Methodenartikel

Identificatie van gemodificeerde histonen als bindende substraten van het menselijke Spindlin-familielid 4 (SPIN4) door middel van peptidearrays en native nucleosoompulldown

DOI:

10.3791/70934

⸱

27 maart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetische varianten in menselijke Spindlin Family Member 4 (SPIN4) zijn recentelijk vastgesteld bij patiënten met botovergroei, een nieuwe ontwikkelingsstoornis. Een protocol en nieuwe resultaten die de biochemische identificatie van gemodificeerde histonen in de context van nucleosomen als SPIN4-bindende substraten beschrijven, worden gepresenteerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijk Spindlin Family Member 4 (SPIN4) is zojuist opgedoken als een nieuwe regulator van botgroei. Functieverliesvarianten in SPIN4 werden vastgesteld bij patiënten met een pre- en postnataal overgroeisyndroom, dat wordt overgeërfd op een X-gebonden dominante wijze. SPIN4 bevat drie tandemherhalingen van Tudor-domeinen, die elk een eigen aromatische kooi vormen. Deze Tudor-domeinen worden beschouwd als epigenetische lezersdomeinen voor gemethyleerde arginine- en lysineresiduen van histonen op basis van sequentiehomologie. De exacte bindingssubstraten van SPIN4 blijven echter onduidelijk. Menselijk SPIN4, zowel in zijn wildtype als ziekteverwekkende mutantvormen, werd succesvol gegenereerd via een insectencelexpressiesysteem. Met een histonmodificatie-peptidearray werden de differentiële bindingsaffiniteiten tussen wildtype en mutant SPIN4 bepaald. Functionele validaties toonden verder aan dat SPIN4 een bona fide lezer is van histon H3 Lysine 4-methylering (H3K4me), zoals blijkt uit biochemische pulldown van native mononucleosomen. Deze geïntegreerde aanpak faciliteert een snelle identificatie van epigenetische lezereiwitten als bindende doel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spindlin Family Member 4 (SPIN4) is een epigenetische lezer en is recentelijk geïnspecteerd met het overgroeisyndroom, met een constellatie van pre- en postnatale overgroei en een lange gestalte 1,2. Spin4 knockout (KO) muizen herhaalden het exacte menselijke fenotype, wat de causaliteit ondersteunde. Tot op heden is SPIN4 de enige exclusieve epigenetische lezer die de botgroei negatief reguleert. De biochemische eigenschappen van SPIN4, een cruciale epigenetische lezer voor groei, zijn echter nog niet gekarakteriseerd, waardoor er een cruciale kenniskloof ontstaat in het begrijpen van de fundamentele, ziekteverwekkende mechanismen in deze nieuwe ontwikkelingsstoornis. SPIN4 bevat drie tandemherhalingen van Tudor-domeinen, die doorgaans worden beschouwd als gemethyleerde arginine- of lysine-histonlezereiwitdomeinen3. Een SPIN4D82H missense-variant is onlangs vastgesteld bij een patiënt met prenatale en postnatale botovergroeisyndroom. Deze mutatie treft het eerste Tudor-domein van SPIN4; de relevante bindende substraten van deze Tudor-domeinen blijven echter onduidelijk, wat de functionele dissectie van SPIN4-afhankelijke regulatie van chromatine en genexpressie tijdens de botontwikkeling beperkt.

De identificatie van nieuwe histone-bindende substraten van lezereiwitdomeinen is niet afhankelijk van één enkele, gestandaardiseerde aanpak. Posttranslationele modificaties (PTM's) van histon vinden meestal plaats bij histonen die naar buiten staken vanuit de kerndeeltjes van het nucleosoom. De herkenning van PTM's op histonstaarten door lezerseiwitdomeinen is zeer variabel en vereist vaak multivalente, elektrostatische interacties waarbij nucleosomaal DNA, linker-DNA en/of andere histondomeinen betrokken zijn om de interactie tussen lezer en doelwit gezamenlijk te stabiliseren4. Momenteel zijn PTM's van histonstaartpeptiden geconstrueerd in de vorm van microarrays en op de markt gebracht door verschillende leveranciers5. Hoewel hiponstaartpeptide-gebaseerde PTM-screening voor bindingsdoelen van lezerseiwitdomeinen een hoge doorvoersnelheid heeft, levert dit vaak vals-positieve hits op zonder nucleosomen. Bovendien zijn de experimentele voorwaarden voor dergelijke screenings zeer empirisch en variëren ze van eiwit tot eiwit, waardoor ze technisch moeilijk te behandelen zijn. Synthetische nucleosoom-gebaseerde PTM-screening of pulldown biedt een veel robuustere uitlezing, maar is veel duurder en met een lage doorvoersnelheid, omdat het reconstitueren van nucleosomen met variabele combinaties van PTM's inherent uitdagend is.

Dit protocol beschrijft een snelle aanpak om histon-PTM's in nucleosomen te identificeren als bindende doelen van SPIN4. Recombinante SPIN4 werd gereconstitueerd en gescreend tegen een commerciële histon PTM-peptidearray om potentiële bindingsdoelen te identificeren. Inheemse mononucleosomen met diverse endogene histon-PTM's werden vervolgens gegenereerd uit levende cellen. SPIN4 pulldown van mononucleosomen maakte gerichte antilichaamvalidatie van histon PTM's mogelijk na de initiële screening. Deze geïntegreerde biochemische strategie demonstreert een proof-of-principle-benadering voor tijd- en kostenefficiënte doelzoektocht en kan gemakkelijk worden toegepast om bindende substraten van andere slecht gekarakteriseerde epigenetische lezereiwitten te identificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures waarbij HEK293FT cellen betrokken zijn, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Biosafety Committee (IBC) van Virginia Commonwealth University.

1. Zuivering van recombinante menselijke SPIN4

  1. Klon volwaardige wild-type SPIN4 of SPIN4D82H met een N-terminal 1× FLAG epitooptag in een baculovirale vector 6,7.
  2. Bereid baculovirus voor door Sf9-cellen te transfecteren met baculovirale vectoren, oogst virussen wanneer cellen barsten, aliquot en sla het virus op bij −80 °C 6,7.
  3. Voeg in een 500 mL Erlenmeyer-kolf 100 mL groeimedium, 1,5 × 108 Sf9-cellen en 1 mL P1 baculovirus toe.
  4. Incubeer de cultuur bij 27,5 °C in een orbitale shaker-incubator ingesteld op 125 rpm gedurende 72 uur in het donker.
  5. Zuiver FLAG-SPIN4 met behulp van FLAG-affiniteitsgel in een BC150 lysebuffer met proteaseremmers en elueer het eiwit met 1× FLAG-peptide bij 0,1 mg/mL.
  6. Om het 1× FLAG-peptide volledig te verwijderen, eluiseer je de geïlfueerde FLAG-SPIN4 tegen de BC150 Protein Storage buffer bij 4 °C in de volgende volgorde:
    1. Eerste dialyse: 1 L, 1 uur.
    2. Tweede dialyse: 2 L, 's nachts.
    3. Derde dialyse: 1 L, 1 uur.
  7. Concentreer het gedialyseerde eiwit op het gewenste volume (voor SPIN4, van 600 μL tot 150 μL).
  8. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een Bicinchoninic Acid (BCA) assay en bereken de molaire concentratie dienovereenkomstig.
  9. De hoeveelheid ruwe eiwit die bij elke zuiveringsstap wordt gewonnen en de bijbehorende geschatte opbrengsten worden samengevat in de Aanvullende Tabel 1. De zuivering werd uitgevoerd met 250 mL Sf9-cultuur met 400 μL anti-FLAG affiniteitsgelslib.
  10. Verdun geconcentreerde SPIN4 met 10× in BC150 Protein Storage Buffer (Aanvullende Tabel 2). Laad 1, 2, 5, 10 en 20 μL op een 15% SDS–PAGE gel en visualiseer met Coomassie blue kleuring (Figuur 1A).
  11. Kwantificeer bandintensiteit met behulp van beeldanalysesoftware om de relatieve signaalintensiteit te bepalen tussen lanes die met gelijke volumes geladen zijn.
  12. Deel de intensiteitsverhouding door het molecuulgewicht van elk eiwit om de molaire verhouding te verkrijgen.
  13. Gebruik deze molaire verhouding om de molaire concentratie te corrigeren die in stap 1.8 wordt geschat.
  14. Aliquot gezuiverd eiwit, vries in vloeibare stikstof en bewaar bij −80 °C. Voor kortdurend gebruik bewaar je het bij 4 °C een nacht voordat je doorgaat naar het volgende experiment.

2. Histon peptide-array

  1. Bereid de peptolarrayblokkeringsbuffer voor door 5 g Bovine Serumalbumine (BSA) op te lossen in de BC150 Protein Storage Buffer tot een eindvolume van 100 mL.
  2. Geef optioneel het reactiegebied op de peptidearray een omlijning met een hydrofobe markerpen om het gebruik van reagens te minimaliseren.
  3. Leg meerdere vellen filterpapier in een petrischaal van 15 cm en bevochtig ze met water.
  4. Plaats de peptide-arrays op het bevochtigde filterpapier.
  5. Voeg voorzichtig een blokkeringsbuffer van 300 μL toe om elk arraygebied volledig te dekken.
  6. Bedek de petrischaal en broed 1–3 uur uit op kamertemperatuur.
  7. Bereid FLAG-SPIN4 voor in de blokkeringsbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 1 μM.
  8. Bereid 1× FLAG-peptide voor in een blokkerende buffer tot een uiteindelijke concentratie van 1 μM.
  9. Om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en ongewenste achtergrond te verminderen, voer je de volgende stappen uit in een koele kamer. Verplaats de geblokkeerde arrays (met de petrischaal) naar de koelkamer voordat je eiwitten toevoegt.
  10. Verwijder overtollige blokkeringsbuff uit de arrays.
  11. Voeg voorzichtig het gewenste FLAG-SPIN4 eiwit of FLAG-peptide toe als controle aan elk blok.
  12. Bedek de petrischaal en laat het een nacht in de koelkamer incuberen.
  13. Voeg ongeveer 50 mL peptide-array wash buffer toe aan een Western blot wasdoos en breng deze naar de koelruimte.
  14. Gooi de eiwitoplossing weg en breng de arrays onmiddellijk over in de wasbuffer, met de reactiezijde omhoog.
  15. Was de arrays vijf keer als volgt: de eerste twee wasbeurten elk 1 minuut, en de overige drie wasbeurten elk 5 minuten.
  16. Spoel de arrays af met een peptide-array blocking buffer om het resterende wasmiddel te verwijderen, en breng ze daarna terug in de petrischaal.
  17. Bereid anti-FLAG antistofoplossing voor in verdunning van 1:2000 en voeg 300 μL per blok toe.
  18. Broed 1 uur op kamertemperatuur.
  19. Herhaal stappen 2.14 tot 2.16 om de arrays te wassen.
  20. Bereid HRP-geconjugeerde geiten-anti-muis IgG (secundaire antilichaam) oplossing voor in verdunning van 1:6000 en voeg 300 μL per blok toe.
  21. Broed 1 uur op kamertemperatuur.
  22. Herhaal stappen 2.14 tot 2.16 om de arrays te wassen.
  23. Plaats de arrays in een transparante sheetbeschermer.
  24. Voeg ongeveer 1 mL Enhanced Chemiluminescence (ECL) substraat toe, zodat het reactieoppervlak gelijkmatig wordt bedekt.
  25. Verwijder luchtbellen en neem chemiluminescente en helderveldbeelden vast met een geschikt beeldvormingssysteem (bijv. digitale beeldvormers of autoradiografische films) (Figuur 1B).
  26. Analyseer signaalintensiteit volgens de peptidearray-software en bijbehorende online tools (Figuur 2A–C).

3. Grootschalige expressie van FLAG-SPIN4 voor pulldown-assay

  1. Voeg in een 500 mL Erlenmeyer-kolf 125 mL ESF921 medium, 1,8 × 10 8 Sf9-cellen en 1,2 mL P1 baculovirus toe dat FLAG-SPIN4 of FLAG-SPIN4D82H expressieert.
  2. Broeden bij 27,5 °C in een orbitale shaker-incubator (125 rpm) gedurende 72 uur.
  3. Aliquot de cultuur als volgt:
    1. 4 ml kweek in een 15 ml buisje voor titratie.
    2. 30 mL kweek in vier 50 mL buizen.
  4. Centrifugeer de buizen op 600 × g gedurende 15 minuten en gooi het supernatant weg.
  5. Vries de pellets in vloeibare stikstof en bewaar bij −80 °C tot gebruik.

4. Titratie van de verhouding van kraal-lysaat voor FLAG-SPIN4 en FLAG-SPIN4D82H

  1. Voeg 1 mL BC150 lysisbuffer toe aan elk van de Sf9-pellets uit 5 mL Sf9-kweek zoals beschreven in Sectie 3, Stap 3.1.
  2. Sonicaer de lysaten om volledige verstoring te garanderen: 30% amplitude, 5 s aan/5 s uit, voor een totale sonicatietijd van 15 s.
  3. Centrifugeer op 20.000 × g, 4 °C, gedurende 10 minuten en breng het supernatant over in verse 1,5 mL buizen.
  4. Bereid 20 μL anti-FLAG affiniteitsgelslurry voor voor elke pulldown-reactie (60 μL voor 3 titracaties)
  5. Was de kralen met BC150 lysisbuffer:
    1. Voeg 1 mL BC150 lysisbuffer toe en vortex kortstondig.
    2. Centrifugeer op 3.000 × g gedurende 1 minuut.
    3. Aspireer en gooi het supernatant weg.
  6. Suspendeer de kralen opnieuw in een 40 μL BC150 lysisbuffer voor elke 1 pulldown-reactie (120 μL voor 3 titranaties).
  7. Combineer het lysaat in 1,5 mL buizen met BC150 lysisbuffer en bead suspension (Aanvullende Tabel 3)
  8. Incubeer de buizen op een buisrotator ingesteld op 15 toeren per minuut bij 4 °C gedurende 1,5 uur.
  9. Centrifugeer op 3.000 × g gedurende 1 minuut en aspireer het supernatant.
  10. Was de kralen drie keer als volgt:
    1. Suspendeer de kralen opnieuw in de 500 μL BC150 lysisbuffer en vortex kort.
    2. Centrifugeer op 3.000 × g gedurende 1 minuut.
    3. Aspireer het supernatant.
  11. Suspendeer de kralen opnieuw in een 20 μL 1× Laemmli-buffer en incubeer bij 95 °C gedurende 5 minuten.
  12. Centrifugeer op 3.000 × g gedurende 1 minuut.
  13. Voer het supernatant uit op een 15% SDS–PAGE gel en kleur met Coomassie blue om de eiwitopbrengst te schatten.
  14. Op basis van de gegevens selecteer je een lysaat-parel-verhouding die de antilichaambindingsplaatsen op de kralen verzadigt. In de experimenten was ≥300 μL lysaat per 20 μL kralen voldoende om een volledige bindingscapaciteit te bereiken.
    OPMERKING: "Verzadiging van antilichaambindingsplaatsen" wordt gedefinieerd als het punt waarop het verhogen van het lysaatvolume niet langer leidt tot een beter herstel van het doeleiwit.
    OPMERKING: Bij dezelfde molariteit vertoont SPIN4D82H een lagere bindende affiniteit met FLAG-affiniteitsgel dan de wildtype-tegenhanger.
    OPMERKING: In deze experimentele setting werd 1 mL lysaat afgeleid uit 6 miljoen Sf9-cellen (berekend als 1,5 × 106 cellen/mL × 4 mL), wat aangeeft dat SPIN4 tot expressie gebracht uit ~6 miljoen Sf9-cellen voldoende is om 20 μL anti-FLAG affiniteitsgelslurry te verzadigen.

5. Grootschalige voorbereiding van anti-FLAG affiniteitsgel-gebonden FLAG-SPIN4 als lokaas

  1. Voor elk eiwit dat getest wordt, verzamel je twee pellets uit 30 mL culturen. Suss elke pellet opnieuw in een 6 mL BC150 lysisbuffer, plaats deze in een 15 mL centrifugebuis en pas het totale volume aan op 13 mL met een BC150 lysisbuffer.
  2. Sonicate elk monster op ijs met 100% amplitude, 15 s aan/30 s uit, voor een totale sonicatietijd van 2 minuten.
  3. Breng de lysaten over in voorgekoelde hogesnelheids-centrifugebuizen en centrifugeer op 20.000 × g, 4 °C, gedurende 15 minuten.
  4. Voeg 200 × (aantal monsters + 1) × 1,1 μL anti-FLAG affiniteitsgelslurry toe aan een centrifugebuis van 1,5 mL.
  5. Was de kralen één keer met >5 kolomvolumes (CV) BC150 lysisbuffer.
  6. Suspendeer de kralen opnieuw in 400 × (aantal monsters + 1) × 1,1 μL BC150 lysisbuffer.
  7. Overbreng de supernatanten verkregen in stap 4 naar 15 mL centrifugebuizen.
  8. Voeg 500 μL van de Step 5.7 bead-suspension toe aan elke buis.
  9. Voeg in één buis 3 mL BC150 lysisbuffer en 60 μL 1× FLAG-peptide (100 mM) toe als negatieve controle.
  10. Incubeer de monsters op een buisrotator ingesteld op 120 rpm bij 4 °C gedurende 1,5 uur.
  11. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
  12. Susselt de kralen opnieuw in een geschikte hoeveelheid supernatant en breng ze over in 1,5 mL buizen.
  13. Centrifugeer op 3.000 × g gedurende 1 minuut en aspireer het supernatant.
  14. Was de kralen vijf keer met BC150 lysisbuffer als volgt:
    1. Suss de kralen opnieuw in een 1 mL BC150 lysisbuffer.
    2. Voor de 4e en 5e wasbeurt plaats je de monsters op een buisrotator die staat ingesteld op 20 toeren per minuut bij 4 °C gedurende 10 minuten.
    3. Centrifugeer op 3.000 × g gedurende 1 minuut en aspireer het supernatant.
  15. Suss de kralen opnieuw in een 200 μL BC150 lysisbuffer.
  16. Neem 9 μL van de bead/buffer suspension en analyseer het eiwitgehalte met 15% SDS–PAGE gevolgd door Coomassie blue kleuring.
  17. Omdat de eiwitinvoer de bindingscapaciteit van de korrel overschrijdt, zou de hoeveelheid eiwit per kraalvolume vergelijkbaar moeten zijn tussen de monsters. Semi-kwantificeer de bandintensiteit door digitale beeldanalyse en pas de kraalhoeveelheden aan voor latere reacties.

6. Bereiding van mononucleosomen uit HEK293FT cellen

  1. Laat HEK293FT cellen groeien in 15 cm weefselkweekschalen tot ongeveer 90% confluentie met 10% Fetaal Bovine Serum (FBS) in DMEM-media bij 37 °C in een 5% CO2-bevochtigde broedmachine.
  2. Vroege passage HEK293FT cellen worden commercieel verkregen en geauthenticeerd door STR-profilering.
    OPMERKING: Eén schotel van 15 cm levert ~27 miljoen cellen op, wat genoeg is voor 1–2 pulldown-reacties. Voor zes reacties (inclusief negatieve controles) bereid je minstens drie schalen van 15 cm voor. Als de doelhiston post-translationele modificatie (PTM) zeldzaam of instabiel is, verhoog het celaantal dienovereenkomstig met 2–10×
  3. (Optioneel) Afhankelijk van de relevante histonmodificatie voeg je geschikte PTM-remmers toe (Aanvullende Tabel 2) aan het kweekmedium en incubeer je gedurende 24 uur.
    OPMERKING: Deze stap kan worden weggelaten als er veel histon-PTM's aanwezig zijn.
  4. Wanneer cellen bijna 100% confluentie bereiken, verzamel je ze als volgt:
    1. Aspireer het kweekmedium.
    2. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 ml ijskoude PBS en aspireer dan.
    3. Voeg 5 ml ijskoude PBS toe.
    4. Schraap cellen op ijs en breng het over in een 50 mL buis (alle schalen kunnen gecombineerd worden).
    5. Centrifugeer op 13.000 × g, 4 °C, gedurende 10 minuten.
    6. Gooi het supernatant weg.
  5. (Optioneel) Ga direct verder of vries de celpellet voor later gebruik:
    1. Schat het volume van de pellets.
    2. Suspensieer opnieuw in 9× pelletvolume van Buffer G om een uiteindelijke glycerolconcentratie van 20% te bereiken.
    3. Vries in vloeibare stikstof en bewaar bij −80 °C.
  6. Als je verder gaat met de bevroren pellet, ontdooi de pellet dan op ijs, centrifugeer op 1.300 × g, 4 °C, gedurende 5 minuten en gooi supernatant weg.
  7. Suspendeer de (verse of ontdooide) pellet opnieuw in 10× pelletvolume TMSD-buffer (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 250 mM sucrose, 1 mM DTT) met proteaseremmers met behulp van een serologische pipet.
  8. Bereid 10% NP-40 vers voor in de TMSD-buffer en voeg 0,11× totale reactievolume toe om een uiteindelijke NP-40-concentratie van ~1% te bereiken.
  9. Incubeer de suspensie op een buisrotator ingesteld op 120 rpm bij 4 °C gedurende 5 minuten.
  10. Meng 10 μL van de suspensie met 10 μL trypanblauw en observeer onder een microscoop om de nucleaire kleuring te monitoren. Zorg ervoor dat kernen volledig geïsoleerd zijn van cytosol (Figuur 3A).
  11. Wanneer ongeveer 95% van de kernen trypanblauw-positief is, ga je door naar de volgende stap. Voor HEK293FT cellen is 1% NP-40 incubatie gedurende 5 minuten meestal voldoende. Voor andere celtypen controleer en pas de incubatietijd aan.
  12. Centrifugeer op 1.300 × g, 4 °C, gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
  13. Suss de pellet opnieuw in 10× pelletvolume TMSD-buffer.
  14. Herhaal stappen 6.12 tot 6.13 vijf keer om de resterende NP-40 volledig te verwijderen.
  15. Suss de pellet opnieuw in 5× pelletvolume van Buffer B.
  16. Voeg 1 eenheid micrococcal nuclease (MNase) toe per 10.000 kernen en incubeer in een waterbad van 37 °C. Beweeg af en toe de buis tijdens de incubatie om de kernen gelijkmatig te laten hersuspenderen
  17. Op de aangegeven tijdstippen (0,5, 1 en 2,5 uur) wordt 50 μL van de reactie in 1,5 mL buizen gehaald, direct 1 μL van 0,5 M EDTA-Na (pH 8,0) toegevoegd en vortex.
  18. Haal DNA uit elk tijdstip volgens de onderstaande procedure:
    1. Voeg 80 μL H₂O, 30 μL 10% SDS en 20 μL 5 M NaCl toe; vortex.
    2. Voeg 200 μL fenol/chloroform toe; Vortex grondig.
    3. Centrifuge op 20.000 × g, RT, 3 min.
    4. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe 1,5 mL buis.
    5. Voeg 1 mL 100% ethanol en 20 μL 3 M natriumacetaat (pH 5,2) toe; vortex.
    6. Centrifuge op 20.000 × g, RT, 5 min.
    7. Verwijder supernatant, voeg 1 ml 70% ethanol toe.
    8. Centrifuge op 20.000 × g, RT, 1 min.
    9. Verwijder het supernatant en droog de pellet 10 minuten met de dop open bij 55 °C.
    10. Suspendeer de pellet opnieuw in een 50 μL TE-buffer.
  19. Voer monsters uit op een 1% TBE agarosegel om de grootte van mononucleosoom DNA (147 bp) te bevestigen (Figuur 3B).
  20. (Optioneel) De verteringsefficiëntie van Micrococcal Nuclease (MNase) varieert per celtype; indien nodig kan extra MNase halverwege de reactie worden toegevoegd om polynucleosomen volledig te verwijderen. Als bijvoorbeeld 1 uur en 2 uur monsters vergelijkbaar lijken, voeg dan meer MNase toe bij 3 uur.
  21. Wanneer een overheersende ~147 bp-band wordt waargenomen, of wanneer extra MNase/uitgebreide incubatie de fragmentgrootte niet langer verandert, stop de reactie door 0,5 M EDTA-Na (pH8,0) toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 2 mM.
  22. Centrifugeer op 1.300 × g, 4 °C, gedurende 5 minuten. Verzamel het supernatant (S1).
  23. Sussief de pellet opnieuw in 10× pelletvolume TE-buffer + proteaseremmers en incubeer het monster op een buisrotator ingesteld op 20 rpm bij 4 °C gedurende minstens 30 minuten.
    OPMERKING: De efficiëntie van mono-nucleosoomextractie varieert per celtype. 0-300 mM NaCl kan worden gebruikt om nucleosomen efficiënt te extraheren.
  24. Centrifugeer op 1.300 × g, 4 °C, gedurende 5 minuten. Verzamel het supernatant (S2).
  25. Breng elk 50 μL van S1 en S2 over naar aparte 1,5 mL buizen.
  26. Analyseer alle fracties met agarosegelelektroforese (stappen 6.17 tot 6.18) om de DNA-grootteverdeling en extractie-efficiëntie te beoordelen. De meeste mononucleosomen bevinden zich in de S2-fractie (Figuur 3C).
  27. Breng S2 over naar hogesnelheids-centrifugebuizen en draai 10 minuten op 20.000 × g, 4 °C, om onoplosbaar materiaal te verwijderen.
  28. Verzamel het supernatant en dialyseer tegen BC150 lysisbuffer (zonder remmers):
    1. Eerste dialyse: 1 L, 1 uur.
    2. Tweede dialyse: 2 L, 's nachts.
  29. Na dialyse centrifugeer je opnieuw op 20.000 × g, 4 °C, gedurende 10 minuten om eventueel onoplosbaar afval te verwijderen.
  30. Verzamel het laatste supernatant.
  31. Meng 5 μL van het supernatant met 35 μL BC150 lysisbuffer en 10 μL 5× Laemmli-buffer, verhit op 95 °C gedurende 5 minuten, en laad 1, 2, 5, 10 en 20 μL op een 15% SDS–PAGE gel.
  32. Laad 1, 2 en 5 μL van 0,1 mg/mL BSA in Laemmli-buffer als referentie voor opbrengstschatting.
  33. Kleur met Coomassie blue en schat de nucleosoomopbrengst semi-kwantitatief met behulp van een beeldanalyse-software (Figuur 3D).

7. Gemodificeerde nucleosoompulldown

  1. Bereid 2× bead blocking buffer voor door 1 g BSA op te lossen in de BC150 lysisbuffer tot een eindvolume van 10 mL, en laat dan vortex tot volledig opgelost.
  2. Overbreng FLAG-SPIN4-WT en FLAG-SPIN4D82H kralen met equivalente molaire hoeveelheden eiwit (van sectie 5, stappen 5.16 tot 5.17) in aparte 1,5 mL buizen.
  3. Voeg een gelijk volume negatieve controlekralen toe (uit Sectie 5, Stap 10) aan het FLAG-SPIN4-WT monster.
  4. Pas het totale volume van alle kraalmonsters aan zodat het identiek is met behulp van de BC150 lysisbuffer.
  5. Voeg een gelijke hoeveelheid 2× korrelblokkerende buffer toe aan elke buis met kralen en BC150 lysisbuffer.
  6. Incubeer de monsters op een buisrotator die staat op 20 toeren per minuut bij 4 °C 's nachts (O/N).
  7. Ontdooi een geschikte hoeveelheid 1× nucleosoom dat uit HEK293FT cellen op ijs is gehaald. Het vereiste volume hangt af van de gewenste nucleosoom-SPIN4 molaire verhouding. Voor initiële optimalisatie gebruik je een molaire verhouding van 1:1 van het nucleosoom tot SPIN4.
  8. Meng 1× nucleosoom met een gelijk volume van 2× korrelblokkerende buffer grondig.
  9. Combineer het mengsel uit stap 7.8 met de voorgeblokte kralen in een 15 mL buis.
  10. Incubeer het mengsel op een buisrotator ingesteld op 20 rpm bij 4 °C gedurende 4 uur of een nacht.
  11. Centrifugeer op 3.000 × g, 4 °C, gedurende 3 minuten.
  12. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
  13. Susselt de kralen opnieuw in een 1 mL BC150 lysisbuffer en breng ze over naar 1,5 mL buizen.
  14. Was de kralen drie keer als volgt:
    1. Centrifugeer op 3.000 × g, 1 minuut, en aspireer het supernatant.
    2. Suss de kralen opnieuw in een 1 mL BC150 lysisbuffer.
    3. Beweeg af en toe de buis om de kralen tijdens het wassen gelijkmatig te laten hersuspenderen.
  15. Was de kralen nog twee keer als volgt:
    1. Centrifugeer op 3.000 × g, 1 minuut, en aspireer het supernatant.
    2. Repusser de kralen in 1 mL BC150 lysisbuffer.
    3. Draai op 20 rpm, 4 °C, gedurende 10 minuten.
  16. Na het wassen worden de kralen opnieuw opgehangen in 9-kolomsvolumes (CV) van BC150 lysisbuffer.
  17. Neem 160 μL uit elk monster, meng met 40 μL 5× Laemmli-buffer en verwarm 5 minuten op 95 °C.
    OPMERKING: Een flag-peptodeelluëntie van het eiwit-nucleosoomcomplex wordt aanbevolen, wat schonere resultaten oplevert met minder achtergrond.
  18. Centrifugeer op 3.000 × g, kamertemperatuur, gedurende 5 minuten.
  19. Laad 5 μL van het supernatant op een 15% SDS–PAGE gel en voer zilverkleuring uit (Figuur 4A).
  20. Laad nog eens 5 μL van het supernatant op een 15% SDS–PAGE-gel, breng over naar een PVDF-membraan en test met de juiste primaire en secundaire antilichamen die specifiek zijn voor de doel-histon-PTM's (Figuur 4B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de bindende substraten van humaan SPIN4 te onderzoeken, werden wildtype SPIN4 en een patiënt-afgeleide mutant geassocieerd met overgroeisyndroom gereconstrueerd met behulp van een Sf9-insectencelexpressiesysteem. Specifiek is dit een asparaginazuur (D) naar histidine (H) missense-mutatie bij residu 82 (D82H), die zich bevindt in het eerste Tudor-domein van SPIN4, wat impliceert dat het de rol ervan speelt bij het reguleren van de substraatbinding van SPIN4. Een baculoviale vector die ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werd een tijd- en kosteneffectieve methode gepresenteerd om biochemisch specifieke histon-PTM's als doelwitten van een slecht gekarakteriseerd eiwit te identificeren, en om te beoordelen hoe de ziekte-geassocieerde mutatie de bindingsaffiniteit van het doelwit beïnvloedt. Het voordeel van deze methode is dat het geen dure of tijdrovende reconstitutie van synthetische nucleosomen vereist. Deze aanpak maakte gebruik van het gemak van gecommercialiseerde histon PTM-peptidearrays, terwijl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken alle voormalige en huidige leden van het Yu and Jee Lab voor hun technische ondersteuning. J.-R.Y. werd ondersteund door de NIH NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) R35GM160046. YH. J werd ondersteund door het Children's National Hospital en het Children's Research Institute.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL Microcentrifuge TubesSarstedt72.690.001Algemene experimenten
15 cm Tissue Culture DishSarstedt83.3903.300Algemene experimenten
15 mL Conical Centrifuge TubesSarstedt62.554.101Algemene experimenten
50 mL Conical Centrifuge TubesSarstedt62.548.004Algemene experimenten
500 mL Erlenmeyer FlaskStellar ScientificCT229809Sf9 celcultuur
Amersham ImageQuant 800 CCD ImagerCytivaIMQ800CCD beeldsysteem
Anti-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220Biochemische pulldown
Anti-FLAG M2 antibodySigma-AldrichF1804Western blot
AprotininMedChemExpressHY-P0017Protease remmer
Array Analyze SofrwareActive Motifhttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipMODified peptide array data analyse
ASI Agarose LEAlkali ScientificA7700DNA gel
Bac-to-Bac Baculovirus Expression SystemThermo Scientific10359016Baculoviral expressie
Benzamidine hydrochlorideMedChemExpressHY-W018781Protease remmer
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9647Eiwit kwantificering standaard
Bromophenol BlueThermo ScientificA18469.08Lammeli buffer
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Scientific20278Proteïne gel kleuring
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich D5545Lyse buffer
EDTARPI research productsE58100Lyse buffer
Enhanced Chemiluminescence (ECL) substrateCytivaRPN2232Western blot
ESF 921 Insect Cell Culture MediumExpression Systems96-001Sf9 celcultuur
Ethanol (200 proof)Spectrum ChemicalET107DNA precipitatie
EVOS M5000 Imaging SystemInvitrogenM5000Algemene beeldvorming
FLAG peptideMedChemExpressHY-P7006Pulldown elutie
GlycerolSigma-Aldrich G77893Opslag buffer
H3K4me1 antibody Active Motif39300Western blot
H3K4me2 antibody Cell Signaling9725TWestern blot
H3K4me3 antibody Cell Signaling9751TWestern blot
HEK293FT cellsThermo ScientificR70007Human embryonaal nier fibroblasten cel lijn
HEPESSigma-Aldrich H3375Lyse buffer
ImageJNational Institutes of Healthhttps://imagej.net/ij/download.html Java-based beeldverwerkingsprogramma
Leupeptin hemisulfateMedChemExpressHY-18234AProtease remmer
Micrococcal Nuclease (MNase)NEB M0247SEndonuclease voor chromatine vertering
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110Sonicatie
MODified Histone Peptide ArrayActive Motif13005Proteïne bindings assay
Pepstatin AMedChemExpressHY-P0018Protease remmer
Peroxidase IgG Fraction Monoclonal Goat Anti-Mouse IgG, light chain specificJackson ImmunoResearch115-035-174Western blot
pFastBac1-Flag-SPIN4Thermo Scientific10360014Baculoviral expressie vector
pFastBac1-Flag-SPIN4-D82HThermo Scientific10360014Baculoviral expressie vector
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)Sigma-AldrichP2069DNA zuivering
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay KitThermo ScientificPIA53226Eiwit kwantificering
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24612Proteïne detectie
PMSF Protease InhibitorThermo Scientific36978Protease remmer
Polyacrylamide GelMade in-houseN/AProteïne gel
Sf9 insect cellsATCCCRL-1711Insect cel lijn voor baculovirus expressie
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCOThermo Scientific69572Proteïne dialyse
Sodium acetateSigma-AldrichS8750DNA precipitatie
Sodium Chloride Fischer BP358-1Algemene buffers
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Sigma-Aldrich L3771Algemene buffers
Trypan Blue Solution (0.4%)Thermo Scientific15250061Kernkleuring

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
  2. Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation. Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).
  3. Lu, R., Wang, G. G. Tudor: a versatile family of histone methylation readers. Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).
  4. Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).
  5. Mauser, R., Jeltsch, A. Application of modified histone peptide arrays in chromatin research. Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).
  6. Hsu, C. I., et al. Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1. Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).
  7. Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system. STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).
  8. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).
  9. Fuhrmann, J., Thompson, P. R. Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation. ACS Chem Biol. 11, 654(2015).
  10. Zhao, F., et al. Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1. J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).
  11. Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).
  12. Greschik, H., et al. The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development. Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

Gerelateerde artikelen