Fisher Scientific | 14-222-262 | Gebaat voor poke-tube beenmerg extractie setup |
| 16 G naald | BD | 305197 | Gebaat om de 0.2 mL PCR tube te puncteren |
| 30 µm cel zeef | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Gebaat voor filtratie van skeletspiermonsters |
| 70% ethanol | Sigma-Aldrich | 1.11727 | Gebaat om pincetten te steriliseren |
| Bioveiligheidskabinet | NA | NA | Gebaat voor steriele weefselverwerking |
| Botsnijinstrument | Fisher Scientific | 10-001-976 | Gebaat om femur en tibia te scheiden en beenmerg bloot te leggen |
| Rundserumalbumine (BSA) | BioShop | ALB001 | Gebaat voor Western blot blokkering en antilichaamverdunning |
| Calciumchloride dihydraat (CaCl2·2H2O) | BioShop | CCL302 | Gebaat voor HEPES buffer bereiding |
| Koolstof gecoat koperrooster, 200-mesh | Sigma-Aldrich | 930342 | Gebaat voor TEM monster voorbereiding |
| Centrifugale filter, 100 kDa MWCO | MilliporeSigma | UFC810096 | Gebaat voor EV concentratie |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | Gebaat voor enzymatische vertering van skeletspieren |
| Cryovial | Sarstedt | 72.690.300 | Gebaat voor weefsel- en botopslag |
| De-ioniseert water (ultrapuur) | NA | NA | Gebaat voor buffer voorbereiding en TEM wasstappen |
| DNase I | Roche | 11284932001 | Gebaat voor enzymatische vertering van skeletspieren |
| Droge ijs | NA | NA | Gebaat voor monsterkoeling en transport |
| Enhanced chemiluminescence substraat | Biorad | 1705061 | Gebaat voor Western blot detectie |
| Filter unit, 0.22 µm | Sarstedt | 83.3941.501 | Gebaat om PBS te filteren waar van toepassing |
| Pincet / pincetten | MilliporeSigma | F3892 | Gebaat voor weefselverwerking |
| Glutaraldehyde | NA | NA | Gebaat voor TEM fixatie |
| Glycine | NA | NA | Gebaat in TEM rooster wasstappen |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | Gebaat voor DNase I stock voorbereiding |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | Gebaat voor HEPES-NaOH buffer voorbereiding |
| Horseradish peroxidase-geconjugeerd streptavidin | Thermo Fisher | S911 | Gebaat voor Western blot detectie |
| Beeldvormingssysteem voor chemiluminescence | Biorad | 12003153 | Gebaat om Western blot membranen te beelden |
| KCl | BioShop | POC308 | Gebaat voor HEPES buffer voorbereiding |
| Magnesiumchloride (MgCl2) | BioShop | MAG510.500 | Gebaat voor HEPES buffer voorbereiding |
| 2-Methylbutaan | Thermo Fisher | 78-78-4 | Gebaat voor skeletspier snap-freezing |
| Milligram weegschaal | MilliporeSigma | Z741359 | Gebaat voor weefsel- en beenmerg weging |
| NaCl | BioShop | SOD004.1 | Gebaat voor HEPES buffer voorbereiding |
| Nano-deeltjes tracking analyse instrument | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | NanoSight NS300 gebruikt voor deeltjesmeting en telling |
| NaOH | BioShop | SHY500.500 | Gebaat voor pH aanpassing |
| Nitrocellulose membraan | BioRad | 1704271 | Gebaat voor Western blot overdracht |
| Nutating mixer | Labnet | S0500 | Gebaat tijdens enzymatische vertering |
| P1000 pipette | MilliporeSigma | FA10006M-1EA | Gebaat voor weefseloverdracht |
| Pipettip, 1 mL | Sarstedt | 70.3050.275 | Tip is bijgesneden om opening te verbreden voor overdracht van weefselfragmenten |
| Fosfaat-gebufferd zout (PBS) | Wisent | INC 811.012-FL | Gebaat door het hele protocol; ook gebruikt voor SEC equilibratie en elutie |
| Fosfatase remmer | MilliporeSigma | 4906845001 | Gebaat voor Western blot lysate voorbereiding |
| Petrischaaltje | MilliporeSigma | CLS351146 | Gebaat voor beenmerg voorbereiding |
| Polyacrylamide gel, 4–20% gradiënt stain-free | BioRad | 4561094 | Gebaat voor Western blot scheiding |
| Protease remmer | MilliporeSigma | 11697498001 | Gebaat voor Western blot lysate voorbereiding |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R7388-500ML | Onaanvuld; geen FBS of antibiotica |
| RIPA buffer, 10× | Merck | 20-188 | Gebaat voor eiwitextractie voor Western blotting |
| Scalpel, steriele wegwerp | Ultident Paragon | 02-90000-10 | Gebaat om skeletspierweefsel te snijden |
| SEC kolom, originele 70 nm | IZON | ICO70P | Gebaat voor skeletspier SEC |
| SEC kolom, enkele 70 nm | IZON | ICS70P | Gebaat voor beenmerg SEC |
| Natriumaziet | Sigma-Aldrich | S2002 | Toegevoegd aan PBS voor het wassen van de kolom |
| Natriumcacodylaat buffer | NA | NA | Gebaat voor TEM fixatie buffer |
| Luer Slip enkelvoudig gebruik spuit zonder naald | Medline | SYR101020 | Gebaat |
Referenties
- Whitham, M., et al. Extracellular vesicles provide a means for tissue crosstalk during exercise. Cell Metab. 27 (1), 237-251.e4 (2018).
- Kumar, M. A., et al. Extracellular vesicles as tools and targets in the....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
