Deze methode bestudeert hoe senescente huidfibroblasten gezonde fibroblasten beïnvloeden. Senescentie wordt geïnduceerd door UVB-blootstelling, en het geconditioneerde medium wordt toegepast op normale fibroblasten. Het helpt bij het evalueren van bioactieve verbindingen die gericht zijn op veranderde cel-tot-cel communicatie bij huidveroudering.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Nieuwe combinatie van antioxidanten om gezonde intercellulaire communicatie te herstellen in een in vitro model met behulp van een geconditioneerd medium uit senescente cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Huidveroudering is een multifactorieel proces dat wordt aangedreven door veranderingen op moleculair en cellulair niveau, ook wel kenmerkend voor veroudering genoemd. Een van deze veranderingen bestaat uit veranderde intercellulaire communicatie, wat bijdraagt aan huidweefseldisfunctie en structurele schade. Hier wordt een in vitro model gepresenteerd om deze huidverouderingskenmerken na te bootsen door gezonde fibroblasten te incuberen met een geconditioneerd medium uit senescente fibroblasten. Ten eerste kunnen UVB-bestraalde fibroblasten worden geanalyseerd op veranderingen in genexpressie die samenhangen met fotoveroudering. Ten tweede kan geconditioneerd medium van UVB-geïnduceerde senescente fibroblasten worden geoogst en overgedragen aan gezonde fibroblasten, wat leidt tot downregulatie van extracellulaire matrixeiwitten en upregulatie van pro-inflammatoire cytokine-genexpressie. Deze veranderingen worden tegengegaan door gebruik te maken van een nieuwe combinatie van antioxidanten (vitamine C + idebenon). Deze resultaten tonen aan dat het in vitro-model kan worden gebruikt om de effectiviteit van nieuwe verbindingen op huidhuidcellenverouderingskenmerken te beoordelen, en daarmee om verbindingen te selecteren die huidregeneratieve en verjongingscellulaire processen kunnen moduleren.
Inleiding
Huidveroudering is het natuurlijke proces van verminderde huidfuncties en -eigenschappen, waaronder verlies van stevigheid en elasticiteit en verhoogde doorhanging. Dit wordt versneld door externe factoren, zoals ultraviolet (UV) blootstelling en vervuiling, die cellen beschadigen en veranderingen op moleculair niveau1 veroorzaken. Deze veranderingen zijn goed gekarakteriseerd door recent onderzoek en geïdentificeerd als kenmerken van veroudering, waaronder genomische instabiliteit, telomeerafbraak, epigenetische veranderingen, verlies van proteostase, defecte macroautofagie, gedereguleerde voedingssensoren, mitochondriale disfunctie, cellulaire veroudering, stamceluitputting, veranderde intercellulaire communicatie, chronische ontsteking en dysbiose2. Deze kenmerken verklaren hoe subcellulaire schade zich vertaalt naar weefseldisfunctie, waardoor het verouderingsproces wordt bevorderd. Interessant genoeg werken deze veranderingen niet onafhankelijk, maar vormen ze een onderling afhankelijke netwerksignatur. Primaire schade, zoals genomische schade of epigenetische veranderingen, hoopt zich op en veroorzaakt uiteindelijk cellulaire senescentie. In het geval van de huid wordt dit voornamelijk veroorzaakt door UV-schade, waarbij fotoveroudering de belangrijkste bijdrage levert aan huidverouderingskenmerken3. Senescente cellen vertonen een verhoogde productie van pro-inflammatoire cytokinen, matrix metalloproteïnasen en groeifactoren, ook bekend als het senescence-associated secretory fenotype (SASP) en omvat IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA of IL1A, onder andere 4,5,6. Deze afgescheiden factoren beïnvloeden niet alleen de structurele eigenschappen van de huid, zoals de dermale extracellulaire matrix, maar verstoren ook de functie van omliggende cellen. Dit omvat de afgifte van cytokines die melanocytactivatie stimuleren om leeftijdsgebonden huidhyperpigmentatie (zoals Stamcelfactor of IL18) of andere schadelijke eiwitten te veroorzaken die de functie van omliggende gezonde fibroblasten veranderen, hun functie aantasten en bijdragen aan de verbeterde amplatie van het senescentie fenotype 7,8,9,10,11. Als gevolg hiervan zijn chronische ontstekingen en veranderde intercellulaire communicatie belangrijke promotoren van de schadelijke toestand die deze moleculaire veranderingen vertaalt naar visuele tekenen van huidveroudering, zoals rimpels, slappe huid, ouderdomsvlekken of verlies van stevigheid.
De specifieke eiwitbronnen van de schadelijke effecten van SASP kunnen worden bestudeerd met bekende technieken zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Luminex, quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) of Western Blot, onder andere 5,12. Deze benadering is echter nuttig om specifieke eiwitten vanuit individueel perspectief te identificeren en een specifiek werkingsmechanisme te karakteriseren, maar houdt geen rekening met de effecten van de volledige SASP op naburige cellen. Hier wordt een in vitro protocol voorgesteld om het effect te bestuderen van de SASP geproduceerd door door UVB geïnduceerde senescente dermale fibroblasten op gezonde naburige fibroblasten, waarmee het veranderde intercellulaire communicatiekenmerk van veroudering wordt nagebootst. Zoals eerder vermeld, is UV de belangrijkste oorzaak van celveroudering. UV-schade wordt daarom geselecteerd als bron van schade boven replicatieve of oncogene-geïnduceerde senescentie om het huidige model3 te bouwen. Hiervoor wordt het medium gebruikt dat de factoren bevat die door senescent fibroblasten worden uitgescheiden (geconditioneerd medium), en worden markers van celfunctie gekwantificeerd in gezonde fibroblasten die met dit medium zijn geïncubeerd. Onder dit protocol worden zodra het geconditioneerde medium is overgedragen van senescent naar gezonde cellen, UVB-geïnduceerde senescent fibroblasten geoogst om moleculaire kenmerken te kwantificeren, zoals genen die betrokken zijn bij pro-inflammatoire en paracriene signalering. Ten tweede worden gezonde fibroblasten behandeld met een geconditioneerd medium uit senescent fibroblasten geoogst om het effect van de SASP op naburige cellen te karakteriseren, waarbij genen worden gekwantificeerd die betrokken zijn bij extracellulaire matrix, groeifactoren en fibroblastactivatie. Zo wordt het effect van verbindingen van belang (COI) zowel aanvankelijk geanalyseerd in senescente fibroblasten als later in gezonde fibroblasten behandeld met het geconditioneerde medium. Wat betreft deze verbindingen heeft eerder onderzoek aangetoond dat antioxidanten effectief zijn in het beschermen tegen en corrigeren van tekenen van door fotoveroudering veroorzaakte huidveroudering. Daarom wordt de combinatie van twee antioxidanten (vitamine C en idebenon) gebruikt om sommige van de door UVB veroorzaakte veranderingen terug te draaien, zowel in senescente cellen als in gezonde cellen die geïncubeerd zijn met geconditioneerd medium uit senescente cellen 13,14,15
Al met al is dit protocol ontworpen om de effecten van SASP op huidcellen te bestuderen en nieuwe moleculen/interventies te identificeren die veranderde intercellulaire communicatie herstellen, waardoor ze geschikt zijn voor regeneratieve en biostimulerende producten in de esthetische geneeskunde en regeneratieve dermatologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Menselijke dermale fibroblasten die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van een commerciële cellijnaanbieder. Omdat er geen primaire menselijke monsters, patiëntgegevens of in vivo-experimenten betrokken waren, was goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) en geïnformeerde toestemming niet vereist voor deze studie.
1. Senescentie-inductie bij dermale fibroblasten met UVB
- Plaat menselijke dermale fibroblasten met een dichtheid van 6 × 104 cellen per put in een 6-well plaat met behulp van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% Fetaal Bovine Serum (FBS).
- Na 24 uur verwijder je het celkweekmedium en vervang je dit door 1 ml fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS) per put.
- Bestral de cellen met UVB-licht bij 25 mJ/cm2.
OPMERKING: Deze energie is geoptimaliseerd voor het UVB-bestralingsapparaat dat in dit protocol wordt gebruikt (zie Materiaaltabel) om voldoende schade te veroorzaken om veroudering te veroorzaken, terwijl overmatige schade die tot apoptose kan leiden wordt voorkomen. Bij gebruik van andere apparaten pas je de bestralingsenergie dienovereenkomstig aan.
VOORZICHTIG: UVB-straling is gevaarlijk. Gebruik geschikte beschermingsmiddelen en afscherming om blootstelling te voorkomen. - Verwijder PBS en voeg 2 ml vers celkweekmedium per put toe.
- Na 72 uur verwijder je het celkweekmedium, voeg je 1 ml PBS per put toe en herhaal je UVB-bestraling zoals beschreven in stap 1.3.
- Na 72 uur verwijder je het celkweekmedium en voeg 0,5 mL 0,05% trypsine-EDTA per put toe. Incubeer 1–2 minuten bij 37 °C, en oogst vervolgens de cellen met 1,5 mL vers celkweekmedium.
- Plat de cellen met een dichtheid van 8 × 104 cellen per put in een 6-well plaat met behulp van celkweekmedium (DMEM aangevuld met 10% FBS). Cellulaire senescentie wordt na deze stap geïnduceerd.
2. Behandeling van senescente cellen met interessante verbindingen
- Na 24 uur verwijder je het celkweekmedium en voeg je 2 ml celkweekmedium toe met interessante verbindingen.
- Na nog eens 24 uur wordt een aparte batch menselijke dermale fibroblasten (zoals beschreven in stap 1.1) in platen met 6 putjes geplunderd. Deze cellen dienen als gezonde dermale fibroblasten voor de overdracht van geconditioneerd medium.
3. Geconditioneerde mediumoverdracht van senescente cellen naar gezonde cellen
- 48 uur na de samengestelde behandeling van senescente cellen en 24 uur na het plateren van gezonde fibroblasten, verzamel 2 ml geconditioneerd medium per put van senescente cellen en geef dit over aan de gezonde fibroblasten.
OPMERKING: Verwijder het kweekmedium direct van gezonde fibroblasten voordat het geconditioneerd medium wordt toegevoegd om een efficiënte overdracht te garanderen. - Voeg 1 mL PBS toe aan de senescente cellen en oogst deze met trypsine zoals beschreven in stap 1.6. Gebruik deze cellen voor analyse van senescentie- of ontstekingsmarkers met behulp van een ELISA-kit of qPCR.
OPMERKING: Celpellets kunnen worden opgeslagen bij −80 °C als er niet direct stroomafwaartse assays worden uitgevoerd. - Incubeer gezonde fibroblasten met geconditioneerd medium bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 24 uur.
4. Gezonde cellen oogsten voor fibroblastactivatieanalyse door genexpressie-analyse
- Na 24 uur incubatie met geconditioneerd medium, oogst je gezonde fibroblasten met trypsine zoals beschreven in stap 1.6. Analyseer extracellulaire matrixgenexpressie met qPCR.
- Voer qPCR-analyse uit.
- Haal RNA uit celpellets volgens de instructies van de fabrikant (RNA-extractiekit).
- Voer reverse transcriptie uit van 200 ng RNA volgens de instructies van de fabrikant (reverse transcription kit).
- Amplify cDNA volgens de instructies van de fabrikant (qPCR master mix). Voer qPCR uit onder de volgende omstandigheden: 95 °C voor 30 seconden, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 5 seconden en 60 °C voor 30 seconden. De gebruikte primers zijn vermeld in Tabel 1.
| Gene | Vooron-sequentie | Omgekeerde volgorde |
| CDKN2A | 5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3' | 5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3' |
| CDKN1A | 5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3' | 5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3' |
| SCF | 5'-AATCCTCTCGTCAAAAACTGAAGG-3' | 5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3' |
| IL-18 | 5'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3' | 5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGCG-3' |
| ELN | 5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3' | 5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3' |
| FBN1 | 5'-GGTGAATGTACAACACACAGTCAGTCAGCAG-3' | 5'-ATAGGAACAGAGCACAGCTTGTTGA-3' |
| IL-6 | 5'-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3' | 5'-TCTGCCAGTGCCTCTTTGC-3' |
| IL-8 | 5'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGTGAAGGT-3' | 5'-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCT-3' |
| CTGF | 5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGGGTGTGTGT-3' | 5'-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3 |
| IGF1 | 5'-CAGAGACAGATAGAGCCTGCG-3' | 5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3' |
Tabel 1: Lijst van primers die worden gebruikt voor qPCR-assays. Voor elke primer worden voor- en achteruitsequenties gegeven die overeenkomen met de genen die in dit model zijn bestudeerd en gekwantificeerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het huidige protocol beschrijft een methode om het kenmerk van veroudering in vitro te simuleren door de veranderde intercellulaire communicatie. Figuur 1 toont een grafisch schema dat de belangrijkste stappen van het protocol illustreert, waaronder senescentie-inductie, markerkwantificatie en de analyse van veranderde intercellulaire communicatie in huidcellen in vitro.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het begrijpen van het verouderingsproces op moleculair niveau is essentieel voor het ontwerpen van nieuwe benaderingen en interventies die verouderingsgerelateerde kenmerken vertragen en de levensduur en functionaliteit van cellen en weefsels verlengen. De definitie en identificatie van de kenmerken van veroudering zijn essentieel geweest voor het opzetten van een wetenschappelijk kader voor de ontwikkeling van deze interventies 2,16
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs waren in dienst van Mesoestetic Pharma Group, S.L.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de medewerkers bedanken voor hun hulp en advies bij dit project.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 6-well plates | Fisher Scientific | 10578911 | Cell culture multiwell plates om te gebruiken tijdens de assay (senescentie-inductie en behandeling met verbindingen) |
| Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (UVB-bestralingsapparaat) | Vilber Lourmat | VL-6111-1090-1 | Apparaat dat wordt gebruikt om schade te veroorzaken door UVB-bestraling en bijgevolg senescentie te induceren |
| Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) | Merck Life science | D6046-500ML | Standaard celkweekmedium voor dermale fibroblasten |
| Foetaal bovien serum (FBS) | Fisher Scientific | 17593595 | Nutrientensupplement dat wordt gebruikt als bron van groeifactoren, hormonen, eiwitten en essentiële micronutriënten voor celgroei |
| H3K27me3 ELISA-kit | Epigentek | P-3014T-096 | Een specifieke immunoassay om de epigenetische modificatie van H3K27me3 in biologische monsters te detecteren |
| Menselijke dermale fibroblasten | Promocell | C-12302 | Hoofdhuidcellen in de dermis en regulator van huidveroudering door fotobelichting |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | Merck Life science | D8537-500ML | Bufferoplossing die het fysiologische milieu nabootst. Wordt gebruikt om cellen te wassen zonder stress te veroorzaken of de celviabiliteit te verminderen |
| PrimeScript RT-reagenskit (omkeertranscriptiekit) | Takara Bio | RR037A | De kit om cDNA te verkrijgen uit RNA geïsoleerd uit cellen. 2e stap voor qPCR-assay na RNA-zuivering. |
| TB Green Premix Ex Taq (qPCR-mastermix) | Takara Bio | RR420A | De kit om de polymerasekettingreactie te produceren van cDNA om genexpressieniveaus te kwantificeren. 3e stap voor qPCR-assay na omgekeerde transcriptie. |
| Totale RNA-zuiveringskit (RNA-extractiekit) | Norgen | 17200 | De kit om RNA te verkrijgen uit geoogste cellen. 1e stap voor qPCR-assay na celoogst. |
| Trypsine/EDTA 0,05% | Merck Life science | T2601-100ML | Enzymoplossing die wordt gebruikt bij het oogsten/doorvoeren van stappen voor celdetachering van celkweekplaten |
Referenties
- Chaudhary, M., Khan, A., Gupta, M. Skin ageing: Pathophysiology and current market treatment approaches. Curr Aging Sci. 13 (1), 22-30 (2020).
- López-Otín, C., et al. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
- Razzaghi, Z., Ahmadzadeh, A. Examination of the biological effects of sunlight on the skin: a review. J Lasers Med Sci. 16, e52 (2025).
- He, R., et al. Hallmarks of the aging skin microenvironment: components and mechanisms. J Cell Physiol. 240 (11), e70111 (2025).
- Karras, A., et al. Measuring the senescence-associated secretory phenotype. Biomedicines. 13 (9), 2451 (2025).
- Chin, T., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
- Yuan, X. H., Jin, Z. H. Paracrine regulation of melanogenesis. Br J Dermatol. 178 (3), 632-639 (2018).
- Fullard, N., et al. Cell senescence-independent changes of human skin fibroblasts with age. Cells. 13 (8), 662 (2024).
- Hachiya, A., et al. The paracrine role of stem cell factor/c-kit signaling in the activation of human melanocytes in ultraviolet-B-induced pigmentation. J Invest Dermatol. 116 (4), 578-586 (2001).
- Kovacs, D., et al. Role of fibroblast-derived growth factors in regulating hyperpigmentation of solar lentigo. Br J Dermatol. 163 (5), 1020-1027 (2010).
- Kim, M., et al. Ultraviolet-irradiated endothelial cells secrete stem cell factor and induce epidermal pigmentation. Sci Rep. 8 (1), 4235 (2018).
- Lee, Y. H., et al. Identification of senescence rejuvenation mechanism of Magnolia officinalis extract including honokiol as a core ingredient. Aging. 17 (2), 497-523 (2025).
- Pandel, R., Poljšak, B., Godic, A., Dahmane, R. Skin photoaging and the role of antioxidants in its prevention. ISRN Dermatol. 2013, 1-11 (2013).
- McDaniel, D. H., et al. Clinical efficacy assessment in photodamaged skin of 0.5% and 1.0% idebenone. J Cosmet Dermatol. 4 (3), 167-173 (2005).
- Farris, P. K. Topical vitamin C: a useful agent for treating photoaging and other dermatologic conditions. Dermatol Surg. 31 (7 Pt 2), 814-817 (2005).
- López-Otín, C., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Sjerobabski-Masnec, I., Situm, M. Skin aging. Acta Clin Croat. 49 (4), 515-518 (2010).
- Ganguly, B., Hota, M., Pradhan, J. Skin aging: implications of UV radiation, reactive oxygen species and natural antioxidants. Skin Aging. , (2022).
- Ito, T., et al. Regulation of cellular senescence by polycomb chromatin modifiers through distinct DNA damage- and histone methylation-dependent pathways. Cell Rep. 22 (13), 3480-3492 (2018).
- Sen, P., Shah, P. P., Nativio, R., Berger, S. L. Epigenetic mechanisms of longevity and aging. Cell. 166 (4), 822-839 (2016).
- Cencioni, C., et al. Aging Triggers H3K27 Trimethylation Hoarding in the Chromatin of Nothobranchius furzeri Skeletal Muscle. Cells. 8 (10), 1269 (2019).
- Ma, Z., et al. Epigenetic drift of H3K27me3 in aging links glycolysis to healthy longevity in Drosophila. eLife. 7, e35368 (2018).
- Martinez-Gutierrez, A., et al. Hyaluronic and Succinic Acid: new biostimulating combination to counteract dermal and subcutaneous aging. Int J Mol Sci. 26 (15), 7548 (2025).
- Park, S., et al. Senotherapeutic potential of araliadiol in senescent human dermal fibroblasts: an in vitro study using three senescence models. Pharmaceutics. 17 (12), 1560 (2025).
- Waldera Lupa, D. M., et al. Characterization of skin aging–associated secreted proteins (SAASP) produced by dermal fibroblasts isolated from intrinsically aged human skin. J Invest Dermatol. 135 (8), 1954-1968 (2015).
- Boismal, F., et al. Proteomic and secretomic comparison of young and aged dermal fibroblasts highlights cytoskeleton as a key component during aging. Aging. 16 (16), 11776-11795 (2024).
- Abdul Ghani, N. I., et al. Effect of different collection times of dermal fibroblast conditioned medium (DFCM) on in vitro re-epithelialisation process. Biomedicines. 10 (12), 3203 (2022).
- Chowdhury, S. R., Aminuddin, B. S., Ruszymah, B. H. I. Effect of supplementation of dermal fibroblasts conditioned medium on expansion of keratinocytes through enhancing attachment. Indian J Exp Biol. 50 (5), 332-339 (2012).
- Ohgo, S., et al. Senescent dermal fibroblasts enhance stem cell migration through CCL2/CCR2 axis. Exp Dermatol. 24 (7), 552-554 (2015).
- Malaquin, N., et al. Senescent fibroblasts enhance early skin carcinogenic events via a paracrine MMP-PAR-1 axis. PLoS One. 8 (5), e63607 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
