$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Hebei Algemeen Ziekenhuis (goedkeuringsnummer: 2025-LW-0265). Vanwege het retrospectieve karakter van de studie werd ethische goedkeuring verkregen na de gegevensverzamelingsperiode, die door de commissie was toegestaan voor niet-interventionele studies met anonimiseerde klinische gegevens. De vereiste voor schriftelijke geïnformeerde toestemming werd opgeheven.
Selectie van deelnemers
Potentiële deelnemers werden tussen juli 2022 en mei 2024 gerekruteerd uit de afdeling Nefrologie van het Hebei General Hospital. Alle patiënten werden gescreend volgens vooraf gedefinieerde inclusie- en exclusiecriteria.
De inclusiecriteria waren als volgt: diagnose diabetische nefropathie (DN) bij Mogensen stadium III23, gedefinieerd als persistente albuminurie met een urinealbumine-naar-creatinine verhouding (UAlb/UCR) van 30–300 mg/g in ten minste twee van de drie spoturinemonsters die over 3–6 maanden zijn verzameld, zonder hematurie of snel afnemende nierfunctie die wijst op niet-diabetische nierziekte; geschatte glomerulaire filtratiesnelheid (eGFR) ≥45 mL/min/1,73m2 , berekend met behulp van de CKD-EPI-vergelijking; eerste diagnose van DN zonder voorafgaande vitamine D-, probucol of immunosuppressieve therapie voor DN; leeftijd <75 jaar; en klinisch stabiele toestand zonder acute diabetische complicaties zoals diabetische ketoacidose of hyperglykemische hyperosmolaire toestand, of actieve ernstige infecties binnen 4 weken voor inschrijving. Nierbiopsie was niet vereist voor inschrijving; Patiënten met vermoedelijke niet-diabetische nierziekte, waaronder actieve urineafzet, snel progressieve glomerulonefritis of systemische auto-immuunziekte, werden echter uitgesloten.
De exclusiecriteria omvatten ernstige systemische ziekten zoals maligniteiten, ernstige hart- en vaatziekten of auto-immuunziekten; bekende allergie voor vitamine D, probucol, valsartan, atorvastatine of insuline; zwangerschap of lactatie; en recent gebruik van medicijnen binnen 4 weken die de studieresultaten kunnen beïnvloeden, waaronder immunosuppressiva of corticosteroïden.
Groepstoewijzing
De screeningsarts bleef blind voor de definitieve groepstoewijzing tot bevestiging van de geschiktheid.
Basisdemografische en klinische kenmerken, waaronder leeftijd, geslacht, duur van diabetes en DN, en geschiedenis van hypertensie of hyperlipidemie, werden geregistreerd.
Deze studie gebruikte een retrospectief, niet-gerandomiseerd gecontroleerd ontwerp. Om selectiebias te minimaliseren en mogelijke verstorende factoren, waaronder temporele veranderingen en arts-gerelateerde variabiliteit, aan te pakken, was de groepstoewijzing gebaseerd op chronologische opnamevolgorde in plaats van op arts- of patiëntvoorkeur.
Patiënten die tussen juli 2022 en december 2023 werden opgenomen, kregen standaard drievoudige therapie bestaande uit valsartan, atorvastatine en probucol en werden toegewezen aan de controlegroep (n = 56). Patiënten die tussen januari 2024 en mei 2024 werden opgenomen en viervoudige therapie kregen (valsartan, atorvastatine, probucol en vitamine D) werden toegewezen aan de observatiegroep (n = 94).
Het grotere aantal patiënten in de observatiegroep weerspiegelde een verhoogde klinische toepassing van aanvullende vitamine D-therapie in het onderzoekscentrum, beginnend begin 2024, na opkomend bewijs. De basisdemografische en klinische kenmerken waren vergelijkbaar tussen de groepen (Tabel 1; P>0,05), en er vonden tijdens de studieperiode geen significante veranderingen plaats in diagnostische criteria, laboratoriummethoden of samenstelling van het artsenteam.
Behandelingsregime toediening
Alle deelnemers kregen gedurende de 8 maanden durende studieperiode een gestandaardiseerd dagelijks subcutaan insuline-infusieregime voor glycemische controle. De insulinedosering werd individueel aangepast volgens dagelijkse capillaire bloedsuikermonitoring. Patiënten in de controlegroep kregen valsartan (80 mg eenmaal per dag op een lege maag), atorvastatine (20 mg eenmaal daags) en probucol (250 mg twee keer daags) gedurende 8 maanden. Patiënten in de observatiegroep kregen hetzelfde valsartan-, atorvastatine- en probucol-regime met identieke doseringen en schema's, samen met dagelijkse orale vitamine D-suppletie.
De vitamine D-dosering werd bepaald op basis van de basisniveaus van serum 25-hydroxyvitamine D [25(OH)D], gemeten bij inschrijving met behulp van elektrochemiluminescentie-immunoassay (ECLIA). Vitamine D-voldoendeheid werd gedefinieerd als 25(OH)D ≥30 ng/mL, insufficiëntie als 20 ng/mL ≤25(OH)D <30 ng/mL, en tekort als 25(OH)D <20 ng/mL. Patiënten die supplementen kregen om tekort te voorkomen kregen 600–800 IE/dag, terwijl patiënten met een vastgesteld vitamine D-insufficiëntie of -tekort 2000 IU/dag kregen.
Veiligheidsbewaking en stopcriteria
Om de veiligheid van de deelnemers tijdens de 8 maanden behandelperiode te waarborgen, werden de serumniveaus van calcium, fosfor en bijschildklierhormoon (PTH) gemeten bij de aanvangslijn en elke 4 weken om vitamine D-geïnduceerde hypercalcëmie en calcium-fosfor-onbalans te monitoren. Een 12-kanaals elektrocardiogram (ECG) werd uitgevoerd bij de aanvangslijn en na 8 maanden om de QTc-intervalverlenging die geassocieerd is met probucol te beoordelen. Bij patiënten met een baseline QTc ≥450 ms bij mannen of ≥460 ms bij vrouwen werd het ECG herhaald in maand 1.
Nierfunctieparameters, waaronder serumcreatinine en eGFR, samen met serumelektrolyten, werden tweewekelijks gemonitord gedurende de eerste maand en daarna maandelijks. Deelnemers kregen de instructie om onmiddellijk nieuwe symptomen te melden. De criteria voor het stopzetten van de behandeling omvatten gecorrigeerd serumcalcium >10,5 mg/dL (2,62 mmol/L), bevestigd door herhaalde tests binnen 48 uur; QTc-interval >500 ms of meer >60 ms vanaf de basislijn op twee opeenvolgende ECG's; verdubbeling van serumcreatinine ten opzichte van de basislijn of ontwikkeling van acute nierschade volgens de criteria van Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO); en elke bijwerking graad ≥3 volgens de Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) die mogelijk, waarschijnlijk of definitief gerelateerd wordt aan vitamine D of probucol. Ernstige bijwerkingen werden binnen 24 uur gemeld aan de ethische commissie van het ziekenhuis.
Biologische monsterverzameling en -verwerking
Bloed- en urinemonsters werden afgenomen vóór de start van de behandeling en na afloop van de 8 maanden durende behandelingsperiode. Alle monsters werden 's ochtends genomen na een nachtelijke vasten van 8–12 uur. Ongeveer 20 ml veneus bloed werd verzameld met standaard proefafneemtechnieken in serum-separator- en EDTA-buizen. Bloedmonsters mochten 30 minuten bij kamertemperatuur stollen en 15 minuten bij 1000 × g centrifugeren bij 4 °C. Transparante serumsupernatanten werden zorgvuldig geaspireerd zonder het stolsel of de buffy-vacht te verstoren, gealiquoteerd in cryovials voor verschillende assays, gelabeld met deelnemer-ID, datum en monstertype, en opgeslagen bij −80 °C tot analyse. Serummonsters konden tot 12 maanden worden opgeslagen bij −80 °C.
Bij 24 uur urine-eiwituitscheiding (24 uur UPE) gooiden deelnemers het eerste ochtendurinemonster om 7:00 uur op dag 1 weg en verzamelden vervolgens alle urine, inclusief het eerste ochtendurinemonster om 7:00 uur op dag 2, in een meegeleverde verzamelcontainer. Deelnemers kregen de instructie om de verzamelcontainer tijdens de verzamelperiode te koelen. Het totale urinevolume werd geregistreerd, grondig gemengd en gealiquoteerd voor laboratoriumanalyse. Monsters werden opgeslagen bij 4 °C bij analyse binnen 24 uur of bij −20 °C voor latere analyse.
Voor de urine-albumine-creatinineverhouding (UAlb/UCR) werden de eerste ochtend midstream urinemonsters verzameld in steriele containers en op vergelijkbare wijze verwerkt. Dezelfde procedures werden herhaald na afloop van de 8 maanden durende behandelingsperiode.
Biochemische en klinische parameteranalyse
Bevroren serummonsters werden ontdooid op ijs of bij 4 °C vóór serum creatinine (SCr)-analyse. SCr werd gemeten met een enzymatische colorimetrische assay op een geautomatiseerde biochemische analyzer, volgens de instructies van de fabrikant. Dagelijkse kalibratie werd uitgevoerd met multi-level kalibratoren, en in elke batch werden twee niveaus commerciële kwaliteitscontrolematerialen opgenomen. Monsters werden dubbel geanalyseerd en assays met een variatiecoëfficiënt van >5% werden herhaald. De onderste detectiegrens voor SCr was 2,0 μmol/L.
De eiwitconcentratie in 24-uurs urine-aliquots werd gemeten met de pyrogallol rood-molybdate methode. Monsters werden in duplicaat geanalyseerd en kwaliteitscontrolematerialen werden bij elke run opgenomen. Monsters boven het kalibratiebereik (>3,0 g/L) werden verdund met normale zoutoplossing en opnieuw geëvalueerd. De 24 uur UPE werd berekend met behulp van de eiwitconcentratie in de urine en het totale urinevolume.
De concentraties van urinealbumine en creatinine in urinemonsters van de eerste ochtend werden gemeten met behulp van de biochemische analyzer, waarna de UAlb/UCR-verhouding werd berekend.
Nuchtere plasmaglucose (FPG) en 2 uur postprandiale glucose (2h-PPG) werden gemeten met een gevalideerde bloedsuikermeter en capillaire vingerprikbloedmonsters, volgens de instructies van de fabrikant.
Glycated hemoglobine (HbA1c) werd geanalyseerd met behulp van high-performance vloeistofchromatografie met een speciaal HbA1c-analysesysteem. Deelnemers kregen de instructie om 7 dagen geen lipidenverlagende medicatie te gebruiken en 24 uur vetrijke maaltijden of alcohol te nemen voordat er bloed na de behandeling werd afgenomen. Serum totaal cholesterol (TC), triglyceriden (TG), high-density lipoproteïnecholesterol (HDL-C) en low-density lipoproteïnecholesterol (LDL-C) werden gemeten met behulp van enzymatische assays. Twee niveaus kwaliteitscontrolemateriaal werden dagelijks geanalyseerd. Lipidenparameters werden aanvankelijk in single gemeten, en monsters met een variatiecoëfficiënt van >10% werden opnieuw beoordeeld in dubbele samenhang. Detectielimieten waren 0,1 mmol/L voor TC, 0,05 mmol/L voor TG, 0,08 mmol/L voor HDL-C en 0,10 mmol/L voor LDL-C. LDL-C-waarden werden bepaald door directe assay of door de Friedewaldvergelijking wanneer de triglyceridenniveaus <400 mg/dL waren.
Analyse van immuunfunctie en ontstekingsmarkers
Serum immunoglobuline G (IgG) concentraties werden gemeten met een commerciële humane IgG ELISA-kit. Het detectiebereik van de assay was 1,37–1000 ng/mL, de gevoeligheid was 0,52 ng/mL, de intra-assay variatiecoëfficiënt was <6%, en de interassay variatiecoëfficiënt was <9%. Alle monsters werden dubbel geanalyseerd en hoogwaardige en laagwaardige controlematerialen die bij de kit werden geleverd, werden op elke plaat opgenomen. Platen met kwaliteitscontrolewaarden buiten 2 standaardafwijkingen van de doelwaarden werden afgewezen en herhaald. Monsters boven de bovengrens werden 1:2 verdund en opnieuw beoordeeld.
Alle reagentia en serummonsters werden vóór de analyse in evenwicht gebracht tot kamertemperatuur. Serummonsters werden verdund volgens de instructies van de kit, meestal bij verdunning van 1:100.000. Standaarden, verdunde monsters en blanks (100 μL) werden toegevoegd aan geschikte putten van voorgecoate microplaten en 90 minuten geïncubeerd bij 37 °C. De putten werden drie keer gewassen voordat ze werden geïncubeerd met een biotinyleerd detectie-antilichaam gedurende 60 minuten bij 37 °C. Na extra wassen werd mierikswortelperoxidaseconjugaat toegevoegd en 30 minuten in het donker geïncubeerd. Na het wassen werd de substraatoplossing toegevoegd en werd het mengsel 15 minuten in het donker geïncubeerd voordat de stopoplossing werd toegevoegd. Optische dichtheid werd gemeten bij 450 nm met referentiegolflengten van 570 nm of 630 nm. Standaardcurves werden gegenereerd om IgG-concentraties te berekenen.
Lymfocytensubsets werden geanalyseerd met flowcytometrie op een BD FACSCanto II uitgerust met 488 nm en 640 nm lasers. De voorwaartse verstrooiingsspanning werd ingesteld op 300 V, zijspanning op 350 V, en de fotomultiplierbuisspanningen voor FITC-, APC- en PE-kanalen respectievelijk op 400 V, 550 V en 480 V. Doublets werden uitgesloten met FSC-A versus FSC-H gating.
Levensvatbaarheidskleuring werd uitgevoerd met 7-aminoactinomycine D (7-AAD), en er werden slechts 7-AAD-negatieve gebeurtenissen geanalyseerd. Volbloedmonsters werden verdeeld in ongekleurde, isotypecontrole- en reageerbuizen. Anti-menselijke CD3-FITC, CD4-APC en CD8-PE antilichamen werden aan reageerbuizen toegevoegd, terwijl gematchte isotype-controleantilichamen aan controlebuisjes werden toegevoegd. Monsters werden 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. Beloningscontroles werden voorbereid met BD CompBeads en automatische compensatie werd uitgevoerd in FACSDiva-software. Rode bloedcellen werden gelyseerd met een rode bloedcellen-lysebuffer, vervolgens gewassen en opnieuw opgehangen in een kleuringsbuffer met 7-AAD.
Dagelijkse cytometeropstelling en trackingkralen werden gebruikt voor kwaliteitscontrole. De gatinghiërarchie omvatte doublet-uitsluiting, lymfocytselectie, levensvatbaarheidsgating, CD3+ gating en identificatie van CD4/CD8-subsets. Er werden per monster minstens 50.000 levende lymfocyten verkregen, met een totaal aantal verworven gebeurtenissen variërend van 100.000 tot 150.000. De gegevens werden geanalyseerd met FlowJo-software en percentages van CD3+, CD4+ en CD8+ cellen, samen met CD4+/CD8+ verhoudingen, werden berekend.
Serum hs-CRP, IL-6, TNF-α en MCP-1 concentraties werden gemeten met commerciële ELISA-kits. Detectiebereiken en gevoeligheden waren als volgt: hs-CRP (0,07–12,5 ng/mL; gevoeligheid 0,022 ng/mL), IL-6 (0,7–300 pg/mL; gevoeligheid 0,35 pg/mL), TNF-α (1,6–100 pg/mL; gevoeligheid 0,8 pg/mL) en MCP-1 (5–1000 pg/mL; gevoeligheid 2,5 pg/mL). Alle assays werden dubbel uitgevoerd. Op elke plaat waren laag- en hoogwaardige controlematerialen inbegrepen. De intra-assay variatiecoëfficiënten waren <8%, en de variatiecoëfficiënten tussen de assay waren <10%. Waarden onder detectielimieten werden geregistreerd als de helft van de onderste kwantificatielimiet, terwijl waarden boven de hoogste standaard werden verdund en opnieuw beoordeeld. Monsters ondergingen slechts één vries-dooicyclus voor analyse. Cytokine ELISA-procedures volgden protocollen die identiek waren aan die beschreven voor IgG ELISA, volgens de instructies van de fabrikant met betrekking tot verdunningsfactoren, incubatiecondities en temperaturen.
Klinische uitkomstbeoordeling en gegevensbeheer
Aan het einde van de 8 maanden durende behandelperiode evalueerden behandelend behandelend artsen, blind voor groepstoewijzing, de klinische status van de deelnemers. Patiënten werden als ontslagen geclassificeerd wanneer aan alle vooraf gedefinieerde klinische verbeteringscriteria voor diabetische nefropathie ten minste twee opeenvolgende weken was voldaan: ≥30% vermindering van 24 uur UPE vergeleken met de baseline, stabilisatie of verbetering van eGFR gedefinieerd als afname <5 mL/min/1,73 m² ten opzichte van de baseline, en afwezigheid van acute diabetische complicaties of andere aandoeningen die verdere klinische zorg vereisen. Deelnemers die niet aan alle criteria voldeden, werden als niet ontslagen geclassificeerd. Klinische responspercentages werden vervolgens berekend voor elke groep.
Alle verzamelde demografische gegevens, laboratorium- en klinische gegevens werden ingevoerd in een elektronische database via dubbele gegevensinvoer door twee onafhankelijke onderzoekers. Bereikcontroles en consistentiecontroles werden uitgevoerd om de nauwkeurigheid van de gegevens te waarborgen. De primaire eindpunten omvatten veranderingen van de basislijn tot 8 maanden in nierfunctieparameters, waaronder 24 uur UPE en UAlb/UCR, en immuunfunctieparameters, waaronder CD3+ T-celpercentage en CD4+/CD8+ ratio. Secundaire eindpunten omvatten veranderingen van de basislijn tot 8 maanden in glycemische parameters (FPG, 2h-PPG, HbA1c), lipidenprofiel (TC, TG, LDL-C, HDL-C), ontstekingsmarkers (hs-CRP, IL-6, TNF-α, MCP-1) en klinische responssnelheid. Alle uitkomstmaten werden beoordeeld bij de basis, binnen 48 uur voor de start van de behandeling, en na de behandeling, binnen 1 week na afronding van de 8 maanden durende behandelingsperiode.
Statistische analyse
Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS-software. Continue variabelen met normale verdeling werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking, terwijl categorische variabelen werden uitgedrukt als frequentie en percentage. Onafhankelijke t-toetsen werden gebruikt voor vergelijkingen tussen groepen, en chi-kwadraattests voor categorische variabelen. Statistische significantie werd gedefinieerd als P<0,05. Gezien het verkennende karakter van de studie en het grote aantal beoordeelde uitkomsten, werden secundaire uitkomsten niet aangepast voor multipliciteit. Daarom werden P-waarden als beschrijvend beschouwd in plaats van bevestigend. Vanwege het retrospectieve niet-gerandomiseerde onderzoeksontwerp waren alle vergelijkingen tussen de controle- en observatiegroepen niet aangepast voor potentiële confounders, en kan residuele confounding zijn gebleven. Alle 150 ingeschreven patiënten (56 in de controlegroep en 94 in de observatiegroep) voltooiden de volledige 8 maanden durende behandeling en follow-upperiode. Er gingen geen patiënten verloren aan follow-up, werden ingetrokken of na inschrijving uitgesloten. Er ontbrekende gegevens werden niet vastgesteld voor basislijnkenmerken of uitkomstmaten, waaronder nierfunctie, glucose- en lipideprofielen, immuunmarkers en ontstekingsfactoren. Daarom waren er geen imputatieprocedures vereist.