Generatie en differentiatie van humane olfactorische epitelorganoïden uit volwassen stamcellen

Samenvatting

Dit protocol schetst een gevestigde aanpak om olfactorische voorlopercellen te isoleren uit volwassen menselijke superieure turbinateweefsel om olfactorische epitelorganoïden te genereren. Het beschrijft ook een chemische inductiestrategie om de differentiatie van deze organoïden tot volwassen, olfactorische sensorische neuronen te stimuleren, waardoor de modellering van menselijke olfactorische neurogenese mogelijk wordt.

Samenvatting

Het humane olfactorisch epitiheel bezit een opmerkelijke neurogene capaciteit, die wordt ondersteund door een residentiële populatie van basale stamcellen; Het is echter een uitdaging gebleken om een dynamisch in vitro model op te zetten dat dit regeneratieve proces getrouw reproduceert. Hier presenteren we een gevestigd protocol voor het genereren van olfactorische organoïden uit voorlopercellen geïsoleerd uit volwassen menselijke superieure turbinateweefsel. Deze organoïden behouden de stamheid, zoals blijkt uit SOX2-expressie, en vertonen een ruimtelijk georganiseerd differentiatiepatroon, gekenmerkt door uniforme expressie van de onvolwassen neuronale marker GAP43 en perifere lokalisatie van de rijpe olfactorische sensorische neuronmarker OMP. Latere gerichte differentiatie met de Notch-remmer LY411575, de Wnt-activator CHIR-99021 en retinoïnezuur genereerde marker-positieve olfactorische sensorische neuron-achtige cellen die OMP en de neuronale marker Tuj1 (klasse III β-tubuline) co-expresseerden. Dit door mensen afgeleide model omzeilt de beperkingen van muissystemen en biedt een robuust in vitro platform voor het bestuderen van olfactorische neurogenese, COVID-19-geassocieerde anosmie en andere olfactorische neurodegeneratieve aandoeningen.

Inleiding

Het humane reuksysteem ondersteunt continue neurogenese,1 een proces dat voornamelijk wordt aangedreven door basale stamcellen in het olfactorisch epitheel, specifiek horizontale basale cellen (HBC's) en bolvormige basale cellen (GBC's). ^2,3 GBC's differentiëren constitutief in olfactorische sensorische neuronen (OSN's), terwijl HBC's stil blijven tot ze door een letsel worden geactiveerd. ^4,5 Reukwaarneming begint wanneer geurmoleculen binden aan receptoren op de trilharen van OSN's, waardoor een signaaltransductiecascade wordt geactiveerd die informatie doorgeeft aan de reukbol en cortex. ⁶ De ontwikkeling en het onderhoud van deze sensorische functie worden bepaald door het olfactorisch epitheel.

Reukstoornissen veroorzaakt door fysieke, chemische of biologische beledigingen verdwijnen vaak spontaan. ⁷ Desalniettemin treft het 1,5% tot 25% van de wereldbevolking⁸ en kan het het gevolg zijn van diverse oorzaken, waaronder trauma, ⁹ infecties,10 en neurodegeneratieve aandoeningen zoals Alzheimer en de ziekte van Parkinson¹¹; In deze gevallen is spontane herstel vaak onvolledig of afwezig. Huidige therapeutische benaderingen, zoals olfactorische training en toediening van corticosteroïden, tonen beperkte effectiviteit. ^12,13 Deze therapeutische kloof komt voort uit een onvolledig begrip van de mechanismen die het overleven en regenereren van olfactorische neuroepitheel na een blessure, een kenniskloof die verder wordt verergerd door de ontoereikendheid van bestaande in vitro-modellen voor het bestuderen van de menselijke olfactorische biologie.

In de afgelopen jaren heeft de ontwikkeling van diverse menselijke organoïde modellen nieuwe technologische platforms gecreëerd voor het bestuderen van menselijke ziekten. ¹⁴ organoïden afkomstig van volwassen stamcellen (AdSC's), ook wel weefsel-residente stamcellen genoemd, zijn met succes gegenereerd voor een reeks endoderm-afgeleide weefsels, waaronder de maag, lever, alvleesklier, longen en blaas. 15,16,17,18,19 Daarentegen blijft het vestigen van menselijke olfactorische epitheelorganoïden uit de ectoderm-afgeleide olfactorische placode technisch uitdagend. Een grote praktische uitdaging is de moeilijkheid om consequent levensvatbaar olfactorisch epitheel te verkrijgen uit het menselijke bovenste neusschelp. De locatie en omvang van de reukzone verschillen aanzienlijk tussen individuen en ondergaan uitgesproken leeftijdsgebonden degeneratie. Onbedoelde verzameling van respiratoire in plaats van olfactorische epitheel benadeelt de kweekresultaten. Om dit aan te pakken, hebben we het protocol van 2021 verfijnd door Ren et al., die met succes celclusters uit humaan reukslijmvlies hebben ^gekweekt,20 om betrouwbaar humane olfactorische epitelorganoïden te genereren. Onze aanpak genereert menselijke olfactorische epitelorganoïden met een driedimensionale, hiërarchisch georganiseerde architectuur en ondersteunt hun differentiatie in olfactorische sensorische neuronen. Dit model biedt een waardevol experimenteel platform voor het onderzoeken van de mechanismen die het lot van olfactorische epitheliale stamcellen bepalen en voor het screenen van potentiële therapeutische middelen voor olfactorische stoornissen.

Om het expliciet samen te vatten: het primaire doel van deze methode is het opzetten van een gestandaardiseerde workflow voor het genereren en onderscheiden van humane olfactorische epitheelorganoïden uit volwassen voorlopercellen. De reden voor deze aanpak is om de kritieke kloof aan te pakken die ontstaat door het ontbreken van fysiologisch relevante in vitro modellen van het menselijk reuksysteem. In vergelijking met traditionele tweedimensionale (2D) monolaagculturen of muismodellen biedt dit driedimensionale (3D), door mensen afgeleide systeem het duidelijke voordeel dat het de complexe ruimtelijke organisatie en mensspecifieke genetische context van het reukslijmvlies getrouw recapituleert. Voor onderzoekers om dit protocol te overwegen, is het essentieel te erkennen dat het nauwkeurig isoleren van levensvatbaar reukepitheel uit het menselijke superieure neusschelp, zonder besmetting met het respiratoire epitheel te vermijden, uitzonderlijk uitdagend is en sterk wordt beïnvloed door de leeftijd van de patiënt en individuele anatomische variatie. Daarom is dit protocol bijzonder geschikt voor onderzoekers die consistente toegang hebben tot menselijke klinische monsters en proberen menselijke olfactorische neurogenese, virus-geïnduceerde anosmie of reuktekorten die geassocieerd worden met neurodegeneratieve aandoeningen te modelleren.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd met goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) van het West China Hospital van de Universiteit van Sichuan (Goedkeuringsnr. 2024 (31)). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemende patiënten voorafgaand aan weefselverzameling en publicatie van gegevens. Superieure turbinate weefselmonsters werden verkregen van patiënten die endoscopische schedelbasischirurgie of ethmoïd sinuschirurgie ondergingen voor cerebrospinaal vocht rhinorroe.

1. Verwerking en transport van weefselmonsters

1. Direct na de verzameling worden de weefselmonsters geplaatst in een voorgekoeld, steriel transportmedium, bestaande uit DMEM/F12/HEPES basaal medium aangevuld met 10% foetaal rundserum en 5% penicilline–streptomycine-oplossing, en ze naar het laboratorium vervoerd bij 4 °C.
   OPMERKING: Het serum helpt de levensvatbaarheid van de cel te behouden, terwijl het antibioticummengsel mogelijke microbiële besmetting tijdens de overdracht voorkomt. Houd de transporttijd onder de 2 uur om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.

2. Weefselvoorbewerking (uitgevoerd op ijs)

1. Breng het monster over in een voorgekoelde, steriele kweekschaal, verwijder het transportmedium en was het weefsel met een aangepaste PBS-buffer die 5% penicilline-streptomycineoplossing bevat. Voer de wasbeurt als volgt uit: voeg 5 ml voorgekoelde wasoplossing toe aan de schaal, tik voorzichtig 5–7 keer op het weefsel, en aspiraat dan de vloeistof volledig. Herhaal deze wascyclus drie keer om bloedcellen en weefselresten te verwijderen.
2. Met steriele microschaar snijd je het weefsel in fragmenten van ongeveer 1–2 mm³.
   OPMERKING: Tijdens deze stap houd je de hydratatie van het weefsel bij, zet je het vast met een stompe pincet en minimaliseer je de trimtijd om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.

3. Enzymatische vertering

1. Breng het mechanisch gedissocieerde weefsel over in een 15 mL centrifugebuis en voeg 3 mL voorverwarmde (37 °C) verbindingsverteringsbuffer toe (met 0,125% trypsine en 10 U/mL DNase I), waarbij een enzym-tot-weefselvolumeverhouding van 3:1 wordt gehandhaafd. Incubeer de buis in een 37 °C waterbad met zachte beweging gedurende 20 minuten. Controleer het monster elke 5 minuten om de voortgang van de vertering te monitoren en weefselklontering te voorkomen.
2. Stop de spijsvertering door een gelijke hoeveelheid afdringingsoplossing toe te voegen, DMEM/F12/HEPES basaal medium aangevuld met 10% foetaal rundserum. Pipetteer het mengsel voorzichtig 10 keer omhoog en omlaag om volledige menging en effectief contact tussen de enzymen en de remmende componenten te garanderen.
   OPMERKING: De α1-antitrypsine, aanwezig in het serum, neutraliseert efficiënt de trypsineactiviteit.

4. Bereiding van single-cell suspension

1. Plaats een 40 μm celzeef bovenop een 50 mL centrifugebuis. Met een afgeknipte pipettip van 1 mL breng je het verteerde weefsel en de vloeistof van de 15 mL buis over op de zef. Draai het materiaal op het filter voorzichtig met de pipettip om de doorgang te vergemakkelijken, en spoel daarna de zeef met een extra 1–2 mL afsluitoplossing. Zodra alle vloeistof door de zeef is gegaan, breng je het filtraat van de 50 mL buis over in een nieuwe 15 mL centrifugebuis.
2. Centrifugeer de suspensie op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Observeer de duidelijke celpellet onderin de buis en aspireer voorzichtig de supernatant, waarbij je ongeveer 100 μL overlaat om te voorkomen dat de celpellet wordt verstoord of verloren.

5. Vestiging van een driedimensionaal cultuursysteem

1. Zonder de celpellet opnieuw te suspenderen in kweekmedium, combineer je deze direct met Matrigel met behulp van een voorgekoelde, laagbindende pipettip om een precieze dichtheid van 10.000 cellen/μL te bereiken. Doseer 40 μL van dit cel–Matrigel-mengsel in elke put van een 24-put plaat en 20 μL in elke glazen confocale schaal. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 30 minuten zodat de matrigel kan polymeriseren en een driedimensionale steiger vormt.
2. Na de matrigel-stolling voeg je voorzichtig 500 μL serumvrij reuk-neurale stamcelkweekmedium toe langs de wand van de put om te voorkomen dat de gel wordt verstoord. Houd culturen in een bevochtigde incubator op 37 °C met 5% CO₂, waarbij het medium elke 3 dagen wordt vervangen door vers vooropgewarmd medium.
   OPMERKING: Het olfactorische neurale stamcelkweekmedium bestaat uit DMEM/F12/HEPES aangevuld met de volgende componenten: R-spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), een primair antimicrobieel agent (100 μg/mL), N2-supplement (1%), B27-supplement (2%) en L-glutamine (1%).

6. Passaging en differentiatie

1. Koel de organoïde hersteloplossing 10 minuten op ijs voor gebruik; aspireer het kweekmedium uit de putten en voeg vervolgens 1 ml ijskoude hersteloplossing toe aan elke put. Kantel de plaat naar een hoek van 45° en aspireer en doseer de oplossing voorzichtig 5–7 keer om organoïden uit de basale membraanmatrix te verwijderen en de resulterende suspensie over te brengen naar een 15 mL centrifugebuis. Incubeer de buis op ijs gedurende 3–5 minuten, centrifugeer dan bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en verwijder voorzichtig het supernatant, waarbij ongeveer 100 μL vloeistof overblijft om verlies van de pellet te voorkomen.
2. Voeg 1 mL organoïde dissociatie-reagens direct toe aan de celpellet en incubeer de buis bij 37 °C met zacht schudden bij 220 rpm gedurende 5 minuten. Beëindig onmiddellijk de vertering door een gelijke hoeveelheid Stop-oplossing toe te voegen en pipetteer het mengsel voorzichtig 5 keer omhoog en omlaag om homogeniteit te garanderen. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de gedissocieerde cellen te verzamelen.
3. Suspendeer de celpellet opnieuw in Matrigel met een volume van 40 μL per put voor 24-wellplaten of 20 μL per put voor glazen bodem confocale cultuurschotels; Meng grondig met een voorgekoelde, laagbindende pipettip om een uniforme suspensie te garanderen. Na het zaaien in de juiste borden of schalen, incubeer je de constructies bij 37 °C gedurende 30 minuten om matrigelpolymerisatie en de vorming van een driedimensionale steiger mogelijk te maken. Voeg vervolgens voorzichtig 500 μL gespecialiseerd serumvrij sferoidkweekmedium voor olfactorische neurale stamcellen toe langs de wanden van de put om verstoring van de gel te voorkomen. Houd culturen in een broedmachine bij 37 °C met 5% CO₂ en 95% relatieve luchtvochtigheid.
4. Ongeveer 7 dagen na het passeren, zodra de nieuwe generatie olfactorische epitheelorganoïden is hervormd tot sferoïden, aspireert men het expansiemedium uit de confocale schalen aan de glasbodem en vervangt het door differentiatiemedium. Vervang het differentiatiemedium elke 3 dagen door verse, voorverwarmde medium. Morfologisch onderscheiden reukneuronen worden meestal zichtbaar onder microscopie na ongeveer 7 dagen differentiatie.
   OPMERKING: Het differentiatiemedium bestaat uit DMEM/F12/HEPES aangevuld met R-Spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), LY411575 (5 μM), CHIR99021 (3 μM), retinoïnezuur (RA, 1 μM), een primaire antimicrobieel stof (100 μg/mL), N2-supplement (1%), B27-supplement (2%) en L-glutamine (1%).

7. Immunofluorescentie

1. Aspireer het kweekmedium en was de monsters voorzichtig één keer met 500 μL PBS. Verwijder de PBS, voeg dan 500 μL 4% paraformaldehyde toe en zet de monsters 15 minuten op kamertemperatuur. Aspireer en gooi het fixatief weg; daarna was je de vaste monsters met PBS (3 x 500 μL) en bewaar ze tot 48 uur bij 4 °C.
2. Aspirateer de PBS en voeg 500 μL permeabilisatieoplossing toe (0,2% Triton X-100 in PBS), incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur, aspireer en gooi de oplossing weg. Was de monsters met 0,02% PBST (0,02% Triton X-100 in PBS; 3 x 500 μL).
3. Voeg 500 μL blokkeringsoplossing toe (3% BSA in PBS) en incubeer 1 uur op kamertemperatuur.
4. Aspireer de blokkerende oplossing en vervang deze door 500 μL primaire antilichaamoplossing, bereid door het juiste primaire antilichaam (bijv. anti-GAP43 bij 1:160, anti-OMP bij 1:50 of anti-SOX2 bij 1:50) in blokkerende oplossing te verdunnen, en incubeer een nacht bij 4 °C. De volgende dag aspireer je de primaire antistofoplossing en was je de monsters met 0,02% PBST (3 x 500 μL).
5. Voeg 500 μL secundaire antilichaamoplossing toe, met een Alexa Fluor 488– of Alexa Fluor 555–geconjugeerd secundair antilichaam, verdund 1:500 in blokkerende oplossing, en incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur. Aspireer de secundaire antistofoplossing en voer extra washes uit met 0,02% PBST (3 x 500 μL).
6. Voeg 500 μL DAPI-werkoplossing toe (DAPI verdund in PBS) en incubeer in het donker gedurende 10 minuten om de kernen te kleuren. Aspireer de DAPI-oplossing en was de monsters met 0,02% PBST (3 x 500 μL). Bewaar de gekleurde monsters tot 48 uur bij 4 °C vóór beeldvorming.

8. Confocale microscopiebeeldvorming

1. Voer confocale microscopie uit met een Z-as van 1 μm voor organoïden met een diameter van ≤100 μm, en 0,5 μm voor organoïden groter dan 100 μm. Maakt beelden in multi-kanaals sequentiële modus, scannend in de volgende volgorde: DAPI, FITC, TRITC en Cy5. Importeer de verkregen Z-stack beeldsequentiebestanden in de 3D-renderingssoftware (bijv. Imaris). Gebruik de 3D-volumerenderingsfunctie om een compleet driedimensionaal model van de organoïde te genereren. Observeer dit gereconstrueerde model om de ruimtelijke verdeling van specifieke cellulaire markers (bijv. SOX2, GAP43 en OMP) te visualiseren en kwalitatief de hiërarchische architectuur en neuronale differentiatiestatus van de olfactorische epitelorganoïden als eindpunt te bevestigen.

Resultaten

Isolatie van olfactorisch epitheelweefsel en kweek van primaire olfactorische epitheelorganoïden
Om een kweeksysteem voor olfactorische epitheelorganoïden op te zetten, isoleerden we olfactorisch epitheel uit menselijk superieur turbinateweefsel en inbedden dit in een driedimensionale matrigelmatrix (Figuur 1). Voortbouwend op de door Ren et al. gerapporteerde gedefinieerde kweekomstandigheden, valideerden en verfijnden we de concentratie...

Discussie

Organoïden vormen een uniek in vitro-model omdat hun zelforganiserende, driedimensionale architectuur nauw overeenkomt met die van inheemse menselijke weefsels en in sommige gevallen histologisch niet te onderscheiden is van echte organen. ¹⁴ Het vaststellen van menselijke organoïdemodellen is daarom cruciaal voor het bestuderen van menselijke ziekten. Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een organoïde kweeksysteem uit primaire menselij...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ALEXA FLUOR 488 DONKEY	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEY	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP antibody	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 antibody	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 Supplement	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-glutamine supplement)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel (basement membrane matrix)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 Supplement	Gibco	17502048	1%
Organoid Dissociation Reagent	Precedo	PRS-ODR	/
Organoid Recovery Solution	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin (primary antimicrobial agent)	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
Recombinant Human EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
Recombinant Human Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
Retinoic acid	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM