Robuuste isolatie en multiplexe identificatie van circulerende zeldzame cellen via continue centrifugale microfluidica en hydrogel immunocytochemie

Samenvatting

Deze studie presenteert een continue centrifugale microfludiïde workflow voor efficiënte isolatie en identificatie van circulerende zeldzame cellen. Het systeem maakt nauwkeurige vloeistofcontrole mogelijk en minimaliseert celverlies, waardoor gelijktijdige analyse van meerdere CRC-subtypes, waaronder CTC's en cCAFs, mogelijk is voor een verbeterde diagnostische nauwkeurigheid.

Samenvatting

Circulerende zeldzame cellen (CRC's), waaronder circulerende tumorcellen (CTC's) en circulerende kanker-geassocieerde fibroblasten (cCAFs), zijn veelbelovende biomarkers voor kankerdiagnose en prognose. Hun extreem lage abundantie en fenotypische heterogeniteit maken echter efficiënte isolatie en multiparametrische analyse technisch uitdagend. Hier presenteren we een continue centrifugale microfludiïde workflow voor de sequentiële isolatie en identificatie van CRC's uit volbloed. De patroon bestaat uit vijf onderling verbonden kamers met regelbare kleppen die een nauwkeurige behandeling van dichtheidsgradiënt, medium en bloedlagen tijdens centrifugatie mogelijk maken. Gebaseerd op een eerder gevalideerd verrijkingsplatform integreert de huidige workflow hydrogel-gebaseerde celimmobilisatie met gemultiplexeerde immunocytochemie ter ondersteuning van de downstream identificatie en karakterisering van meerdere CRC-subtypes, waaronder CTC's en cCAFs. Na isolatie worden cellen geïmmobiliseerd binnen een hydrogelmatrix om celretentie te ondersteunen tijdens herhaalde immunokleuring en beeldvormingsgebaseerde analyses. Met deze workflow werden zowel CTC's als cCAFs uit dezelfde steekproef geïdentificeerd, wat de haalbaarheid aantoont van geïntegreerde analyse van meerdere circulerende zeldzame celpopulaties binnen één vloeistofbiopsieworkflow. Dit platform biedt een praktische en reproduceerbare benadering voor downstream karakterisering van zeldzame cellen in vloeibare biopsietoepassingen.

Inleiding

Circulerende zeldzame cellen (CRC's) worden gedefinieerd als cellen die in de bloedbaan voorkomen op extreem lage frequenties vergeleken met normale bloedcomponenten zoals rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes. CRC's ontstaan uit diverse bronnen, zoals bijproducten van biologische processen, weefselremodellering, wondgenezing of vasculaire letsel. Representatieve voorbeelden zijn circulerende endotheelcellen, circulerende foetale cellen, megakaryocyten, erythroblasten en diverse voorloper- of stamcellen ^1,2. Hoewel het bestaan van CRC's op zichzelf niet noodzakelijk een pathologische toestand weerspiegelt, wijzen verhoogde niveaus vaak op abnormale fysiologische of pathologische aandoeningen ^3,4. Dan ook levert gevoelige detectie en karakterisering van CRC's waardevolle inzichten op in dynamische fysiologische en pathologische processen die in het lichaam plaatsvinden.

Onder CRC-subtypes zijn circulerende tumorcellen (CTC's) en circulerende kankergeassocieerde fibroblasten (cCAFs) belangrijke biomarkers van kanker. CTC's leveren direct bewijs van tumorcelverspreiding en worden veel bestudeerd⁵. Veranderingen in CTC-enumeratie worden vaak geassocieerd met vroege detectie, prognose en monitoring van therapeutische respons⁶. Parallel vertegenwoordigen cCAFs stromale componenten die in de bloedbaan worden afgestoten, wat de interacties tussen tumormicro-omgevingen en de vorming van de pre-metastatische niche⁷ weerspiegelt. Echter, vergeleken met CTC's blijft onderzoek naar cCAFs beperkt en begint hun klinische nut nog maar net te worden^onderzocht.

CTC's en cCAFs kunnen complementaire biologische informatie leveren in vloeibare biopsie, aangezien CTC's tumorcelverspreiding en metastatische eigenschappen weerspiegelen, terwijl cCAFs stromale remodellering en tumor-microomgevingsgeassocieerde progressiesignalen kunnen vertegenwoordigen. Gelijktijdige analyse van deze twee circulerende zeldzame celpopulaties kan daarom een meer geïntegreerd begrip van kankerprogressie ondersteunen dan analyse van een van beide populaties alleen. Hun klinische en translationele nut wordt echter aanzienlijk beperkt door hun extreme zeldzaamheid in perifeer bloed, het ontbreken van universeel geaccepteerde markers van cCAFs, en de aanzienlijke heterogeniteit van markerexpressie tussen celsubpopulaties, wat samen een betrouwbare identificatie belemmert. Daarom is het minimaliseren van celverlies tijdens verrijking en identificatie cruciaal om een robuuste en betrouwbare analyse te garanderen. Bovendien is een uitgebreide karakterisering van de functionele en markerdiversiteit van CTC's en cCAFs essentieel om hun rol bij metastasen te verduidelijken en voor het ontwikkelen van klinisch betekenisvolle biomarkers ^8,9.

Hier presenteren we een methode voor de gelijktijdige isolatie van cCAFs en CTCs^10,11, gecombineerd met multi-marker identificatie met behulp van hydrogel-encapsulatie van zeldzame cellen immunocytochemie (ICC)¹². Huidige CRC-isolatiemethoden ondervinden vaak technische beperkingen, waaronder celverlies tijdens meerstapsverwerking, beperkte vangst van fenotypisch heterogene cellen en selectiebias die samenhangen met marker-afhankelijke verrijkingsstrategieën. Daarentegen is het continue centrifugale microfludiïdische platform dat in deze studie wordt gebruikt, gebaseerd op een allesomvattend verrijkingskader, waardoor de afhankelijkheid van conventionele positieve selectiemarkers wordt verminderd. De analytische en workflowprestaties van het onderliggende verrijkingsplatform zijn beschreven in onze eerdere studies⁹.

Voortbouwend op dat gevalideerde platform richt de huidige studie zich op de integratie van hydrogel-gebaseerde celimmobilisatie en multiplexed immunocytochemie om de uitgebreide isolatie en identificatie van meerdere circulerende zeldzame celpopulaties, waaronder CTC's en cCAFs, binnen een uniforme workflow mogelijk te maken. Door verrijking, stabiele celretentie en herhaalde kleuring-compatibele analyse te combineren, biedt dit protocol een praktisch kader voor geïntegreerde zeldzame celanalyse uit vloeibare biopsiemonsters.

Protocol

Alle procedures waarbij menselijke bloedmonsters van patiënten en gezonde donoren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Review Board (IRB) van Severance Hospital. Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van Severance Hospital (IRB nr. 4-2013-0059). De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Apparaatvoorbereiding

1. Druk op de aan/uit-schakelaar om het instrument aan te zetten.
2. Schakel de laservergrendelschakelaar in en zet dan de laserschakelaar aan.
3. Start de besturingssoftware en bevestig dat het systeem normaal initialiseert.
4. Selecteer vanuit de hoofdsoftware-interface Device Operation en selecteer het vooraf ingestelde protocol voor standaard EDTA-volbloedmonsters.

2. Apparaatbediening - 1e^stap

OPMERKING: Details van de inlaatposities en de cartridgestructuur zijn weergegeven in Figuur 1A.

1. Voeg vanaf inlaat 6 2 mL Reagens A (dichtheidsgradiëntmedia) toe aan de initiële kamer.
2. Voeg vanaf inlaat 8 875 μL Reagens A toe aan de uitputtingskamer.
3. Bevestig de cartridge op het disc rack en zorg voor een juiste balans voor centrifugatie.
4. Druk op de Deurknop op de CTCeptor om de houder te openen, monteer dan de disc rack op de CTCeptor en zet deze vast met de bevestigingsschroeven.
5. Druk op de Deurknop om de bevestiging te sluiten en voer de Spin Down-stap uit met de CTCeptor-software (ongeveer 30 seconden).
6. Nadat je hebt bevestigd dat Reagens A is overgebracht naar het onderste deel van de initiële kamer, laat je de bevestigingsschroeven los en verwijder je het schijfrek van het instrument terwijl de cartridge gemonteerd blijft.

3. Apparaatbediening -^2e stap

1. Voordat u bloedmonsters hanteert, voert u alle procedures uit in een gecertificeerde biologische veiligheidskast en draagt u passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, een labjas en oogbescherming, in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen.
2. Met de cartridge uit het instrument verwijderd, injecteer 3 ml bloed in de eerste kamer via inlaat 6.
3. Bevestig het disc rack op de CTCeptor en bevestig het met de bevestigingsschroeven.
4. Voer de verwijderingsstap van de rode bloedcellen uit met de CTCeptor-software (ongeveer 40 minuten). Tijdens deze stap scheidt centrifugatie plasma, RBC's en perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) binnen de cartridge, en wordt de PBMC-houdende fractie overgebracht naar de volgende kamer voor latere leukocytendepletie.
5. Na voltooiing van de verwijderingsstap van de RBC's verwijder je het schijfrek van het instrument.

4. Apparaatbediening -^3de stap

1. Desinfecteer de werkruimte zorgvuldig om de steriliteit te behouden.
2. Vortex het Reagens B (leukocytenisolatiekralen) om homogene suspensie te garanderen.
3. Bereid de wasbuffer voor door Ca²⁺/Mg²⁺-vrije DPBS te mengen met 0,1% BSA en 2 mM EDTA (pH 7,4).
4. Breng het gewenste volume Reagens B over in een 1,5 mL buis (bijvoorbeeld 50 μL per patroon).
5. Voeg de wasbuffer toe op vijf keer het volume Reagens B en meng voorzichtig door te pipetteren.
6. Plaats de buis 1 minuut op een magnetische standaard zodat de kralen in Reagens B kunnen verzamelen, en gooi dan voorzichtig het supernatant weg.
7. Suspendeer de kralen opnieuw in de wasbuffer op een volume gelijk aan het oorspronkelijke kraalvolume.
8. Bewaar de kralen op 4 °C tot gebruik.
9. Onmiddellijk voor gebruik meng je 50 μL van de voorbereide kralen met 50 μL DPBS, en laad je 100 μL van het mengsel in inlaat 7.
10. Bevestig het disc rack op de CTCeptor en bevestig het met de bevestigingsschroeven.
11. Voer de stap Witte Bloedcellen Verwijderen uit met de CTCeptor-software (ongeveer 50 minuten). In deze geprogrammeerde stap worden de geladen leukocytenisolatiekralen gemengd met de PBMC-houdende fractie door te schudden om de binding tussen de kraal en de WBC te bevorderen, gevolgd door centrifugatie-gebaseerde verwijdering van de door de kralen gebonden WBC-fractie.
12. Na voltooiing van de verwijdering van de witte bloedcellen verwijder je het schijfrek van het instrument.

5. Monsterherstel

1. Steek een pipettip in uitlaat 9 van de eindkamer en suspendeer de inhoud opnieuw, waarna het verzamelde monster wordt overgebracht naar een buisje van 15 mL.
2. Injecteer 2 ml DPBS in uitlaat 9, spoel de kamer grondig door te pipetteren en breng de wash over in dezelfde 15 mL buis.
3. Herhaal de wasstap twee keer.
4. Stel het volume van de opgevangen vloeistof in de 15 mL buis aan naar 14 mL met DPBS, sluit de buis af en meng voorzichtig door inversie te doen.
5. Centrifugeer de buis op 380 × g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
6. Verwijder voorzichtig het supernatant, laat ongeveer 1 mL over, en gebruik de resterende suspensie voor de analyse stroomafwaarts.

6. Identificatie van CRC's

1. Voor het bereiden van het pre-hydrogel polymeer wordt Ca^2⁺/Mg^2⁺-vrije DPBS, hydrogel pellicle immunocytochemie (HypICC) oplossing A (prepolymeer) en fotoinitiator gemengd in een verhouding van 80:20:1.
2. Meng 870 μL CRC-suspensie met 270 μL pre-hydrogel polymeer.
3. Breng het mengsel over naar de HypICC-kamer en centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten zodat de cellen in het platform kunnen neerzetten.
4. Plaats de dikteregelaar in de HypICC-kamer om de hydrogeldikte in te stellen.
5. Bestral het monster met UV-licht (365 nm) gedurende 20–30 seconden vanaf de bodem om de hydrogellaag te kruisbinden.
6. Verwijder de dikteregelaar en was de hydrogel-geïncapsuleerde cellen drie keer met DPBS.
7. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten op kamertemperatuur, en was de monsters daarna drie keer met DPBS, elk 10 minuten.
8. Permeabiliseer de cellen met 0,05% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Daarna was je de monsters drie keer met DPBS, elk 10 minuten.
9. Blokkeer de monsters met 2% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
10. Incubeer de monsters met primaire antistoffen een nacht bij 4 °C.
11. Was de monsters vijf keer met DPBS, 20 minuten per was.
12. Kleur de kernen met Hoechst gedurende 10 minuten op kamertemperatuur, en was de monsters daarna drie keer met DPBS, elk 10 minuten.
13. Indien nodig kan secundaire antilichaamincubatie worden uitgevoerd onder dezelfde nachtelijke omstandigheden als de primaire antilichaamincubatie.
14. Voer fluorescentiemicroscopiebeeldvorming uit en identificeer CRC's.

7. Multiplex-immunokleuring van CRC's

1. Na immunokleuring en beeldvorming kunnen CRC's een extra ronde antistofkleuring ondergaan na het afkoelen.
2. Bereid een afschrikoplossing voor bestaande uit 4,5% H_2O2 en 24 mM NaOH in PBS.
3. Verwijder de DPBS uit de HypICC-kamer en voeg de afschrikoplossing toe.
4. Broed 1 uur op kamertemperatuur onder wit licht met schudden.
5. Vervang de afkoeloplossing en incubeer nog eens 1 uur onder dezelfde omstandigheden.
6. Was de monsters vier keer met DPBS gedurende 10 minuten per was.
7. Begin de immunokleuringsprocedure opnieuw vanaf de blokkerende stap met 2% BSA.

Resultaten

Figuur 1A toont een afbeelding van een enkele cartridge die wordt gebruikt voor zeldzame celisolatie. De cartridge bestaat uit vijf afzonderlijke kamers die verbonden zijn door microkanalen en regelbare kleppen die de vloeistofstroom regelen. De structuur van de patroon is als volgt: (1) een plasmakamer die plasma verzamelt dat gescheiden is van heel bloed; (2) een initiële kamer waarin heel bloed wordt gescheiden in plasma-, rode bloedcel- en PBMC-lagen; (3...

Discussie

CRC's zijn belangrijke biomarkers met potentiële waarde voor zowel de diagnose als de prognose van kanker. Om het klinische nut van CRC-analyse te verbeteren, is het echter belangrijk om een breder scala aan fenotypisch diverse CRC-populaties te vangen en parallelle multiparametrische karakterisering¹³ te ondersteunen. Daarnaast wijst groeiend bewijs in de onco-immunologie erop dat immuuncomponenten en de tumormicro-omgeving een cruciale rol spelen in het vormgeve...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-vrij	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumine	GenDepot	A0100-010
CD45 antilichaam	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Disc cartridge
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	Disc rack
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagens A	CTCELLS	CTR-S1001	density gradient media
CTR-S Reagens B	CTCELLS	CTR-S1002	leukocyte isolation beads
FAP antilichaam	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	HypICC kamer
Latex handschoen	Ansell	93743080
Magnetische standaard			Gemaakt in eigen beheer met een 3D-printer
Handmatig pipetteren  (0,5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Handmatig pipetteren  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Handmatig pipetteren  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Handmatig pipetteren  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Handmatig pipetteren  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pancytokeratin antilichaam	Invitrogen	53-9003-82
PBS (fosfaatbufferoplossing)	Welegene	LB001-02
SMA antilichaam	Invitrogen	PA5-18292
Tip, 10 µL	TipOne	9104020333
Tip, 1250 µL	TipOne	9104020740
Tip, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Volbloed			Opgeslagen bij 4-8 °C door te verzamelen in EDTA
β actin antilichaam	abcam	ab8226