Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie onderzoekt het effect van intrathecaal toegediende propentofylline op het verminderen van incisie-hyperalgesie en of dit effect geassocieerd is met veranderingen in spinale gliale markers en in de fosforylering van extracellular signal-regulated kinase 1 en 2 bij ratten.
Spinale astrocyten, microglia en extracellulaire signaal-gereguleerde kinase 1 en 2 (ERK1/2) zijn betrokken bij de pijnverwerking. Deze studie onderzocht of preoperatieve intrathecale propentofylline (PPF) acute incisie-hyperalgesie bij ratten vermindert en of dit effect geassocieerd is met spinale gliale markers en ERK1/2-fosforylering. Zesenzestig mannelijke Sprague–Dawley ratten werden willekeurig toegewezen aan groepen voor blanco, incisiepijn, normale zoutoplossing, dimethylsulfoxide, PPF en U0126. Mechanische en thermische hyperalgesie werden beoordeeld bij de baseline en 2, 4, 8, 24 en 72 u na de incisie. Spinale neuronale en gliale markers, p-ERK1/2 en inflammatoire mediatoren werden geëvalueerd via Western blotting en immunofluorescentie. Daarnaast werden experimenten met primaire spinale astrocyten gebruikt om de ERK1/2-afhankelijke afgifte van inflammatoire mediatoren te onderzoeken. Preoperatieve intrathecale PPF verminderde de mechanische en thermische hyperalgesie gedurende de gehele observatieperiode van 72 u, terwijl U0126 hyperalgesie vooral verminderde tijdens de vroege post-incisieperiode. 4 u na de incisie waren beide behandelingen geassocieerd met een verminderde spinale expressie van GFAP, Iba-1 en p-ERK1/2 en een verminderde immunoreactiviteit van TNF-α en COX-2. In gekweekte astrocyten verminderde PPF de LPS-geïnduceerde afgifte van inflammatoire mediatoren, terwijl constitutief actieve ERK1/2 dit effect tegenging. Deze bevindingen ondersteunen een associatie tussen het antihyperalgesische effect van PPF en de modulatie van spinale gliale, ERK1/2-gerelateerde en inflammatoire responsen na een incisie.
Incisiepijn, een veelvoorkomende vorm van acute pijn na chirurgische ingrepen, houdt over het algemeen niet langer dan 7 dagen aan, maar heeft complexe pathologische mechanismen die verschillen van die van inflammatoire en neuropathische pijn1,2. Indien incisiepijn tijdens de ontwikkeling onvoldoende wordt beheerst, kan dit verder progresseren tot een chronisch pijnsyndroom, waarbij het karakter kan verschuiven van acute weefselschadepijn naar neuropathische of gemengde pijn3. Over het algemeen is het toedienen van analgetica, zoals opioïden en niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen, de meest gebruikelijke vorm van analgesie na een incisie. Er kunnen echter veel bijwerkingen optreden bij continu of hooggedoseerd gebruik hiervan, een omstandigheid die de noodzaak van veiligere en effectievere analgesiestrategieën benadrukt.
Betrouwbaar bewijs geeft aan dat propentofylline (PPF) hyperalgesie bij verschillende pijnprocessen verlicht4,5. Bovendien kan het analgeserend effect van PPF gedeeltelijk worden bereikt door de spinale expressie van mitogeen-geactiveerde proteïnekinasen (MAPK's), zoals p38 en c-Jun N-terminale kinasen (JNK's), te remmen6. Hoewel de effecten van PPF op p38- en JNK-paden zijn vastgesteld, blijft de potentiële modulatie van het extracellulaire signaal-gereguleerde kinase 1 en 2 (ERK1/2)-pad, een andere kritieke MAPK-subfamilie betrokken bij pijnsignalering, onontdekt bij acute incisiepijn. Deze kennishiaat is bijzonder belangrijk, aangezien de activering van ERK1/2 duidelijk andere temporele en cellulaire patronen vertoont in vergelijking met p38 en JNK, wat wijst op potentiële unieke therapeutische mogelijkheden.
Gliale cellen, waaronder astrocyten, microglia en oligodendrocyten, werden aanvankelijk beschouwd als de verbindende en ondersteunende structuur van zenuwweefsel. Recente studies hebben echter aangetoond dat astrocyten en microglia een belangrijke rol spelen bij het reguleren van synaptische plasticiteit en het overbrengen van pijninformatie7. Als de residente macrofagen van de hersenen en het ruggenmerg kunnen microglia in een zeer vroeg stadium van het pijnproces worden geactiveerd door verschillende extracellulaire stimulussignalen, waarna ze prolifereren en grote hoeveelheden inflammatoire cytokinen afgeven, wat de geleiding van pijnsignalen van het ruggenmerg naar de hersenen versterkt8,9. Tegelijkertijd kunnen geactiveerde astrocyten de afgifte van de excitatoire neurotransmitter glutamaat opreguleren en informatie direct naar sensorische neuronen sturen door de intercellulaire communicatie te verbeteren10.
Studies hebben aangetoond dat astrocytenactivatie optreedt in de vroege fase (binnen de eerste 24 u) van incisie-geïnduceerde pijn, terwijl microgliactivatie veel later optreedt11,12. Daarnaast wees een studie erop dat geactiveerde microglia een beperkt effect hebben op mechanische hyperalgesie bij incisie-geïnduceerde pijn13. Deze bevindingen benadrukken de aanhoudende vragen over de verschillende rollen van astrocyten en microglia bij acute pijn. Propentofylline, een glia-modulerend middel, zou hyperalgesie verlichten door de activatie van astrocyten en microglia te reguleren na chronische zenuwconstrictie-letsels, acute zenuwletsels en acute weefselletsels4,5. Voor zover bekend is er echter geen enkele studie uitgevoerd naar de effecten van PPF op de activatie van astrocyten of microglia bij acute incisie-geïnduceerde pijn.
Extracellulaire signaalgereguleerde kinase 1 en 2, een belangrijke MAPK-subfamilie die stroomafwaarts van mitogeengestuurde proteïnekinase 1 en 2 (MEK1/2) wordt geactiveerd, zijn in grote mate betrokken bij nociceptieve verwerking en neuronale plasticiteit14,15. Eerdere studies hebben aangetoond dat fosfo-ERK1/2 (p-ERK1/2) in spinale neuronen kan worden geïnduceerd door nociceptieve stimulatie en ook kan worden aangetroffen in astrocyten en microglia bij inflammatoire of neuropathische pijntoestanden16,17,18,19. Daarnaast is gerapporteerd dat de farmacologische remming van MEK1/2–ERK1/2-signalering mechanische en thermische hyperalgesie vermindert in verschillende pijnmodellen20,21,22,23,24,25.
De cellulaire distributie van spinale ERK1/2, met name in astrocyten en microglia, geactiveerd door een acute incisie en de rol hiervan bij incisie-geïnduceerde pijn, is echter nog onvoldoende gedefinieerd. Eerdere studies van de onderzoeksgroep wijzen erop dat PPF acute incisonale hyperalgesie bij ratten verlicht door spinale JNK- en p38-signalering te verminderen, maar het blijft onduidelijk of PPF ook de ERK1/2-gerelateerde signalering in spinale gliacellen moduleert tijdens incisie-geïnduceerde pijn. De huidige studie moet daarom worden beschouwd als een uitbreiding van de bestaande kaders betreffende glia en MAPK in pijnonderzoek, in plaats van als een volledig onafhankelijk mechanistisch paradigma. Het belangrijkste onderscheid met eerder werk ligt in de specifieke focus op acute incisonale pijn, het onderzoek naar ERK1/2 in plaats van p38/JNK als de relevante MAPK-component, en de evaluatie van de vroege spinale cellulaire distributie van p-ERK1/2 in relatie tot de behandeling met PPF.
Deze studie was ontworpen om te onderzoeken of preoperatieve intrathecale toediening van PPF incisuele hyperalgesie vermindert in een rattenmodel van een plantaire incisie, en of dit effect geassocieerd is met ERK1/2-fosforylering of veranderingen in de expressie van spinale neuronale en gliale markers en inflammatoire mediatoren, tumornecrosefactor-α (TNF-α) en cyclo-oxygenase-2 (COX-2). Meer specifiek verschilt deze studie van eerdere rapporten door de combinatie van gedragsbeoordeling met temporele Western blot-analyse; de farmacologische vergelijking met de MEK1/2-remmer U0126; en de kwalitatieve immunofluorescentie-lokalisatie van p-ERK1/2 in spinale neuronen, astrocyten en microglia binnen een acuut incisueel pijnmodel. Hoewel het mechanistische kader voortbouwt op eerdere literatuur die gliale modulatie en MAPK-signalering koppelt aan pijn, is het huidige werk bedoeld om aanvullend bewijs te leveren voor de mogelijke betrokkenheid van spinale ERK1/2-gerelateerde gliale responsen in de vroege fase van incisuele hyperalgesie.
In vergelijking met conventionele postoperatieve analgetica kunnen benaderingen die zich richten op specifieke signaalroutes een gedefinieerde signaleringscomponent testen, maar ze bieden mogelijk slechts een tijdelijk voordeel en kunnen een invasieve toediening vereisen; MEK1/2–ERK1/2-remming heeft antihyperalgetische effecten getoond in verschillende experimentele pijnmodellen20,21,22,23,24,25. PPF verschilt van een remmer van een enkele signaalroute omdat het gliale responsen moduleert en is gekoppeld aan meer dan één MAPK-geassocieerd proces4,5,6. De praktische vertaling blijft beperkt door het preklinische ontwerp, de preoperatieve intrathecale toediening, het uitsluitend gebruik van mannelijke ratten en het ontbreken van dosisonderzoeken en veiligheidsstudies in grotere chirurgische modellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De uitgevoerde experimenten zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Second Affiliated Hospital, Lanzhou University, provincie Gansu, China (ethische goedkeuring nr. 2017-070). Alle procedures volgden de richtlijnen van de International Association for the Study of Pain26. In totaal werden 66 volwassen mannelijke Sprague–Dawley ratten gebruikt, verkregen van een geaccrediteerd laboratoriumcentrum voor dieren en met een gewicht van 200–250 g. Alleen mannelijke ratten zijn in deze studie opgenomen om potentiële variabiliteit gerelateerd aan sekse-afhankelijke hormonale invloeden te verminderen. Alle protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de International Association for the Study of Pain26, en er zijn de nodige maatregelen genomen om lijden te minimaliseren. Gedetailleerde informatie over de reagentia, verbruiksartikelen, instrumenten en software die in deze studie zijn gebruikt, wordt gegeven in de Tabel met Materialen.
Dieren
De ratten werden vóór de operatie in paren gehuisvest en na de incisie individueel, met voedsel en water ad libitum. De ruimte werd gehouden in een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker, met een gecontroleerde temperatuur van 24 °C ± 2 °C.
Intrathecale injectie en incisiespijnmodel
Voor de intrathecale toediening van oplossingen werden ratten geanestheseerd met 1,5%–3% sevofluraan (toegediend via een neusconus) en in buikligging geplaatst met de wervelkolom in een gebogen positie. De vacht over de lumbale regio werd geschoren en de huid over de L5–L6 intervertebrale ruimte werd gedesinfecteerd. Een microspuit werd percutaan ingebracht in de L5–L6 intervertebrale ruimte. Succesvolle toegang tot de subarachnoïdale ruimte werd aangegeven door een plotselinge staartreflex of staartbeweging tijdens het invoeren van de naald en werd verder bevestigd door het verschijnen van cerebrospinale vloeistof bij voorzichtig aspireren. Indien deze tekenen niet werden waargenomen, werd de positie van de naald aangepast vóór de injectie. De injectie werd pas uitgevoerd nadat aan beide bevestigingscriteria was voldaan, en dieren die na de injectie abnormale neurologische tekenen vertoonden, werden uitgesloten. De betreffende oplossing werd vervolgens langzaam geïnjecteerd en de huid werd na de injectie opnieuw gereinigd. De chirurgische procedure duurde ongeveer 3 min en de ratten herstelden over het algemeen binnen 5–10 min van de anesthesie.
Het ratmodel voor incisiepijn werd vastgesteld zoals eerder beschreven27. Na anesthesie werd het plantaire oppervlak van de achterpoot gedesinfecteerd met 10% povidonjodium. Er werd een longitudinale incisie van 1 cm gemaakt in de plantaire huid, beginnend op ongeveer 0,5 cm van de hiel en uitbreidend in de richting van de tenen. De incisie penetreerde de huid en fascia. De plantaire spier werd voorzichtig opgetild met oogpincetten en longitudinaal ingesneden, waarbij de algehele weefselcontinuïteit behouden bleef. De spier werd vervolgens teruggeplaatst, er werd lichte druk uitgeoefend om hemostase te bereiken en de wond werd gesloten met twee matrashechtingen met 3-0 nylon. Na sluiting van de wond werd de incisieplaats opnieuw gedesinfecteerd. Na de operatie werden de ratten individueel gehuisvest en mochten ze herstellen in een rustige, warme omgeving, beschermd tegen sterk licht en met vrije toegang tot voedsel en water. De dieren werden postoperatief gemonitord en dieren die niet voldeden aan de vooraf gedefinieerde criteria werden prompt uitgesloten. Wondinfectie werd bepaald op basis van roodheid, zwelling en verhoogde lokale temperatuur rond de wond, abnormaal geelgroen purulent exsudaat met een onaangename geur, vertraagde wondgenezing met aanhoudende wondopening, necrose en vergroting, en systemische tekenen zoals verhoogde lichaamstemperatuur, lethargie en weigering om te eten. Aanvullende uitsluitingscriteria waren het niet herstellen van de anesthesie binnen 30 min, intraoperatieve spiertransectie of neurovasculaire beschadiging, postoperatieve zelfverminking, het niet lukken van de modelvestiging en neurologische defecten, zoals verlamming van de achterpoot of onvermogen om gewicht te dragen dat niet gerelateerd was aan de incisiepijn. Ratten met een wondinfectie of wonddehiscentie werden uitgesloten van de studie.
Gedragsmeting
De mechanische drempel voor pootterugtrekking (PWMT) en de thermische latentietijd voor pootterugtrekking (PWTL) werden gemeten door een onderzoeker die niet op de hoogte was van de groepsindeling. De tests werden uitgevoerd in een stille kamer op een consistent tijdstip van de dag na ten minste 10 min acclimatisatie; de kooi, de bodem van gaas of glas, het omgevingslicht en de intensiteit van de warmtebron werden voor alle groepen constant gehouden. Voor de PWMT-meting werden gekalibreerde von Frey-filamenten (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g en 15.0 g) loodrecht aangebracht op het plantaire oppervlak naast de wond totdat het filament ongeveer 1–2 mm boog. Opeenvolgende stimulaties werden gescheiden door 2 min, en de 50% PWMT werd bepaald met de up-and-down methode28. Voor de PWTL-meting werden ratten in individuele transparante kooien op een glazen bodem geplaatst, waarbij de stralingswarmtebron werd uitgelijnd met het plantaire oppervlak naast de wond. Een cut-off van 30 s voorkwam weefselschade, opeenvolgende blootstellingen werden gescheiden door 2 min en het gemiddelde van drie metingen werd geregistreerd29. Het optillen, schudden of likken van de poot werd beschouwd als een positieve terugtrekkingsrespons; tests die beïnvloed werden door verzorgingsgedrag, voortbeweging of verlies van uitlijning met de warmtebron werden na hernieuwde acclimatisatie herhaald.
Western blot-analyse
Op de vooraf vastgestelde tijdstippen werden de ratten geëuthanaseerd door middel van cervicale dislocatie en werd het L4–L6 lumbale ruggenmerg snel geoogst in radioimmunoprecipitatie-assay lysisbuffer, aangevuld met protease-inhibitor in een verhouding van 100:1. Het weefsel werd gehomogeniseerd, 20 min op ijs bewaard en gecentrifugeerd bij 15.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C. De supernatant werd gemengd met 4× laadbuffer in een verhouding van 3:1, 5 min verhit in kokend water en bewaard bij −80 °C. Eiwitmonsters (30 µg per lane) werden gescheiden op 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegels en overgebracht op 0,45 of 0,22 µm polyvinylideenfluoride-membranen. De succesvolle overdracht werd gecontroleerd door de verwachte migratie van de voorgekleurde molecuulgewichtmarker te bevestigen en het ontbreken van duidelijke ongelijkmatige of onderbroken overdrachtsgebieden vast te stellen. Membranen werden 2 u bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk en 3% runderserumalbumine en overnacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) of GAPDH (1:2.000). Na het wassen in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween 20 (pH 7,4) werden de membranen 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met het overeenkomstige met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichaam (1:5.000). Signalen werden ontwikkeld met verbeterde chemiluminescentie en op film vastgelegd met hetzelfde belichtingsbereik binnen elk doelwit. Een onderzoeker die blind was voor de groepsindeling analyseerde de bandendichtheid met beeldanalyse-software. De afbeeldingen werden omgezet naar 8-bits grijswaarden, voor elke band werd een identiek rechthoekig interessegebied (region of interest) toegepast, de lokale achtergrond van een aangrenzend leeg gebied werd afgetrokken en de geïntegreerde dichtheid werd vastgelegd. Dezelfde grootte van het gebied en dezelfde achtergrondprocedure werden gebruikt voor alle lanes op een blot. NeuN, GFAP, Iba-1 en t-ERK1/2 werden genormaliseerd naar GAPDH; p-ERK1/2 werd genormaliseerd naar t-ERK1/2; en de waarden werden vervolgens uitgedrukt relatief ten opzichte van de blanco groep.
Immunofluorescentie
Op de vooraf vastgestelde tijdstippen werden de ratten geanestheseerd met 3% pentobarbitalnatrium (1,5 mL/kg) en via het hart geperfundeerd met 300 mL vorgekoelde 0,01 mol/L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4), gevolgd door 250 mL vorgekoelde 4% paraformaldehyde. Het ruggenmerg op niveau L4–L6 werd gedurende 6 u nagesfixeerd in 4% paraformaldehyde, gedurende de nacht cryoprotectief behandeld in 20%–30% sucrose–PBS bij 4 °C en bij −22 °C gesneden in secties van 10 µm. De secties werden gewassen in 0,01 mol/L PBS, gedurende 1 u bij kamertemperatuur geblokkeerd in 10% geitenserum en gedurende de nacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) of COX-2 (1:50). Na drie wasbeurten met PBS werden de secties gedurende 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met het overeenkomstige met een groene- of rood-fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichaam (1:400), nog drie keer gewassen in PBS en gemonteerd met antifade-medium en een dekglas. In elke kleuringsserie werden negatieve controlesecties opgenomen die zonder primair antilichaam waren verwerkt. De beelden werden door een geblindeerde onderzoeker vastgelegd met een fluorescentiemicroscoop. Overzichtsfoto's bij lage vergroting werden gemaakt met een 10× objectief, terwijl beelden van cellulaire immunoreactiviteit en colocalisatie werden gemaakt met 20× of 40× objectieven, afhankelijk van het betreffende figuurpaneel. Voor vergelijkingen binnen dezelfde figuur en kleuringsserie werden de objectiefvergroting, verlichtingsintensiteit, belichtingstijd, detectorgain, camera-instellingen en beeldbewerkingsparameters gefixeerd na optimalisatie onder de verzadigingsgrens. Afzonderlijke fluorescentiekanalen werden sequentieel vastgelegd om kanaaloverlap te minimaliseren. Per dier werden drie niet-overlappende velden in de ipsilaterale dorsale hoorn vastgelegd. De fluorescentie-intensiteit werd gekwantificeerd met beeldanalyse-software na 8-bit conversie, achtergrondsubtractie met behulp van een celvrije regio en toepassing van een identiek region of interest en drempelwaarde binnen elke kleuringsserie; de veldwaarden werden gemiddeld om één waarde per dier te verkrijgen. Velden met overbelichting, weefselvouwing, scheuren, slechte focus of een ongelijkmatige achtergrond werden uitgesloten en opnieuw vastgelegd onder dezelfde niet-verzadigende instellingen. De kleuring werd geaccepteerd wanneer de weefselarchitectuur intact was, het doelsignaal de controle zonder primair antilichaam overtrof en er geen grote vouw, scheur of verzadigd gebied de analyse beïnvloedde.
In vitro experimenten met primaire spinale astrocyten
Primaire astrocyten uit het ruggenmerg van ratten werden gekweekt onder standaard steriele omstandigheden in volledig kweekmedium bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2 incubator. Cellen werden gebruikt wanneer zij een confluentie van ongeveer 70%–80% bereikten en werden toegewezen aan de controle-, LPS-gestimuleerde, LPS + PPF, LPS + U0126 en ERK1/2-rescue-groepen. PPF en U0126 werden toegevoegd in een concentratie van 10 µM. De condities voor LPS-stimulatie, drugbehandeling en oogsten werden identiek gehouden voor parallelle wells binnen elk experiment. Voor de analyse van de pad-selectiviteit werden cellysaten verzameld voor Western blotting van p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, totaal p38, p-JNK, totaal JNK en de overeenkomstige loading control. Kweeksupernatanten van parallelle wells werden verzameld, geklaard door centrifugatie en geanalyseerd op TNF-α, PGE2 en IL-6 middels een enzyme-linked immunosorbent assay volgens de instructies van de fabrikant. De densitometrie van de Western blots volgde dezelfde principes voor beeldanalyse als hierboven beschreven. Voor de rescue-experimenten werd endogeen ERK1/2 onderdrukt door siRNA-transfectie, en een constitutief actief ERK1/2 (CA-ERK1/2) expressieconstruct werd geïntroduceerd voorafgaand aan de behandeling. De efficiëntie van de knockdown en overexpressie werd bevestigd via Western blotting voordat de cytokinedata werden geïnterpreteerd. Cellen die waren blootgesteld aan het transfectiereagens zonder actief siRNA of construct dienden, indien van toepassing, als procedurele controles.
Experimenteel ontwerp
Indeling van experimentele dieren in subgroepen
De ratten werden met behulp van een methode met een willekeurige getallentabel toegewezen aan zes groepen, en de groepsindeling werd voltooid vóór de gedragstests en de weefselverzameling. De zes groepen bestonden uit een blanco groep (n = 6), een incisiepijn-groep (IP) (n = 18), een normale zoutoplossing-groep (NS) (0,9% NS, 10 µL; n = 9), een PPF-groep (10 µg in 10 µL; n = 12), een dimethylsulfoxide-groep (DMSO) (10% DMSO, 10 µL; n = 9) en een U0126-groep (10 µg in 10 µL; n = 12). Ratten in de blanco groep kregen noch een plantaire incisie noch een intrathecale injectie en dienden als onbehandelde controles. Ratten in de IP-groep ondergingen een plantaire incisie zonder voorbehandeling via intrathecale injectie. Ratten in de NS-, PPF-, DMSO- en U0126-groepen kregen 30 min vóór de plantaire incisie een intrathecale toediening van hun respectievelijke middelen. De NS-groep diende als vehikelcontrole voor PPF, terwijl de DMSO-groep diende als vehikelcontrole voor U0126.
Doses van propentofylline en U0126
Propentofylline is een gliale modulator, en een dosis van 10 µg werd gekozen omdat deze in eerdere studies door de onderzoeksgroep acute hyperalgesie had verlicht. U0126 is een niet-adenosinetrifosfaat-competitieve MEK1/2-remmer die wordt gebruikt om de fosforylering van ERK1/2 te blokkeren. Effectieve intrathecale doses van 1–10 µg zijn gerapporteerd in diverse pijnmodellen30,31,32; in de huidige studie werd de dosis van 10 µg gebruikt. U0126 werd opgelost in 10% dimethylsulfoxide, terwijl PPF werd opgelost in 0,9% normale zoutoplossing. De uiteindelijke concentraties waren 1 µg/µL. De geneesmiddelen en dragers werden voor de operatie bereid, bewaard bij 4 °C en binnen 12 u gebruikt.
Effect van de preoperatieve intrathecale toediening van propentofylline of U0126 op hyperalgesie
Zes ratten uit elke groep werden willekeurig geselecteerd voor gedragsmetingen 24 u vóór de operatie, en de resulterende PWMT's en PWTL's werden als baseline aangemerkt. Intrathecale injecties werden 30 min vóór de operatie toegediend. Om de effecten van de preoperatieve intrathecale toediening van PPF en U0126 op mechanische en thermische hyperalgesie te beoordelen, werden PWMT en PWTL gemeten op 2 u, 4 u, 8 u, 24 u en 72 u na de incisie.
Experimenteel ontwerp voor het evalueren van de effecten van preoperatief intrathecaal toegediende propentofylline of U0126 op de expressie van spinale neuronale en gliale markers na incisie
Om het geschikte tijdstip na de incisie te bepalen voor de beoordeling van het behandelingseffect, werd eerst een voorlopige tijdreeksanalyse uitgevoerd in de IP-groep. Specifiek werden ratten in de IP-groep geëuthanaseerd op 2 u, 4 u, 24 u en 72 u na de incisie, en werden de expressieniveaus van de celmarkers NeuN, GFAP en Iba-1 in het ruggenmerg gemeten via Western blot (n = 3 per tijdstip). Op basis van deze voorlopige analyse werden de eerste 4 u na de incisie gekozen als een vroeg observatievenster na de incisie, omdat de expressie van NeuN haar hoogste niveau bereikte op het 4 u-tijdstip en omdat vroege moleculaire veranderingen als het meest relevant werden beschouwd voor de initiële ontwikkeling van incisie-hyperalgesie. Het 4 u-tijdstip was echter niet bedoeld om alle temporele moleculaire veranderingen na de incisie te vertegenwoordigen.
Op dit geselecteerde tijdstip werden ratten die een intrathecale injectie hadden ontvangen geëuthanaseerd voor Western blot-analyse van verschillende celmarkers (n = 3 per groep) en immunofluorescentie-evaluatie van de morfologie van verschillende celtypen (n = 3 per groep). In de blanco groep werden ratten willekeurig geëuthanaseerd om de basale expressieniveaus van verschillende celmarkers (NeuN, GFAP en Iba-1) in het ruggenmerg te bepalen via Western blot (n = 3) en de morfologie van verschillende cellen (neuronen, astrocyten en microglia) via immunofluorescentie (n = 3). De blanco groep diende dus als de niet-ingesneden, onbehandelde basiscontrole.
Behandelingseffecten op spinale p-ERK1/2 en inflammatoire mediatoren
Om het juiste tijdstip na de incisie te bepalen voor het evalueren van de effecten van de behandeling op de expressie van p-ERK1/2 en de spiegels van inflammatoire cytokinen, werd eerst een voorlopige tijdreeksanalyse uitgevoerd in de IP-groep. Meer specifiek werden ratten in de IP-groep geëuthanaseerd op 2 u, 4 u, 24 u en 72 u na de incisie, en werd de spinale p-ERK1/2-expressie gemeten via Western blot (n = 3 per tijdstip). Op basis van dit tijdreeksexperiment, samen met het tijdstip waarop de NeuN-expressie na de incisie het hoogst was, werd 4 u na de incisie gekozen als het vaste tijdstip voor de daaropvolgende evaluatie van de effecten van preoperatief intrathecaal toegediende PPF of U0126 op de spinale p-ERK1/2-expressie en inflammatoire cytokinen. Dit tijdstip werd gekozen als een vroeg mechanistisch observatievenster en niet als een volledige weergave van alle temporele veranderingen na de incisie.
Op dit geselecteerde tijdstip werden ratten die een intrathecale injectie hadden ontvangen, geëuthanaseerd voor Western blot-analyse van de p-ERK1/2-expressie (n = 3 per groep) en immunofluorescentie-evaluatie van inflammatoire cytokinen (n = 3 per groep). In de blanco groep werden ratten willekeurig geëuthanaseerd om de basale expressieniveaus van p-ERK1/2 in het ruggenmerg te bepalen via Western blot (n = 3) en van inflammatoire cytokinen (TNF-α en COX-2) via immunofluorescentie (n = 3). De blanco groep diende dus als de niet-geïncideerde, niet-behandelde baseline-controle.
Cellulaire lokalisatie van spinale p-ERK1/2 in neuronen, astrocyten en microglia
Om de cellulaire distributie van spinale p-ERK1/2 na incisie verder te beoordelen, werd immunofluorescentiekleuring uitgevoerd in de Blank- en IP-groepen 4 u na de incisie (n = 3).
Statistische analyse
Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. De steekproefomvang werd bepaald op basis van eerdere studies van de onderzoeksgroep en preliminaire experimenten. Gedragsgegevens werden geanalyseerd met een two-way repeated-measures analyse van variantie (ANOVA), waarbij de groep als tussen-subject factor en de tijd als binnen-subject factor dienden. De Western blot-gegevens van het tijdsverloop werden geëvalueerd met een one-way ANOVA, gevolgd door Bonferroni-gecorrigeerde paarsgewijze vergelijkingen. Western blot- en immunofluorescentiegegevens van vaste tijdspunten werden geëvalueerd met een one-way ANOVA met Bonferroni-gecorrigeerde geplande vergelijkingen; vergelijkingen tussen twee groepen werden geëvalueerd met de Student's t-test. Normaliteit en homogeniteit van variantie werden respectievelijk beoordeeld met de Shapiro–Wilk- en Levene-testen. Een tweezijdige p-waarde < 0,05 werd als significant beschouwd. Statistische analyses werden uitgevoerd met de statistische analysesoftware die vermeld staat in de Tabel met Materialen. Voor de in vitro astrocytenexperimenten werden onafhankelijke kweekexperimenten beschouwd als de analyse-eenheid; Western blot-densitometrie en cytokinconcentraties werden vergeleken met behulp van een one-way ANOVA, gevolgd door Bonferroni-gecorrigeerde geplande vergelijkingen of de Student's t-test voor vooraf gespecificeerde vergelijkingen tussen twee groepen, afhankelijk van de situatie.
BESCHIKBAARHEID VAN GEGEVENS:
Gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn opgenomen in Supplementary File 1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De effecten van de incisie en van de preoperatieve intrathecale toediening van propentofylline of U0126 op hyperalgesie na de incisie
Mechanische hyperalgesie
Er waren geen significante verschillen in PWMT's tussen de zes groepen 24 u vóór de operatie (p > 0,05; Figuur 1A,B). In de IP-groep nam de PWMT af na de incisie en bleef deze significant lager dan de baseline vanaf 2 u tot 72...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De meeste patiënten lijden na een operatie aan acute pijn, niet alleen fysiek maar soms zelfs mentaal33, maar er is nog veel onbekend over de gedetailleerde mechanismen van acute postoperatieve pijn. Naast de krachtige effecten van pijnstillende medicatie volgen onvermijdelijk bijwerkingen, waardoor het onderzoek naar veiligere, effectieve analgesica van cruciaal belang is. Deze studie was gebaseerd op een eerder gevalideerd incisiemodel bij ratten voor het simuleren van acute postoperatieve pijn,...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat zij geen persoonlijke, financiële, commerciële of academische belangenconflicten hebben.
De auteurs danken Haijiao Zhou en Ming Wang voor de technische ondersteuning.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0,01 M PBS-buffer | Solarbio | P1020 | |
| 1,0 M Tris-HCl-buffer (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | |
| 1,5 M Tris-HCl-buffer (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | |
| 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) | Solarbio | S1010 | |
| 10× TBST-stockoplossing | Solarbio | T1081 | |
| 30% acrylamide | Solarbio | A1010 | |
| 4× protein loading buffer | Solarbio | P1041 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | — | |
| Ammoniumpersulfaat | Solarbio | A1030 | |
| Automatische schaapsijs-machine | Changshu Xueke | IMS-40 | |
| Bovien serumalbumine (BSA) | Solarbio | A8020 | |
| Cryostaat CM150 | Leica | CM150 | |
| Digitale pH-meter | — | PHS-3C | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Solarbio | D8371 | |
| Elektronische analytische balans | Cany | — | |
| Enhanced chemiluminescence (ECL) reagens | Solarbio | PE0010 | |
| Film | Kodak | — | |
| Fluorescentiemicroscoop DP71 | Olympus | DP71 | |
| Inbeddingsmedium voor vriescoupes | Sakura | 4583 | |
| Gelelektroforese-apparaat | BIO-RAD | — | |
| Glycerol | Solarbio | IG0910 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Geit anti-muis Alexa Fluor 594 secundair antilichaam | Proteintech | SA00013-3 | |
| Geit anti-muis mierikwortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam | ZSGB-BIO | ZB2305 | |
| Geit anti-konijn Alexa Fluor 488 secundair antilichaam | Proteintech | SA00013-2 | |
| Geit anti-konijn mierikwortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam | ZSGB-BIO | ZB2301 | |
| Geitenserum | Solarbio | SL038 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 5 | |
| Hogesnelheidsgekoelde centrifuge 3K15 | Sigma | 3K15 | |
| Horizontale orbitale schudmachine TS-1000 | Haimen Qilinbeier | TS-1000 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.51j8 | |
| Methanol | Tianjin Guangfu | — | |
| Muis anti-rat GAPDH primair antilichaam | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| Muis anti-rat p-ERK1/2 primair antilichaam | CST | 9101S | |
| Na2HPO3 | Tianjin Beichen Fangzheng | — | |
| NaH2PO3 | Tianjin Damao | — | |
| Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Microscopiedia van pathologische graad | Shitai | — | |
| Fenylmethansulfonylfluoride (PMSF) | Beyotime | ST506 | |
| Plantar Test 37370 | UGO BASILE | 37370 | |
| Polyvinylideenfluoride-membraan | Solarbio | — | |
| Propentofylline (PPF) | Taosu | T19812 | |
| Konijn anti-rat COX-2 primair antilichaam | Abcam | Ab179800 | |
| Konijn anti-rat GFAP primair antilichaam | Proteintech | 16825-1-AP | |
| Konijn anti-rat Iba-1 primair antilichaam | Proteintech | 10904-1-AP | |
| Konijn anti-rat NeuN primair antilichaam | Abcam | Ab279297 | |
| Konijn anti-rat t-ERK1/2 primair antilichaam | Proteintech | 11257-1-AP | |
| Konijn anti-rat TNF-α primair antilichaam | Proteintech | 29652-1-AP | |
| RIPA-lysebuffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS | Solarbio | S8010 | |
| Magere melkpoeder | Solarbio | D8340 | |
| SPSS | IBM | 22 | |
| Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Solarbio | T8090 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| U0126-EtOH | Selleck | S1102 | |
| Ultra-laagtemperatuurvriezer | Haier | — | |
| Ultra-laagtemperatuurvriezer | Sanyo | — | |
| Ultrapuur waterzuiveringssysteem | Heal Force | — | |
| von Frey-filamenten | North Coast Medical | — |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.