Een geoptimaliseerde methode om vrouwelijke muizenurethrale epitheel te isoleren voor eencellige en immunofluorescentieanalyse

Samenvatting

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde methode om de epitheelbekleding van de volwassen vrouwelijke muizenurethra te isoleren voor downstream analyses, waaronder flowcytometrie, immunokleuring en organoïdekweek. Methoden leverden verrijkte, levensvatbare urethrale epitheelcellen op, zoals blijkt uit flowcytometrieanalyse, whole-mount imaging en efficiënte organoïdevorming.

Samenvatting

De urethra, bekleed met epitheelcellen, dient als kanaal voor urine-uitvoer uit het lichaam. De epitheelbekleding van de urethra bestaat uit verschillende celtypen met gensignaturen die wijzen op een rol in antimicrobiële en immuunverdediging. Residente macrofagen die zijn ingebed in de urethrale epitheliale laag vormen een transcriptioneel onderscheiden subtype met vermeende rollen in immuunsurveillance en antigeenpresentatie. Urinewegpathogenen stijgen omhoog via de plasbuis om de blaas te bereiken. Een studie van de urethrale epitheelwand en de bijbehorende immuuncellen zal licht werpen op de verdedigingsmechanismen van de gastheer in de onderste urinewegen. Een centraal doel van dit protocol is het bieden van geoptimaliseerde methoden voor het dissecten van de vrouwelijke muizenurethra en het isoleren van de epitheelbekleding voor downstream-analyses. Het protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om epitheelweefsel van de vrouwelijke urinebuis van de muis te isoleren door zachte enzymatische en mechanische scheiding. Na de epitheliale isolatie worden methoden beschreven voor een zachte enzymatische vertering van geïsoleerd urethraal epitheel en bijbehorende immuuncellen om hooglevensvatbare eencellige suspenties te verkrijgen. Het protocol beschrijft ook methoden voor flowcytometrie-analyse van de geïsoleerde urinebuis-epitheelcellen van de muis en epitheliale immuuncellen. Daarnaast worden hier methoden gepresenteerd om gelaagde 3D-urethrale epitheliale organoïden te genereren uit geïsoleerde epitheelcellen. Het protocol beschrijft ook een geoptimaliseerde methode voor volledige immunokleuring van urethrale epitheelplaten, die kan worden gebruikt om de morfologie en moleculaire structuren van het urethrale epitheel van de muis en bijbehorende immuuncellen te observeren. Over het algemeen maken de hier beschreven methoden voor isolatie en single-cel digestie van muizenurethrale epitheelcellen downstream-analyses mogelijk, waaronder immunokleuring, flowcytometrie, organoïdegeneratie en single-cell RNA-sequencing.

Inleiding

De onderste urinewegen van de muis (LUT) bestaat uit twee delen: de blaas en de plasbuis. Tijdens embryonale stadia ontwikkelen de structuren van de LUT zich uit de cloaca, een tijdelijke endoderm-afgeleide structuur die zich bevindt in de caudale achterdarm. Het ventrale deel van de cloaca, de urogenitale sinus, vormt de blaas aan de voorkant en de urethra^{achteraan 1}. Het blaasslijmvlies is goed bestudeerd. Het vormt een strakke barrière tegen urinecomponenten via apicale kristallijne plaques die bestaan uit uroplakine-eiwitten ^2,3,4. Hoewel het blaaswand een overgangsepitheel is, vertoont de urethra verschillen in epitheliale architectuur van de blaashals tot de distale urethrale opening. Daarnaast vertoont de urethra seksuele dimorfisme in epitheelstructuren en cellulaire architectuur. De mannelijke muizenurethra bestaat uit overgangsepitheel bij de blaashals, gevolgd door kolom- en gelaagd epitheel. De vrouwelijke muizenurethra is bekleed met overgangsepitheel bij de blaashals en meerlaags gelaagd niet-plaveiselepithel met kleine gangen die eindigen in secretoire klieren richting het distale uiteinde⁵.

Vrouwen zijn vatbaarder voor urineweginfecties (UWI's), voornamelijk veroorzaakt door uropathogene bacteriën die vanuit de darm via de urethra opstijgen om de blaas^te infecteren. De urethra is het eerste oppervlak in de LUT dat in contact komt met opstijgende urinewegpathogenen. De functie van urethrale epitheelcellen, vooral hun rol als actieve immunologische barrière, is onderbelicht. Recent werk van dezelfde groep leverde een ruimtelijke kaart met enkelvoudige celresolutie op van de volwassen vrouwelijke muisurethra⁵. Er werd een drievoudig laags urethrale bekleding vastgesteld met basale, intermediaire en apicale cellen. Tussen de epitheelbekleding zijn zeldzame neuro-endocriene cellen ^5,7 verspreid. Richting het midden van de plasbuis vertakten kleine kanalen zich van de hoofdstam van de plasbuis en eindigen in clusters van secretorische klieren, ingebed in het stromale compartiment van de plasbuis. Transcriptomische gegevens toonden aan dat de epitheelcellen in de urethra immunomodulerende en antimicrobiële genen tot expressie brengen die de verdediging van de gastheer^kunnen vormen. Het bestuderen van de eigenschappen en eigenschappen van urethrale epitheelcellen in verband met hun verdedigingspotentieel en immunomodulerende functies kan nieuwe strategieën opleveren om urineweginfecties te bestrijden.

Door de muis te gebruiken om het urethrale epitheel te bestuderen, maakt het temporele studies en onderzoek naar seksuele dimorfisme mogelijk. Gezien de overeenkomsten tussen de muis en de mens wat betreft de cellulaire structuur van de blaas en urethra¹, is de muis uitgebreid gebruikt om de embryonale ontwikkeling van de onderste urinewegen te bestuderen ^1,8,9. Muizen zijn ook gebruikt in transurethrale instillatiemodellen om UTI veroorzaakt door urinewegpathogenen te bestuderen 10,11,12. Het onderste urinewegweefsel is moeilijk toegankelijk bij patiënten, tenzij ze een resectie ondergaan voor kanker of andere aandoeningen. Een bron van consistent, gezond menselijk weefsel is moeilijk toegankelijk en de muis biedt een nuttig model om weefsels in de onderste urinewegen te onderzoeken voor studies naar weefselhomeostase, herstel en reactie op ontstekingsaantastingen. De vrouwelijke muis en de menselijke urethrale bekleding bestaan beide uit overgangsepitheel bij de blaashals en gelaagd niet-plaveiselachtig, niet-keratinisch epitheel aan het distale uiteinde. Plaveiselepitheel wordt waargenomen aan het distale uiteinde van de vrouwelijke plasbuis, hoewel variabiliteit wordt waargenomen in het vrouwelijke urethrale slijmvlies bij^{een mens vanaf 5,13} jaar. Hoewel er geen vergelijkingen zijn gemaakt van de urethrale bekleding op transcriptoomniveau tussen de menselijke en muisurethra, vormt de muis een nuttig model om epitheelpatroonvorming, epitheel-immuuninteracties en de respons op infecties in de urethra vast te leggen.

In deze studie beschrijven de auteurs methoden voor het dissectie van de volwassen vrouwelijke muizenurethra, isolatie van het urethrale epitheel en een zachte enzymatische vertering om eencellige suspenties te bereiden. Dit is het eerste gedetailleerde protocol voor de isolatie en vertering van vrouwelijk urethraal epitheelweefsel van de muis. Het geoptimaliseerde protocol levert een verrijkte single-cel populatie van epitheelcellen op die kan worden gebruikt voor diverse downstream analyses. Zoals gepresenteerd in de studie, hebben de auteurs flowcytometrie uitgevoerd op een single-cel suspension van urethrale epitheelcelisolaten, wat de aanwezigheid aantoont van levensvatbare enkele cellen, voornamelijk van epitheliale aard. Bovendien kunnen deze epitelcellen organoïden produceren in 3D-kweek, die lijken op de gelaagde muizenurethrale bekleding. De auteurs tonen ook een volledige inkleuring van urethrale epitheelplaten aan om de associatie te bestuderen tussen epitheel-geassocieerde immuuncellen, specifiek macrofagen, en urethrale epitheelcellen. De in dit artikel beschreven methoden zullen bijdragen aan onderzoek naar de urethrale bekleding en haar rol in immuunverdediging.

Protocol

Alle studies op muizen werden uitgevoerd met goedkeuring van het Institutional Animal Ethics Committee (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) en het Institutional Biosafety Committee (inStem/G-141(3)-22/DBJ) aan het BRIC-Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine, Bengaluru. Vrouwelijke CD-1 of C57BL6/J muizen van 6-12 weken oud, gehuisvest in het Animal Care and Resource Centre (ACRC) van het National Centre for Biological Sciences (NCBS), Bangalore Life Sciences Cluster (BLiSC), werden voor deze studie gebruikt. Muizen werden gehuisvest onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden onder een 12-uur licht-donkercyclus met ad libitum voedsel en water.

Alle gebruikte materialen worden vermeld in de Materiaallijst.

1. Dissectie en verzameling van de volwassen vrouwelijke muizenurethra

1. Euthanaseer de muis met_CO2 totdat de muis stopt met ademen. Voer cervicale dislocatie uit als een vorm van secundaire euthanasie.
2. Plaats de muis in rugligging en spray 70% ethanol om het haar op de buik nat te maken (Figuur 1A).
3. Til de huid op de buik op met een tang en maak een verticale incisie richting het onderlichaam, eindigend bij de externe urethrale opening (Figuur 1B en 1C).
4. Identificeer de blaas en til deze voorzichtig op met een tang. In sommige gevallen kan het gevuld zijn met urine. Druk voorzichtig de blaas tussen de tangen samen om hem te legen.
   OPMERKING: De blaas zal verschijnen als een bolvormige structuur.
5. Knip vet en bindweefsel rond de blaas met kleine veerschaar om de vlindervormige structuur bloot te leggen waar de twee schaambeenderen samenkomen bij de schaamsymfyse (Figuur 1D). De plasbuis loopt onder de symfyse pubis.
6. Snijd bij de schaamsymfyse door deze met een tang op te tillen en open te snijden met een kleine veerschaar (Figuur 1E). Verwijder de schaambeen fragmenten zodat de plasbuis naar beneden loopt vanaf de blaas (Figuur 1F).
   OPMERKING: De urethra zal verschijnen als een dunne rode buis die op het ventrale oppervlak van de vaginale wand ligt (Figuur 1G).
7. Trek de blaas voorzichtig omhoog vanuit de lichaamsholte met fijne pincetten en laat een kleine veerschaar tussen de plasbuis en de vaginale wand lopen om de urine- en voortplantingswegen te scheiden.
8. Houd lichte spanning op de blaas terwijl je langs de achterkant van de plasbuis snijdt om deze van de vaginale wand te scheiden (Figuur 1H–J). Snijd helemaal door tot aan de distale urethrale opening om de volledige muizenurethra (1,2–1,5 cm lang) te verkrijgen (Figuur 1K en 1L).
9. Scheid de urethra van de blaas door een enkele snee te maken in de hals van de blaas.

2. Isolatie van urethraal epitheelweefsel

OPMERKING: Het protocol om epitheelplaten uit de urethra te isoleren is aangepast en geoptimaliseerd vanuit een protocol om endometriumepitheel¹⁴ te isoleren. Figuur 2 toont stappen voor de isolatie van urethrale epitheelplaten van het omliggende stromale compartiment (Figuur 2A).

1. Breng de gedissectiede urethra over in een steriele petrischaal met verse 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, Ca- en Mg-vrij, details gegeven in Aanvullende Tabel 1).
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om in dit stadium 4–5 urethren te verzamelen voor epitheelscheiding en eencellige vertering.
2. Onder een dissectiemicroscoop snoei je vet en bindweefsel rondom de plasbuis met fijnpunttangen en kleine veerschaar (Figuur 2B).
3. Snijd elke urethra in twee even grote stukken dwars en plaats bovenop een 100-micron nylon gaaszeef (Figuur 2C–G).
4. Was de weefsels door 1 ml 1x HBSS (Ca en Mg-vrij) over de weefsels te brengen.
5. Breng weefselstukjes over in een 1,5 mL microcentrifugebuis (MCT) (Figuur 2H) met 1 mL 1% trypsine (1% trypsine, met 1x sHBSSa, details gegeven in aanvullende tabel 2).
6. Digesteer het weefsel door 15–30 minuten te incuberen op een monsterrotator (30 rpm) bij 4 °C.
7. Na de incubatie verwijder je buisjes van 4 °C. Voeg MgCl₂ (1 M MgCl₂, bouillon bereid in 1x HBSS) toe aan een eindconcentratie van 10 mM en DNase I (10 mg/mL DNase I, bouillon bereid in 1x PBS) aan een eindconcentratie van 10 μg/mL in dezelfde buis als de weefselstukken.
8. Breng de buis over in een 37 °C hybridisatieoven op een monsterrotator om 15–30 minuten te incuberen.
   OPMERKING: De incubatietijden voor trypsine bij 4 °C en 37 °C kunnen worden aangepast op basis van de latere toepassing. Het is beter om 15 minuten te gebruiken voor de kleuring van de hele mount en 30 minuten voor de eencellige vertering.
9. Breng de weefsels over naar een 1,5 mL MCT met 10% schapenserum in 1x HBSS (Ca en Mg vrij) om de trypsine-activiteit te blusten.
10. Breng urethrale weefsels over in een nieuwe buis met ijskoude 1x HBSS (Ca en Mg vrij). Vervolgens overbrengen naar een steriele petrischaal met ijskoude 1x HBSS.
11. Met twee fijnpunttangen pers je het epitheel uit de plasbuis. Houd één uiteinde van het urethrale stuk vast met één paar tangen.
12. Met de andere hand knijp je het stuk urethraal tussen de tanden van de pincet en laat je het hele stuk over de hele lengte van het stuk lopen om het epitheel eruit te persen. Herhaal dit voor de overgebleven urethrale fragmenten in de schotel om het epitheel te isoleren (Figuur 2I–J).
    OPMERKING: Bij mechanische scheiding wordt een dunne laag transparant epitheelweefsel uit het lumen van de plasbuis geëxtrudeerd. Het urethrale epitheel kan worden geïdentificeerd als dunne, velachtige weefselfragmenten die lichter van kleur (transparant) lijken dan het stromale weefsel. Epitheelisolaten moeten fijne, transparante weefselstukken zijn die in een petrischaal kunnen worden overgebracht om te hakken. Weefselisolaten mogen niet volledig worden afgebroken. Als weefselstukken volledig zijn afgebroken, kan de trypsine-incubatietijd worden verkort.

3. Vertering tot single-cel suspensie

1. Breng geïsoleerde stukjes epitheel over in een steriele petrischaal met behulp van een kleine plastic transferpipet of een pipettip van 200 μL. Hak epitheel in kleine fragmenten met een kleine veer-schaar in een druppel 1x HBSS die direct aan de fragmenten wordt toegevoegd (Figuur 2K).
   OPMERKING: Stromale weefselstukken die na de scheiding van het epitheel overblijven, kunnen op dezelfde manier worden verteerd als het geïsoleerde epitheel.
2. Breng gehakte stukken over met een pipet naar een 2 mL MCT met 1,5 mL voorverwarmde (37 °C) Accutase digestieoplossing. De Accutase-verteringsoplossing bevat het volgende: Accutase, 10 μM Rocki Y-27632, en 100 μg/mL DNase I.
3. Breng de buis met het weefsel en de verteringsoplossing over in een monsterrotator in een 37 °C hybridisatieoven. Broed 1 uur uit.
   OPMERKING: De inhoud van de buis kan worden gecontroleerd op een succesvolle vertering voordat u verder gaat. Succesvolle vertering: Het gehakte weefsel is goed verspreid in de Accutase-oplossing met na de incubatie slechts enkele zichtbare stukjes. Mislukte spijsvertering: Grote weefselstukken zijn na incubatie in Accutase-oplossing nog aanwezig. Weefsels moeten zo fijn mogelijk worden gehakt voor een succesvolle vertering.
4. Na 1 uur overbrengen we de volledige inhoud van de 2 mL MCT in een 5 mL centrifugebuis en voeg 2 mL wasfilter toe (1x PBS zonder Ca en Mg, met 1% runderserumalbumine).
5. Draai de ophanging 5 minuten in een 4 °C centrifuge met een schandeldraerrotor op 600 x g.
6. Aspireer het supernatant met een zachte vacuüm en suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL wasdemper met een 1 mL pipet met filtertip.
7. Met de pipettip breek je de pellet op en neer door op en neer te pipetten totdat de klonten kleiner worden. Voer de vering met 4 slagen door een 23 1/2 gauge naald die is bevestigd aan een 1 mL spuit, gevolgd door 4–6 slagen door een 26 1/2 gauge naald die is bevestigd aan een 1 mL spuit.
   OPMERKING: Passage door een naald van kleine dikte is nodig om een uniforme single-cel suspensie te verkrijgen en celklontering te voorkomen. Hoewel deze stap shearstress en celdood kan veroorzaken, hebben de auteurs het aantal slagen met naald en spuit geoptimaliseerd om één enkele suspensie te bieden zonder overmatige celdood. Het overslaan van deze stap resulteert in een groot aandeel samengeklonterde cellen, wat downstream analyses zoals single-cell RNA-sequencing en flowcytometrie in de war zal brengen.
8. Voeg 1 ml wasbuffer toe om het oppervlak van een 30-micron pre-scheidingsfilter over een 5 mL buis te bevochtigen. Gebruik de spuit die is aangesloten op de 26 1/2 -gauge naald om 1 mL celoplossing door de zeef te brengen.
9. Voeg 1 ml extra wash buffer toe aan de buis met cellen, neem deze oplossing vervolgens met de spuit op en laat deze door het filter gaan. Pelletcellen door centrifugatie op 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met een schuddelende emmerrotor.
10. Aspireer het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 100 μL wash buffer, en voeg 100 μL 1x rode bloedcellen (RBC) lysebuffer toe. Incubeer de suspensie precies 3 minuten op kamertemperatuur, voeg dan 4 ml wasbuffer toe en suspendeer de pellet opnieuw.
    OPMERKING: Rode bloedcel-lyse wordt aanbevolen om bloedcellen uit de urethrale epitheelcelsuspensie te verwijderen. Hoewel deze stap een geringe invloed kan hebben op de levensvatbaarheid van epitheelcellen, gebruikte het protocol een 0,5x verdund rode bloedcel en een incubatie van 3 minuten om celverlies te minimaliseren en de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
11. Oogst cellen door centrifugatie bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met een schanderende emmerrotor.
12. Aspireer het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 50–200 μL wasbuffer afhankelijk van de pelletgrootte.
    OPMERKING: De korrelgrootte van weefsels afkomstig uit 4–5 samengevoegde muizenurethrale epitheliale monsters zal klein zijn maar nog steeds zichtbaar voor het oog. Het is essentieel om cellen te centrifugeren met een schuddelende emmerrotor, zodat de pellet zich verzamelt aan de onderkant van de buis in plaats van langs de zijkant te worden uitgesmeerd. De onderzoekers hebben een celopbrengst van 28.000–34.000 levende cellen per muizenurethraal epitheel geregistreerd.
13. Breng 5 μL aliquot van cellen over naar een 0,5 mL MCT en voeg 5 μL trypanblauw toe. Meng en laad op de hemocytometer om de opbrengst en levensvatbaarheid van de cel te controleren.

4. Flowcytometrie-analyse van urethrale epitheliale enkelcelisolaten

1. Aliquot 100.000 cellen in totaal in een 5 mL centrifugebuis om fluorescerende immunokleuring uit te voeren van enkele cellen uit het urethrale epitheliale of stromale compartiment voor flowcytometrie. Verhoog het volume in de buis tot 4 mL met 1x PBS.
   OPMERKING: Om betrouwbare resultaten te behalen met flowcytometrie wordt minimaal 50.000 cellen per monster aanbevolen.
2. Draai de celophanging 500 x g 5 minuten op 4 °C met een schwenkbare bakschuiver.
3. Gooi het supernatant weg en suspendeer het pelletje opnieuw in 50 μL 1x PBS.
4. Voeg 50 μL 2x Ghost kleurstof Violet 450 (1 μL Ghost kleurstof in 500 μL 1x PBS) toe aan de celsuspensie om 100 μL 1x Ghost kleurstofoplossing te verkrijgen.
   OPMERKING: Ghost Dye V450 is een amine-reactieve levensvatbaarheidskleurstof die kan worden gebruikt om te onderscheiden tussen levensvatbare en niet-levensvatbare cellen in flowcytometrietoepassingen.
5. Voeg 5 μL Fc-receptorblokkerende oplossing (anti-muis CD16/32) toe per 100 μL celsuspensie en incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Deze stap is vereist om de binding van immunoglobuline aan Fc-receptoren te blokkeren.
6. Breng de celsuspensie nog eens 25 minuten op ijs.
7. Verdun de celsuspensie tot 5 mL met behulp van een celkleuringsbuffer (1x PBS, 0,02% (w/v) natriumazide en 1% (w/v) BSA, zie aanvullende tabel 3). Draai 500 x g voor 5 minuten bij 4 °C met een schwenkbare emmerrotor. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 100 μL celkleuringsbuffer.
   OPMERKING: Natriumazide is zeer giftig. Vermijd contact met huid, ogen en kleding. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij het hanteren.
8. Voeg in 100 μL celsuspensie 5 μL geconjugeerde primaire antilichamen toe: anti-CD326/EPCAM (labelt epitheelcellen), anti-F4/80 (labelt muismacrofagen) en anti-CD45 (pan-immuunmarker) bij een verdunning van 1:20. Breng de celsuspensie 30 minuten op ijs.
9. Verdun de celsuspensatie tot 5 mL met een celkleuringsbuffer en spin daarna 500 x g voor 5 minuten bij 4 °C met een schanderende emmerrotor. Aspiraat het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 500 μL celkleuringsbuffer.
10. Breng de celsuspensie over via een 35-micron nylon gaaszeef op filterdop-sorteerbuizen. Plaats buizen op ijs tot nader onderzoek.
11. Voer de eerste afstelling en prestatiecontrole uit op de cytometer.
12. Pas de spanningen aan met ongekleurde en volledig gekleurde monsters. Voer compensatie uit met kraalcontroles en ga door met overname.
    OPMERKING: Experimenten met meer dan één fluorofoor vereisen een compensatie. Bereid de benodigde compensatiemaatregelen voor. Je hebt enkelvoudig gekleurde controles nodig (d.w.z. compensatiekralen) voor elke fluorofoor die in het experiment wordt gebruikt. Compensatie kan automatisch worden uitgevoerd volgens de instellingen van de flowcytometersoftware. FMO (fluorescentie min één) controles worden aanbevolen om positieve en negatieve celpopulaties voor een bepaalde fluorofor te onderscheiden. Bereid FMO's voor door alle fluoroforen in het monster op te nemen, behalve degene waarvoor wordt gecontroleerd.
13. Stel poorten aan met FMO (fluorescentie min één) controles en verzamel 50.000 gebeurtenissen per monster.

5. Kweek van urethrale epitheelorganoïden

OPMERKING: Voor muizenurethrale epitheelorganoïden volgt u Protocollen, Sectie 3, Spijsvertering naar eencellige suspensie, stappen 3.1 tot 3.11. om single-cell suspenties te verkrijgen.

1. Sussen de pellet van de urethrale epitheelcel opnieuw in 50–100 μL organoïde expansiemedium (details gegeven in Aanvullende Tabel 4). Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen en het aantal cellen door te tellen op een hemocytometer.
2. Bereid een 1:4 mengsel van celsuspensie (1 deel) en Cultrex (4 delen), met een uiteindelijke concentratie van 5000 cellen in 25 μL. Voeg 3 druppels 25 μL celsuspensie (5000 cellen/druppel) toe aan elke put van een 12-wells plaat.
   OPMERKING: Pipetteer Cultrex altijd voorzichtig met een afgesneden punt om bubbels te voorkomen.
3. Breng de plaat 15 minuten over in een 37 °C incubator (5%_CO2) om de druppels te laten stollen.
4. Leg de druppels over 800 μL organoïde expansiemedia, voorzichtig vanaf de zijkanten van de put, en breng de plaat terug naar de broedmachine.
   OPMERKING: Een mediawissel is elke 2 dagen vereist. Vervang het gebruikte medium door 800 μL verse organoïde expansiemedia.
5. Maak foto's van de organoïden op elke dag van dag 0 tot 6 dagen met een omgekeerde microscoop met een vergroting van 4x–20x.

6. Histologie en immunokleuring van urethrale organoïden

VOORZICHTIG: Xyleen is een zeer brandbaar oplosmiddel. Gebruik geschikt PBM om de chemische stof te verwerken. Verzamel gebruikte xyleen als organisch oplosmiddelafval. Verwijder via goedgekeurde programma's voor gevaarlijk chemisch afval. Formaline is giftig en veroorzaakt irritatie van huid, ogen en ademhalings. Vermijd huidcontact en inademing. Gebruik geschikt PBM om de chemische stof te verwerken. Verwijder via institutionele systemen voor het verwijderen van gevaarlijk chemisch afval. Het protocol om urethrale organoïden in paraffineblokken te plaatsen is aangepast en geoptimaliseerd van een protocol om endometriumorganoïden¹⁴ in te sluiten.

1. Op dag 6 van organoïdecultuur gooi je het gebruikte medium weg en was je de organoïden met 1x HBSS op kamertemperatuur. Voeg 1,5 mL neutraal gebuffreerd formaline (10%) toe aan de putten gedurende 15 minuten.
2. Gooi het fixatief weg en voeg 1,5 mL hematoxyline toe aan de putten voor 10 minuten. Gooi de beits weg en was twee keer met 1x HBSS.
3. Voeg 1 mL 2% UltraPure agarose met een laag smeltpunt toe, gemaakt in 1x HBSS, in elke put met 3 druppels, en laat de agarose 15 minuten bij kamertemperatuur stollen.
4. Haal voorzichtig de agarose uit de put met het platte uiteinde van een dunne spatel, zodat er ook Cultrex-druppels afkomen.
5. Breng de agaroseschijf over in een weefselcassette en dehydrateer in 70% ethanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met constante roering.
6. Verder gedehydrateerd in verschillende concentraties ethanol en duur: 90% ethanol voor 30 minuten, 100% ethanol voor 30 minuten, 100% ethanol voor 60 minuten, 100% ethanol voor 90 minuten.
7. Dep overtollige ethanol eraf en maak 45 minuten op kamertemperatuur met constante beweging schoon met xyleen. Herhaal de xyleen-verwijderingsstap 60 minuten.
8. Depp het overtollige xyleen af en breng het over naar infiltrerende paraffinewas (65 °C) 's nachts.
9. Voeg een dunne laag inbeddingswas toe aan de basis van een metalen inbeddingsmal en plaats de agaroseschijf eroverheen. Verwijder de mal van de slidewarmer en bedek deze snel met inbouwwas door de latten van de cassettebodem. Laat het bij kamertemperatuur stollen.
10. Snijd organoïde paraffineblokken op een microtoom om 5-μm doorsneden te verkrijgen. Plaats secties op positief geladen dia's.
11. Hematoxyline-eosine-kleuring
    1. Bakslides op 60 °C en deparaffineer met xyleen en rehydrateren via een reeks ethanolwashes (xyleen 1 min, 100% ethanol 1 min, 95% ethanol 1 min, 75% ethanol 1 min)
    2. Was de glijbanen in kraanwater en broed 3 minuten met Gill's Hematoxylin No. 2. Plaats glijbanen onder een straal kraanwater om een blauwe kleur te ontwikkelen.
    3. Incubeer slides in 95% ethanol gedurende 1 minuut, gevolgd door 0,25% eosineoplossing gedurende 1 minuut. Wash schuift in kraanwater totdat het water helder is.
    4. Dehydrateer slides (95% ethanol 1 min, 100% ethanol 1 min) en maak het schoon met xyleen (1 min) voordat je ze monteert met snelhardend montagemedium.
12. Immunokleuring van paraffinedoorsneden
    1. Bak paraffinesecties van 5 μm in een hybridisatieoven op 60 °C gedurende 1–2 uur.
    2. Wax slides door 6 minuten in xyleen te dompelen in een glaaspotje.
    3. Rehydrateer 100%, 95%, 75% ethanol in gedestilleerd water gedurende elk 6 minuten. Daarna spoel je de slides 5 minuten in gedestilleerd water.
    4. Voeg de glaasjes toe in een vierkante Pyrex-schaal met 0,01 M citroenzuur (in gedestilleerd water) antigeenophaaloplossing, en bedek de schaal met huishoudfolie. Voer antigeenwinning uit door 20 minuten op hoog vermogen in de magnetron te hangen.
    5. Koel tot lauw gedurende 20 minuten en spoel de slides 5 minuten af in PBS. Trek een hydrofobe barrière rond weefselsecties en voeg 100 μL/sectie paardenblokkeringsbuffer toe gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht wiegen (zie aanvullende tabel 5 voor de voorbereiding van een paardenblokkeringsbuffer).
    6. Bereid primaire antilichaamoplossing voor in de paardenblokkeringsbuffer door primaire antilichamen toe te voegen met een geschikte verdunning (1:100–1:200). Voeg 100 μL primaire antistofoplossing toe aan elke sectie. Incubeer slides 's nachts bij 4 °C met zacht wiegen.
       OPMERKING: Organoïden werden geïnomantiseerd met antilichamen tegen Keratine 5/KRT5 (basale epitheelmarker), P63 (basale epitheelmarker), KRT4 (intermediair/suprabasale epitheelmarker) en KRT13 (intermediaire/suprabasale epitheelmarker).
    7. Na de nachtelijke incubatie spoel je de wasglijbanen in PBS 4 x 5 minuten op kamertemperatuur met zacht wiegen.
       OPMERKING: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een lichtbeveiligde doos bij kamertemperatuur.
    8. Bereid een secundaire antistofoplossing voor in een paardenblokkerende buffer, waarbij fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen worden toegevoegd met een verdunning van 1:500. Broed de slides 1 uur op kamertemperatuur met zacht wiegen.
    9. Wash slides in PBS 4 x 5 minuten op kamertemperatuur met zacht wiegen.
       OPMERKING: Optionele stap: gebruik autofluorescentie-afschrikkits om het autofluorescentiesignaal te dempen.
    10. Incubeer met een 300 nM DAPI-oplossing gedurende 5 minuten met zacht wiegen. Was in PBS gedurende 2 x 5 minuten op kamertemperatuur met zacht wiegen.
    11. Monteren met antifade bevestigingsoplossing (90% glycerol, 0,2% n-propylgallaat in 1x PBS). Beeldsecties op een breedveld fluorescentiemicroscoop.
        OPMERKING: De belichtingsinstellingen van de camera voor elke fluorofor moeten worden aangepast om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren en pixelverzadiging te vermijden. Gebruik dezelfde belichtingsinstellingen bij het fotograferen van organoïden die in een sessie zijn gekleurd.

7. Volledige immunokleuring van geïsoleerde urethrale epitheelbladen

OPMERKING: Voor volledige immunkleuring volgt u Protocol, Sectie 2, Isolatie van urethraal epitheelweefsel, stappen 2.1 tot 2.12. om urethrale epitheelbladen te verkrijgen.

1. Breng het epitheelweefsel voorzichtig over met een transferpipet of een 200 μL pipetpunt in een put van een 24-put weefselkweekschotel met 500 μL 10% neutrale gepufferde formaline. Sluit het deksel van het bord af met paraffine en laat het 20 minuten op een wipstoel incuberen op 4 °C.
   OPMERKING: Voer alle stappen in dezelfde put uit om verlies van epitheelweefsel te voorkomen.
2. Aspireer voorzichtig de formaline uit de put. Voer een wash uit met 500 μL 1x PBS en incubeer 5 minuten op kamertemperatuur op een wippenstoel. Herhaal dezelfde wasstap nog eens.
3. Voeg 500 μL permeabilisatieoplossing met 1x PBS + 1% Triton X-100 toe aan de put. Sluit het deksel van de plaat af met parafilm en beculeer het 2 uur bij 4 °C met zacht wiegen.
4. Aspireer voorzichtig de permeabilisatieoplossing uit de put.
5. Voer blokkering uit door weefsels te incuberen in een 500 μL paardenblokkeringsbuffer met een extra 1% Triton X-100 (Recept voor paardenblokkeringsbuffer is opgenomen in Aanvullende Tabel 5). Sluit het deksel van het schotel af met parafilm en incubeer het een nacht op 4 °C met zacht wiegen.
6. Bereid primaire antilichaamoplossing voor in een paardenblokkerende buffer met een extra 1% Triton X-100 door primaire antilichamen toe te voegen met een geschikte verdunning (1:100–1:200). Aspireer blokkerende oplossing en voeg 500 μL primaire antistofoplossing toe: anti-CDH1 (epitheelcelmarker) en anti-F4/80 (muismacrofagenmarker). Sluit het deksel af met parafilm en broeuw 48–72 uur bij 4 °C met zacht wiegen.
7. Aspireer voorzichtig de primaire antistofoplossing en was drie keer met 1x PBS gedurende 30 minuten elk op kamertemperatuur met zacht wiegen.
8. Bereid secundaire antistofoplossingen voor in een paardenblokkeringsbuffer met een extra 1% Triton X-100 door secundaire antilichamen toe te voegen bij een geschikte verdunning (1:500).
9. Voeg 500 μL secundaire antistofoplossing toe aan de put en bedek de plaat met aluminiumfolie, en incubeer 4–6 uur bij kamertemperatuur op een rocker.
10. Aspireer voorzichtig de secundaire antistofoplossing en was drie keer met 1x PBS gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
    OPMERKING: DAPI-kleuring kan worden uitgevoerd door weefsels te incuberen met verdunde DAPI-voorraadoplossing (300 nM eindconcentratie) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de tissues met 1x PBS (2x 5 minuten) op kamertemperatuur op een wipstoel.
11. Breng voorzichtig het epitheelweefsel over naar een glazen glaasglaap of beeldschotel en voeg een antifade-bevestigingsoplossing toe (90% glycerol, 0,2% n-propylgallaat in 1x PBS).
12. Beeld weefsels in beeld met een fluorescentiemicroscoop.
    OPMERKING: Gezien de dikte van het monster raden de auteurs aan om beeldvorming te maken met een fluorescentiemicroscoop die optisch doorsnede kan uitvoeren. In deze studie gebruikten de auteurs een breedveld-fluorescentiemicroscoop met Apotome optische sectie om onscherp licht te verwijderen en z-stacks te verkrijgen. Beeld-z-stacks werden verkregen om dendritische projecties van epitheliaal-geassocieerde macrofagen te visualiseren.

Resultaten

Dissectie en verzameling van de volwassen vrouwelijke urinebuis

In het eerste deel van deze studie geven de auteurs een gedetailleerd protocol voor de dissectie van de vrouwelijke urinebuis van de muis. Gezien de aanhechting aan de ventrale vaginale wand en de locatie onder de pubicale symfyse, maakt de hier gegeven methode een schone dissectie van de volledige vrouwelijke urethra mogelijk (Figuur 1).

Isolatie van urethraal epitheelweefsel en flowcytometrieanalyse voor enkelcelisolaten

Trypsine vertering zorgt voor een gemakkelijke scheiding van de epitheelbekleding van de urethra van het omringende stroma. Epitheellagen met een hogere transparantie dan het stromale weefsel kunnen na de scheiding worden waargenomen (Figuur 2). De gescheiden epitheelplaten leverden bij enzymatische vertering eencellige suspenties op. Enkele cellen geïsoleerd uit het urethrale epitheel vertonen een consistent hoge levensvatbaarheid (>80%) door trypanblauwe uitsluiting op een hemocytometer (Figuur 2L) en flowcytometrie met levensvatbaarheidskleurstoffen om levende cellen te gaten (Figuur 3, Aanvullend Dossier 1).

De auteurs voerden flowcytometrie uit om de verrijking van epitheelcellen uit enkelcellige suspenties van urethraal epitiheel te beoordelen. Om de levensvatbaarheid van cellen te controleren, werd de celsuspensie gekleurd met een levende/dode marker, de amine-reactieve spookkleurstof V450. Auteurs observeerden consequent een cellevensvatbaarheid van >80% bij de levend/dood marker. De levend/dood marker maakte het mogelijk om puin en dode cellen tijdens de stroomanalyse uit te sluiten. Ze kleurden monsters met een epitheelcelmarker (CD326/EPCAM), een macrofagenmarker (F4/80) en een immuuncelmarker (CD45) om de samenstelling van geïsoleerde cellen met deze methode vast te leggen. De resultaten van flowcytometrie toonden aan dat de auteurs een verrijkte epitheelcelpopulatie isoleerden uit het vrouwelijke urethrale epitheel van de muis. Voor beide onafhankelijke experimenten behaalde de groep 80–90% EPCAM-positieve epitheelcellen na gating op levende cellen. De auteurs observeerden ook ~1,30% van de CD45+ immuuncellen in de epitheliale preparat. Macrofagen die geassocieerd zijn met de epitheliale bekleding vormden ~1,18% van de levende cellen uit het epitheelcompartiment. Flowcytometrieanalyse van single-cel suspensies van epitheelplaten toont minimale stromale contaminatie (5–6%), wat volgens hun eerdere studie vooral wordt toegeschreven aan het vasculaire endotheel⁵. Aanvullend dossier 1 toont flowcytometrieresultaten voor enkelcelpreparaten uit de epitheel- en stromale compartimenten. Vergeleken met de 80–90% verrijking van epitheelcellen geïsoleerd uit het epitheelcompartiment, toonde het stromale compartiment ook 40–50% epitheelcellen, die afkomstig zijn van de korte kanalen en het klierepitheel die zich uitstreken van het urethrale lumen naar het omliggende stroma (Figuur 3, Aanvullend Dossier 1).

Kweek van urethrale epitheliale organoïden, histologie en immunokleuring

De auteurs tonen ook aan dat enkele epitheelcellen die uit de urethra zijn geïsoleerd levensvatbaar zijn en organoïden kunnen vormen in een 3D-matrix, en observeerden organoïde groei van enkele urethrale epiteelcellen tot dag 6 in cultuur (Figuur 4B–G). Ze voerden hematoxyline-eosine-kleuring uit (H&E) om de histologie van organoïden te observeren (Figuur 4H–J). De auteurs observeerden twee verschillende morfologieën van urethrale epitheliale organoïden, waarvan één groot en hol was, terwijl het andere type kleiner en vast was. In beide gevallen waren de organoïden gestratificeerd en recapituleerde markers die tot expressie kwamen in de epitheliale bekleding van de vrouwelijke urethra, waaronder KRT5 en P63 die de basale laag markeren en KRT4 en KRT13 die suprabasale/intermediaire cellagen labelen (Figuur 4K–N), Aanvullende Figuur 1). De verschillen in organoïdevormingscapaciteit tussen de proximale en distale urethra werden onderzocht. Organoïden die uit de proximale urethra werden gegenereerd, hadden een hoger aandeel holle organoïden, terwijl organoïden uit de distale urethra vaste bollen vormden (Figuur 4O–P). Daarnaast observeerden zij verschillen in organoïdevormende efficiëntie in epitheelcellen die geïsoleerd waren uit het proximale en distale deel van de urethra. Distale urethrale epitheel vormde organoïden met een hogere efficiëntie dan het proximale urethrale epitheel met dezelfde initiële zaaidichtheid (5000 cellen/druppel) (Figuur 4Q–S).

Volledige immunokleuring van geïsoleerde urethrale epitheelplaten

De onderzoekers presenteren ook een geoptimaliseerde methode voor whole-mount kleuring van de vrouwelijke urethrale epitheelbladen van de vrouwelijke muis. Hier kleurden ze epitheelplaten met twee markers: F4/80 voor macrofagen en E-cadherine/CDH1 om epitheelcel-cel verbindingen te markeren (Figuur 5). Weefsels werden gefotografeerd met een Zeiss Axio Observer 7-microscoop met Apotome 3 optische doorsneden. Epitheelbladen vertonen sterke labeling met het CDH1-antilichaam. Volledige voorbereidingen van urethraal epitheel, gelabeld met antilichamen tegen F4/80, toonden macrofagen die een abor van dendrieten vormden in de epitheliale bekleding. Macrofagen konden dendritische processen tussen epitheelcellen van de urethra sturen. Over het geheel genomen tonen de resultaten het nut aan van de hier beschreven protocollen voor het bestuderen van de epitheelbekleding van de vrouwelijke muizenurethra.

Figuur 1: Muisdissectie voor vrouwelijke plasbuisverzameling. (A) Plaats de muis in rugligging en spuit de buik in met 70% EtOH. (B–C) Open de buik door de huid op te tillen en een verticale incisie te maken. (D) Vet en bindweefsel afknippen om de vlindervormige schaambeenderen bloot te leggen die verbonden zijn bij de (Arrow in Black) schaamsymfyse. (E) Snijd de schaamsymfyse door. (F) Zodra de schaambeen zijn verwijderd, is de plasbuis naar beneden te zien lopen (omlijnd met een zwarte stippellijn) vanaf de blaas. (G) Trek voorzichtig de blaas omhoog met een tang. De plasbuis is duidelijk zichtbaar als een dun rood buisje. (H–I) Trek de blaas omhoog vanuit de lichaamsholte. Gebruik spanning op de blaas om de urethra van de ventrale vaginale wand te scheiden. Haal de schaar tussen de plasbuis en de vaginale wand om de urine- en voortplantingswegen te scheiden. (J–K) Haal het distale uiteinde van de plasbuis los die aan de huid vastzit. (L) Afbeelding van een gedissecte vrouwelijke muis in de onderste urinewegen (FLUT), met blaas en plasbuis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Isolatie van urethrale epitiheel en voorbereiding van een single-cell suspensie. (A) Schema dat enzymatische vertering en mechanische scheiding van de epitheliale en stromale compartimenten van de urethra weergeeft, gevolgd door eencellige vertering. (B) Verwijder het overtollige vet uit de vrouwelijke onderste urinewegen. (C–F) Snijd de plasbuis van het blaas-nekgebied af om de plasbuis van de blaas te scheiden. Snijd daarna de urethra in tweeën met een fijne schaar. (G) Was de plasbuisstukken met 1x HBSS-oplossing door een filter van 100 micron te passeren. (H) Fragmenten van urethraal weefsel overbrengen naar 1% trypsinoplossing. Incubeer op een monsterrotator in de koelruimte. Voeg MgCl₂ en DNase I toe aan dezelfde tube. Incubeer bij 37 °C in een hybridisatieoven op een monsterrotator. (I–J) Isoleer het epitheel door voorzichtig met fijne tangen langs de lengte van het urethrale fragment te knijpen. (K) Weefsels worden met fijne schaar in kleine stukjes gehakt. Breng het gemalen epitheelweefsel over in een Accutase-digestieoplossing en breng het op 37 °C in een hybridisatieoven op een monsterrotator. (L) Tellen van epitheelcellen en beoordeling van levensvatbaarheid met trypanblauw en een hemocytometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Flowcytometrie om single-cel suspenties van urethrale epitheel en stromacompartimenten te beoordelen. Flowcytometrie werd uitgevoerd op enkelcellige preparaten van samengevoegde muizenurethra (A), epitheliale en (B) stromale compartimenten. Levende cellen werden afgesloten om dode cellen die gekleurd waren met Ghost Dye V450 uit te sluiten. Levende cellen werden beoordeeld op CD45 (pan-immuunmarker), CD326/EPCAM (pan-epitheliale marker) en F4/80 (muismacrofagenmarker) expressie. De gegevens zijn representatief voor 2 onafhankelijke experimenten uitgevoerd op een pool van 5–6 muizen per experiment om epitheel- en stromale monsters te genereren. Afkortingen; SSC-A = zij-verstrooiingspiekgebied; FITC = fluoresceïneisothiocyanaat; APC = allofhycocyanine; PE = phycoerythrin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Histologie en immunokleuring van urethrale epitheliale organoïden. (A) Schema dat de workflow toont voor de generatie van urethrale epitheliale organoïden. (B–G) Representatieve bright-field microfoto's van urethrale epitheelorganoïden (UEO's) die op verschillende dagen van in vitro expansie uit individuele cellen worden gegenereerd. Representatieve brightfield-beelden van (H) holle en (I) vaste urethrale epitheelorganoïden (UEO's) gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E). (J) Kwantificering van organoïdetypen gegenereerd over drie onafhankelijke experimenten. De foutbalk geeft de standaardfout van het gemiddelde weer. Representatieve beelden van (K) holle en (L) solide urethrale epitheliale organoïden (UEO's) die immunogekleurd zijn met epitheelmarkers KRT13 (suprabasale epitheelmarker), KRT5 (basale epitheelmarker) en P63 (basale epitheelmarker). Afbeeldingen die enkele fluorescerende kanalen tonen, zijn weergegeven in K', K'', K''', L',L'' en L'''. Representatieve beelden van (M) holle en (N) vaste urethrale epitheliale organoïden (UEO's) die immuno-gekleurd zijn met epitheelmarkers KRT4 (suprabasale epitheliale marker) en KRT5 (basale epitheelmarker). Afbeeldingen die enkele fluorescerende kanalen tonen, zijn weergegeven in M', M'', N' en N". (O) Schema van dissectie van proximale en distale urethra. (P) Kwantificering van organoïdetypen gegenereerd vanuit de proximale en distale urethra in twee onafhankelijke experimenten. Representatieve brightfield-micrografieën van dag 6 urethrale epitheliale organoïden (UEO's) gegenereerd uit epitheel geïsoleerd uit de (Q) proximale en (R) distale urethra. Gegevens van organoïden die uit de volledige urethra zijn gegenereerd, zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten uitgevoerd met een pool van 3–5 muizen per experiment. (S) Gegevens van organoïden die worden gegenereerd uit de proximale en distale urethra zijn representatief voor 2 onafhankelijke experimenten uitgevoerd met een pool van 3–4 muizen per experiment. Kernen gelabeld met DAPI (blauw). (Schaalbalken, 100 μM). Schema's opgesteld met BioRender en Adobe Illustrator. Gemaakt in BioRender. Binoy joseph, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Volledige immunokleuring van urethrale epitheelplaten. (A) 10-micron bevroren sectie van de volwassen vrouwelijke muizenurethra in optimale snijmedia, met immunokleuring voor de muismacrofagen marker F4/80 (in rood) en het epitheeleiwit E-cadherine/CDH1 (in groen). (A') staat voor ingezoomd in beeld van inzet in (A). (B) Schematisch diagram dat stappen toont voor de volledige kleuring van geïsoleerde urethrale epitheelplaten. Volledige immunokleuring van geïsoleerde vrouwelijke urethrale bekleding van de muis werd uitgevoerd met antistoffen tegen de muismacrofagen marker F4/80 (in rood) en het epitheeleiwit E-cadherine/CDH1 (in groen). (C) Representatief beeld van samengevoegde weergave. (D) Orthogonale maximale intensiteitsprojectie van het rode kanaal met macrofagenorganisatie. (E–F) Ingezoomd op het epitheel en bijbehorende macrofagen. Witte schaalstaaf, 50 μM. Grijsschaalstaaf, 500 μM. De gegevens zijn representatief voor 2 onafhankelijke experimenten uitgevoerd op een pool van 4–5 muizen. Schema's gemaakt in BioRender en Adobe Illustrator. Gemaakt in BioRender. Binoy joseph, D. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Bereiding van 1x HBSS (geen Ca, Mg).Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Bereiding van 1x sHBSSa en 1% trypsinoplossing.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Voorbereiding van cel-/stroomkleuringsbuffer.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 4: Voorbereiding van organoïde-expansiemedia voor urethrale epitheelorganoïden.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 5: Voorbereiding van de paardenblokkering.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Celtellingen voor het flowcytometrie-experiment uitgevoerd op individuele cellen uit de urethrale epitheliale en stromale compartimenten uit twee onafhankelijke experimenten.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 1: Vergelijking van volwassen vrouwelijke muizenurethrale epitheel met urethrale epitheelorganoïden. Representatieve beelden van (A) volwassen vrouwelijke urethrale epitheelepitheel, (B) holle urethrale epitheliale organoïden, en (C) solide urethrale epitheliale organoïden (UEO's) die immunogekleurd zijn met epitheelmarkers KRT13 (suprabasale epitheelmarker), KRT5 (basale epitheelmarker) en P63 (basale epitheliale marker). Afbeeldingen die enkele fluorescerende kanalen tonen, worden weergegeven in A', A'', A''', B', B'', B''', C', C'' en C'''. Representatieve beelden van (D) volwassen vrouwelijke urethrale epitheel, (E) holle urethrale epitheelorganoïden en (F) solide urethrale epitheliale organoïden (UEO's) geïnompeleerd met epitheelmarkers KRT4 (suprabasale epitheliale marker) en KRT5 (basale epitheliale marker). Afbeeldingen die enkele fluorescerende kanalen tonen, worden weergegeven in D', D'', E', E'', F' en F". Gegevens representatief voor 3 onafhankelijke experimenten uitgevoerd met een pool van 3–4 muizen per experiment. Kernen gelabeld met DAPI (blauw). (Schaalbalken, 100 μM). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Epitheliale barrières in het lichaam zijn van cruciaal belang voor de verdediging van de gastheer. Dit zijn gespecialiseerde compartimenten met meerdere epitheelcellen en bijbehorende residentiële immuuncellen. Epitheliale barrières veranderen gedurende de ontwikkelingsperiode en nemen vaak gastheerverdedigingsgenexpressie over als reactie op microbiota of omgevingsblootstellingen. Defecten aan de epitheelintegriteit of genexpressie kunnen de verdediging van de gastheer^beïnvloeden. Het is essentieel om epitheelweefsel in isolatie te bestuderen om transcriptomische signaturen te begrijpen, evenals om cel-celcontacten en epitheliale integriteit te onderzoeken. Momenteel zijn er geen methoden in detail beschreven die geoptimaliseerd zijn voor de isolatie van urethraal epitheel weefsel van de vrouwelijke muis. Hoewel het blaasepitheel alleen door mechanische scheiding¹⁶ kan worden geïsoleerd, bevindt het urethrale epitiheel zich in de stromale buis van de urethra en vereist het een combinatie van enzymatische en mechanische scheiding om epitheelweefsel te isoleren.

Hier presenteren de auteurs een geoptimaliseerde methode voor isolatie van epitheelbladen uit het urethrale lumen van vrouwelijke muizen. De methode kan worden gebruikt voor het genereren van hooglevensvatbare single-cell suspensies van urethrale epiteelcellen voor downstream toepassingen zoals flowcytometrie, organoïdekweek en immunokleuring. De compatibiliteit van deze methode met single-cell RNA-sequencing workflows werd eerder aangetoond door dezelfde groep⁵. Met aanpassingen en verdere optimalisatie kan het hier gepresenteerde protocol worden aangepast om epitheelweefsels uit andere buisvormige organen te extraheren voor latere toepassingen.

De belangrijkste stappen in het protocol omvatten een zorgvuldige dissectie van de volledige volwassen vrouwelijke muizenurethra, waardoor regionale verschillen langs de proximaal-distale as bestudeerd kunnen worden. Hierna gebruikt het protocol een zachte enzymatische vertering om de epitheelwand van de plasbuis los te maken van het omliggende stroma. De enzymatische vertering maakt het epitheliale lichaam los om mechanische scheiding mogelijk te maken door voorzichtig de urinebuis tussen de pincetten samen te knijpen om het epitheelweefsel vrij te maken. De onderzoekers hebben zorgvuldig de timing van trypsine vertering geoptimaliseerd om isolatie van urethraal epitheel met een hoge levensvatbaarheid (> 80%) mogelijk te maken als bladen voor immunokleuring of voor downstream enkelcelisolatie (Figuur 3, Aanvullend Dossier 1). De eencelige vertering van urethrale epitheel onthulde 80–90% van de epitheelcellen in urethrale epitheelisolaten. Uit een eerdere studie blijkt dat niet-epitheliale cellen in deze preparaat voornamelijk bestaan uit epitheel-geassocieerde immuuncellen en vaatendotheel⁵. De huidige methode voor enkelcelisolatie levert hoogwaardige single-cel suspenties op voor latere toepassingen zoals flowcytometrie en single-cell RNA-sequencing door celklonten te elimineren via mechanische verstoring via small-gauge naaldaspiratie en verwijdering van rode bloedcellen door zachte lysis.

De resultaten tonen aan dat deze methode kan worden gebruikt om compartimentspecifieke immuuncellen te verrijken (Figuur 3). Epitheel dat is geïsoleerd uit de proximale en distale urethra kan ook afzonderlijk worden bestudeerd. Daarnaast toonden de auteurs aan dat geïsoleerde epitheelcellen kunnen worden gebruikt voor de vorming van urethrale organoïden die eerder niet zijn beschreven (Figuur 4). Deze resultaten tonen ook regionale variabiliteit in organoïde generatiecapaciteit in de vrouwelijke urethra. Hoewel recente studies van de auteur proximaal-distale verschillen hebben aangetoond in epitheliale genexpressie en immuuncelorganisatie in de vrouwelijke muisurethra⁵, toont de huidige studie aan dat proximale urethrale epitheelcellen minder organoïden vormen dan epitheel geïsoleerd uit de distale urethra (Figuur 4). Een beperking van deze ruimtelijke afbakening in proximale en distale urethra is dat er geen anatomisch herkenningspunt is dat op het moment van dissectie gebruikt kan worden om deze twee gebieden te onderscheiden. In deze studie hebben de auteurs de lengte van de urethra gehalveerd om proximale en distale compartimenten te verkrijgen. De hier beschreven epitheliale isolatiemethode kan worden gebruikt om de verschillen in genexpressie en cellulaire samenstelling tussen het proximale en distale urethrale epitheel verder te karakteriseren.

Hoewel het hier geoptimaliseerde protocol toegankelijk en reproduceerbaar is, vereisen sommige stappen oefening en zorgvuldige kalibratie. In het bijzonder vereist de hier getoonde dissectiemethode zorgvuldig het verwijderen van de plasbuis onder de symfyse pubis, terwijl de volledige lengte van de plasbuis behouden blijft. Daarnaast moet zorgvuldig worden betracht om na de dissectie al het vaginaal weefsel dat aan de dorsale urethrale wand vastzit te verwijderen. Vet rond de blaashals moet zorgvuldig worden verwijderd om adipocytenbesmetting te verminderen tijdens latere toepassingen zoals single-cell RNA-sequencing. Bovendien moet de trypsine-vertering zorgvuldig worden geoptimaliseerd bij elke batch enzym om een consistente vertering te garanderen. Oververtering van weefsel kan leiden tot verlies van cellevensvatbaarheid. De auteurs hebben de tijd voor de trypsin-vertering zorgvuldig geoptimaliseerd, waarbij een tijdsvenster van 15–30 minuten voor de incubatiestappen wordt aangegeven bij 4 °C en 37 °C. Dit kan verder worden geoptimaliseerd op basis van de gebruikte batch enzym. Het is ook cruciaal om weefsels in kleine stukjes te hakken voor een efficiënte eencellige vertering. De auteurs hebben Accutase gebruikt voor verdere single-cell digestion, omdat het resulteert in een zachte dissociatie. In geval van een vermindering van de cellevensvatbaarheid kan de tijd voor Accutase-incubatie worden verkort. Daarnaast hebben de auteurs een Rock-remmer toegevoegd aan de Accutase-verteringsmix om de celoverleving te verbeteren. De vertering van DNase wordt aanbevolen om celklontering te verminderen door extracellulair DNA te verteren dat vrijkomt van dode en stervende cellen. De auteurs bevelen ook het gebruik van een rode bloedcellen-lysebuffer aan om besmetting van rode bloedcellen te verminderen, wat latere resultaten zoals flowcytometrie en single-cell RNA-sequencing zou kunnen verwarren.

Een beperking van de hier gepresenteerde epitheliale isolatiemethode is dat deze is geoptimaliseerd voor de vrouwelijke urinebuis van de muis. De mannelijke muizenurethra is anatomisch complexer, met veranderende epitheelarchitectuur van de proximale naar de distale urethra. Daarnaast kan de methode alleen de epitheelcellen isoleren die het urethrale lumen bekleden. Urethrale secretoire klieren die via korte epitheelgangen met het urethrale lumen verbonden zijn, kunnen niet worden geïsoleerd omdat deze in stromaal weefsel zijn ingebed in stromaal weefsel. In plaats daarvan worden deze epitheelstructuren verrijkt in het stromale compartiment dat overblijft na het isoleren van de urethrale epitheliale bekleding (Figuur 3).

Ondanks deze beperkingen heeft deze methode belangrijke inzichten in de architectuur van het urethrale epiteel mogelijk gemaakt en zal verdere onderzoeken mogelijk maken naar epitheliaal-geassocieerde immuuncellen via visualisatie van epitheliale macrofagen in situ. De methode is al aangetoond compatibel te zijn met single-cell RNA-sequencing workflows om cellulaire heterogeniteit in het urethrale epitheel en bijbehorende immuuncellen^te identificeren. Daarnaast zal het vermogen om epitheel te isoleren van de proximale en distale urethra studies mogelijk maken om ruimtelijke verschillen in de urethra te begrijpen. Belangrijk is dat de epitelcel-verteringsmethode levensvatbare individuele cellen oplevert die urethrale epitheliale organoïden kunnen genereren die nuttig zijn voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties en de epitheelbiologie van de urethra. Al met al voegen deze methoden een aanvulling op de toolkit om diepgaandere onderzoeken naar de urethrale epitheelbiologie mogelijk te maken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#5 fine forceps
10% neutraal gebufferd formaline	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-scheidingsfilter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		Voor het maken van figuurpanelen
Adobe Photoshop	Adobe		Voor het maken van figuurpanelen
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibioticum/antimycoticum	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	1:20 verdunning, voor Flow cytometry
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	1:20 verdunning, voor Flow cytometry
Anti-CDH1 (Konijn)	Cell Signalling Technology	3195S	1:200 verdunning
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	1:20 verdunning, voor Flow cytometry
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	1:200 verdunning
Anti-Keratin 13 (Konijn)	Abcam	ab92551	1:200 verdunning
Anti-Keratin 4 (Muis)	Abcam	ab9004	1:200 verdunning
Anti-Keratin 5 (Kip)	Biolegend	905904	1:800 verdunning
Anti-Keratin 5 (Konijn)	Cell Signaling Technology	71536	1:200 verdunning
Anti-p63 (Muis)	Biocare medical	CM163A	1:200 verdunning
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumine (BSA), fractie V	Genetix	PG-2330
CD-1 Muizen	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI-oplossing	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfaat (DMSO)	Himedia	MB058
di-Natrium waterstof ortofosfaat (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Ezel anti-Kip IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500 verdunning
Ezel anti-Muis IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500 verdunning
Ezel anti-Muis IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500 verdunning
Ezel anti-Konijn IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500 verdunning
Ezel anti-Konijn IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500 verdunning
Ezel anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500 verdunning
Ezel anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500 verdunning
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosine	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt montagemedia	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filtercap sorteerbuisjes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrisch	Merck	DA1P692899
Hemotoxyline	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Paarden serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	Analyse van flow cytometry gegevens
Magnesiumchloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-muis CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteïne	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propylgallaat	Sigma Aldrich	P3130
Paraffinewas	Qualigens	Q19215
Kaliumchloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic zuur	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling Technology	1