$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Experimentele locaties
De proeven werden uitgevoerd op twee locaties die 7 km van elkaar verwijderd lagen; De locaties werden met verschillende behandelingen geïnëntificeerd. In de eerste proef werd een nethuisfaciliteit met 40% schaduw opgezet op de Molelwane, North-West University (NWU) Research Farm (25.810°Z, 25.630°E, 1276 m) in de Noordwestelijke Provincie van Zuid-Afrika. De rode zandige leembodem werd gecategoriseerd als Hutton-vorm en bevatte 75% zand, 4% slib en 21% klei25. Het tweede experiment werd uitgevoerd op de nethuisfaciliteit van de NWU Mafikeng campus (25.8278 °Z, 25.6079 °E, 1276 m). De bodems op de tweede locatie bevatten zandige leem met 82% zand, 3% slib, 15% klei, en werden eerder geclassificeerd als Arcadia vorm25. De CuO/ZnO groene hybride NP's werden gesynthetiseerd in het laboratorium van de afdeling Chemie, School of Physical and Chemical Sciences, Faculteit Natuur- en Landbouwwetenschappen, NWU, in Zuid-Afrika.
Synthese van CuO/ZnO groene hybride NP's
Tien (10) g gedroogde Pleurotus ostreatus gebruikte paddenstoelsubstraat (SMS) werd toegevoegd aan 100 ml gedeïoniseerd water, verhit op 70 °C en geroerd gedurende 2 uuren 26 uur. Het mengsel werd vervolgens afgekoeld tot kamertemperatuur, gefilterd, en 30 ml filtraat werd toegevoegd aan een oplossing met 2,5 g koperacetaat en 2 g zinkacetat in 30 ml gedestilleerd water. De pH van deze oplossing werd aangepast naar 8 met natriumhydroxide (NaOH), verhit tot 80 °C gedurende 2 uur, na de reactie gecentrifugeerd, een nacht gedroogd in een oven en gecalcineerd bij 650 °C gedurende 2 uuren 26 uur. De gesynthetiseerde NP's werden gekarakteriseerd en bevestigd als CuO/ZnO-groene hybride NP's.
Bodembemonstering en analyse
Bodemmonsters werden verzameld van de University Farm in Molelwane en de proeflocatie op dieptes van 0–15 cm en 15–30 cm. Ze werden vervolgens gecategoriseerd en onderzocht op hun fysieke en chemische eigenschappen, zoals beschreven door27.
Experimenteel ontwerp
De studie maakte gebruik van een factorieel experiment dat was gerangschikt in een gerandomiseerd volledig blokontwerp (RCBD) met drie replicata. Om de effectiviteit van groen-gesynthetiseerde CuO-ZnO hybride NP's onder diverse verontreinigingsscenario's te evalueren, werden twee onafhankelijke blootstellingsmodi vastgesteld op verschillende locaties: Site 1 (North-West University Campus) vertegenwoordigde een exogeen verontreinigingsmodel waarbij de bodem werd bezaaid met geëxtraheerde AFB1 met een snelheid van 160 ppb/kg om de directe adsorptie- en translocatie-afschermingscapaciteiten van de NP's te evalueren. Locatie 2 (Molelwane Research Farm): Vertegenwoordigde een biologisch infectiemodel waarbij de bodem werd ingeënt met A. flavus-sporen bij 160 sporen/kg om de antischimmeleffecten van de NP's op de novo mycotoxineproductie en daaropvolgende plantopname te onderzoeken. De poederachtige NP's werden na de inoculatie gewogen en gelijkmatig gemengd met 1 kg aarde in een plastic plantzak (AFB1 of A. flavus sporen). Elke behandeling werd afzonderlijk uitgevoerd en de handen werden tussen de behandelingen door gedesinfecteerd. Vervolgens werden aanvankelijk vier maïszaden in elke pot geplant (9 cm bovendiameter, 6,5 cm onderdiameter). Om drie gezonde zaailingen per pot te houden, werden de zaailingen een week na het uitkomen gesnoeid. In overeenstemming met de aanbevelingen voor optimale maïsproductie uit bodemanalyse werd de bodem bemest. De potten werden geplaatst op tussen- en intra-rijafstanden van 0,75 m × 0,3 m, voor een totaal van 216 potten. De grond in potten werd na het zaaien tot 60% veldcapaciteit bewaterd. Bodem- en plantenmonsters werden verzameld in drie ontwikkelingsstadia: V10 (ontwikkeling), R1 (bloei) en R6 (volwassenheid). Monsters werden vervolgens in een met ijs gevulde koelbox naar het laboratorium gebracht en op -20 °C bewaard voor verder onderzoek. Bruine papieren zakken werden gebruikt om de resterende plantmonsters op te slaan en diep in te vriezen voor AFB 1-concentraties en andere assays. De resterende plantmonsters voor AFB1-concentraties en andere analyses werden bewaard in bruine papieren zakken en diepgevroren tot de analyse.
Analyse van maïsaflatoxinen
Maïsontwikkelingscomponenten (wortel, stengel, blad en korrel) in verschillende groeistadia werden verzameld in steriele plastic zakken, zorgvuldig gelabeld en naar het laboratorium vervoerd. Om de integriteit van de groeigegevens te behouden en onafhankelijke waarnemingen voor elke ontwikkelingsfase te waarborgen, werd een destructief steekproefprotocol geïmplementeerd. Om kruisbesmetting tussen nanodeeltjesconcentraties en inoculatietypen te voorkomen, werden oogstgereedschappen en handschoenen gereinigd met 70% ethanol en gespoeld met gedeïoniseerd water tussen elke behandelingsgroep. Met een vijzel en stamper werden 10 g plantmateriaal en 1 g natriumchloride (NaCl) 10 minuten lang vermalen in 25 ml 80% methanol en 20% gedestilleerd water. Voor maïskorrels en maïskern werden 25 g gemalen monster en 2,5 g NaCl gemengd met 100 mL 80% methanol:20 gedistilleerd water op hoge snelheid gedurende 10 minuten. Vervolgens werd het gehomogeniseerde extract gefilterd door een glazen microvezelfilter, gevolgd door wassen met 20 mL van 20% Tween-2 in fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS). Aflatoxines werden na elutie uit de immuunaffiniteitskolom geëxtraheerd met een stroomsnelheid van één druppel per seconde, en het supernatant (cytoplasma) werd verzameld in een amberkleurig flesje. Vervolgens werden AFB1 en andere aflatoxines gemeten volgens de vloeistofchromatografiemethode28 , waarbij aflatoxines werden gederivateerd met o-phthaldialdehydeoplossing en de gederivateerde verbindingen werden geïnjecteerd in een high-performance liquid chromatography (HPLC)-systeem. Het HPLC-systeem was uitgerust met een Jasco FP-920 fluorescentiedetector ingesteld op 362 nm excitatie en 425 nm emissie. De AFB1 was fysiologisch gestructureerd om te worden gedetecteerd bij een excitatiegolflengte van 362 nm. Een Hichrom-kolom (4,6 mm × 150 mm) met 5 μm deeltjes werd gebruikt, en de derivatisatiereactor was een KOBRA-celprogramma op 100 μA. Separaties van chromatografische pieken werden uitgevoerd in een Hichrom-kolom waarin een pre-kolom met vergelijkbare stationaire fase was gemonteerd. De Inertsil ODS-3 en ODS-3 V werden respectievelijk als guard- en analytische patronen gebruikt, terwijl de injector bestond uit een autosampler met een reodyneklep. De mobiele fase bestond uit water: methanol (65:35, v/v), kaliumbromide (119 mg) en 4 M salpeterzuur (350 μL) per liter, en werd gepompt met een debiet van 1,0 mL/min in een isocratisch programma. Aflatoxinedetectie werd als positief beschouwd voor elke piek bij een retentietijd vergelijkbaar met elke standaard en op een hoogte die vijf keer hoger was dan de basislijnruisvan 29.
Detectielimieten (LOD), kwantificatielimiet (LOQ) en percentage (%) herstel werden berekend om de analytische aanpak van de HPLC te bevestigen, met behulp van respectievelijk vergelijkingen 1, 2 en 3. De LOD is de laagste concentratie aflatoxine die betrouwbaar kan worden onderscheiden van achtergrondruis, terwijl LOQ de laagste concentratie aflatoxine is die kwantitatief met acceptabele precisie en nauwkeurigheid30 kan worden gemeten. AFB1 en zijn metabolieten werden teruggewonnen door 10 μL totale aflatoxinestandaarden (AFB1, AFB2, AFG1 en AFG2) toe te voegen aan de negatieve maïscontrolemonsters in drievoudige uitvoering. De monsters werden vervolgens gewonnen met behulp van HPLC volgens de eerder genoemde procedures.
LOD = X + 3s 1
LOQ = X + 10s 2
3
Waarbij: "X" de gemiddelde concentratie is van versterkte steekproefblanke waarden, en "s" de standaardafwijking van het monster is.
AFB1 blootstellingsschatting
De gemiddelde aflatoxinewaarden in het maïsdieet, de dagelijkse inname van maïs en het gemiddelde lichaamsgewicht (kinderen, volwassenen, rundvee, melkkoeien en kuikens) werden gebruikt om de geschatte dagelijkse inname (EDI) te berekenen. De EDI voor gemiddelde aflatoxines werd berekend volgens vergelijking 2 en uitgedrukt in (ng/kg lichaamsgewicht/dag); voor de hazard index (HI)-berekening werden EDI-waarden omgezet naar ng/kg lichaamsgewicht/dag (1 ppb/kg/dag = 1.000 ng/kg lichaamsgewicht/dag) om overeen te komen met de eenheden van TD503231.
4
Risicobeoordeling en karakterisering
De hazard index (HI) werd berekend door de EDI te delen door de TD50 en te vermenigvuldigen met een veiligheidsfactor van 50.000. Median toxische dosis (TD) 50 is de noodzakelijke dosering (ng/kg/lichaamsgewicht/dag) om tumoren te veroorzaken bij 50% van de proefdieren die bij nul dosisgeen tumoren zouden hebben ontwikkeld.
Data-analyse
De variantieanalyse werd uitgevoerd op de verzamelde groei- en opbrengstgegevens met behulp van de RCBD-procedure in SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, VS). Meervoudige vergelijkingen van least squares means werden uitgevoerd met behulp van Tukey's honestly significant difference (HSD) test33.