Onderzoeksartikel

Propentofylline verlicht incisuele hyperalgesie door regulering van ERK1/2-fosforylering in spinale astrocyten en microglia

12 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70927

⸱

14 augustus 2026

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie onderzoekt het effect van intrathecaal toegediende propentofylline op het verminderen van incisie-hyperalgesie en of dit effect geassocieerd is met veranderingen in spinale gliale markers en in de fosforylering van extracellular signal-regulated kinase 1 en 2 bij ratten.

Samenvatting

Spinale astrocyten, microglia en extracellulaire signaal-gereguleerde kinase 1 en 2 (ERK1/2) zijn betrokken bij de pijnverwerking. Deze studie onderzocht of preoperatieve intrathecale propentofylline (PPF) acute incisie-hyperalgesie bij ratten vermindert en of dit effect geassocieerd is met spinale gliale markers en ERK1/2-fosforylering. Zesenzestig mannelijke Sprague–Dawley ratten werden willekeurig toegewezen aan groepen voor blanco, incisiepijn, normale zoutoplossing, dimethylsulfoxide, PPF en U0126. Mechanische en thermische hyperalgesie werden beoordeeld bij de baseline en 2, 4, 8, 24 en 72 u na de incisie. Spinale neuronale en gliale markers, p-ERK1/2 en inflammatoire mediatoren werden geëvalueerd via Western blotting en immunofluorescentie. Daarnaast werden experimenten met primaire spinale astrocyten gebruikt om de ERK1/2-afhankelijke afgifte van inflammatoire mediatoren te onderzoeken. Preoperatieve intrathecale PPF verminderde de mechanische en thermische hyperalgesie gedurende de gehele observatieperiode van 72 u, terwijl U0126 hyperalgesie vooral verminderde tijdens de vroege post-incisieperiode. 4 u na de incisie waren beide behandelingen geassocieerd met een verminderde spinale expressie van GFAP, Iba-1 en p-ERK1/2 en een verminderde immunoreactiviteit van TNF-α en COX-2. In gekweekte astrocyten verminderde PPF de LPS-geïnduceerde afgifte van inflammatoire mediatoren, terwijl constitutief actieve ERK1/2 dit effect tegenging. Deze bevindingen ondersteunen een associatie tussen het antihyperalgesische effect van PPF en de modulatie van spinale gliale, ERK1/2-gerelateerde en inflammatoire responsen na een incisie.

Inleiding

Incisiepijn, een veelvoorkomende vorm van acute pijn na chirurgische ingrepen, houdt over het algemeen niet langer dan 7 dagen aan, maar heeft complexe pathologische mechanismen die verschillen van die van inflammatoire en neuropathische pijn1,2. Indien incisiepijn tijdens de ontwikkeling onvoldoende wordt beheerst, kan dit verder progresseren tot een chronisch pijnsyndroom, waarbij het karakter kan verschuiven van acute weefselschadepijn naar neuropathische of gemengde pijn3. Over het algemeen is het toedienen van analgetica, zoals opioïden en niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen, de meest gebruikelijke vorm van analgesie na een incisie. Er kunnen echter veel bijwerkingen optreden bij continu of hooggedoseerd gebruik hiervan, een omstandigheid die de noodzaak van veiligere en effectievere analgesiestrategieën benadrukt.

Betrouwbaar bewijs geeft aan dat propentofylline (PPF) hyperalgesie bij verschillende pijnprocessen verlicht4,5. Bovendien kan het analgeserend effect van PPF gedeeltelijk worden bereikt door de spinale expressie van mitogeen-geactiveerde proteïnekinasen (MAPK's), zoals p38 en c-Jun N-terminale kinasen (JNK's), te remmen6. Hoewel de effecten van PPF op p38- en JNK-paden zijn vastgesteld, blijft de potentiële modulatie van het extracellulaire signaal-gereguleerde kinase 1 en 2 (ERK1/2)-pad, een andere kritieke MAPK-subfamilie betrokken bij pijnsignalering, onontdekt bij acute incisiepijn. Deze kennishiaat is bijzonder belangrijk, aangezien de activering van ERK1/2 duidelijk andere temporele en cellulaire patronen vertoont in vergelijking met p38 en JNK, wat wijst op potentiële unieke therapeutische mogelijkheden.

Gliale cellen, waaronder astrocyten, microglia en oligodendrocyten, werden aanvankelijk beschouwd als de verbindende en ondersteunende structuur van zenuwweefsel. Recente studies hebben echter aangetoond dat astrocyten en microglia een belangrijke rol spelen bij het reguleren van synaptische plasticiteit en het overbrengen van pijninformatie7. Als de residente macrofagen van de hersenen en het ruggenmerg kunnen microglia in een zeer vroeg stadium van het pijnproces worden geactiveerd door verschillende extracellulaire stimulussignalen, waarna ze prolifereren en grote hoeveelheden inflammatoire cytokinen afgeven, wat de geleiding van pijnsignalen van het ruggenmerg naar de hersenen versterkt8,9. Tegelijkertijd kunnen geactiveerde astrocyten de afgifte van de excitatoire neurotransmitter glutamaat opreguleren en informatie direct naar sensorische neuronen sturen door de intercellulaire communicatie te verbeteren10.

Studies hebben aangetoond dat astrocytenactivatie optreedt in de vroege fase (binnen de eerste 24 u) van incisie-geïnduceerde pijn, terwijl microgliactivatie veel later optreedt11,12. Daarnaast wees een studie erop dat geactiveerde microglia een beperkt effect hebben op mechanische hyperalgesie bij incisie-geïnduceerde pijn13. Deze bevindingen benadrukken de aanhoudende vragen over de verschillende rollen van astrocyten en microglia bij acute pijn. Propentofylline, een glia-modulerend middel, zou hyperalgesie verlichten door de activatie van astrocyten en microglia te reguleren na chronische zenuwconstrictie-letsels, acute zenuwletsels en acute weefselletsels4,5. Voor zover bekend is er echter geen enkele studie uitgevoerd naar de effecten van PPF op de activatie van astrocyten of microglia bij acute incisie-geïnduceerde pijn.

Extracellulaire signaalgereguleerde kinase 1 en 2, een belangrijke MAPK-subfamilie die stroomafwaarts van mitogeengestuurde proteïnekinase 1 en 2 (MEK1/2) wordt geactiveerd, zijn in grote mate betrokken bij nociceptieve verwerking en neuronale plasticiteit14,15. Eerdere studies hebben aangetoond dat fosfo-ERK1/2 (p-ERK1/2) in spinale neuronen kan worden geïnduceerd door nociceptieve stimulatie en ook kan worden aangetroffen in astrocyten en microglia bij inflammatoire of neuropathische pijntoestanden16,17,18,19. Daarnaast is gerapporteerd dat de farmacologische remming van MEK1/2–ERK1/2-signalering mechanische en thermische hyperalgesie vermindert in verschillende pijnmodellen20,21,22,23,24,25.

De cellulaire distributie van spinale ERK1/2, met name in astrocyten en microglia, geactiveerd door een acute incisie en de rol hiervan bij incisie-geïnduceerde pijn, is echter nog onvoldoende gedefinieerd. Eerdere studies van de onderzoeksgroep wijzen erop dat PPF acute incisonale hyperalgesie bij ratten verlicht door spinale JNK- en p38-signalering te verminderen, maar het blijft onduidelijk of PPF ook de ERK1/2-gerelateerde signalering in spinale gliacellen moduleert tijdens incisie-geïnduceerde pijn. De huidige studie moet daarom worden beschouwd als een uitbreiding van de bestaande kaders betreffende glia en MAPK in pijnonderzoek, in plaats van als een volledig onafhankelijk mechanistisch paradigma. Het belangrijkste onderscheid met eerder werk ligt in de specifieke focus op acute incisonale pijn, het onderzoek naar ERK1/2 in plaats van p38/JNK als de relevante MAPK-component, en de evaluatie van de vroege spinale cellulaire distributie van p-ERK1/2 in relatie tot de behandeling met PPF.

Deze studie was ontworpen om te onderzoeken of preoperatieve intrathecale toediening van PPF incisuele hyperalgesie vermindert in een rattenmodel van een plantaire incisie, en of dit effect geassocieerd is met ERK1/2-fosforylering of veranderingen in de expressie van spinale neuronale en gliale markers en inflammatoire mediatoren, tumornecrosefactor-α (TNF-α) en cyclo-oxygenase-2 (COX-2). Meer specifiek verschilt deze studie van eerdere rapporten door de combinatie van gedragsbeoordeling met temporele Western blot-analyse; de farmacologische vergelijking met de MEK1/2-remmer U0126; en de kwalitatieve immunofluorescentie-lokalisatie van p-ERK1/2 in spinale neuronen, astrocyten en microglia binnen een acuut incisueel pijnmodel. Hoewel het mechanistische kader voortbouwt op eerdere literatuur die gliale modulatie en MAPK-signalering koppelt aan pijn, is het huidige werk bedoeld om aanvullend bewijs te leveren voor de mogelijke betrokkenheid van spinale ERK1/2-gerelateerde gliale responsen in de vroege fase van incisuele hyperalgesie.

In vergelijking met conventionele postoperatieve analgetica kunnen benaderingen die zich richten op specifieke signaalroutes een gedefinieerde signaleringscomponent testen, maar ze bieden mogelijk slechts een tijdelijk voordeel en kunnen een invasieve toediening vereisen; MEK1/2–ERK1/2-remming heeft antihyperalgetische effecten getoond in verschillende experimentele pijnmodellen20,21,22,23,24,25. PPF verschilt van een remmer van een enkele signaalroute omdat het gliale responsen moduleert en is gekoppeld aan meer dan één MAPK-geassocieerd proces4,5,6. De praktische vertaling blijft beperkt door het preklinische ontwerp, de preoperatieve intrathecale toediening, het uitsluitend gebruik van mannelijke ratten en het ontbreken van dosisonderzoeken en veiligheidsstudies in grotere chirurgische modellen.

Protocol

De uitgevoerde experimenten zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Second Affiliated Hospital, Lanzhou University, provincie Gansu, China (ethische goedkeuring nr. 2017-070). Alle procedures volgden de richtlijnen van de International Association for the Study of Pain26. In totaal werden 66 volwassen mannelijke Sprague–Dawley ratten gebruikt, verkregen van een geaccrediteerd laboratoriumcentrum voor dieren en met een gewicht van 200–250 g. Alleen mannelijke ratten zijn in deze studie opgenomen om potentiële variabiliteit gerelateerd aan sekse-afhankelijke hormonale invloeden te verminderen. Alle protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de International Association for the Study of Pain26, en er zijn de nodige maatregelen genomen om lijden te minimaliseren. Gedetailleerde informatie over de reagentia, verbruiksartikelen, instrumenten en software die in deze studie zijn gebruikt, wordt gegeven in de Tabel met Materialen.

Dieren

De ratten werden vóór de operatie in paren gehuisvest en na de incisie individueel, met voedsel en water ad libitum. De ruimte werd gehouden in een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker, met een gecontroleerde temperatuur van 24 °C ± 2 °C.

Intrathecale injectie en incisiespijnmodel

Voor de intrathecale toediening van oplossingen werden ratten geanestheseerd met 1,5%–3% sevofluraan (toegediend via een neusconus) en in buikligging geplaatst met de wervelkolom in een gebogen positie. De vacht over de lumbale regio werd geschoren en de huid over de L5–L6 intervertebrale ruimte werd gedesinfecteerd. Een microspuit werd percutaan ingebracht in de L5–L6 intervertebrale ruimte. Succesvolle toegang tot de subarachnoïdale ruimte werd aangegeven door een plotselinge staartreflex of staartbeweging tijdens het invoeren van de naald en werd verder bevestigd door het verschijnen van cerebrospinale vloeistof bij voorzichtig aspireren. Indien deze tekenen niet werden waargenomen, werd de positie van de naald aangepast vóór de injectie. De injectie werd pas uitgevoerd nadat aan beide bevestigingscriteria was voldaan, en dieren die na de injectie abnormale neurologische tekenen vertoonden, werden uitgesloten. De betreffende oplossing werd vervolgens langzaam geïnjecteerd en de huid werd na de injectie opnieuw gereinigd. De chirurgische procedure duurde ongeveer 3 min en de ratten herstelden over het algemeen binnen 5–10 min van de anesthesie.

Het ratmodel voor incisiepijn werd vastgesteld zoals eerder beschreven27. Na anesthesie werd het plantaire oppervlak van de achterpoot gedesinfecteerd met 10% povidonjodium. Er werd een longitudinale incisie van 1 cm gemaakt in de plantaire huid, beginnend op ongeveer 0,5 cm van de hiel en uitbreidend in de richting van de tenen. De incisie penetreerde de huid en fascia. De plantaire spier werd voorzichtig opgetild met oogpincetten en longitudinaal ingesneden, waarbij de algehele weefselcontinuïteit behouden bleef. De spier werd vervolgens teruggeplaatst, er werd lichte druk uitgeoefend om hemostase te bereiken en de wond werd gesloten met twee matrashechtingen met 3-0 nylon. Na sluiting van de wond werd de incisieplaats opnieuw gedesinfecteerd. Na de operatie werden de ratten individueel gehuisvest en mochten ze herstellen in een rustige, warme omgeving, beschermd tegen sterk licht en met vrije toegang tot voedsel en water. De dieren werden postoperatief gemonitord en dieren die niet voldeden aan de vooraf gedefinieerde criteria werden prompt uitgesloten. Wondinfectie werd bepaald op basis van roodheid, zwelling en verhoogde lokale temperatuur rond de wond, abnormaal geelgroen purulent exsudaat met een onaangename geur, vertraagde wondgenezing met aanhoudende wondopening, necrose en vergroting, en systemische tekenen zoals verhoogde lichaamstemperatuur, lethargie en weigering om te eten. Aanvullende uitsluitingscriteria waren het niet herstellen van de anesthesie binnen 30 min, intraoperatieve spiertransectie of neurovasculaire beschadiging, postoperatieve zelfverminking, het niet lukken van de modelvestiging en neurologische defecten, zoals verlamming van de achterpoot of onvermogen om gewicht te dragen dat niet gerelateerd was aan de incisiepijn. Ratten met een wondinfectie of wonddehiscentie werden uitgesloten van de studie.

Gedragsmeting

De mechanische drempel voor pootterugtrekking (PWMT) en de thermische latentietijd voor pootterugtrekking (PWTL) werden gemeten door een onderzoeker die niet op de hoogte was van de groepsindeling. De tests werden uitgevoerd in een stille kamer op een consistent tijdstip van de dag na ten minste 10 min acclimatisatie; de kooi, de bodem van gaas of glas, het omgevingslicht en de intensiteit van de warmtebron werden voor alle groepen constant gehouden. Voor de PWMT-meting werden gekalibreerde von Frey-filamenten (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g en 15.0 g) loodrecht aangebracht op het plantaire oppervlak naast de wond totdat het filament ongeveer 1–2 mm boog. Opeenvolgende stimulaties werden gescheiden door 2 min, en de 50% PWMT werd bepaald met de up-and-down methode28. Voor de PWTL-meting werden ratten in individuele transparante kooien op een glazen bodem geplaatst, waarbij de stralingswarmtebron werd uitgelijnd met het plantaire oppervlak naast de wond. Een cut-off van 30 s voorkwam weefselschade, opeenvolgende blootstellingen werden gescheiden door 2 min en het gemiddelde van drie metingen werd geregistreerd29. Het optillen, schudden of likken van de poot werd beschouwd als een positieve terugtrekkingsrespons; tests die beïnvloed werden door verzorgingsgedrag, voortbeweging of verlies van uitlijning met de warmtebron werden na hernieuwde acclimatisatie herhaald.

Western blot-analyse

Op de vooraf vastgestelde tijdstippen werden de ratten geëuthanaseerd door middel van cervicale dislocatie en werd het L4–L6 lumbale ruggenmerg snel geoogst in radioimmunoprecipitatie-assay lysisbuffer, aangevuld met protease-inhibitor in een verhouding van 100:1. Het weefsel werd gehomogeniseerd, 20 min op ijs bewaard en gecentrifugeerd bij 15.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C. De supernatant werd gemengd met 4× laadbuffer in een verhouding van 3:1, 5 min verhit in kokend water en bewaard bij −80 °C. Eiwitmonsters (30 µg per lane) werden gescheiden op 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegels en overgebracht op 0,45 of 0,22 µm polyvinylideenfluoride-membranen. De succesvolle overdracht werd gecontroleerd door de verwachte migratie van de voorgekleurde molecuulgewichtmarker te bevestigen en het ontbreken van duidelijke ongelijkmatige of onderbroken overdrachtsgebieden vast te stellen. Membranen werden 2 u bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk en 3% runderserumalbumine en overnacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) of GAPDH (1:2.000). Na het wassen in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween 20 (pH 7,4) werden de membranen 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met het overeenkomstige met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichaam (1:5.000). Signalen werden ontwikkeld met verbeterde chemiluminescentie en op film vastgelegd met hetzelfde belichtingsbereik binnen elk doelwit. Een onderzoeker die blind was voor de groepsindeling analyseerde de bandendichtheid met beeldanalyse-software. De afbeeldingen werden omgezet naar 8-bits grijswaarden, voor elke band werd een identiek rechthoekig interessegebied (region of interest) toegepast, de lokale achtergrond van een aangrenzend leeg gebied werd afgetrokken en de geïntegreerde dichtheid werd vastgelegd. Dezelfde grootte van het gebied en dezelfde achtergrondprocedure werden gebruikt voor alle lanes op een blot. NeuN, GFAP, Iba-1 en t-ERK1/2 werden genormaliseerd naar GAPDH; p-ERK1/2 werd genormaliseerd naar t-ERK1/2; en de waarden werden vervolgens uitgedrukt relatief ten opzichte van de blanco groep.

Immunofluorescentie

Op de vooraf vastgestelde tijdstippen werden de ratten geanestheseerd met 3% pentobarbitalnatrium (1,5 mL/kg) en via het hart geperfundeerd met 300 mL vorgekoelde 0,01 mol/L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4), gevolgd door 250 mL vorgekoelde 4% paraformaldehyde. Het ruggenmerg op niveau L4–L6 werd gedurende 6 u nagesfixeerd in 4% paraformaldehyde, gedurende de nacht cryoprotectief behandeld in 20%–30% sucrose–PBS bij 4 °C en bij −22 °C gesneden in secties van 10 µm. De secties werden gewassen in 0,01 mol/L PBS, gedurende 1 u bij kamertemperatuur geblokkeerd in 10% geitenserum en gedurende de nacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) of COX-2 (1:50). Na drie wasbeurten met PBS werden de secties gedurende 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met het overeenkomstige met een groene- of rood-fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichaam (1:400), nog drie keer gewassen in PBS en gemonteerd met antifade-medium en een dekglas. In elke kleuringsserie werden negatieve controlesecties opgenomen die zonder primair antilichaam waren verwerkt. De beelden werden door een geblindeerde onderzoeker vastgelegd met een fluorescentiemicroscoop. Overzichtsfoto's bij lage vergroting werden gemaakt met een 10× objectief, terwijl beelden van cellulaire immunoreactiviteit en colocalisatie werden gemaakt met 20× of 40× objectieven, afhankelijk van het betreffende figuurpaneel. Voor vergelijkingen binnen dezelfde figuur en kleuringsserie werden de objectiefvergroting, verlichtingsintensiteit, belichtingstijd, detectorgain, camera-instellingen en beeldbewerkingsparameters gefixeerd na optimalisatie onder de verzadigingsgrens. Afzonderlijke fluorescentiekanalen werden sequentieel vastgelegd om kanaaloverlap te minimaliseren. Per dier werden drie niet-overlappende velden in de ipsilaterale dorsale hoorn vastgelegd. De fluorescentie-intensiteit werd gekwantificeerd met beeldanalyse-software na 8-bit conversie, achtergrondsubtractie met behulp van een celvrije regio en toepassing van een identiek region of interest en drempelwaarde binnen elke kleuringsserie; de veldwaarden werden gemiddeld om één waarde per dier te verkrijgen. Velden met overbelichting, weefselvouwing, scheuren, slechte focus of een ongelijkmatige achtergrond werden uitgesloten en opnieuw vastgelegd onder dezelfde niet-verzadigende instellingen. De kleuring werd geaccepteerd wanneer de weefselarchitectuur intact was, het doelsignaal de controle zonder primair antilichaam overtrof en er geen grote vouw, scheur of verzadigd gebied de analyse beïnvloedde.

In vitro experimenten met primaire spinale astrocyten

Primaire astrocyten uit het ruggenmerg van ratten werden gekweekt onder standaard steriele omstandigheden in volledig kweekmedium bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2 incubator. Cellen werden gebruikt wanneer zij een confluentie van ongeveer 70%–80% bereikten en werden toegewezen aan de controle-, LPS-gestimuleerde, LPS + PPF, LPS + U0126 en ERK1/2-rescue-groepen. PPF en U0126 werden toegevoegd in een concentratie van 10 µM. De condities voor LPS-stimulatie, drugbehandeling en oogsten werden identiek gehouden voor parallelle wells binnen elk experiment. Voor de analyse van de pad-selectiviteit werden cellysaten verzameld voor Western blotting van p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, totaal p38, p-JNK, totaal JNK en de overeenkomstige loading control. Kweeksupernatanten van parallelle wells werden verzameld, geklaard door centrifugatie en geanalyseerd op TNF-α, PGE2 en IL-6 middels een enzyme-linked immunosorbent assay volgens de instructies van de fabrikant. De densitometrie van de Western blots volgde dezelfde principes voor beeldanalyse als hierboven beschreven. Voor de rescue-experimenten werd endogeen ERK1/2 onderdrukt door siRNA-transfectie, en een constitutief actief ERK1/2 (CA-ERK1/2) expressieconstruct werd geïntroduceerd voorafgaand aan de behandeling. De efficiëntie van de knockdown en overexpressie werd bevestigd via Western blotting voordat de cytokinedata werden geïnterpreteerd. Cellen die waren blootgesteld aan het transfectiereagens zonder actief siRNA of construct dienden, indien van toepassing, als procedurele controles.

Experimenteel ontwerp

Indeling van experimentele dieren in subgroepen

De ratten werden met behulp van een methode met een willekeurige getallentabel toegewezen aan zes groepen, en de groepsindeling werd voltooid vóór de gedragstests en de weefselverzameling. De zes groepen bestonden uit een blanco groep (n = 6), een incisiepijn-groep (IP) (n = 18), een normale zoutoplossing-groep (NS) (0,9% NS, 10 µL; n = 9), een PPF-groep (10 µg in 10 µL; n = 12), een dimethylsulfoxide-groep (DMSO) (10% DMSO, 10 µL; n = 9) en een U0126-groep (10 µg in 10 µL; n = 12). Ratten in de blanco groep kregen noch een plantaire incisie noch een intrathecale injectie en dienden als onbehandelde controles. Ratten in de IP-groep ondergingen een plantaire incisie zonder voorbehandeling via intrathecale injectie. Ratten in de NS-, PPF-, DMSO- en U0126-groepen kregen 30 min vóór de plantaire incisie een intrathecale toediening van hun respectievelijke middelen. De NS-groep diende als vehikelcontrole voor PPF, terwijl de DMSO-groep diende als vehikelcontrole voor U0126.

Doses van propentofylline en U0126

Propentofylline is een gliale modulator, en een dosis van 10 µg werd gekozen omdat deze in eerdere studies door de onderzoeksgroep acute hyperalgesie had verlicht. U0126 is een niet-adenosinetrifosfaat-competitieve MEK1/2-remmer die wordt gebruikt om de fosforylering van ERK1/2 te blokkeren. Effectieve intrathecale doses van 1–10 µg zijn gerapporteerd in diverse pijnmodellen30,31,32; in de huidige studie werd de dosis van 10 µg gebruikt. U0126 werd opgelost in 10% dimethylsulfoxide, terwijl PPF werd opgelost in 0,9% normale zoutoplossing. De uiteindelijke concentraties waren 1 µg/µL. De geneesmiddelen en dragers werden voor de operatie bereid, bewaard bij 4 °C en binnen 12 u gebruikt.

Effect van de preoperatieve intrathecale toediening van propentofylline of U0126 op hyperalgesie

Zes ratten uit elke groep werden willekeurig geselecteerd voor gedragsmetingen 24 u vóór de operatie, en de resulterende PWMT's en PWTL's werden als baseline aangemerkt. Intrathecale injecties werden 30 min vóór de operatie toegediend. Om de effecten van de preoperatieve intrathecale toediening van PPF en U0126 op mechanische en thermische hyperalgesie te beoordelen, werden PWMT en PWTL gemeten op 2 u, 4 u, 8 u, 24 u en 72 u na de incisie.

Experimenteel ontwerp voor het evalueren van de effecten van preoperatief intrathecaal toegediende propentofylline of U0126 op de expressie van spinale neuronale en gliale markers na incisie

Om het geschikte tijdstip na de incisie te bepalen voor de beoordeling van het behandelingseffect, werd eerst een voorlopige tijdreeksanalyse uitgevoerd in de IP-groep. Specifiek werden ratten in de IP-groep geëuthanaseerd op 2 u, 4 u, 24 u en 72 u na de incisie, en werden de expressieniveaus van de celmarkers NeuN, GFAP en Iba-1 in het ruggenmerg gemeten via Western blot (n = 3 per tijdstip). Op basis van deze voorlopige analyse werden de eerste 4 u na de incisie gekozen als een vroeg observatievenster na de incisie, omdat de expressie van NeuN haar hoogste niveau bereikte op het 4 u-tijdstip en omdat vroege moleculaire veranderingen als het meest relevant werden beschouwd voor de initiële ontwikkeling van incisie-hyperalgesie. Het 4 u-tijdstip was echter niet bedoeld om alle temporele moleculaire veranderingen na de incisie te vertegenwoordigen.

Op dit geselecteerde tijdstip werden ratten die een intrathecale injectie hadden ontvangen geëuthanaseerd voor Western blot-analyse van verschillende celmarkers (n = 3 per groep) en immunofluorescentie-evaluatie van de morfologie van verschillende celtypen (n = 3 per groep). In de blanco groep werden ratten willekeurig geëuthanaseerd om de basale expressieniveaus van verschillende celmarkers (NeuN, GFAP en Iba-1) in het ruggenmerg te bepalen via Western blot (n = 3) en de morfologie van verschillende cellen (neuronen, astrocyten en microglia) via immunofluorescentie (n = 3). De blanco groep diende dus als de niet-ingesneden, onbehandelde basiscontrole.

Behandelingseffecten op spinale p-ERK1/2 en inflammatoire mediatoren

Om het juiste tijdstip na de incisie te bepalen voor het evalueren van de effecten van de behandeling op de expressie van p-ERK1/2 en de spiegels van inflammatoire cytokinen, werd eerst een voorlopige tijdreeksanalyse uitgevoerd in de IP-groep. Meer specifiek werden ratten in de IP-groep geëuthanaseerd op 2 u, 4 u, 24 u en 72 u na de incisie, en werd de spinale p-ERK1/2-expressie gemeten via Western blot (n = 3 per tijdstip). Op basis van dit tijdreeksexperiment, samen met het tijdstip waarop de NeuN-expressie na de incisie het hoogst was, werd 4 u na de incisie gekozen als het vaste tijdstip voor de daaropvolgende evaluatie van de effecten van preoperatief intrathecaal toegediende PPF of U0126 op de spinale p-ERK1/2-expressie en inflammatoire cytokinen. Dit tijdstip werd gekozen als een vroeg mechanistisch observatievenster en niet als een volledige weergave van alle temporele veranderingen na de incisie.

Op dit geselecteerde tijdstip werden ratten die een intrathecale injectie hadden ontvangen, geëuthanaseerd voor Western blot-analyse van de p-ERK1/2-expressie (n = 3 per groep) en immunofluorescentie-evaluatie van inflammatoire cytokinen (n = 3 per groep). In de blanco groep werden ratten willekeurig geëuthanaseerd om de basale expressieniveaus van p-ERK1/2 in het ruggenmerg te bepalen via Western blot (n = 3) en van inflammatoire cytokinen (TNF-α en COX-2) via immunofluorescentie (n = 3). De blanco groep diende dus als de niet-geïncideerde, niet-behandelde baseline-controle.

Cellulaire lokalisatie van spinale p-ERK1/2 in neuronen, astrocyten en microglia

Om de cellulaire distributie van spinale p-ERK1/2 na incisie verder te beoordelen, werd immunofluorescentiekleuring uitgevoerd in de Blank- en IP-groepen 4 u na de incisie (n = 3).

Statistische analyse

Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. De steekproefomvang werd bepaald op basis van eerdere studies van de onderzoeksgroep en preliminaire experimenten. Gedragsgegevens werden geanalyseerd met een two-way repeated-measures analyse van variantie (ANOVA), waarbij de groep als tussen-subject factor en de tijd als binnen-subject factor dienden. De Western blot-gegevens van het tijdsverloop werden geëvalueerd met een one-way ANOVA, gevolgd door Bonferroni-gecorrigeerde paarsgewijze vergelijkingen. Western blot- en immunofluorescentiegegevens van vaste tijdspunten werden geëvalueerd met een one-way ANOVA met Bonferroni-gecorrigeerde geplande vergelijkingen; vergelijkingen tussen twee groepen werden geëvalueerd met de Student's t-test. Normaliteit en homogeniteit van variantie werden respectievelijk beoordeeld met de Shapiro–Wilk- en Levene-testen. Een tweezijdige p-waarde < 0,05 werd als significant beschouwd. Statistische analyses werden uitgevoerd met de statistische analysesoftware die vermeld staat in de Tabel met Materialen. Voor de in vitro astrocytenexperimenten werden onafhankelijke kweekexperimenten beschouwd als de analyse-eenheid; Western blot-densitometrie en cytokinconcentraties werden vergeleken met behulp van een one-way ANOVA, gevolgd door Bonferroni-gecorrigeerde geplande vergelijkingen of de Student's t-test voor vooraf gespecificeerde vergelijkingen tussen twee groepen, afhankelijk van de situatie.

BESCHIKBAARHEID VAN GEGEVENS:

Gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn opgenomen in Supplementary File 1.

Resultaten

De effecten van incisie en van de preoperatieve intrathecale toediening van propentofylline of U0126 op hyperalgesie na incisie

Mechanische hyperalgesie

Er waren geen significante verschillen in PWMT's tussen de zes groepen 24 u vóór de operatie (p > 0,05; Figuur 1A,B). In de IP-groep nam de PWMT af na de incisie en bleef deze significant lager dan de baseline van 2 u tot 72 u na de incisie (p < 0,05 t.o.v. baseline; Figuur 1A). In de NS- en DMSO-groepen waren er geen significante verschillen in PWMT's tussen de tijdstippen na de incisie (p > 0,05 t.o.v. de IP-groep; Figuur 1B). In de PPF-groep was de PWMT significant hoger dan in de IP-groep van 2 u tot 72 u na de incisie (p < 0,05 t.o.v. de IP-groep; Figuur 1A), en 72 u na de incisie was deze niet langer significant verschillend van de baseline (p > 0,05 t.o.v. baseline; Figuur 1A). In de U0126-groep waren de PWMT's significant hoger dan die in de IP-groep gedurende de eerste 24 u na de incisie (p < 0,05 t.o.v. de IP-groep; Figuur 1A), maar dit effect hield niet aan tot 72 u na de incisie, waarbij de PWMT significant lager bleef dan de baseline en niet langer significant verschilde van die in de IP-groep (p < 0,05 t.o.v. baseline; p > 0,05 t.o.v. de IP-groep; Figuur 1A).

Thermische hyperalgesie

Er waren geen significante verschillen in PWTLs tussen de zes groepen 24 u vóór de operatie (p > 0,05; Figuur 1C,D). In de IP-groep nam de PWTL af van 24,85 s ± 1,06 s vóór de operatie naar 4,38 s ± 1,02 s op 4 u na de incisie en steeg vervolgens gedeeltelijk naar 18,37 s ± 1,38 s op 72 u na de incisie, maar bleef gedurende de gehele observatieperiode significant lager dan de baseline (p < 0,05 vs baseline; Figuur 1C). In de NS- en DMSO-groepen waren er geen significante verschillen in PWTLs tussen de tijdstippen na de incisie (p > 0,05 vs de IP-groep; Figuur 1D). In de PPF-groep was de PWTL gedurende de gehele observatieperiode van 72 u significant hoger dan in de IP-groep (p < 0,05 vs de IP-groep; Figuur 1C), en op 72 u na de incisie was deze teruggekeerd naar een niveau dat niet significant verschilde van de baseline (p > 0,05 vs baseline; Figuur 1C). In de U0126-groep was de PWTL tijdens de eerste 24 u na de incisie significant hoger dan in de IP-groep (p < 0,05 vs de IP-groep; Figuur 1C); dit effect hield niet aan op 72 u na de incisie, waarbij de PWTL significant lager bleef dan de baseline en niet langer significant verschilde van die in de IP-groep (p < 0,05 vs baseline; p > 0,05 vs de IP-groep; Figuur 1C).

Western blot-analyse van temporele veranderingen in de expressie van spinale celmarkers en fosforylering van extracellulair signaal-gereguleerd kinase 1 en 2 na incisie

Op de PVDF-membranen werden met een specifieke antilichaam verschillende banden geïdentificeerd bij exacte moleculaire gewichten, waaronder NeuN (48 en 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD) en GAPDH (36 kD). De GAPDH-band werd gebruikt als controle voor NeuN, GFAP, Iba-1 en t-ERK1/2, en de t-ERK1/2-band werd gebruikt als controle voor p-ERK1/2.

Western blot-gegevens van het ruggenmerg in de IP-groep toonden stijgingen van variërende mate na de incisie (Figuur 2A). De expressie van neuron-specifiek nucleair eiwit bereikte haar hoogste waarde 4 u na de incisie (p < 0,001 t.o.v. baseline; Figuur 2A) en bleef significant verhoogd 72 u na de incisie (p < 0,001 t.o.v. baseline; Figuur 2A). De spiegels van gliaal fibrillair zuur eiwit namen geleidelijk toe gedurende de observatieperiode van 72 u (p < 0,001 t.o.v. baseline; Figuur 2A), waarbij de hoogste waarde werd waargenomen op 72 u onder de gemeten tijdstippen. Op dezelfde wijze bereikte Iba-1 ook een significant verhoogd niveau 4 u na de incisie (p < 0,001 t.o.v. baseline; Figuur 2A) en fluctueerde dit binnen een klein bereik. Opvallend is dat de Western blot-gegevens van het ruggenmerg in de IP-groep toonden dat de ERK1/2-activatie alleen toenam gedurende de eerste 24 u na de incisie (p < 0,05 t.o.v. baseline; Figuur 2B), maar afnam op 72 u na de incisie (p < 0,05 t.o.v. baseline; Figuur 2B), terwijl de expressie van t-ERK/2 op geen enkel tijdstip een significante verandering vertoonde.

Western blot-analyse van de effecten van de preoperatieve intrathecale toediening van propentofylline of U0126 op de expressie van celmarkers en gefosforyleerde extracellular signal-regulated kinase 1 en 2 in het ruggenmerg

Western blotting-gegevens lieten zien dat de NeuN-expressie haar hoogste niveau bereikte 4 u na de incisie, op het moment dat de gedragsmatige meting op haar laagste drempelwaarde lag. Daarom werden de effecten op de expressie van celmarkers en de ERK1/2-fosforylering van intrathecaal toegediende PPF en U0126, 30 min vóór de operatie, geëvalueerd 4 u na de incisie.

Western blot-gegevens toonden aan dat, vergeleken met de blanco groep, de spinale expressie van alle celmarkers significant was toegenomen in de IP-groep 4 u na de incisie (p < 0,05 t.o.v. baseline; Figuur 3). Vergeleken met de IP-groep verminderde preoperatieve intrathecale toediening van PPF de spinale expressie van NeuN (p < 0,05 vs de IP-groep; Figuur 3A), GFAP (p < 0,05 vs de IP-groep; Figuur 3B) en Iba-1 (p < 0,01 vs de IP-groep; Figuur 3C). Vergeleken met de IP-groep verminderde preoperatieve intrathecale toediening van U0126 eveneens de spinale expressie van NeuN (p < 0,01 vs de IP-groep; Figuur 3D), GFAP (p < 0,05 vs de IP-groep; Figuur 3E) en Iba-1 (p < 0,01 vs de IP-groep; Figuur 3F). Wanneer deze echter werden vergeleken met de blanco groep, bleef de NeuN-expressie in de PPF-groep significant hoger dan de baseline (p < 0,01 vs baseline; Figuur 3A), terwijl de NeuN-expressie in de U0126-groep significant lager was dan in de blanco groep (p < 0,01 vs baseline; Figuur 3D). Voor GFAP en Iba-1 benadrukt de tekst nu de vergelijking met de IP-groep, zoals getoond in Figuur 3. De preoperatieve intrathecale toediening van NS en DMSO had geen significant effect op de expressie van enige celmarkers.

Western blot-gegevens lieten zien dat de spinale t-ERK1/2-expressie 4 u na de incisie niet significant verschilde tussen de Blank-, IP-, NS- en PPF-groepen (Figuur 4A). In contrast hiermee was de p-ERK1/2-expressie 4 u na de incisie significant verhoogd in de IP- en NS-groepen vergeleken met de blank-groep (p < 0,001 vs de blank-groep; Figuur 4B). Vergeleken met de IP-groep verminderde preoperatieve intrathecale toediening van PPF de p-ERK1/2-expressie significant 4 u na de incisie (p < 0,001 vs de IP-groep; Figuur 4B). Vergeleken met de NS-groep was de p-ERK1/2-expressie in de PPF-groep ebenfalls significant lager (p < 0,01 vs de NS-groep; Figuur 4B). Echter, vergeleken met de blank-groep bleef de p-ERK1/2-expressie in de PPF-groep 4 u na de incisie significant verhoogd. Op soortgelijke wijze verschilde de spinale t-ERK1/2-expressie 4 u na de incisie niet significant tussen de Blank-, IP-, DMSO- en U0126-groepen (Figuur 4C). Vergeleken met de blank-groep was de p-ERK1/2-expressie 4 u na de incisie significant verhoogd in de IP- en DMSO-groepen (p < 0,001 vs de blank-groep; Figuur 4D). Vergeleken met de IP-groep verminderde preoperatieve intrathecale toediening van U0126 de p-ERK1/2-expressie significant (p < 0,001 vs de IP-groep; Figuur 4D). Vergeleken met de DMSO-groep was de p-ERK1/2-expressie in de U0126-groep eveneens significant lager (p < 0,001 vs de DMSO-groep; Figuur 4D). Opmerkelijk is dat de p-ERK1/2-expressie in de U0126-groep 4 u na de incisie niet significant verschilde van die in de blank-groep. Voorbehandeling met NS of DMSO had geen significant effect op de p-ERK1/2-expressie in vergelijking met de IP-groep.

Immunofluorescentie-observaties van spinale celmarkers en inflammatoire mediatoren

De resultaten van de immunofluorescentie toonden kwalitatief een sterkere NeuN-immunoreactiviteit aan in de ipsilaterale dorsale hoorn 4 u na de incisie vergeleken met de contralaterale zijde (Figuur 5). In de blanco groep toonden representatieve beelden de baselinereactiviteit van NeuN, GFAP en Iba-1 in de ipsilaterale dorsale hoorn van het ruggenmerg (Figuur 6A–C). In de IP-groep was de NeuN-immunoreactiviteit kwalitatief sterker dan in de blanco groep (Figuur 6D vs Figuur 6A), was de GFAP-immunoreactiviteit eveneens sterker (Figuur 6E vs Figuur 6B) en was ook de Iba-1-immunoreactiviteit verhoogd (Figuur 6F vs Figuur 6C). Tegelijkertijd leken astrocyten en microglia in de IP-groep hypertrofisch, met vergrote cellichamen en dikkere, sterker vertakte uitlopers (Figuur 6E,F).

In de PPF-groep suggereerden representatieve afbeeldingen een zwakkere NeuN-immunoreactiviteit dan in de IP-groep (Figuur 6G vs Figuur 6D), een zwakkere GFAP-immunoreactiviteit (Figuur 6H vs Figuur 6E) en een zwakkere Iba-1-immunoreactiviteit (Figuur 6I vs Figuur 6F). In de U0126-groep suggereerden representatieve afbeeldingen op soortgelijke wijze een zwakkere NeuN-immunoreactiviteit dan in de IP-groep (Figuur 6J vs Figuur 6D), een zwakkere GFAP-immunoreactiviteit (Figuur 6K vs Figuur 6E) en een zwakkere Iba-1-immunoreactiviteit (Figuur 6L vs Figuur 6F). In zowel de PPF- als de U0126-groepen leken astrocyten en microglia minder hypertrofisch, met kleinere cellichamen en minder en dunnere uitlopers (Figuur 6H,I,K,L). De bijbehorende analyse van de fluorescentie-intensiteit van NeuN, GFAP en Iba-1 was consistent met de representatieve immunofluorescentie-observaties (Figuur 6M–O, respectievelijk).

Vier uur na de incisie waren de immunoreactiviteit en de relatieve fluorescentie-intensiteit van TNF-α en COX-2 verhoogd in de ipsilaterale dorsale hoorn van de IP-groep vergeleken met de blanco-groep. Beide maten waren lager na preoperatieve intrathecale behandeling met PPF of U0126 (Figuur 7A–C).

Cellulaire lokalisatie van spinale p-ERK1/2 via immunofluorescentie

De resultaten van de immunofluorescentie toonden aan dat de p-ERK1/2-immunoreactiviteit in de blanco groep zwak was in het ruggenmerg en alleen werd waargenomen in NeuN-positieve neuronen (Figuur 8A–C). In tegenstelling hiermee was de p-ERK1/2-immunoreactiviteit 4 u na de incisie duidelijk verhoogd in de ipsilaterale dorsale hoorn van het ruggenmerg en co-lokaliseerde deze niet alleen met neuronen, maar ook met GFAP-positieve astrocyten en Iba-1-positieve microglia (Figuur 8D–I). Deze bevinding geeft aan dat de incisie een bredere cellulaire distributie van p-ERK1/2 induceerde, van uitsluitend neuronen onder baseline-condities naar neuronen, astrocyten en microglia na het letsel.

In vitro validatie van het ERK1/2-afhankelijke mechanisme in spinale astrocyten

Om verder te evalueren of PPF de afgifte van inflammatoire mediatoren op cellulair niveau kon onderdrukken via ERK1/2-gerelateerde signalering, werden primaire spinale astrocyten van ratten gestimuleerd met LPS en behandeld met PPF of U0126 (10 µM). Western blot-analyse toonde aan dat PPF de LPS-geïnduceerde expressie van p-ERK1/2 reduceerde, terwijl de fosforylering van p-p38 en p-JNK niet duidelijk veranderd was (Figuur 9A), wat wijst op een relatieve selectiviteit voor de ERK1/2-route onder deze omstandigheden. Parallel hieraan reduceerde PPF de spiegels van TNF-α, PGE2 (een downstreamproduct van COX-2-activiteit) en IL-6 in het supernatants van de kweek in vergelijking met de Stim-groep; U0126 vertoonde vergelijkbare remmende effecten (Figuur 9B).

Om te testen of persistente ERK1/2-activering het ontstekingsremmende effect van PPF zou kunnen verzwakken, werden rescue-experimenten uitgevoerd. Endogene ERK1/2 werd neergeslagen met behulp van siRNA, waarna een constitutief actief ERK1/2 (CA-ERK1/2) construct werd geïntroduceerd (Figuur 9C). In astrocyten die CA-ERK1/2 tot expressie brachten, reduceerde PPF de spiegels van TNF-α, PGE2 of IL-6 niet langer in dezelfde mate (Figuur 9D), wat aantoont dat de onderdrukking van ERK1/2-fosforylering bijdraagt aan het ontstekingsremmende effect van PPF in dit in vitro astrocytenmodel.

Collectief leveren deze in vitro bevindingen mechanistische ondersteuning op cellulair niveau dat PPF de afgifte van inflammatoire mediatoren remt via een ERK1/2-afhankelijk mechanisme in spinale astrocyten, wat de in vivo observationele gegevens aanvult.

figure-results-1
Figuur 1: Effecten van preoperatieve intrathecale PPF of U0126 op door incisie geïnduceerde mechanische en thermische hyperalgesie. (A) PWMT in de blanco, IP, PPF en U0126-groepen. (B) PWMT in de IP- en vehicle-controlegroepen. (C) PWTL in de blanco, IP, PPF en U0126-groepen. (D) PWTL in de IP- en vehicle-controlegroepen. Gegevens zijn gemiddelde ± SD (n = 6 ratten per groep) en zijn geanalyseerd via twee-weg repeated-measures ANOVA. ***p < 0.001 ten opzichte van de baseline; #p < 0.05, ##p < 0.01 en ###p < 0.001 ten opzichte van de IP-groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Tijdverloop van de expressie van spinale celmarkers en ERK1/2-fosforylering na incisie. (A) Kwantificering en representatieve Western blots van NeuN, GFAP en Iba-1 in de IP-groep vanaf de baseline tot 72 u na de incisie. (B) Kwantificering en representatieve Western blots van t-ERK1/2 en p-ERK1/2 over dezelfde periode. Waarden werden genormaliseerd ten opzichte van de blanco-groep (100%) en worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3 ratten per tijdspunt). Algemene verschillen werden geanalyseerd met een-weg ANOVA met de aangegeven paarsgewijze vergelijkingen. *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001 ten opzichte van de baseline. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Effecten van preoperatieve intrathecale PPF of U0126 op spinale neuronale en gliale markers 4 u na incisie. (A–C) NeuN, GFAP en Iba-1 in de blanco, IP, normale zoutoplossing- en PPF-groepen. (D–F) NeuN, GFAP en Iba-1 in de blanco, IP, dimethylsulfoxide- en U0126-groepen. Representatieve Western blots worden rechts getoond. Waarden zijn genormaliseerd naar de blancogroep (100%) en worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3 ratten per groep). *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001 ten opzichte van blanco; #p < 0,05 en ##p < 0,01 ten opzichte van IP; Δp < 0,05, ΔΔp < 0,01 en ΔΔΔp < 0,001 ten opzichte van de overeenkomstige vehikelgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Effecten van preoperatieve intrathecale PPF of U0126 op spinale ERK1/2-fosforylering 4 u na incisie. (A,B) t-ERK1/2 en p-ERK1/2 in de blanco, IP, normale zoutoplossing en PPF-groepen. (C,D) t-ERK1/2 en p-ERK1/2 in de blanco, IP, dimethylsulfoxide en U0126-groepen. Representatieve Western blots worden rechts getoond. Waarden zijn genormaliseerd ten opzichte van de blancogroep (100%) en worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3 ratten per groep). **p < 0,01 en ***p < 0,001 versus blanco; ###p < 0,001 versus IP; ΔΔp < 0,01 en ΔΔΔp < 0,001 versus de overeenkomstige vehikelgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Ipsilaterale en contralaterale spinale NeuN-immunoreactiviteit na incisie. Een representatieve transversale sectie van het lumbale ruggenmerg van de IP-groep 4 u na incisie toont NeuN-kleuring in de contralaterale en ipsilaterale dorsale hoorns. De afbeelding is representatief voor n = 3 ratten en wordt verstrekt voor kwalitatieve anatomische vergelijking. Schaalbalk = 500 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Effecten van PPF en U0126 op spinale neuronale en gliale immunoreactiviteit 4 u na incisie. (A–C) NeuN, GFAP en Iba-1 in de blanco-groep. (D–F) Overeenkomstige kleuring in de IP-groep. (G–I) Overeenkomstige kleuring na PPF-behandeling. (J–L) Overeenkomstige kleuring na U0126-behandeling. (M–O) Respectievelijk relatieve fluorescentie-intensiteiten van NeuN, GFAP en Iba-1. Balken tonen gemiddelde ± SD (n = 3 ratten per groep); *p < 0.05, **p < 0.01 en ***p < 0.001 voor de aangegeven vergelijkingen.Schaalbalken = 200 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Spinale TNF-α en COX-2 immunoreactiviteit na incisie en behandeling. (A) Representatieve TNF-α en COX-2 beelden van de blanco, IP, PPF en U0126 groepen 4 u na de incisie. (B) Relatieve TNF-α fluorescentie-intensiteit. (C) Relatieve COX-2 fluorescentie-intensiteit. Staven tonen het gemiddelde ± SD (n = 3 ratten per groep); ***p < 0,001 voor de aangegeven vergelijkingen. Schaalbalken = 200 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Cellulaire lokalisatie van spinale p-ERK1/2 op 4 u na incisie. (A–C) p-ERK1/2 co-kleuring met respectievelijk NeuN, GFAP en Iba-1 in de controlegroep. (D–F) Overeenkomstige co-kleuring in de IP-groep; pijlen identificeren representatieve co-gelokaliseerde cellen. Rood geeft p-ERK1/2 aan, groen geeft de celmarker aan en geel geeft co-lokalisatie aan. (G–I) Relatieve fluorescentie-intensiteiten geassocieerd met respectievelijk NeuN-, GFAP- en Iba-1-positieve regio's. Staven tonen het gemiddelde ± SD (n = 3 ratten per groep); **p < 0,01 en ***p < 0,001 voor de aangegeven vergelijkingen. Schaalbalken = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: ERK1/2-afhankelijke ontstekingsremmende effecten van PPF in primaire astrocyten uit het ruggenmerg van ratten. (A) Representatieve Western blots die laten zien dat PPF de door LPS geïnduceerde p-ERK1/2 verminderde zonder een duidelijk effect op p-p38 of p-JNK. (B) Concentraties van TNF-α, PGE2 en IL-6 in kweeksupernatanten na behandeling met LPS, PPF of U0126. (C) Western blots die de siRNA-gemedieerde ERK1/2-knockdown en expressie van constitutief actieve ERK1/2 (CA-ERK1/2) bevestigen. (D) Concentraties van TNF-α, PGE2 en IL-6 na CA-ERK1/2-expressie met of zonder PPF. Staven tonen het gemiddelde ± SD van onafhankelijke in vitro experimenten; ***p < 0,001 voor de aangegeven vergelijkingen; ns, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De meeste patiënten lijden na een operatie aan acute pijn, niet alleen fysiek maar soms zelfs mentaal33, maar er is nog veel onbekend over de gedetailleerde mechanismen van acute postoperatieve pijn. Naast de krachtige effecten van pijnstillende medicatie volgen onvermijdelijk bijwerkingen, waardoor het onderzoek naar veiligere, effectieve analgesica van cruciaal belang is. Deze studie was gebaseerd op een eerder gevalideerd incisiemodel bij ratten voor het simuleren van acute postoperatieve pijn, dat eenvoudig en haalbaar te prepareren was27. In het huidige onderzoek werden veranderingen in spinale neuronale en gliale markers, ERK1/2-fosforylering en inflammatoire mediatoren na de incisie geëvalueerd, en werd onderzocht of het antihyperalgesische effect van preoperatieve intrathecale toediening van PPF geassocieerd was met parallelle veranderingen in spinale ERK1/2-fosforylering en de expressie van inflammatoire cytokinen.

Na de incisie ontwikkelden ratten in de IP-groep een robuuste mechanische en thermische hyperalgesie, terwijl voorbehandeling met het vehikel geen detecteerbaar effect had op zowel de gedragsmatige als moleculaire uitkomsten. Deze bevindingen ondersteunen de stabiliteit van het model en geven aan dat de geobserveerde effecten in de PPF- en U0126-groepen waarschijnlijk niet toeschrijfelijk waren aan de injectieprocedure of het vehikel zelf. Daarnaast moet de toename van de NeuN-expressie na de incisie met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd als een verandering in de expressie van een neuronale marker en niet als direct bewijs van neuronale activatie. Samen vormen deze waarnemingen de basis voor het onderzoeken van gliale en ERK1/2-gerelateerde responsen bij de vroege ontwikkeling van incisiepijn.

Er is aangetoond dat glialcellen een belangrijke rol spelen bij synaptische vorming, synaptische informatieoverdracht en -integratie, en de regulatie van synaptische plasticiteit. De immunologische en pro-inflammatoire functies van glialcellen bij pijnbewerking, en in het bijzonder van geactiveerde spinale astrocyten en microglia, kunnen de centrale sensitisatie versterken die betrokken is bij het mediëren van hyperalgesie en postoperatieve gedragsveranderingen7,34. Maladaptieve neurologische veranderingen in het ruggenmerg kunnen leiden tot een verhoogde responsiviteit op nociceptieve of non-nociceptieve stimuli. Er is aanzienlijk bewijs dat activatie van spinale astrocyten en microglia betrokken is bij de ontwikkeling en het in stand houden van hyperalgesie in modellen van spinale zenuwschade35, door weefselplasminogeenactivator geïnduceerde pijn16, incisiepijn11,12 en botkankerpijn19,31. Daarom lijkt spinale gliale activatie een gemeenschappelijk kenmerk te zijn van meerdere pijntoestanden, en een verdere verkenning van deze rol bij incisiepijn kan het huidige begrip van postoperatieve pijnmechanismen uitbreiden.

De huidige bevindingen ondersteunen het standpunt dat spinale astrocyten en microglia deelnemen aan de vroege neuroinflammatoire respons na een incisie12. In plaats van identieke temporele patronen te vertonen, vertoonden GFAP, Iba-1 en p-ERK1/2 gedeeltelijk verschillende tijdspaden, wat suggereert dat verschillende glia-gerelateerde processen kunnen bijdragen aan verschillende fasen van de ontwikkeling van postoperatieve pijn31,35. Immunofluorescentiebevindingen ondersteunden deze interpretatie verder door hypertrofische morfologische veranderingen in astrocyten en microglia na de incisie aan te tonen. Samen met de toenames in TNF-α en COX-2 immunoreactiviteit zijn deze observaties consistent met het concept dat glia-geassocieerde inflammatoire signalering bijdraagt aan acute incisionele hyperalgesie7,36.

Propentofylline, een derivaat van methylxanthine, werd aanvankelijk bestudeerd als een cerebrovasculair actief geneesmiddel vanwege de antiplaatjesaggregatie-activiteit en de ondersteuning van het behoud van het langetermijngeheugen37. Echter, het regulerende effect van PPF op gliacellen maakt het ook potentieel waardevol als analgeticum. Studies wijzen uit dat PPF de activatie van microglia kan belemmeren door de afbraak van intracellulair cyclisch adenosinemonofosfaat te remmen en de heropname van extracellulair adenosine te verminderen4,5. In een in vitro studie remde PPF de proliferatie van astrocyten door het TNF-α-geïnduceerde mammalian target of rapamycin-pad te hinderen6. Bijgevolg is het het regulerende effect van PPF op gliacellen dat de deelname ervan aan de modulatie van pijnprocessen mogelijk maakt.

Het aanhoudende antihyperalgesische effect van PPF in de huidige studie, samen met de reducties in de expressie van GFAP en Iba-1, ondersteunt de interpretatie dat gliale modulatie een belangrijk onderdeel is van de analgeserende werking van PPF in dit model. Eerdere studies hebben ook gesuggereerd dat PPF glia-gerelateerde inflammatoire signalering in pijntoestanden kan onderdrukken5,31. Daarnaast suggereert de parallelle afname van TNF-α en COX-2 dat PPF incisiepijn gedeeltelijk kan verminderen door glia-geassocieerde inflammatoire responsen te dempen. Omdat de huidige gegevens echter associatief en niet mechanistisch zijn, moeten deze resultaten worden geïnterpreteerd als ondersteuning voor gliale betrokkenheid in plaats van als bewijs voor een direct causaal pad.

De betrokkenheid van ERK1/2, een paar belangrijke intracellulaire signaalgereguleerde kinasen, bij de ontwikkeling en het behoud van verschillende pijnprocessen (door neuronale exciteerbaarheid en synaptische plasticiteit in de hersenen en het ruggenmerg te mediëren) is bewezen21. Zo toonde een studie aan dat de injectie van capsaïcine of formaline een korte en snelle toename van p-ERK1/2 in het ruggenmerg induceerde, maar dat spinale ERK1/2-activatie veel langer aanhield na de injectie van compleet adjuvans van Freund of bijengif (na een korte latentieperiode)38,39. Omgekeerd bereikte spinale ERK1/2-activatie geïnduceerd door zenuwletsel in een andere studie extreem vroeg een piek en hield deze enige tijd aan, waarbij hyperalgesie zich ontwikkelde na de piek van p-ERK1/235. Daarom kan de fosforylering van ERK1/2 plaatsvinden in verschillende stadia bij verschillende pijnprocessen, en kan upregulatie van p-ERK1/2 in het ruggenmerg belangrijk zijn voor zowel de onmiddellijke inductie als de langetermijngenrespons.

In de huidige studie nam de door de incisie geïnduceerde fosforylering van ERK1/2 in de eerste 24 u na de incisie significant toe vergeleken met de blanco groep, en de expressie van p-ERK1/2 bereikte een piek 4 u na de incisie (zoals eerder beschreven)24, wat samenviel met het tijdstip waarop de NeuN-expressie het hoogst was. Tegelijkertijd, zoals onthuld door de resultaten van immunofluorescentie, was de door de incisie geïnduceerde fosforylering van ERK1/2 gelijktijdig verspreid over neuronen, astrocyten en microglia in de ipsilaterale dorsale hoorn van het ruggenmerg, wat de visie ondersteunt dat ERK1/2-gerelateerde signalering bijzonder relevant is voor de vroege fase van incisie-geïnduceerde hyperalgesie. Bovendien verminderde de preoperatieve intrathecale toediening van U0126 de expressie van spinale gliale markers, NeuN en p-ERK1/2 4 u na de incisie en verlichtte het zowel de mechanische als thermische hyperalgesie tijdens de vroege post-incisieperiode, wat suggereert dat spinaal p-ERK1/2 betrokken kan zijn bij de vroege fase van acute hyperalgesie na een incisie. Echter, omdat GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 en de gedragsresultaten verschillende temporele profielen vertoonden, dient de huidige mechanistische interpretatie beperkt te blijven tot de vroege post-incisiefase, vertegenwoordigd door het tijdstip van 4 u, in plaats van gegeneraliseerd te worden naar de gehele postoperatieve periode.

Bovendien verminderde preoperatieve intrathecale toediening van PPF in de huidige studie ook de ERK1/2-fosforylering 4 u na de incisie, wat suggereert dat de waargenomen veranderingen in de expressie van spinale NeuN, GFAP en Iba-1 mogelijk, ten minste gedeeltelijk, geassocieerd zijn met ERK1/2-gerelateerde signalering. Preoperatieve intrathecale toediening van U0126 verminderde eveneens de TNF-α- en COX-2-immunoreactiviteit, wat een mogelijk verband ondersteunt tussen ERK1/2-fosforylering en de expressie van inflammatoire mediatoren na de incisie. De aanvullende in vitro astrocytenexperimenten getoond in Figuur 9 boden ondersteuning op cellulair niveau voor een ERK1/2-afhankelijke anti-inflammatoire component, aangezien aanhoudende ERK1/2-activering het vermogen van PPF om de afgifte van TNF-α, PGE2 en IL-6 te verminderen, verzwakte. Omdat deze rescue-experimenten echter werden uitgevoerd in gekweekte astrocyten in plaats van in het intacte ruggenmerg, en omdat er geen in vivo rescue of celtype-selectieve manipulatie is uitgevoerd, moeten de in vivo conclusies nog steeds worden geïnterpreteerd als ondersteunend en niet als definitief bewijs voor een causaal ERK1/2-afhankelijk mechanisme.

Om de mogelijke relaties tussen gliale celactivatie, p-ERK1/2-expressie en de afgifte van inflammatoire cytokinen verder te bespreken, werden de ruimtelijke lokalisatiepatronen waargenomen met immunofluorescentie overwogen. Na de incisie werd p-ERK1/2 co-expressie waargenomen met GFAP-positieve astrocyten en Iba-1-positieve microglia in het dorsale hoorn van het ruggenmerg 4 u na de incisie. In combinatie met de Western blot- en immunofluorescentiebevindingen, die aantonen dat zowel PPF als U0126 geassocieerd waren met een verminderde expressie van p-ERK1/2, TNF-α en COX-2, suggereren deze gegevens dat ERK1/2-fosforylering in spinale gliacellen betrokken kan zijn bij de inflammatoire respons na een incisie. De in vitro-gegevens in primaire astrocyten ondersteunen verder een directe cellulaire link tussen PPF-behandeling, ERK1/2-suppressie en de afgifte van inflammatoire mediatoren. Niettemin toont het in vivo-bewijs associaties en behandelingsgerelateerde parallelle veranderingen aan, terwijl de cellulaire experimenten complementair zijn aan, maar geen vervanging vormen voor in vivo celtype-specifieke causale validatie. Omdat de immunofluorescentieanalyse gebaseerd was op een beperkt aantal dieren en velden, moeten deze waarnemingen voorzichtig worden geïnterpreteerd en in samenhang met de Western blot- en in vitro-bevindingen worden beschouwd.

Verschillende procedurele stappen hebben een onevenredig groot effect op de reproduceerbaarheid. Intrathecale injectie vereist zowel een karakteristieke staartrespons als bevestiging door cerebrospinale vloeistof; weerstand tijdens de injectie, het ontbreken van bevestiging of een nieuw neurologisch defect moeten leiden tot uitsluiting in plaats van herhaalde injectie op dezelfde plek. Gedragstests zijn gevoelig voor acclimatisatie, kooijomstandigheden, de plaatsing van stimuli en de verwachtingen van de onderzoeker, waardoor blindering, vaste intervallen en consistente omgevingscondities essentieel zijn. De tijdstip van weefselverzameling, uniforme eiwitoverdracht, antilichaamincubatie en identieke microscopie-instellingen binnen elke kleuringsbatch zijn eveneens belangrijk. Veelvoorkomende problemen omvatten variabele drempelwaarden voor terugtrekking door onvoldoende acclimatisatie, zwakke of ongelijkmatige Western blot-banden door incomplete overdracht of overbelichting, en een hoge fluorescentieachtergrond door onvoldoende wassen, een te hoge antilichaamconcentratie of verzadigde acquisitie-instellingen.

Het protocol kan worden aangepast aan de wetenschappelijke vraagstelling. Een breder tijdsverloop kan worden gebruikt wanneer late gliale responsen van belang zijn, en dosisbereiken of alternatieve toedieningswegen kunnen worden toegevoegd wanneer de translationele haalbaarheid prioriteit heeft. In vergelijking met ontstekings- of neuropathische pijnmodellen is het plantaire incisiemodel relatief snel en praktisch en reproduceert het een gedefinieerde postoperatieve beschadiging27. De combinatie van gedragstests, Western blotting en cel-geassocieerde immunofluorescentie biedt complementaire functionele, moleculaire en ruimtelijke informatie; dit is echter arbeidsintensiever dan een assay met één eindpunt en stelt op zichzelf geen cel-specifieke causaliteit vast. Farmacologische vergelijking met U0126 versterkt de interpretatie van de signaalroute, maar blijft minder specifiek dan genetische of celtype-selectieve manipulatie20,21,22,23,24,25.

Toekomstige toepassingen omvatten het testen van beide geslachten, grotere chirurgische letsels, klinisch haalbare toedieningsroutes, aanvullende postoperatieve tijdstippen en interventies gericht op specifieke gliale populaties. De workflow is praktisch voor het screenen van kandidaat-analgetische of glia-modulerende behandelingen, omdat het incisiemodel kort is, de gedragsmatige eindpunten reproduceerbaar zijn en de moleculaire assays gebruikmaken van standaard laboratoriummethoden. De reproduceerbaarheid is desalniettemin afhankelijk van vooraf vastgestelde exclusiecriteria, geblindeerde beoordeling van de uitkomsten, consistente beeldacquisitie en volledige rapportage van ruwe gegevens en analyse-instellingen.

Beperkingen

Deze studie kent enkele beperkingen. Ten eerste stelt het incisiemodel van de plantaire poot een relatief geringe chirurgische verwonding voor en weerspiegelt dit mogelijk niet volledig grotere chirurgische ingrepen, zoals een thoracotomie of laparotomie. Daarom is voorzichtigheid geboden bij het extrapoleren van de huidige bevindingen naar andere vormen van postoperatieve pijn. Daarnaast waren alleen mannelijke Sprague–Dawley ratten inbegrepen, wat de generaliseerbaarheid van deze bevindingen over de seksen beperkt. Gezien de bekende sekseverschillen in pijnreacties, analgesische effecten en patronen van gliale activatie, is verder onderzoek met vrouwelijke dieren gerechtvaardigd.

De belangrijkste moleculaire en histologische waarnemingen waren gericht op het tijdstip 4 u na de incisie. Omdat verschillende eindpunten, waaronder GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 en gedragsmatige uitkomsten, verschillende temporele profielen vertoonden na de incisie, moet de mechanistische interpretatie van de huidige bevindingen hoofdzakelijk worden beperkt tot de vroege post-incisie fase. Bovendien werden de moleculaire experimenten hierin uitgevoerd met een relatief beperkte steekproefomvang, wat de statistische robuustheid van deze waarnemingen mogelijk vermindert.

Extracellulaire signaalgereguleerde kinase 1 en 2 werden gezamenlijk geëvalueerd als p-ERK1/2; hun individuele bijdragen werden niet afzonderlijk onderzocht. Daarom konden de respectievelijke rollen van ERK1 en ERK2 bij incisie-geïnduceerde pijnverwerking in de huidige studie niet worden bepaald. Daarnaast was de kwantificering van de fluorescentie-intensiteit gebaseerd op een beperkt aantal dieren en velden en omvatte deze geen stereologische celtellingen of formele co-lokalisatiecoëfficiënten. Deze waarnemingen dienen daarom voorzichtig te worden geïnterpreteerd, samen met de bevindingen van de Western blot.

Ten slotte, hoewel de in vitro rescue-experimenten met astrocyten mechanistische ondersteuning boden voor de ERK1/2-afhankelijke regulatie van inflammatoire mediatoren, zijn de stroomopwaartse regulerende gebeurtenissen na de incisie en de stroomafwaartse gebeurtenissen in intact ruggenmergweefsel niet diepgaand onderzocht. Het in vitro cultuursysteem kan bovendien de interacties tussen neuronen, astrocyten, microglia en infiltrerende immuuncellen in de dorsale hoorn van het ruggenmerg niet volledig reproduceren. Bijgevolg ondersteunt de huidige studie een ERK1/2-gerelateerd mechanisme, maar stelt het geen volledige cel-specifieke causaliteit in vivo vast.

Conclusie

De huidige studie demonstreert dat incisie-geïnduceerde toenames in de spinale expressie van NeuN, GFAP en Iba-1 werden afgezwakt door de preoperatieve intrathecale toediening van PPF. Dit effect ging gepaard met de verlichting van acute mechanische en thermische hyperalgesie en met reducties in ERK1/2-fosforylering en TNF-α- en COX-2-expressie na de incisie. Deze bevindingen ondersteunen echter (zonder definitief mechanisch bewijs te leveren voor) een associatie tussen het antihyperalgesische effect van PPF en verminderde ERK1/2-fosforylering in spinale gliacellen (in verband met een verminderde expressie van inflammatoire mediatoren). Het antihyperalgesische effect van PPF hield aan gedurende de gehele observatieperiode na de incisie, terwijl het effect van de MEK1/2-remmer U0126 hoofdzakelijk beperkt was tot de vroege post-incisieperiode. Deze resultaten suggereren dat ERK1/2-signalering mogelijk bijzonder relevant is tijdens de vroege ontwikkeling van incisiepijn. Het langer aanhoudende effect van PPF geeft aan dat het werkingsmechanisme mogelijk aanvullende pathways omvat naast enkel ERK1/2-remming. PPF zou hiermee een potentiële therapeutische interventie kunnen vormen, in plaats van een biologisch doelwit, voor het verbeteren van de behandeling van acute postoperatieve pijn.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen persoonlijke, financiële, commerciële of academische belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Haijiao Zhou en Ming Wang voor de technische ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,01 M PBS-bufferSolarbioP1020
1,0 M Tris-HCl-buffer (pH 6,8)SolarbioT1020
1,5 M Tris-HCl-buffer (pH 8,8)SolarbioT1010
10% natriumdodecylsulfaat (SDS)SolarbioS1010
10× TBST-stockoplossingSolarbioT1081
30% acrylamideSolarbioA1010
4× protein loading bufferSolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
AmmoniumpersulfaatSolarbioA1030
Automatische schaapsijs-machineChangshu XuekeIMS-40
Bovien serumalbumine (BSA)SolarbioA8020
Cryostaat CM150LeicaCM150
Digitale pH-meter—PHS-3C
Dimethylsulfoxide (DMSO)SolarbioD8371
Elektronische analytische balansCany—
Enhanced chemiluminescence (ECL) reagensSolarbioPE0010
FilmKodak—
Fluorescentiemicroscoop DP71OlympusDP71
Inbeddingsmedium voor vriescoupesSakura4583
Gelelektroforese-apparaatBIO-RAD—
GlycerolSolarbioIG0910
GlycineSolarbioG8200
Geit anti-muis Alexa Fluor 594 secundair antilichaamProteintechSA00013-3
Geit anti-muis mierikwortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaamZSGB-BIOZB2305
Geit anti-konijn Alexa Fluor 488 secundair antilichaamProteintechSA00013-2
Geit anti-konijn mierikwortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaamZSGB-BIOZB2301
GeitenserumSolarbioSL038
GraphPad PrismGraphPad Software5
Hogesnelheidsgekoelde centrifuge 3K15Sigma3K15
Horizontale orbitale schudmachine TS-1000Haimen QilinbeierTS-1000
ImageJNational Institutes of Health1.51j8
MethanolTianjin Guangfu—
Muis anti-rat GAPDH primair antilichaamProteintech60004-1-Ig
Muis anti-rat p-ERK1/2 primair antilichaamCST9101S
Na2HPO3Tianjin Beichen Fangzheng—
NaH2PO3Tianjin Damao—
ParaformaldehydeBiosharpBL539A
Microscopiedia van pathologische graadShitai—
Fenylmethansulfonylfluoride (PMSF)BeyotimeST506
Plantar Test 37370UGO BASILE37370
Polyvinylideenfluoride-membraanSolarbio—
Propentofylline (PPF)TaosuT19812
Konijn anti-rat COX-2 primair antilichaamAbcamAb179800
Konijn anti-rat GFAP primair antilichaamProteintech16825-1-AP
Konijn anti-rat Iba-1 primair antilichaamProteintech10904-1-AP
Konijn anti-rat NeuN primair antilichaamAbcamAb279297
Konijn anti-rat t-ERK1/2 primair antilichaamProteintech11257-1-AP
Konijn anti-rat TNF-α primair antilichaamProteintech29652-1-AP
RIPA-lysebufferSolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
Magere melkpoederSolarbioD8340
SPSSIBM22
Tetramethylethylendiamine (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
Ultra-laagtemperatuurvriezerHaier—
Ultra-laagtemperatuurvriezerSanyo—
Ultrapuur waterzuiveringssysteemHeal Force—
von Frey-filamentenNorth Coast Medical—

Referenties

  1. Bateman C. Pain management—the global sound of silence. S Afr Med J. 2015;105:621-3.
  2. Pogatzki-Zahn EM, Segelcke D, Schug SA. Postoperative pain—from mechanisms to treatment. Pain Rep. 2017;2:e588.
  3. Kaiser U, Kopkow C, Deckert S, Neustadt K, Jacobi L, Cameron P, et al. Validation and application of a core set of patient-relevant outcome domains to assess the effectiveness of multimodal pain therapy (VAPAIN): a study protocol. BMJ Open. 2015;5:e008146.
  4. Tawfik VL, Nutile-McMenemy N, Lacroix-Fralish ML, DeLeo JA. Efficacy of propentofylline, a glial modulating agent, on existing mechanical allodynia following peripheral nerve injury. Brain Behav Immun. 2007;21:238-46.
  5. Wu F, Li H, Sun J, Li X, Jiang W, Huang Y, et al. Inhibition of GAP-43 by propentofylline in a rat model of neuropathic pain. Int J Clin Exp Pathol. 2013;6:1516-22.
  6. Norsted Gregory E, Codeluppi S, Gregory JA, Steinauer J, Svensson CI. Pentoxifylline and propentofylline prevent proliferation and activation of the mammalian target of rapamycin and mitogen-activated protein kinase in cultured spinal astrocytes. J Neurosci Res. 2013;91:300-12.
  7. Ji RR, Chamessian A, Zhang YQ. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 2016;354:572-7.
  8. Grace PM, Hutchinson MR, Maier SF, Watkins LR. Pathological pain and the neuroimmune interface. Nat Rev Immunol. 2014;14:217-31.
  9. Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy? Pain. 2013;154 Suppl 1:S10-28.
  10. Chen G, Park CK, Xie RG, Ji RR. Connexin-43 induces chemokine release from spinal cord astrocytes to maintain late-phase neuropathic pain in mice. Brain. 2014;137:2193-209.
  11. Liu Y, Hou B, Zhang W, Wang D, Wang H, Yu G, et al. The activation of spinal astrocytes contributes to preoperative anxiety-induced persistent postoperative pain in a rat model of incisional pain. Eur J Pain. 2015;19(5):733-40.
  12. Obata H, Eisenach JC, Hussain H, Bynum T, Vincler M. Spinal glial activation contributes to postoperative mechanical hypersensitivity in the rat. J Pain. 2006;7:816-22.
  13. Masaki E, Mizuta K, Ohtani N, Kido K. Early postoperative nociceptive threshold and production of brain-derived neurotrophic factor induced by plantar incision are not influenced by minocycline in a rat: role of spinal microglia. Neurosignals. 2016;24:15-24.
  14. Cargnello M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev. 2011;75:50-83.
  15. Roskoski R Jr. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66:105-43.
  16. Berta T, Liu YC, Xu ZZ, Ji RR. Tissue plasminogen activator contributes to morphine tolerance and induces mechanical allodynia via astrocytic IL-1β and ERK signaling in the spinal cord of mice. Neuroscience. 2013;247:376-85.
  17. Bi RY, Meng Z, Zhang P, Wang XD, Ding YQ, Gan YH, et al. Involvement of trigeminal ganglionic Nav1.7 in hyperalgesia of inflamed temporomandibular joint is dependent on ERK1/2 phosphorylation of glial cells in rats. Eur J Pain. 2013;17(7):983-94.
  18. Mikuzuki L, Saito H, Katagiri A, Okada S, Kubo A, Suzuki T, et al. Phenotypic change in trigeminal ganglion neurons associated with satellite cell activation via extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is involved in lingual neuropathic pain. Eur J Neurosci. 2017;46:2190-202.
  19. Song Z, Xie W, Chen S, Strong JA, Print MS, Wang JI, et al. STAT1 as a downstream mediator of ERK signaling contributes to bone cancer pain by regulating MHC II expression in spinal microglia. Brain Behav Immun. 2017;60:161-73.
  20. Duncia JV, Santella JB III, Higley CA, Pitts WJ, Wityak J, Frietze WE, et al. MEK inhibitors: the chemistry and biological activity of U0126, its analogs, and cyclization products. Bioorg Med Chem Lett. 1998;8:2839-44.
  21. Ji RR, Gereau RW IV, Malcangio M, Strichartz GR. MAP kinase and pain. Brain Res Rev. 2009;60:135-48.
  22. Li F, Zhang H, Ma X, Zhang X, Wang Y, Zhang J, et al. Annexin A10 contributes to chronic constrictive injury-induced pain through activating ERK1/2 signalling in rats. Int J Neurosci. 2018;128(2):125-32.
  23. Qiu Q, Chai S, Jiang Z, Zhang Y, Liu X, Li M, et al. Propofol produces preventive analgesia via GluN2B-containing NMDA receptor ERK1/2 signaling pathway in a rat model of inflammatory pain. Mol Pain. 2017;13:1744806917737462.
  24. van den Heuvel I, Reichl S, Segelcke D, Zahn PK, Pogatzki-Zahn EM. Selective prevention of mechanical hyperalgesia after incision by spinal ERK1/2 inhibition. Eur J Pain. 2015;19(2):225-35.
  25. Zhang YB, Guo Y, Li H, Wang LN. Gabapentin effects on PKC-ERK1/2 signaling in the spinal cord of rats with formalin-induced visceral inflammatory pain. PLoS One. 2015;10:e0141142.
  26. Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 1983;16:109-10.
  27. Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. Characterization of a rat model of incisional pain. Pain. 1996;64:493-9.
  28. Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1980;20:441-62.
  29. Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988;32:77-88.
  30. Hao J, Chen H, Madigan MC, Coote JH, Zhang Y, Xu XJ, et al. Roles of peripheral mitogen-activated protein kinases in melittin-induced nociception and hyperalgesia. Neuroscience. 2008;152:1067-75.
  31. Wang LN, Yao M, Yang JP, Peng J, Peng Y, Li CF, et al. Cancer-induced bone pain sequentially activates the ERK/MAPK pathway in different cell types in the rat spinal cord. Mol Pain. 2011;7:48.
  32. Yang F, Sun W, Yang Y, Wang Y, Li CL, Fu H, et al. SDF1-CXCR4 signaling contributes to persistent pain and hypersensitivity via regulating excitability of primary nociceptive neurons: involvement of ERK-dependent Nav1.8 up-regulation. J Neuroinflammation. 2015;12:219.
  33. Apfelbaum JL, Chen C, Mehta SS, Gan TJ. Postoperative pain experience: results from a national survey suggest postoperative pain continues to be undertreated. Anesth Analg. 2003;97:534-40.
  34. Latremoliere A, Woolf CJ. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 2009;10:895-926.
  35. Zhuang ZY, Gerner P, Woolf CJ, Ji RR. ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model. Pain. 2005;114:149-59.
  36. Marchand F, Perretti M, McMahon SB. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 2005;6:521-32.
  37. Bath PM, Bath-Hextall FJ. Pentoxifylline, propentofylline and pentifylline for acute ischemic stroke. Cochrane Database Syst Rev. 2004;3:CD000162.
  38. Cui XY, Chen Y, Chen J, Ma ZL, Zhao YL, Li YQ, et al. Differential activation of p38 and extracellular signal-regulated kinase in spinal cord in a model of bee venom-induced inflammation and hyperalgesia. Mol Pain. 2008;4:17.
  39. Ji RR. ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity. J Neurosci. 2002;22:478-85.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Spinale microgliapropentofyllinebehandelingmechanische hyperalgesiethermische hyperalgesieWestern blottingimmunofluorescentieanalyseinflammatoire mediatoren

Gerelateerde artikelen