Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Ijzeroverbelasting verminderde de MEG3-expressie in alvleesklierweefsel. MEG3 kan een beschermende rol spelen tegen ijzer-geïnduceerde eilandjes-β-cel apoptose, mogelijk met modulatie van de NF-ĸB-route. Dit mechanisme kan bijdragen aan islet-disfunctie bij patiënten met β-TM met ijzeroverbelasting.
Patiënten met bèta-thalassemie major (β-TM) vertonen vaak abnormale glucosemetabolisme, en factoren zoals ijzeroverbelasting, chronische bloedarmoede, hormonale disbalansen, leverstoornissen en door ontsteking geassocieerde insulineresistentie worden beschouwd als belangrijke bijdragers aan dysfunctie van het alvleeskliereilandje. Lange niet-coderende ribonucleïnezuren (lncRNA's) worden steeds meer erkend om hun regulerende rol in celapoptose en glucosehomeostase. Deze studie onderzoekt de functie van het lncRNA, maternaal expressief gen 3 (MEG3), bij ijzer-geïnduceerde eilandjes-β-celbeschadiging. Een ijzeroverbelasting-muismodel werd geïnduceerd via intraperitoneale injectie van ijzerdextran. Ijzerafzetting en weefselschade in de alvleesklier werden geëvalueerd met behulp van Pruisische blauwe en hematoxyline- en eosine kleuring, en MEG3-expressie werd gekwantificeerd via reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). In vitro werden MIN6-cellen getransfecteerd met MEG3 small interfererend RNA om apoptose te onderzoeken via flowcytometrie, en de activiteit van de NF-kappa (ĸ)B signaalweg werd beoordeeld met Western blotting. Histologische kleuring bevestigde significante ijzerafzetting en structurele schade in het alvleesklierweefsel van ijzeroverbelaste muizen. De RT-PCR-analyse toonde een duidelijke vermindering van MEG3-expressie in de alvleesklier (p<0,05). In vitro verhoogde MEG3 knockdown significant de apoptose van MIN6-cellen vergeleken met controles. Western blot-analyse toonde een verhoogd niveau van NF-ĸB, wat wijst op activatie van de NF-ĸB-signaalroute in MEG3-gesilencede cellen. Deze bevindingen suggereren dat MEG3-downregulatie de apoptose van eilandjes β-cel via NF-ĸB-signalering onder ijzeroverbelasting kan versterken. Het MEG3-gen kan een beschermende rol spelen tegen ijzer-geïnduceerde eilandjes-β cel apoptose, mogelijk met modulatie van de NF-ĸB-route. Dit mechanisme kan bijdragen aan islet-disfunctie bij patiënten met β-TM met ijzeroverbelasting.
Beta (β)-thalassemieën zijn een groep erfelijke hematologische aandoeningen die worden gekenmerkt door verminderde of afwezige productie van β-globineketen, wat resulteert in chronische bloedarmoede en ineffectieve erytropoëse1. Bij patiënten met transfusie-afhankelijke β-thalassemia major (β-TM) leiden herhaalde bloedtransfusies en hemolyse vaak tot systemische ijzeroverbelasting, wat meerdere organen kan beschadigen en kan bijdragen aan een reeks endocriene complicaties, waaronder abnormale glucosemetabolisme2. Daarnaast verhoogt chronische bloedarmoede de last op de alvleesklier, hormonale disbalansen die de glucoseregulatie beïnvloeden, leverdysfunctie die het glucosemetabolisme belemmert, en insulineresistentie veroorzaakt door ontstekingsprocessen kunnen allemaal bijdragen aan hyperglykemie bij patiënten met β-TM. Daarom zijn glucosemetabole verstoringen in β-TM van aard multifactorieel 2,3. Een recente meta-analyse rapporteerde dat de prevalentie van verstoorde nuchtere glucose, verminderde glucosetolerantie (IGT) en diabetes mellitus (DM) bij patiënten met β-TM respectievelijk 17,21%, 12,46% en 6,54% bedroeg, wat wijst op een toenemende last van glucosemetabole stoornissen in deze populatie3.
Ondanks de groeiende klinische relevantie blijven de onderliggende mechanismen van abnormale glucosemetabolisme in β-TM slecht begrepen. Eerdere studies hebben aangetoond dat chronische ijzeroverbelasting, voornamelijk door herhaalde transfusies en hemolyse, kan leiden tot overmatige ijzerafzetting in de alvleesklier, vooral binnen eilandjes β cellen. Deze ophoping bevordert de vorming van reactieve zuurstofsoorten en verergert oxidatieve stress, waardoor mitochondriale disfunctie wordt geactiveerd, de insulinesynthese en -afgifte wordt belemmerd, en uiteindelijk β-cel apoptose en insulinetekortwordt veroorzaakt 4,6. Daarnaast kan ijzeroverbelasting bijdragen aan perifere insulineresistentie door oxidatieve stress veroorzaakte ontsteking en interferentie in insulinesignaleringsroutes. De moleculaire routes die ijzeroverbelasting koppelen aan β-celschade en systemische glucose-dysregulatie zijn echter complex en moeten nog volledig worden opgehelderd. Lange niet-coderende ribonucleïnezuren (lncRNA's) – een klasse van transcripten langer dan 200 nucleotiden die geen eiwitten coderen – zijn naar voren gekomen als belangrijke regulatoren in diverse biologische processen, waaronder glucosehomeostase, insulinesecretie en oxidatieve stressresponsen 7,8,9. Cellen β het eilandje alvleesklier staan bekend om meer dan 1.000 lncRNA's, wat wijst op hun potentiële regulerende rol bij het behouden van de endocriene functie10.
Er is echter weinig bekend over de lncRNA-expressieprofielen en hun functionele rollen in de context van door ijzeroverbelasting veroorzaakte schade aan eilandjes β-cel, vooral in β-TM. Recente ontwikkelingen toonden aan dat LncRNA MEG3 (MEG3) de insulinesecretie bevordert en de apoptose van pancreascellenβ 11 remt. Het effect ervan op de β-cellen van de alvleesklier bij ijzeroverbelasting blijft echter ongrijpbaar. In andere pathologische contexten is aangetoond dat lncRNA's interageren met belangrijke signaalroutes zoals NF-kappa (ĸ)B, JNK en Nrf2, die ook betrokken zijn bij cellletsel gerelateerd aan oxidatieve stress en ijzeroverbelasting 12,13,14. Specifiek is NF-ĸB een centrale transcriptiefactor die wordt geactiveerd onder oxidatieve stress en is geïntroduceerd bij β-cel apoptose onder ijzeroverbelastingsomstandigheden 15,16,17. Daarom onderzoekt deze studie dat de MEG3-downregulatie de apoptose van eilandjes β-cel via NF-ĸB-signalering onder ijzeroverbelasting kan versterken. Dit werk kan nieuwe inzichten bieden in de moleculaire mechanismen achter abnormale glucosemetabolisme in β-TM.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De experimentele protocollen die in deze studie zijn gebruikt, zijn goedgekeurd door de Ethiekcommissie van het Hainan General Hospital (protocol nr. 2021-239). De US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en de Verklaring van Helsinki werden strikt gevolgd in alle experimentele procedures. De reagentia en de gebruikte apparatuur in deze studie zijn vermeld in de Materiaalkunde.
1. Diermodel en experimenteel ontwerp
Zesendertig mannelijke C57BL/6J muizen (4 weken oud, ca. 20 g) werden in deze studie gebruikt. Alle muizen werden gehuisvest onder standaard laboratoriumomstandigheden (20–25 °C, 50%–65% relatieve luchtvochtigheid, 12-uur licht/donker cyclus) met ad libitum toegang tot voedsel en water. Na een acclimatisatieperiode van 7 dagen werden muizen willekeurig verdeeld in twee groepen (n=18 per groep): de ijzeroverbelastingsgroep (modelgroep), die twee keer per week gedurende 4 weken intraperitoneale injecties van ijzerdextran (0,2 g/kg) kreeg; en de controlegroep, die gelijkwaardige hoeveelheden normale zoutoplossing via intraperitoneale injectie ontvangt. Na 4 weken werden de muizen geëuthanaseerd en werden alvleesklierweefsels geoogst voor vervolganalyse.
2. Serum-ijzermeting
Bloedmonsters werden afgenomen uit de retro-orbitale sinus onder 1% pentobarbitale anesthesie tijdens de diestrus. Na 1 uur op kamertemperatuur te hebben staan, werd het bloed 15 minuten gecentrifugeerd bij 4 °C en 3.000 toeren per minuut. Serum werd gescheiden en opgeslagen bij -80 °C. De serumijzerconcentraties werden bepaald met behulp van een ijzercolorimetrische assaykit volgens het protocol van de fabrikant.
3. Histologische Analyse
Pancreasweefselmonsters werden ondergedompeld in 4% paraformaldehyde voor fixatie, gevolgd door paraffine-inbedding voorafgaand aan de voorbereiding van de sectie. Seriële weefseldoorsneden met een dikte variërend van 4–5 μm werden verkregen en verwerkt via standaard deparaffinisatie- en rehydratatieprocedures. Vervolgens werd een histomorfologisch onderzoek uitgevoerd met behulp van hematoxyline- en eosinekleuring, terwijl ijzerafzetting in alvleesklierweefsel werd geëvalueerd met Pruisische blauwkleuring volgens conventionele histologische kleuringsprotocollen.
4. Celcultuur en kleine interfererende ribonucleïnezuurtransfectie
De MIN6-muizenpancreas-β-cellen werden gekweekt in het gemodificeerde Eagle-medium van Dulbecco met een hoog glucosegehalte en aangevuld met 15% foetaal rundserum, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 10 mM HEPES, 50 mM natriumpyruvaat en 50 μmol/L β-mercaptoethanol. Alle experimenten werden uitgevoerd bij 80% celconfluentie. Elke keer tijdens celkweek wordt 6–8 ml kweekmedium genomen. De cellen werden op 37 °C gehouden in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO₂. Voor functionele studies werden MIN6-cellen in de logaritmische groeifase getransfecteerd met lncRNA-specifiek klein interfererend (si)RNA (gericht op geselecteerd lncRNA op basis van microarrayresultaten; Inhibitorgroep) of negatieve controle siRNA (Inhibitor NC-groep) met Lipofectamine 2000, volgens de instructies van de fabrikant. Na 24 uur cultiveren werden cellen geanalyseerd met behulp van een kwantitatieve polymerasekettingreactie (qRT-PCR) of western blot om de knockdown-efficiëntie te bepalen. Doelsequenties van dit siRNA waren als volgt: siMEG3: GCGUCUUCCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGACGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT. Elk experiment werd driemaal uitgevoerd en drie keer herhaald.
5. Reverse Transcriptie Polymerase Kettingreactie Assay
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit alvleesklierweefselmonsters en MIN6-cellen met behulp van een commercieel verkrijgbaar, fenolgebaseerd RNA-isolatiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Complementair DNA werd gesynthetiseerd met behulp van een reverse transcription kit in een totaal reactievolume van 20 μL. Na reverse transcriptie was de cDNA-concentratie van de meeste monsters ongeveer 1 μg/μL op basis van monsterkwantificatieanalyse. Vervolgens werd 1 μL cDNA-sjabloon gebruikt voor kwantitatieve realtime PCR-amplificatie. qRT-PCR werd uitgevoerd met een SYBR Green-gebaseerde PCR-detectiekit onder de volgende cyclische omstandigheden: 95 °C voor 30 s, 90 °C voor 15 s, 60 °C voor 34 s, en 68 °C voor 30 s. Relatieve genexpressieniveaus werden bepaald met behulp van de vergelijkende drempelcyclusmethode (2-ΔCT-methode ). GAPDH werd gebruikt als het interne referentiegen voor normalisatie van realtime PCR-gegevens. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de protocollen van de betreffende fabrikanten, en elk experiment werd onafhankelijk minstens drie keer herhaald. De primersequenties die in deze studie zijn gebruikt, zijn vermeld in Aanvullende Tabel 1 en Tabel 2.
6. Celtelling Kit-8 Assay
De celproliferatiecapaciteit werd bepaald met behulp van een celtelkit-8 assay volgens de richtlijnen van de fabrikant. Kort gezegd werden MIN6-cellen geplateerd in 96-wells kweekplaten met een dichtheid van 5 x 103 cellen per put na transfectie met si-MEG3 of si-NC en gedurende 24 uur onderhouden. Op de aangewezen tijdstippen werd 10 μL cellevensvatbaarheidsreagens in elke put geïncubeerd, en de platen werden 2 uur geïncubeerd bij 37 °C. De absorptiewaarden werden vervolgens gemeten op 450 nm met behulp van een microplaatlezer. De cellevensvatbaarheid werd berekend als een percentage ten opzichte van de controlegroep.
7. Apoptosedetectie door Flowcytometrie
Apoptotische veranderingen in MIN6-cellen werden onderzocht met behulp van een Annexin V-FITC/PI apoptosedetectiekit volgens de instructies van de fabrikant. Na 48 uur siRNA-transfectie werden cellen geoogst, tweemaal gewassen met koude, fosfaatgeborrelde zoutoplossing en opnieuw gesuspendeerd in bindingsbuffer. Daarna werden cellen geïncubeerd met 5 μL Annexine V-FITC en 5 μL propidiumjodide gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder donkere omstandigheden. Direct na het kleuren werden monsters geanalyseerd met flowcytometrie. Vroege en late apoptotische celpopulaties werden gekwantificeerd met behulp van flowcytometrische analysesoftware. Het aandeel apoptotische cellen werd vervolgens berekend voor intergroepvergelijkingen. Elk experiment werd drie keer onafhankelijk uitgevoerd.
8. Western Blot-analyse
Western blot-experimenten werden uitgevoerd volgens eerder gerapporteerde protocollen18. Cellen werden eerst verteerd met trypsine, verzameld en gelyseerd op ijs met behulp van radioimmunoprecipitatie-assay lysisbuffer. Eiwitconcentraties werden gekwantificeerd en equivalente hoeveelheden eiwit werden gescheiden op 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel-elektroforesegelgels voordat ze werden overgebracht op polyvinylidienfluoridemembranen. Na membraanblokkering werden monsters geïncubeerd met primaire antilichamen tegen NF-κB (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), caspase-3 (1:1000) en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) (1:2000) bij de aangegeven verdunningsverhoudingen, gevolgd door incubatie met mierikswortelperoxidase-gekoppelde secundaire antistoffen. Eiwitsignalen werden gedetecteerd met een chemiluminescentiesysteem en gekwantificeerd met ImageJ-software. GAPDH werd gebruikt als interne belastingscontrole, en de expressieniveaus van eiwitten werden uitgedrukt als vouwveranderingen ten opzichte van de controlegroep.
9. Statistische analyse
De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met behulp van de Mann–Whitney U test19 met statistische analyse. Een p-waarde <0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Evaluatie van het ijzer-overbelasting muismodel en meting van maternale expressie van gen 3 in alvleesklierweefsels
Om de rol van MEG3 in vivo te onderzoeken, hebben we een ijzeroverbelastingsmodel bij muizen opgesteld via intraperitoneale injectie van ijzerdextran. In vergelijking met de controlegroep waren de serumijzerwaarden in de modelgroep significant verhoogd (p<0,05) (Figuur 1A). Histologisch onderzoek toonde opmerkelijke ijzerafzetting...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Abnormale glucosemetabolisme is een veelvoorkomende en ernstige complicatie bij patiënten met β-TM, vaak uit zich als IGT of DM. In deze studie ontdekten we dat ijzeroverbelasting leidde tot alvleesklierschade en de expressie van lncRNA MEG3 in alvleesklierweefsel significant verminderde, gepaard met een verhoogde apoptose van eilandjes β cellen. Bovendien bevorderde de knockdown van MEG3 in MIN6-cellen β-cel apoptose en was het geassocieerd met NF-ĸB-activatie, wat wijst op een mogelijk...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven geen belangenconflicten aan.
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (822QN445) en het Foundation of Hainan Educational Committee (Hnky2024-30).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCL (pH=6.8) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | T1020 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TIANGEN | GH101-01 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TRANS | GH101-01 | |
| -80ºC koelkast | BIOBASE | BDF-86V348 | |
| ABI 7500 real-time PCR systeem | Applied Biosystems, USA | ||
| Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit | MULTI SCIENCES | AP101-100-kit | |
| BCA Protein Assay Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd. | E-BC-K318-M | |
| Biopulverizer | biospec | ||
| BSA | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A8020 | |
| C57BL/6J mannelijke muizen | Gempharmatech Co,Jiangsu,China | ||
| CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit | KeyGEN BioTECH | KGA317 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| DMEM | KeyGEN BioTECH | ||
| Flow cytometry | ACEA Biosciences, USA | NovoCyte 2060R | |
| Fluorescentie PCR instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | ||
| Glycine | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | G8200 | |
| High-capacity cDNA reverse transcriptiekit | Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA | ||
| HiScript II Q RT SuperMix voor qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HiScript II Q RT SuperMix voor qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HRP geconjugeerd Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Servicebio | GB23301 | 1/2000 |
| HRP geconjugeerd Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Servicebio | GB23303 | 1/2000 |
| Human LncRNA Array V5.0 | Arraystar,Rockville, Maryland, USA | ||
| Lipofectamine 3000 Transfectiereagens | Invitrogen | L3000015 | |
| Microarray scanner | Agilent Technologies,California, USA | ||
| MIN6 cel | procell | KGM12800N | |
| Mini-Bead-Beater-16 | biospec | ||
| Mouse Anti-GAPDH | TransGen Biotech | HC301 | 1/2000 |
| NanoDrop spectrofotometer | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | ND-2000 | |
| PAGE Pre-Solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A1010 | |
| Primers | Generay Biotech,Anhui, China | ||
| PrimeScript RT Reagent Kit met gDNA Eraser | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Rabbit Anti Bax | proteintech | 50599-2-ig | 1/5000 |
| Rabbit Anti Bcl-2 | abcam | ab194583 | 1/1000 |
| Rabbit Anti Caspase3 | abcam | ab184787 | 1/2000 |
| Rabbit Anti P65 | abcam | ab32536 | 1/8000 |
| Rabbit Anti p-P65 | Affinity | af2006 | 1/1000 |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa, Japan | ||
| TRIzol | Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA | ||
| TRIzol reagent | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| Ultragevoelig chemiluminescentie beeldvormingssysteem instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | Chemi DocTM XRS+ | |
| Ultraviolette spectrofotometer | NanoPhotometer | NP80 |