Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en kweek van microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen

175 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70909

⸱

17 juli 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie en primaire kweek van hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC's) uit neonataal muishersenweefsel om een robuust in vitro model te genereren voor het bestuderen van de functie van bloed-hersenbarrière onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

Samenvatting

Microvasculaire endotheelcellen (BMEC's) in de hersenen zijn het belangrijkste cellulaire onderdeel van de bloed-hersenbarrière (BBB) en spelen een sleutelrol bij het reguleren van moleculair transport en het in stand houden van de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Betrouwbare in vitro modellen van hersenendothel zijn essentieel voor het bestuderen van de fysiologie en disfunctie van BBB bij neurologische en systemische aandoeningen. Er wordt een reproduceerbaar protocol beschreven voor de isolatie en primaire kweek van BMEC's uit de neonatale muishersenschors. De methode omvat het dissectie van corticaal weefsel, mechanische en enzymatische dissociatie, verwijdering van myelineresten met behulp van een bovine serumalbumine (BSA) dichtheidsgradiënt, en verrijking van endotheelcellen met behulp van CD31-gebaseerde immunoselectie. Geïsoleerde cellen worden vervolgens gekweekt op met collageen gecoate platen en gekarakteriseerd door morfologische beoordeling, immunofluorescentiedetectie van endotheelmarkers, angiogene buisvormingstests en transendotheliale elektrische weerstand (TEER) metingen om barrière-eigenschappen te evalueren. Dit protocol biedt een betrouwbare aanpak om primaire BMEC-culturen te verkrijgen die geschikt zijn voor het onderzoeken van BBB-biologie, endotheelsignaaloverdracht en neurovasculaire interacties onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

Inleiding

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een sterk gespecialiseerde structuur die strikt de uitwisseling van stoffen tussen het centrale zenuwstelsel (CZS) en de systemische circulatiereguleert 1. De BBB wordt voornamelijk gevormd door microvasculaire endotheelcellen in de hersenen die met elkaar verbonden zijn door nauwe verbindingen. Deze endotheelcellen functioneren binnen een meercellig systeem dat bekendstaat als de neurovasculaire eenheid (NVU), waartoe ook astrocyten, pericyten, neuronen, gliale cellen en het basale membraan2 behoren. Onder deze componenten spelen hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC's) een centrale rol door het vormen van een continue laag met strakke verbindingen, duizenden selectieve transportersystemen, beperkte vesiculaire transport, en door de infiltratie van immuuncellen te beperken via lage expressie van adhesiemoleculen die de doorgang van opgeloste stoffen en cellen in het hersenparenchym 3,4 beperken.

Naast hun rol als fysieke en selectieve barrière zijn BMEC's actief betrokken bij essentiële processen, waaronder neurovasculaire signalering, regulatie van de cerebrale bloedstroom, lokale immuunresponsen en in het bijzonder cerebrale angiogenese5. Dit laatste proces is essentieel tijdens de embryonale ontwikkeling, maar wordt ook opnieuw geactiveerd bij pathologische aandoeningen zoals beroerte, ischemie of ontsteking. BMEC's reageren op proangiogene signalen zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en placentagroeifactor (PLGF), en coördineren de vorming en rijping van nieuwe vaten 6,7. Een hersenendotheeldisfunctie zou dus de integriteit van de BBB en de hersenhomeostase ernstig aantasten.

Het bestuderen van BMEC's in vitro stelt ons in staat zowel de fysiologie van de BBB als de mechanismen die hersenangiogenese reguleren te modelleren. Het isoleren van deze cellen uit hersenweefsel brengt echter aanzienlijke technische uitdagingen met zich mee vanwege de complexiteit van neuraal weefsel, de overvloed aan myeline en de noodzaak om culturen met een hoge endotheelzuiverheid te verkrijgen. Hoewel geïmmortaliseerde cellijnen beschikbaar zijn, hebben ze aanzienlijke beperkingen wat betreft hun fenotypische en functionele representativiteit8.

In deze context vormen de protocollen voor primaire kweek van BMEC's uit neonatale muismodellen een krachtig experimenteel instrument, omdat ze veel van de morfologische, moleculaire en functionele kenmerken van het hersenendothel in vivo behouden. Echter, verschillende gevestigde protocollen voor de isolatie van muis-BMEC vertrouwen op mechanische dissociatie gecombineerd met dichtheidsgradiënten (dextran of Percoll), wat vaak leidt tot variabele endotheelverrijking en restbesmetting door pericyten, astrocyten en myeline-afval9. Antibiotica-gebaseerde zuivering met puromycine verbetert de zuiverheid van het endotheli (tot ~95%), maar kan cellulaire stress veroorzaken door het remmen van de eiwitsynthese en mogelijke effecten op endotheliaal fenotype10. Alternatief bieden Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-gebaseerde benaderingen sterk gezuiverde populaties, maar vereisen gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide verwerking, wat de levensvatbaarheid en schaalbaarheid kan verminderen11. Meer recente neonatale protocollen vermijden dichtheidsgradiënten en verminderen het aantal centrifugatiestappen, waardoor de opbrengst verbeterten de besmetting wordt beperkt.

Voortbouwend op deze achtergrond beschrijft dit werk een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren en cultiveren van endotheelcellen uit neonatale muizenhersenmicrovasculatuur. Deze methode combineert nauwkeurige anatomische dissectie, efficiënte enzymatische vertering, myelineverwijdering met behulp van een Bovine Serum Albumine (BSA) gradiënt en verrijking door immunoselectie met magnetische microsferen die geconjugeerd zijn aan de CD31-marker. Het protocol maakt het mogelijk levensvatbare, reproduceerbare en verrijkte primaire culturen te verkrijgen, geschikt voor studies naar cerebrale angiogenese, neurovasculaire interactie, endotheelsignaal en BBB-disfunctie onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De Bioethiek- en Bioveiligheidscommissie van de Universiteit van Bío-Bío heeft dit project goedgekeurd (Fondecyt-subsidie 1240925). Het werk met dieren werd uitgevoerd volgens de belangrijkste principes van de drie R's voor het gebruik van proefdieren13 en in overeenstemming met de aanbevelingen van de Richtlijnen voor de Zorg en het Gebruik van Laboratoriumdieren, gepubliceerd door de National Institutes of Health van de Verenigde Staten14. De dieren werden in geschikte omgevingen gehouden in het Bioterium van de Universiteit van Bío-Bío onder standaard huisvestingsomstandigheden (12 uur licht/donker cyclus, gecontroleerde temperatuur van 22 ± 2 °C, met ad libitum toegang tot voer en water).

Om de cellen te verkrijgen, werden wildtype (WT) zwangere muizen (C57BL/6) gebruikt, tussen de 4 en 6 maanden oud. Na de bevalling bleven de welpen bij de moeder tot postnatale dag 5 (P5). Op dat moment werden de nakomelingen diep verdoofd met isoflurane totdat de reflexen verloren gingen voorafgaand aan de euthanasie. Onderkoeling werd uitsluitend als aanvulling gebruikt om beweging te minimaliseren en werd direct gevolgd door onthoofding. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de American Veterinary Medical Association (AVMA) voor de euthanasie van dieren (2020)15 en internationale regelgeving voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH)14. De hersenschors werd geïsoleerd en gebruikt om dit experimentele protocol te ontwikkelen (zie Protocol Stap 3). De Materiaaltabel vermeldt de materialen en antilichamen die in dit protocol zijn gebruikt.

1. Het voorbereiden van het endotheelcultuurmedium

  1. Om 500 mL kweekmedium voor endotheelcellen van muishersenen te bereiden, in een steriele container, meng je 250 mL DMEM aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS), 250 mL endotheliale celkweekmedium en 10% FBS.
    OPMERKING: Het kweekmedium levert essentiële endotheelgroeifactoren en ondersteunt celproliferatie. Als het genoemde product (zie de Materiaaltabel) niet beschikbaar is, kunnen equivalente endotheelcelsupplementen (bijv. ECGS, hydrocortison en L-glutamine) worden toegevoegd aan DMEM + FBS om vergelijkbare groeicondities16 te bereiken.
  2. Filter het hele medium (10% FBS) steriel door een 0,22 μm filter om steriliteit te garanderen.
  3. Bewaar het voorbereide medium op 4 °C tot gebruik. Bereid elke 2–4 weken een nieuw medium voor om de groeifactoractiviteit te behouden.

2. Het coaten van de kweekplaten

OPMERKING: Om celhechting te bevorderen en het endotheelfenotype te behouden, moeten kweekplaten worden voorbekleed met type I collageen. De stappen voor dit proces zijn als volgt:

  1. Bereid de precoatingoplossing voor door Type I collageen (0,1 mg/mL), M azijnzuur te mengen om het collageen op te lossen, en een steriel basaal medium om een totaalvolume van 15 mL te bereiken. Meng voorzichtig totdat het collageen volledig is opgelost en pas de oplossing indien nodig aan op pH 4,0 . Filter de oplossing steriel door een 0,22 μm filter en laat het ijs liggen tot gebruik om de stabiliteit van het collageen te behouden.
    OPMERKING: Type I collageen bootst het basale membraan na, ondersteunt de hechting van endotheelcellen en helpt het celfenotype te behouden.
  2. Homogeniseer de oplossing onder steriele omstandigheden. Breng de oplossing gelijkmatig aan om het hele oppervlak van de kweekplaten te bedekken.
    OPMERKING: Er wordt alleen het volume gebruikt dat nodig is om het oppervlak te bedekken.
  3. Incubeer de platen bij 37 °C een nacht (12–16 uur) zodat het collageen goed kan adsorberen. Verwijder voor het zaaien van cellen overtollige coatingoplossing en was de platen 2x met steriele 1x fosfaatgeborde zoutoplossing (1x PBS, pH 7,4) om restzuur en ongebonden collageen te verwijderen.

3. Isolatie van hersenmixcelcultuur

OPMERKING: Dit protocol bouwt voort op eerdere rapporten 9,17 die gericht waren op het isoleren van BMEC's uit de hersenschors van P5-muizen.

  1. Offer vijf P5-pups met diepe anesthesie en isoflurane; Gebruik onderkoeling alleen als supplement, gevolgd door halshalsonthoofding.
    OPMERKING: Vanaf deze stap moeten alle procedures worden uitgevoerd in een laminair-flow biologische veiligheidskast.
  2. Verzamel de hersenen (Figuur 1A) en plaats ze in steriele koude PBS (1x) in een 50 mL kegelvormige buis totdat alle hersenen zijn verwerkt.
  3. Scheid de hersenvliezen door voorzichtig elk brein te rollen op een gesteriliseerd nitrocellulosemembraan. Breng de hersenen over op een 100 mm plaat met koude PBS (1x). Verwijder met een steriel scalpel de hersenstam, het cerebellum, de thalamus en de reukknop (Figuur 1B,C).
  4. Verzamel de resulterende hersenvliesvrije cerebrale cortex en bewaar ze in koude PBS (1x). Breng onmiddellijk alle hersenschors over naar een 50 mL conische buis met 5 mL PBS 1x op ijs (Figuur 1D).
  5. Ontkoppel het weefsel mechanisch met een steriele schaar, gevolgd door een pipet van 1 mL totdat er geen stukken meer worden waargenomen en de suspensie homogeen is (Figuur 1E).
    OPMERKING: De pipettip kan worden doorgesneden om de mechanische spanning tijdens trituratie te verminderen. Weefseldissociatie wordt bereikt door gecontroleerde zuiging en zacht pipetteren, terwijl een bredere openingsopening van de punt schuifkrachten en mechanische cellyse minimaliseert, waardoor de levensvatbaarheid van de cel behouden blijft.
  6. Verzamel alle weefsels en plaats ze in 15 mL buizen.
  7. Om het weefsel te verteren, plaats je het monster in een steriele 15 mL conische buis met 2 mL collagenase-oplossing (2 mg/mL in DMEM) en incubeer je het 2 uur bij 37 °C op een orbitale shaker bij 180 rpm.
  8. Voeg na de vertering 5 mL DMEM met 10% FBS toe aan de suspensie en centrifugeer op 3.000 × g gedurende 10 minuten (zie Figuur 1F). Gooi het supernatant weg.
  9. Om myeline te verwijderen, suspendeer je de pellet opnieuw in 4 mL van 20% BSA in PBS (w/v) en centrifugeer je op 3.000 × g gedurende 20 minuten (Figuur 1G). Na centrifugatie verwijder je voorzichtig de bovenste melklaag met myeline met een Pasteur-pipet en gooi je eventueel overgelaten supernatant weg (Figuur 1H).
  10. Sussief de pellet opnieuw in 2 mL DMEM met 10% FBS, en centrifugeer dan opnieuw op 3.000 × g gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeer het laatste pelletje voorzichtig opnieuw in 1 mL DMEM met 10% FBS.
    OPMERKING: In dit stadium bevat de uiteindelijke resuspension een heterogene populatie hersencellen die voortkomen uit weefseldissociatie. Deze mix kan microvasculaire endotheelcellen van de hersenen, astrocyten, pericyten en andere neurale cellen omvatten. Vervolg zuiverings- en kweekstappen zijn nodig om BMEC's selectief te verrijken.
  11. Voordat de geïsoleerde cellen worden geplateerd, verwijder je de coatingoplossing van de voorbereide kweekplaten (zie Stap 2.3) en spoel je elke put twee keer af met steriele PBS (1x).
  12. Zaai de opnieuw gesuspendeerde cellen (stap 3.10) op de gecoate platen (aanbevolen: schalen van 60 mm).
    OPMERKING: Gewoonlijk wordt de gehele celsuspensie die uit één isolatie wordt verkregen, verdeeld over één of twee gecoate schalen, elk met 5 mL endotheliaal groeimedium.
  13. Houd de culturen in endotheelcelmedium op 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂. Vervang het medium elke 2–3 dagen. Wanneer culturen 90–100% confluentie bereiken, ga je verder met immunoselectie met CD31-gecoate kralen om endotheelcellen te verrijken.
    OPMERKING: Na isolatie en het aanzetten van de eerste kweek levert de procedure doorgaans ongeveer 5 × 10 à6 cellen per preparaat op, die hechten aan collageengecoate platen en de karakteristieke cobblestone-morfologie van endotheelmonolagen ontwikkelen.

4. Isolatie van microvasculaire endotheelcellen (BMEC's) in de hersenen met behulp van CD31 magnetische kralen

  1. Voorbereiding en loskoppeling van cellen
    1. Zodra de culturen 90–100% samenvloeiing bereiken, spoel je de cellen 3x met PBS (1x) om het resterende medium te verwijderen.
    2. Voeg 1 ml trypsine (0,5% 1x) toe aan de plaat en incubeer 3–5 minuten bij 37 °C om de cellen los te maken.
    3. Neutraliseer de trypsine door 1 ml endotheelkweekmedium toe te voegen met 10% FBS. Breng de celsuspensie (~2 mL) over in een steriele microcentrifugebuis en centrifugeer op 220 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
  2. Bereiding van CD31 magnetische kralen
    1. Plaats 8 μL CD31 magnetische kralen in een nieuwe 15 mL buis. Was de kralen met 1 ml 1% Hank's oplossing en doe ze voorzichtig opnieuw op door de tube te bewegen.
    2. Plaats de buis 2 minuten op een magneet om de kralen te laten neerslaan. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de kralen te verstoren. Herhaal de wasstap drie keer.
      OPMERKING: Werk altijd dicht bij de magneet om te voorkomen dat je de kralen verliest, en voer deze stap uit onder steriele omstandigheden om besmetting van de primaire celcultuur te voorkomen.
  3. Incubatie van cellen met kralen
    1. Suspendeer de celpellet opnieuw in 1 mL van 1% Hank's oplossing met FBS (om niet-specifieke binding te verminderen).
    2. Breng de cellen over in de buis met de voorgewassen kralen met een 1.000 μL pipet. Incubeer het mengsel op ijs met voorzichtig schudden gedurende 20 minuten.
  4. Magnetische scheiding van endotheelcellen
    1. Plaats de buis 3 minuten op een magneet om kralen-gebonden endotheelcellen neer te slaan.
    2. Verwijder het supernatant voorzichtig.
      OPMERKING: In dit stadium kunnen twee geïsoleerde celtypen worden gezuiverd—één endotheelcel (zie stap 4.5) en een mix van verschillende soorten hersencellen. Op dit moment zijn er twee opties beschikbaar.
      1. Verwijder en gooi het supernatant (d.w.z. het mengsel van hersencellen) weg terwijl de buis op de magneet blijft. Was de kraalgebonden cellen (d.w.z. CD31+ -cellen) met 2 ml Hank's oplossing en herhaal dit 3 keer weer.
      2. Gebruik het supernatant met cellulair afval om een nieuwe cultuur te genereren met niet-geselecteerde cellen (bijv. fibroblasten, astrocyten, microglia, neuronen, pericyten, onder andere).
  5. Het cultiveren van gezuiverde BMEC's
    1. Sussen de door kralen gebonden endotheelcellen opnieuw in 7 mL volledig endotheelmedium (10% FBS).
    2. Zaad de cellen op een 60 mm plaat die eerder met collageen was bedekt een nacht (zie sectie 2). Incubeer onder standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO₂).
      OPMERKING: Het endotheelfenotype blijft behouden tot passage (p) 3 onder de beschreven kweekomstandigheden. Om de bloed-hersenbarrière-gerelateerde eigenschappen te behouden, wordt aanbevolen om experimentele assays uit te voeren met vroege passages (p0–p3).

5. Celkarakterisering

  1. Microscopische observatie van door kralen gevangen cellen
    OPMERKING: Onder de kweekomstandigheden die in dit protocol worden beschreven, kunnen primaire BMEC's doorgaans tot drie passages (p3) worden behouden, terwijl hun karakteristieke endotheelmorfologie en fenotype behouden blijven. Afhankelijk van zaaidichtheid en groeisnelheid kunnen kweeken over het algemeen tot ongeveer 2–3 weken in vitro worden onderhouden voordat significante fenotypische veranderingen optreden.
    1. Na immunoselectie met CD31 magnetische kralen, observeer je de aangehechte cellen onder een fasecontrastmicroscoop (Figuur 2A).
      1. Let op CD31-positieve endotheelcellen met een typische cobblestone-morfologie en homogene monolagen vormen binnen 5–7 dagen.
        OPMERKING: Tijdens immunoselectie binden CD31-gecoate magnetische kralen specifiek aan endotheelcellen, waardoor de endotheelpopulatie wordt verrijkt. Na het selectieproces kunnen de kralen (ongeveer 4,5 μm in diameter) nog steeds worden waargenomen als geassocieerd met of geïnternaliseerd door endotheelcellen tijdens de vroege passages. Deze nemen meestal af bij latere wasbeurten en kweekbehoud en interfereren niet met de levensvatbaarheid of celgroei van BMEC (Figuur 2B).
      2. Gebruik de uniforme morfologie en afwezigheid van verlengde of astrocytachtige cellen om de zuiverheid van de endotheelpopulatie te schatten.
  2. Immunofluorescentie voor CD31 en GLUT1
    1. Zaad 2 × 103 BMEC's op collageenbedekte dekfolies en kweek tot 80–90% confluentie bereikt.
    2. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten op kamertemperatuur (22–25 °C) en was met PBS.
    3. Permeabiliseer met 0,1% Triton X-100 gedurende 5 minuten en blok niet-specifieke binding met 5% BSA gedurende 30 minuten.
    4. Incubeer 's nachts bij 4 °C met primaire antistoffen tegen CD31 en GLUT1 (glucosetransporter specifiek voor hersenendotheel).
    5. Was met PBS en incubeer 1 uur met de juiste fluorescerende secundaire antilichamen.
    6. Tegenkleurkernen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en monteer de coverslips met antifade montagemedium.
    7. Visualiseer onder een fluorescentie- of confocale microscoop. Zoek naar CD31 gelokaliseerd aan celranden (Figuur 3A), terwijl GLUT1 cytoplasmatische en membraanverdeling toont, wat de endotheelidentiteit en het fenotype van het hersenendotheel bevestigt (Figuur 3B).
      OPMERKING: Representatieve beelden van onafhankelijke BMEC-isolaties tonen de typische morfologie en markerexpressie van gekweekte BMEC's aan. De aanwezigheid van tight junction-eiwitten, zoals claudin-5, kan ook worden gebruikt om het hersenendotel te karakteriseren. Om de zuiverheid van de endotheelculturen verder te beoordelen, kan aanvullende immunofluorescentiekleuring worden uitgevoerd met negatieve markers voor andere neurale celtypen. Zo kan het gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) worden gebruikt om astrocyten te detecteren, en het geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul 1 (Iba1) om microgliale cellen te identificeren. Het ontbreken van kleuring voor deze markers bevestigt het ontbreken van besmetting door deze niet-endotheelcelpopulaties (Figuur 3C,D).
  3. Buisvormingsassay
    OPMERKING: Endotheelcellen vertonen proangiogene capaciteit in de Matrigel assays18, en endotheelidentiteit kan met deze assay worden bevestigd.
    1. Voorlaag van een 96-well-plaat met matrigel en laat deze 30 minuten polymeriseren bij 37 °C.
    2. Zaad 1 × 10,4 BMEC's per put in 100 μL volledig endotheelmedium (10% FBS). Incubeer bij 37 °C en monitor de buisvorming gedurende 4–8 uur met een fasecontrastmicroscoop (Figuur 4A).
    3. Kwantificeer de totale buislengte, het aantal verbindingen en meshes met ImageJ (Angiogenesis Analyzer plugin)19. (Figuur 4B).
      OPMERKING: Het vermogen van BMEC's om onderling verbonden buisvormige structuren te vormen bevestigt hun angiogene potentieel en endotheelfunctie.
  4. Meting van transendotheliale elektrische weerstand (TEER)
    OPMERKING: Hersenendotheelcellen moeten een strakke barrière vormen, omdat ze een cruciaal onderdeel zijn van de BBB20. De endotheelcapaciteit om een elektrische barrière te genereren moet worden bevestigd.
    1. Zaad 20.000 BMEC's op collageengecoate Transwell-inserts (poriegrootte 0,4 μm) in het bovenste compartiment en kweek totdat ze samenkomen.
    2. Meet TEER met een epitheelvoltohmmeter om de integriteit van de monolaag te beoordelen. Dagelijks TEER-waarden registreren tot stabilisatie; een toename van weerstand duidt op de vorming van strakke intercellulaire verbindingen, kenmerkend voor functionele endotheelbarrières (Figuur 4C).
      OPMERKING: Resten van het niet-geselecteerde celmengsel, waaronder astrocyten, kunnen worden gebruikt om een cocultuursysteem te genereren. Deze configuratie vereist zorgvuldige optimalisatie van de celverhouding tussen de bovenste (BMEC's) en onderste (niet-geselecteerde celmix) compartimenten, die in elk laboratorium gestandaardiseerd moeten worden. Deze cocultuurconfiguratie is aangepast van eerder beschreven BBB-modellen21.
    3. Zaad de niet-geselecteerde celmix (stap 4.4.2.2) in de onderste put van de kweekplaat en BMEC's aan de bovenzijde van het Transwell-insertmembraan.
      OPMERKING: Een representatief experiment dat monocultuur- en cocultuurcondities vergelijkt, werd opgenomen om de dichtheid van barrières te evalueren met TEER-metingen (Figuur 4C).

6. Uitbreiding en onderhoud van gezuiverde BMEC's

  1. Cultuuromstandigheden
    1. Houd de gezuiverde BMEC's in een volledig endotheelkweekmedium (10% FBS) op 37 °C in een bevochtigde broedmachine (95% luchtvochtigheid) met 5% CO₂. Vervang het kweekmedium elke 2–3 dagen om verse voedingsstoffen te leveren en de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
  2. Monitoring van celgroei en morfologie
    1. Bekijk de culturen dagelijks onder een fasecontrastmicroscoop om celhechting, groei en morfologie te monitoren. Let op de karakteristieke cobblestone-morfologie van BMEC's, die binnen 5–7 dagen een samenvloeiende monolaag vormen.
  3. Subculturering en doorgang
    1. Wanneer culturen 80–90% confluentie bereiken, scheid cellen af met 0,05–0,1% trypsine gedurende 3–5 minuten bij 37 °C.
    2. Neutraliseer de trypsine met een gelijk volume volledig medium, centrifugeer op 220 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C, en suspendeer de pellet opnieuw in een vers endotheelmedium.
    3. Zaai de cellen op collageengecoate platen met de gewenste dichtheid voor verdere expansie.
      OPMERKING: Beperk BMEC-passages tot 3–5 om het endotheelfenotype en de functionele integriteit te behouden.
  4. Optionele cryopreservatie
    1. Voor langdurige opslag moet BMEC's opnieuw worden suspendeerd in een vriesmedium (10% DMSO in volledig endotheelmedium). Vries geleidelijk in tot –80 °C in een vriezer met gecontroleerde snelheid, en doe daarna over in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om primaire BMEC's uit neonatale muizen (P5) te isoleren en te kweken. Deze cellen vormen het belangrijkste cellulaire bestanddeel van de BBB en zijn daarom een waardevol experimenteel hulpmiddel voor het bestuderen van cerebrovasculaire fysiologie en pathofysiologie. Succesvolle isolatie en kweek van hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC's) werden aangetoond door middel van morfologische, fenotypische en functionele beoordelingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De isolatie van BMEC's is een instrumenteel hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die de fysiologie van de BBB en haar disfunctie reguleren in verschillende pathologieën van het centrale zenuwstelsel (CZS), waaronder beroerte. In tegenstelling tot geïmmortaliseerde cellijnen behouden primaire BMEC-culturen belangrijke fenotypische en functionele kenmerken van het hersenendoheel, waaronder de expressie van strak gebonden eiwi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Delen van dit manuscript zijn geschreven met OpenAI's ChatGPT (GPT-4, juli 2025 versie) om de duidelijkheid, taal en samenhang te verbeteren. De auteurs hebben alle AI-ondersteunde inhoud kritisch beoordeeld, bewerkt en goedgekeurd. Er werden geen AI-tools gebruikt voor data-analyse, resultaatinterpretatie of het genereren van wetenschappelijke conclusies.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de onderzoekers van GRIVAS Health en NEUROVAS bedanken voor hun waardevolle input. Deze studie werd gefinancierd door Fondecyt Regular 1240295.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
60 mm culture platesCorning430166
96 Well culture platesCorning41122107
AzijnzuurSigma-AldrichA6283
Antibioticum-Antimycoticum (optioneel)Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-muis IgG Alexa Fluor (594 kleurstof)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-konijn IgG Alexa Fluor  (488 kleurstof)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
Automatische en serologische pipetten Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
Basaal medium (voor collageenoplossing)Gibco (DMEM)11965092
Rundserumalbumine (BSA)Sigma-AldrichA9647
Collagenase type IISigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µg/mL
DMEM (hoge glucose)Thermo Fisher Scientific11965092
EndoGRO-MV Complete MediumMerck MilliporeSCME004Medium voor endothelecelgroei
Falcon buizen (15 & 50 mL)Corning®352096 / 352070
Foetaal runder serum (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
FluorescentiemicroscoopMoticBA410
Handschoenen, maskers, laboratoriumbenodigdhedenDiverse leveranciers—
Heparine (100 U/mL)Sigma-AldrichH3393
Omgekeerd microscoopOlympus CKX41
Magnetische scheidingsmagneetEasySep  NC9284020
Orbitale schudder (37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ParafilmBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
Gekoelde centrifugeHITACHICT5RE
SchaarFine Science ToolsVarious
Scharen en fijne pincettenFine Science ToolsVarious
Steriele nitrocellulose membraanBIO-RAD1620094
Type I collageenCorning 30394

Referenties

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. , (2020).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. , (2006).
  3. Saili, K. S., et al. Blood-brain barrier development: systems modeling and predictive toxicology. Birth Defects Res. , (2017).
  4. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. J Neuroimmune Pharmacol. , (2006).
  5. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. , (2010).
  6. Crouch, E. E., et al. Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. , (2022).
  7. Risau, W. Developing brain produces an angiogenesis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. , (1986).
  8. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: an overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. , (2016).
  9. Assmann, J., et al. Isolation and cultivation of primary brain endothelial cells from adult mice. Bio Protoc. , (2017).
  10. Bernard-Patrzynski, F., et al. Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain. PLoS One. , (2019).
  11. Czupalla, C., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. Collagenase-based single cell isolation of primary murine brain endothelial cells using flow cytometry. Bio Protoc. , (2018).
  12. Nicolicht-Amorim, P., et al. Simple and efficient protocol to isolate and culture brain microvascular endothelial cells from newborn mice. Front Cell Neurosci. , (2022).
  13. Lee, K. H., Lee, D. W., Kang, B. C. The 3Rs principles in laboratory animal experiments. Lab Anim Res. , (2020).
  14. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington (DC). (2011).
  15. American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg (IL). (2020).
  16. Ruck, T., et al. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  17. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. , (2021).
  18. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  19. Carpentier, G., Berndt, S., Ferratge, S., Rasband, W., Cuendet, M., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". Sci Rep. , (2020).
  20. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. , (2024).
  21. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. , (2002).
  22. Liebner, S., Czupalla, C. J., Wolburg, H. Current concepts of blood-brain barrier development. Int J Dev Biol. , (2011).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. , (2010).
  24. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. , (2005).
  25. Rahman, N. A., Rasil, A. N. H. M., Meyding-Lamade, U., Craemer, E. M., Diah, S., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: a systematic review. Brain Res. , (2016).
  26. Wu, W. Z., Bai, Y. P. Endothelial GLUTs and vascular biology. Biomed Pharmacother. , (2023).
  27. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines (Basel). , (2021).
  28. Pusztaszeri, M. P., Seelentag, W., Bosman, F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. , (2006).
  29. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. , (2023).
  30. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: from physiology to disease and back. Physiol Rev. , (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

NeurowetenschappenEditie 233Editie 233Deze maand in JoVEEditiehersenendotheelcellenprimaire cultuurbloed-hersenbarrièrehersenangiogenese
Isolatie en kweek van microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.