Isolatie en karakterisering van tandpulpa-stamcel-afgeleide exosomen over celgangen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde workflow voor het isoleren en karakteriseren van exosomen van tandpulpastamcellen (DPSC) over passages, waardoor de kwaliteit van exosoomen en functionele activiteit voor regeneratieve toepassingen reproduceerbaar kunnen worden beoordeeld.

Samenvatting

Tandpulpastamcellen (DPSC's) vormen een toegankelijke en klinisch relevante bron van mesenchymale stamcellen, en hun afgeleide exosomen zijn uitgegroeid als veelbelovende bioactieve vesikels voor celvrije toepassingen in weefseltechnologie en regeneratieve geneeskunde. Echter, reproduceerbare en gestandaardiseerde methoden voor het isoleren en functioneel valideren van DPSC-afgeleide exosomen blijven beperkt, vooral met betrekking tot variabiliteit die tijdens celexpansie over passages wordt geïntroduceerd. Hier beschrijven we een uitgebreide, gestandaardiseerde, kit-gebaseerde workflow voor de isolatie en zuivering van exosomen uit DPSC-geconditioneerd medium die compatibel is met routinematige laboratoriumpraktijken. Deze methode maakt consistente terugvinding mogelijk van intacte blaasjes die geschikt zijn voor morfologische, moleculaire en functionele karakterisering met gebruik van algemeen beschikbare technieken. De exosoomidentiteit wordt beoordeeld op basis van morfologie, grootteverdeling en markerexpressie, terwijl biologische activiteit wordt geëvalueerd met een gedefinieerde in vitro ontstekingsremmende assay. Om effecten gerelateerd aan passages te onderzoeken, worden exosomen afkomstig van verschillende DPSC-passages vergeleken met behulp van deze functionele uitlezing, wat een praktisch kader biedt om consistentie tijdens celexpansie te beoordelen. Door isolatie, zuivering, karakterisering en functionele validatie te integreren in één workflow, biedt dit protocol een reproduceerbare en schaalbare aanpak voor het genereren van functioneel gevalideerde, DPSC-afgeleide exosomen voor biomaterialenonderzoek en regeneratieve toepassingen.

Inleiding

Exosomen afkomstig van mesenchymale stamcellen dienen als cruciale mediatoren van intercellulaire communicatie en tonen aanzienlijk therapeutisch potentieel op het gebied van weefselengineering en regeneratieve geneeskunde. Exosomen zijn blaasjes met een diameter van 30–150 nm, die in staat zijn bioactieve moleculen af te leveren en verschillende functies in ontvangende cellen te reguleren, zoals proliferatie, differentiatie en immuunrespons ^1,2. Van de verschillende bronnen van mesenchymale stamcellen (MSC) zijn tandpulpastamcellen (DPSC's) van bijzonder belang vanwege hun toegankelijkheid, robuuste proliferatiecapaciteit, lage tumorrisico en minimale ethische zorgen ^3,4,5. Exosomen afkomstig van DPSC's (DPSC-Exo's) bevatten een divers repertoire van functioneel goed, waaronder eiwitten, mRNA's en microRNA's, waardoor ze veel van de biologische eigenschappen van hun oudercellen kunnen behouden. Eerdere studies hebben aangetoond dat DPSC-Exos angiogenese, neurale reparatie, botregeneratie en ontstekingsremmende reacties kunnen bevorderen. Naast hun rol in weefselengineering worden exosomen steeds vaker erkend als belangrijke regulatoren in oncogenese en kankertherapie, waar ze bijdragen aan tumormicro-omgevingsremodel, geneesmiddelresistentie en immuunontwijking⁶. MSC-afgeleide exosomen, waaronder die van DPSC's, bezitten inherente tumorhoming-mogelijkheden en immunomodulerende eigenschappen, waardoor ze veelbelovende volgende generatie voertuigen zijn voor gerichte toediening van antikankermedicijnen of als celvrije immunotherapeutische middelen. Door verschillende beperkingen die gepaard gaan met celgebaseerde therapieën te omzeilen, zijn DPSC-Exo's uitgegroeid tot een veelbelovend acellulair bioactief bestanddeel voor regeneratieve toepassingen 7,8,9,10,11,12.

Ondanks deze voordelen blijft de vertaling van DPSC-Exo-onderzoek naar reproduceerbaar experimenteel of klinisch gebruik een uitdaging. Een grote beperking is het ontbreken van uniforme en gestandaardiseerde protocollen voor isolatie en zuivering van exosoomen. Momenteel gebruikte benaderingen zijn onder andere ultracentrifugatie¹³, ultrafiltratie, precipitatie, grootte-uitsluitingschromatografie en immunoaffiniteitsvangst ^14,15. Onder deze methoden biedt polymeergebaseerde precipitatie praktische voordelen, waaronder hoge doorvoersnelheid, compatibiliteit met een breed scala aan monstervolumes en operationele eenvoud, waardoor het geschikt is voor studies met grote steekproefaantallen of opschalingsvereisten 16,17,18. Vergelijkende analyses van verschillende isolatiemethoden, met name wat betreft eiwitopbrengst en deeltje-tot-eiwit verhouding, zijn breed gedocumenteerd in de literatuur¹⁹. De invloed van het aantal DPSC-passages op de kenmerken en biologische activiteit van afgeleide exosomen is echter niet voldoende behandeld, wat een belangrijke kloof vormt voor de standaardisatie en kwaliteitscontrole van DPSC-Exo-productie.

Om deze technische beperkingen aan te pakken, presenteert deze studie een gestandaardiseerd, kit-gebaseerd protocol voor het isoleren en zuiveren van exosomen uit DPSC-geconditioneerd medium. Naast fysieke en moleculaire karakterisering bevat het protocol een functionele assay om de ontstekingsremmende activiteit van exosomen afkomstig van verschillende DPSC-passages te evalueren, waardoor een vergelijkende beoordeling van passage-afhankelijke consistentie in exosoomkwaliteit en functie mogelijk is. De workflow is ontworpen voor een eenvoudige implementatie in laboratoria die zijn uitgerust met standaard celkweek en moleculaire biologische faciliteiten. Het is afhankelijk van commercieel verkrijgbare kits om interexperimentele variabiliteit te verminderen en kan eenvoudig worden opgeschaald om aan verschillende experimentele behoeften te voldoen. Om de variabiliteit tussen donoren te minimaliseren, worden DPSC's geïsoleerd uit individuele tanden en onafhankelijk uitgebreid in plaats van uit meerdere donoren te worden gepoold. Dit protocol is vooral nuttig voor onderzoekers die functioneel gevalideerde DPSC-afgeleide exosomen willen genereren voor latere toepassingen, waaronder wondgenezing, botweefselengineering en immunomodulatiestudies, waarbij batch-tot-batch consistentie essentieel is. Al met al biedt het een praktisch en gestandaardiseerd kader voor het produceren van DPSC-afgeleide exosomen voor gebruik in weefseltechnologie en onderzoek naar regeneratieve geneeskunde.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de ethische commissies van de instellingen. Menselijk tandpulpaweefsel werd verkregen uit weggegooide derde kiezen of orthodontische premolaren die werden verzameld in het Ningbo Stomatologieziekenhuis volgens de institutionele ethische richtlijnen (Protocol nr. NBKQYY2025LS-04; goedkeuringsdatum: 30 mei 2025). Menselijk huidweefsel is verkregen uit weggegooide voorhuidmonsters die zijn verzameld tijdens routinematige besnijdenisprocedures op de afdeling Urologie van het Affiliated People's Hospital van de Ningbo Universiteit, in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de instelling (Protocol nr. 2024104; goedkeuringsdatum: 30 oktober 2024). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle donoren of hun wettelijke voogden voorafgaand aan de monsterafname.

1. Isolatie van exosomen afkomstig van tandpulpa stamcellen

1. Isolatie, cultuur en identificatie van DPSC's
   1. Monsterverzameling en transport
      1. Verzamel intacte menselijke derde kiezen van donoren van 18–25 jaar of premolaren van donoren van 12–16 jaar na orthodontische extractie.
      2. Plaats de getrokken tanden onmiddellijk in voorgekoelde fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS), aangevuld met 100 U/mL penicilline-G en 100 μg/mL streptomycine.
      3. Transporteer monsters naar het laboratorium bij 4 °C en verwerk binnen 6 uur na extractie.
   2. Blootstelling van tandpulpa en weefseldissociatie
      1. Dompel je in 70% ethanol gedurende 30 seconden; Was drie keer met 1× PBS die 3% K/S bevatte (30 s elk). Verwijder voorzichtig resterende gingivale en parodontale weefsels van het tandoppervlak met een steriele schaar of een scalpel.
      2. Wikkel de tand in steriel gaas en breek vervolgens voorzichtig de kroon met een gesteriliseerde hamer om de pulpakamer bloot te leggen.
      3. Scheid voorzichtig het pulpaweefsel van het dentine en snijd het in kleine fragmenten (<1 mm³) met steriele chirurgische messen.
      4. Breng de weefselfragmenten over in een 1,5 mL centrifugebuis met een verteringsoplossing van 2,5 mg/mL Dispase II en 2,5 mg/mL collagenase type I.
      5. Incubeer het mengsel bij een broedmachine van 37 °C gedurende 30–45 minuten met zachte roering.
         OPMERKING: De duur van enzymatische vertering werd bepaald op basis van het volume en de mate van homogenisatie van het tandpulpaweefsel.
   3. Beëindiging van de spijsvertering en primaire celkweek
      1. Stop de enzymatische vertering door een gelijke hoeveelheid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) toe te voegen, aangevuld met 10% foetaal runderenserum (FBS).
      2. Centrifugeer de celsuspensie op 200 × g gedurende 5 minuten om de cellen en weefselfragmenten te pelleten.
      3. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL volledig kweekmedium (α-MEM met 20% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine).
      4. Zaad de resuspendeerde cellen en explantaties in een kweekschotel van 60 mm en voeg een compleet kweekmedium toe aan een eindvolume van 5 mL.
      5. Incubeer de cellen op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂.
   4. Celonderhoud en subcultuur
      1. Vernieuw het kweekmedium elke 2–3 dagen.
      2. Houd cellen dagelijks in de gaten.
         OPMERKING: Primaire DPSC's migreren doorgaans vanuit weefselexplants en bereiken binnen 7–14 dagen een samenvloeiing van 80–90%.
      3. Voor subcultuur scheid je cellen met 0,05% trypsine-ethyleendiaaminetetraazijnzuur (EDTA) wanneer ze 80–90% confluentie bereiken.
         VOORZICHTIG: Trypsine is een irritatie. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en veiligheidsbrillen.
      4. Doorgang cellen in een verhouding van 1:3 met het volledige kweekmedium (met 20% FBS).
      5. Gebruik DPSC's bij passages 2, 4 en 6 voor alle isolatie en functionele assays stroomafwaarts voor exosoomen.
   5. Karakterisering van DPSC's door flowcytometrie
      1. Koppel DPSC's af bij de gewenste passage met 0,05% trypsine-EDTA, neutraliseer met een volledig kweekmedium en verzamel de celsuspensie.
      2. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Susser de celpellet opnieuw in PBS en tel de cellen. Pas de celdichtheid aan op ongeveer 1 × 10^{6 cellen} /mL.
      3. Aliquot 100 μL van de celsuspensie in elke flowcytometriebuis. Incubeer de cellen met fluorchroom-geconjugeerde antilichamen tegen CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 en CD14 bij een verdunning van 1:100 in PBS gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
      4. Was de cellen door 1 mL PBS aan elke buis toe te voegen, gevolgd door centrifugatie op 300 × g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant zorgvuldig en suspendeer de celpellet opnieuw in 300–500 μL PBS voor analyse.
      5. Voeg geschikte isotypecontrole-antilichamen toe in gelijke concentraties voor elk fluorochroom om achtergrondcorrectie en gating mogelijk te maken.
      6. Analyseer monsters met een flowcytometer uitgerust met geschikte lasers en filters voor de geselecteerde fluorochomen. Verzamel minstens 10.000 gebeurtenissen per monster.
      7. Voer data-analyse uit met behulp van flowcytometriesoftware. Ten eerste, gate-vatbare cellen op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) om puin uit te sluiten. Daarna breng je singletgating toe om doublets te verwijderen.
      8. Bepaal markerexpressie door fluorescentieintensiteit te vergelijken met overeenkomstige isotypecontroles om positieve en negatieve populaties te definiëren.
2. Isolatie en zuivering van DPSC-Exos
   1. Bereiding van geconditioneerd medium
      1. Kweek DPSC's in een 10 cm kweekschotel totdat ze 70–80% confluentie bereiken.
      2. Verwijder het gebruikte medium en was de celmonolaag vervolgens voorzichtig twee keer met voorverwarmde PBS.
      3. Voeg 10 ml volledig medium toe, aangevuld met 10% exosoom-uitgeput FBS.
      4. Incubeer de cultuur verder bij 37 °C totdat de celconfluentie 90–100% bereikt (een proces dat meestal meer dan 24 uur duurt).
   2. Verzameling van geconditioneerd medium
      OPMERKING: Houd alle volgende stappen op ijs of op 4 °C.
      1. Breng het geconditioneerde medium over naar een centrifugebuis.
      2. Centrifugeer het medium op 4 °C en 3.000 × g gedurende 10 minuten om cellen en groot vuil te verwijderen.
      3. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis zonder de pellet te verstoren.
      4. Centrifugeer het supernatant bij 4 °C en 10.000 × g gedurende 10 minuten om kleinere deeltjes en apoptotische lichamen te pelleteren.
      5. Filter het supernatant door een 0,22 μm spuitfilter in een schone 50 mL centrifugebuis.
      6. Bewerking het geklarificeerde medium onmiddellijk voor exosoomisolatie, of aliquot, en bewaar het bij -80 °C.
         OPMERKING: Het geklaarde geconditioneerde medium kan enkele maanden worden bewaard bij -80 °C. Vermijd herhaalde vries-dooicycli.
   3. Exosoomisolatie door polymeergebaseerde precipitatie
      1. Ontdooi het geklaarde, geconditioneerde medium op ijs als het bevroren was.
      2. In een steriele buis op ijs combineert u het medium met een exosoomconcentratieoplossing met een volumeverhouding van 4:1 (bijv. 20 mL medium: 5 mL oplossing). Laat het mengsel 1 minuut vortexen om homogeniteit te waarborgen.
      3. Laat het mengsel onaangeroerd op 4 °C gedurende 16–18 uur om exosoomneerslag mogelijk te maken.
         OPMERKING: De incubatietijd kan passend worden verlengd om de opbrengst mogelijk te verhogen, maar mag niet langer zijn dan 24 uur.
      4. Centrifugeer het mengsel bij 4 °C en 10.000 × g gedurende 75–80 minuten om de exosomen te pelleten. Aspireer en gooi het supernatant voorzichtig af zonder het pelletje te verstoren.
      5. Centrifugeer de buis opnieuw op 4 °C en 10.000 × g gedurende 2 minuten. Verwijder eventuele resterende supernatant met een pipet.
      6. Suspendeer het exosoompelletje opnieuw in 1x PBS (Gebruik 200 μL PBS per 20 mL geconditioneerd medium).
      7. Breng de resuspension over in een nieuwe 1,5 mL centrifugebuis en centrifugeer bij 4 °C en 12.000 × g gedurende 2 minuten, waarbij het supernatant wordt behouden, dat verrijkt is met exosoomdeeltjes (herhaal indien nodig).
   4. Zuivering van exosomen
      1. Breng de exosoom-suspensie aan op een exosoomzuiveringsfilterkolom die in een verzamelbuis is geplaatst.
      2. Centrifugeer de kolom op 4 °C en 3.000 × g gedurende 10 minuten.
      3. Verzamel de doorstroomvloeistof van de bodem van de verzamelbuis. Deze vloeistof bevat de gezuiverde exosomen.
   5. Opslag van gezuiverde exosomen
      1. Aliquot de gezuiverde exosoom-suspensie in eenmalige volumes die geschikt zijn voor latere experimenten.
      2. Bewaar de aliquots bij -80 °C.
         OPMERKING: Aliquoteren is cruciaal om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen, die de integriteit van exosoomen en biologische activiteit kunnen aantasten.
   6. Karakterisering en identificatie van DPSC's-Exo
      1. Voer morfologische analyse uit met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) zoals beschreven in stappen 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. Gebruik een pipet, neem 10 μL van het voorbereide exosoom-suspensiemonster en laat het op de vooraf voorbereide Parafilm vallen. Plaats het formvar/koolstofgecoate koperen rooster, met de filmzijde naar beneden, op de druppel, zodat deze 10–15 minuten natuurlijk kan adsorberen.
      3. Gebruik een filterpapierstrip om overtollig vocht weg te trekken en laat het kort aan de lucht drogen.
      4. Gebruik een pipet, neem 10 μL 2% fosfhotungstische zuuroplossing en laat het op de Parafilm vallen. Draai het rooster om dat de adsorptiestap heeft voltooid zodat de filmzijde naar de kleuringsoplossing gericht is, en laat het 3–5 minuten zitten.
      5. Gebruik een filterpapierstrip om overtollig vocht af te voeren en laat het rooster drogen onder een gloeilamp.
      6. Observeer en maak beelden met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.
      7. Voer een analyse van de grootteverdeling en concentratie uit met nanoparticle tracking analysis (NTA) zoals beschreven in stappen 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. Spoel de monsterkamer drie keer af met ultrazuiver water.
      9. Kalibreer het instrument met standaard 100 nm polystyreenkralen volgens de instructies van de fabrikant. Ga verder met metingen na succesvolle kalibratie.
      10. Spoel de monsterkamer af met 1× PBS.
      11. Verdun het exosoommonster in 1× PBS (1:500 verdunning) en laad het in de monsterkamer. Monitor de beweging van deeltjes in realtime met behulp van de instrumentsoftware.
      12. Verkrijg gegevens en genereer het bijbehorende analyserapport.
      13. Identificeer de eiwitmarkers met Western blot-analyse zoals beschreven in stappen 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. Lyseer exosoommonsters met behulp van een exosoomspecifieke eiwitlysisbuffer en kwantificeer de eiwitconcentratie met een bicinchoninezuur (BCA) assay.
      15. Bereid oploss- en stapelgels voor. Laad gelijke hoeveelheden eiwit per lane en voeg 5 μL eiwitmarker toe aan elke gel.
      16. Voer elektroforese uit bij een constante spanning van 80 V totdat het kleurstoffront de oplossende gel bereikt, verhoog dan tot 120 V en ga door tot het kleurstoffront de onderkant van de gel bereikt.
      17. Snijd een polyvinylidienfluoride (PVDF) membraan op de juiste grootte en activeer het door het 5 minuten in methanol te weken.
      18. Bereid een transferbuffer voor bestaande uit 25 mM Tris-base, 192 mM glycine en 20% (v/v) methanol (pH = 8,3). Evenwichtig alle overdrachtscomponenten in de overdrachtsbuffer.
      19. Assembleer de overdrachtssandwich in de volgende volgorde van kathode tot anode: spons – filterpapier – gel – PVDF-membraan – filterpapier – spons. Verwijder alle luchtbellen en voer eiwitoverdracht uit met een constante stroom van 300 mA.
      20. Na het overbrengen spoel je het PVDF-membraan kort met Tris-buffered zoutoplossing met 0,1% Tween20 (TBST) en blokkeer je het met 5% magere melk gedurende 1 uur op kamertemperatuur met voorzichtig schudden.
      21. Incubeer het membraan met primaire antilichamen (bijv. anti-CD63 en anti-TSG101) verdund in 5% magere melk 's nachts bij 4 °C met zacht schudden. Was het membraan drie keer met TBST gedurende 5 minuten per dag.
      22. Incubeer met het juiste secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, gevolgd door drie wasbeurten met TBST (elk 5 minuten).
      23. Bereid verse elektrochemiluminescentie (ECL) werkoplossing voor (meng oplossingen A en B in een verhouding van 1:1), breng aan op het membraan en detecteer signalen met behulp van een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem.

2. Isolatie en kweek van primaire huidhuidkeratinocyten

1. Monsterverzameling en transport
   1. Verkrijg voorhuidweefselmonsters van gezonde mannelijke donoren in het Affiliated People's Hospital van de Ningbo Universiteit.
   2. Plaats onmiddellijk het verwijderde voorhuidweefsel in 4 °C PBS, aangevuld met 100 U/mL penicilline-G en 100 μg/mL streptomycine.
   3. Transporteer monsters naar het laboratorium bij 4 °C en verwerk binnen 6 uur.
2. Aseptische voorbereiding en weefselfragmentatie
   1. Dompel het weefsel in 70% ethanol gedurende 30 seconden tot 3 minuten.
      OPMERKING: Pas de onderdompelingstijd aan op basis van de weefselgrootte voor de eerste ontsmetting.
   2. Gebruik een steriele schaar of een scalpel om onderhuidig vet en bindweefsel van het gewassen weefselmonster te ontleden en te verwijderen.
   3. Fijnsnijd het in kleine fragmenten (fragmentgrootte <1 mm³) met steriele chirurgische messen.
      OPMERKING: Het fijnhakken van 3–4 weefselmonsters kost doorgaans minder dan 15 minuten. Voeg tijdens het hakken een kleine hoeveelheid PBS toe als het weefsel droog lijkt.
   4. Overbreng de gemalen weefselslurry naar een 50 mL centrifugebuis met een verteringsoplossing van 2,5 mg/mL Collagenase Type I en 2,5 mg/mL Dispase II. Voeg 10–20 ml verteringsoplossing toe per stuk gehakt weefsel.
   5. Incubeer het mengsel 60 minuten in een broedmachine van 37 °C. Houd een zachte beweging aan bij 80 × g, of beweeg de buis elke 20 minuten krachtig met de hand.
3. Secundaire vertering en behandeling van DNase.
   1. Voeg 0,25% trypsine-EDTA toe aan het verteringsmengsel bij een volumeverhouding van 1:5. Incubeer de buis op 37 °C gedurende 25 minuten met zachte roering.
      VOORZICHTIG: Trypsine is een irritatie. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en veiligheidsbrillen.
   2. Voeg DNase I-oplossing (10 mg/mL) toe aan het mengsel in een verhouding van 10 μL per mL van het totale verteringsvolume. Broeuw 5 minuten op 37 °C met zachte roering.
4. Beëindiging van de spijsvertering en primaire celkweek
   1. Stop de enzymatische vertering door een gelijke hoeveelheid DMEM toe te voegen, aangevuld met 10% FBS.
   2. Tritureer het mengsel grondig door ongeveer 20 keer op en neer te pipetteren om de weefselfragmenten te dissociëren. Filter de celsuspensie door een 100 μm celzeef in een nieuwe 50 mL centrifugebuis.
   3. Centrifugeer de celsuspensie op 200 × g gedurende 5 minuten om de cellen en weefselfragmenten te pelleten.
   4. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL volledig kweekmedium (α-MEM met 20% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine).
   5. Zaai de resuspendeerde cellen en explant in een 10 cm kweekschaal en voeg een compleet kweekmedium toe aan een eindvolume van 6 mL.
   6. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5%_CO2.
      OPMERKING: Vul keratinocytkweken aan met Y-27632 bij een uiteindelijke concentratie van 5 μM tijdens de kweek.
5. Celonderhoud en subcultuur
   1. Vernieuw het kweekmedium elke 2–3 dagen.
   2. Houd cellen dagelijks in de gaten.
      OPMERKING: Primaire huidepidermale keratinocyten migreren doorgaans vanuit weefselexplants en bereiken binnen 10-14 dagen een samenvloeiing van 80-90%.
   3. Voor subcultuur scheid je cellen met 0,05% trypsine-EDTA wanneer ze 80–90% confluentie bereiken.
      VOORZICHTIG: Trypsine is een irritatie. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en veiligheidsbrillen.

3. Functionele verificatie van ontstekingsremmende werking van exosomen uit verschillende passages

1. Celzaaien en voorbereiding
   1. Zaad epidermale keratinocyten met een dichtheid van 1,5 × 10^{cellen van 5} cellen per put in een 12-wellplaat. Voeg 1 ml complete medium toe aan elke put en kweek de cellen gedurende 24 uur.
   2. Wanneer celconfluentie ongeveer 70% bereikt, aspireer het medium voorzichtig en was de celmonolaag voorzichtig twee keer met voorverwarmde 1× PBS.
2. Ontstekingsstimulatie en exosoombehandeling
   1. Induceer een psoriasiform cellulair model, stimuleer de cellen met het pro-inflammatoire cytokinemengsel "M5" (met IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatine M en TNF-α, elk met een uiteindelijke concentratie van 10 ng/mL).
   2. Voor de behandelgroepen co-incubeer je de gestimuleerde cellen met DPSC-Exo's (50 μg per put).
   3. Voor de negatieve controle (NC) groep voeg een equivalent volume PBS toe in plaats van exosomen.
      OPMERKING: Voer alle stimulaties en behandelingen uit in een medium zonder Y-27632 om mogelijke interferentie met ontstekingssignalen te voorkomen.
3. Monsterverzameling en qRT-PCR-analyse (functionele vergelijking tussen passages)
   1. Haal de cellen en haal RNA uit na 24 uur behandeling.
   2. Analyseer de expressie van de belangrijkste ontstekingsmarker IL-23A.
      1. Vergelijk de remmende effecten op IL-23A-expressie tussen exosoombehandelingsgroepen afkomstig van verschillende passages (P2, P4 en P6) met qRT-PCR om passage-afhankelijke veranderingen in exosoomfunctie te beoordelen.
      2. Voer qRT-PCR uit met de volgende cyclische condities: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 10 seconden en annealing/extensie bij 60 °C gedurende 30 s.
      3. Voer een smeltcurveanalyse uit van 65 °C tot 95 °C om de versterkingsspecificiteit te bevestigen.
         OPMERKING: Primersequenties: Human-IL-23A (voor: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAC-3', achteruit: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTC-3'); Mens-H36B4 (vooruit: 5'-GCAATGTGTGCCAGTGTGTGTGTGTGT-3', achteruit: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3')

Resultaten

Identificatie en karakterisering van tandpulpastamcellen
Primaire tandpulpastamcellen (DPSC's) die met het beschreven protocol werden geïsoleerd, vertoonden stabiele groei en typische mesenchymale morfologie tijdens de in-vitro expansie. Zoals weergegeven in Figuur 1, toonden DPSC's bij passages 2, 4 en 6 een homogene populatie van spoelvormige, fibroblastachtige cellen, zonder duidelijke morfologische verschi...

Discussie

Het gestandaardiseerde protocol dat in deze studie wordt beschreven, biedt een reproduceerbaar kader voor de isolatie van tandpulpastamcellen (DPSC's), de productie van DPSC-afgeleide exosomen (DPSC-Exo's) en de functionele validatie van deze blaasjes over meerdere celgangen. De onderstaande bespreking belicht kritieke procedurele overwegingen, optimalisatiestrategieën, methodologische beperkingen en de bredere relevantie van deze workflow voor onderzoek naar regeneratieve geneeskunde.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25300054	Vanwege zijn spijsverteringskracht wordt trypsine veel gebruikt voor celafsplitsing, routinepassage van celcultuur en primaire weefselafspalting.
100 mm Cell and Tissue Culture Dish	Biofil	TCD010100	Surface Behandeld/Niet-Behandeld Stériel&Niet-Pyrogeen DNase/RNase-Vrij
100 nm PS beads	Thermo Fisher	3100A	Voorafgaand aan het uitvoeren van nanoparticle tracking analysis (NTA) experimenten, moet het instrument worden gekalibreerd met een standaard met een precies bekende deeltjesgrootte (100 nm).
15-mL Bulk Conical Centrifuge Tube	KIRGEN	KG2611	Stériel, RNase/Dnase en pyrogen vrij
200-mesh Formvar-carbon-coated copper grid	Zhongjing Scientific Instruments	AZH200	Ondersteunt exosome monsters voor TEM beeldvorming. De Formvar-carbon coating verbetert monsteradhesie en geleidbaarheid, terwijl het 200-mesh rooster voldoende open gebied biedt voor een gelijkmatige verdeling van deeltjes en stabiele beeldvorming.
37 °C Incubator	Thermo Scientific	51032877	De 37-graads CO2 incubator biedt een ideale in vitro omgeving.
50-mL Bulk Conical Centrifuge Tube	KIRGEN	KG2811	Stériel, RNase/Dnase en pyrogen vrij
Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5]	Abcam	ab193349	Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5] (ab193349) is een monoklonaal muis antilichaam dat CD63 detecteert in Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. Geschikt voor Human.
Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]	Abcam	ab125011	Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] (ab125011) is een monoklonaal konijn antilichaam dat TSG101 detecteert in Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. Geschikt voor Human, Muis, Rat.
Automated cell counter	Countstar	IC1000	Automatische celteller voor snelle, nauwkeurige celtelling
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	Heeft een goede lineaire relatie binnen het concentratiebereik van 50 - 2000 μg/ml.
Benchtop Centrifuge	BIORIDGE	TD5	Benchtop centrifuge voor snelle en efficiënte monsterscheiding in laboratoriumomstandigheden
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1379	Biologische Veiligheidscabinet is een steriele inhoudsapparaat dat operators, monsters en omgevingen beschermt tegen biogevaren door luchtpadogenes te filteren en kruisbesmetting te voorkomen tijdens microbiologische werkzaamheden.
Cell Culture Plate,12-Well	Eppendorf	0030721110	Behandeld voor weefselcultuur, met deksel, platte bodem Stériel,vrij van detecteerbare pyrogenen,RNase & DNase,human & bact.DNA Niet-cytotoxisch
Cell Culture Plate,96-Well	NEST	701001 0714B	Weefselcultuur behandeld,Polystyreen,Niet-Pyrogen,Stériel
Cellsaving	NCM	C40100	Serum-vrij,dierlijk eiwit-vrij Celbevriezingsmedium
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17100017	Collagenase is een protease die de binding tussen een neutraal aminozuur (X) en glycine in de sequentie Pro-X-Gly-Pro, die met hoge frequentie in collageen wordt aangetroffen, knipt.
Dispase II, powder	Gibco	17105041	Dispase II (neutrale protease) is een amino-endo peptidase die de N-terminale peptidebindingen van niet-polaire aminozuurresiduen hydrolyseert.
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT	[+]4.5g/L D-Glucose [+]L-Glutamine [+]110mg/L Sodium Pyruvate
Evo M-MLV Reverse Transcription Kit	AG	AG11707	Een speciaal reverse transcriptiereagens voor Real Time RT-PCR. Het maakt gebruik van de Evo M-MLV reverse transcriptase met sterke extensiecapaciteit, waardoor efficiënte synthese van cDNA binnen een korte periode mogelijk is.
Exosome Concentration Solution	Umibio	UR52111	Extraheer exosomen uit het celsupernatant
Exosome Depleted Fetal Bovine Serum	Umibio	UR50202	Het exosome-vrije foetale boviene serum werd verkregen door het steriel verzamelde gezonde foetale boviene serum te filteren, en ≥99% van de endogene exosomen in het foetale boviene serum werden verwijderd. Het had dezelfde celgroeisnelheid en morfologie als het foetale boviene serum voorafgaand aan verwerking.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141	Hemoglobineniveau: ≤30 mg/dL (niveaus routinematig ≤25 mg/dL)
Human-H36B4	Sangon Biotech	SB002	Forward: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3'; Reverse: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Human-IL-23A	Sangon Biotech	SB002	Forward: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3'; Reverse: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'
Inverted Biological Microscope	Leica	DMI1	Direct waarnemen van de levende cellen of weefsels die zich hechten aan de wanden van containers zoals kweekkolven en petrischalen.
Minimum Essential Medium	Gibco	C12571500BT	[+]L-Glutamine [+]Ribonucleosiden [+]Deoxyribonucleosiden
NcmSpin Rapid RNA Extraction Kit	NCM	M5106	Deze kit kan snel totaal RNA extraheren uit maximaal