Geslachtshormoondetectie in menselijke traanfilm met behulp van enzymgebonden immunosorbent-assays

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde enzym-gekoppelde immunosorbent-assay (ELISA) methode om 17β-estradiol en testosteron in menselijk traanvocht, verzameld via microcapillaire buizen, te detecteren en te kwantificeren. Deze aanpak maakt minimaal invasieve meting van traanhormoonniveaus mogelijk.

Samenvatting

De traanfilm is een complexe, meerlaagse vloeistof die essentieel is voor het behouden van de gezondheid van het oogoppervlak, visuele helderheid en bescherming tegen ziekteverwekkers en omgevingsstressfactoren. Het bestaat voornamelijk uit lipiden, waterig vocht, oplosbare eiwitten en mucinen, en dient niet alleen om het oog te smeren en te beschermen, maar ook als een waardevol diagnostisch medium voor oogaandoeningen zoals droge ogen (DED). Geslachtshormonen, waaronder androgenen en oestrogenen, staan bekend om hun invloed op de samenstelling van traanfilms, maar de meting van deze hormonen in traanvloeistof wordt beperkt door een laag monstervolume en technische uitdagingen. Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode om commercieel verkrijgbare enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kits aan te passen om 17β-estradiol en testosteron te detecteren en te kwantificeren in basale tranen die worden verzameld met behulp van microcapillaire buizen. De workflow omvat geoptimaliseerde methoden voor het verzamelen van monsters, verdunning en de voorbereiding van assay's om analyse van laagvolume-scheurmonsters mogelijk te maken. Het protocol toont de haalbaarheid en reproduceerbaarheid van hormoondetectie in traanvloeistof aan met aangepaste ELISA-methoden. Representatieve resultaten zijn afgeleid uit samengevoegde pilotmonsters en zijn bedoeld om de assayprestaties te illustreren in plaats van biologische verschillen. Deze aanpak kan toekomstige studies ondersteunen die traanvloeistof onderzoeken als matrix voor hormoonmeting in oculaire oppervlakteonderzoek.

Inleiding

De traanfilm speelt een essentiële rol bij het beschermen, voeden en smeren van het^{oogoppervlak.} Het is ongeveer 2–5,5 μm dik en 3–10 μL in volume, met een omloopsnelheid van 1–2 μL per minuut bij een gezond^{oog 2,3}. De traanklieren scheiden het waterige deel van de tranen af, rijk aan water, elektrolyten, eiwitten en antimicrobiële factoren, terwijl de meibomklieren lipiden produceren die de verdamping van de traanfilm vertragen, en de conjunctivale kelkcellen mucines afgeven die de smering van het oogoppervlak^ondersteunen. Traanproductie vindt plaats op twee hoofdmanieren: 1) basale secretie, die een stabiele traanfilm op een gezond oogoppervlak in stand houdt, en 2) reflexafscheiding, die wordt getriggerd door prikkels zoals irritatie, emotie of fel licht. De biochemische samenstelling verschilt tussen de twee, wat uiteindelijk de methode kan beïnvloeden die wordt gebruikt om tranen te verzamelen voor analyse ^5,6. Basale scheuren bevatten over het algemeen hogere concentraties eiwitten en lipiden die de stabiliteit van de traanfilm en de gezondheid van het hoornvlies ondersteunen, terwijl reflexscheuren een hoger waterig volume hebben en meer verdund zijn om irriterende stoffen door te spoelen en het oogoppervlak te beschermen ^7,8,9.

Omdat tranen functioneren om ontstekingen te reguleren, ziekteverwekkers te verdedigen en voedingsstoffen te leveren aan het avasculaire hoornvlies¹, zijn ze een centraal punt geworden voor biomarkeronderzoek¹⁰. Tranen bieden een minimaal invasieve en relatief kosteneffectieve alternatieve alternatieve bloedmonsters voor het monitoren van fysiologische veranderingen, vooral die nabij de plaats van ziekte⁸. Om deze gegevens nauwkeurig vast te leggen, is correcte verzameling essentieel¹⁰. Glazen microcapillaire buizen worden veel gebruikt voor het bemonsteren van basale tranen omdat ze verzameling mogelijk maken met minimale irritatie en traanverdunning⁵. Deze methode minimaliseert het risico op het stimuleren van reflexscheuren, die de samenstelling van de scheur^{kan veranderen, door} de buis zorgvuldig te positioneren om contact met de bulbaire conjunctiva en de ooglidrand te vermijden. Met deze methode kunnen onderzoekers onverdunde basale scheuren verkrijgen die de fysiologische toestand van het oogoppervlak weerspiegelen. Dit zorgt ervoor dat het monster een betrouwbaar medium blijft om gevoelige analyten, zoals geslachtshormonen^10,12, te kwantificeren. Het beperkte volume dat wordt verkregen vormt echter analytische uitdagingen voor downstream biochemische assays. Basale traanverzameling met microcapillaire buizen levert doorgaans enkele microliters per monster op, wat de compatibiliteit met standaardtests beperkt.

Het menselijke oogoppervlak wordt steeds vaker erkend als een doelweefsel voor geslachtshormonen ^13,14. Bewijs dat dit ondersteunt omvat de detectie van mRNA-transcripten voor androgeenreceptoren (AR), oestrogeenreceptoren (ER) en progesteronreceptoren (PR) in acinaire cellen van de traan- en meibomklieren, evenals in de epitheelcellen van het hoornvlies, conjunctiva en conjunctivale bekercellen¹⁵. Bovendien zijn mRNA's die coderen voor steroïdogene enzymen in deze weefsels geïdentificeerd, wat wijst op het vermogen om steroïdevoorlopers lokaal om te zetten in biologisch actieve geslachtshormonen¹⁶. Dit wijst op potentieel voor in situ hormoonsynthese aan het oogoppervlak en roept een cruciale vraag op of deze hormonen op detecteerbare niveaus in de traanfilm worden afgescheiden.

Huidig bewijs suggereert dat geslachtshormonen essentieel zijn voor het handhaven van de homeostase van het oogoppervlak, hoewel de precieze moleculaire mechanismen nog worden onderzocht^13,14. Androgenen, zoals testosteron, lijken de lipidenafscheiding te stimuleren en ontstekingen te onderdrukken; Daarom wordt androgeentekort algemeen erkend als een oorzaak van verdampingsdroge ogen 13,14,17. Daarentegen is de rol van oestrogenen genuanceerder en contextafhankelijker 13,14,18. Hoewel ze betrokken zijn bij het moduleren van de samenstelling en het volume van de tranen, zijn oestrogeenfluctuaties, zoals die tijdens de menopauze, zwangerschap of gebruik van orale anticonceptie, vaak geassocieerd met een verminderde waterafscheiding, verminderde stabiliteit van de traanfilm en ontsteking van het oogoppervlak^19,20. Als gevolg hiervan vormen personen die deze hormonale onevenwichtigheden ervaren een populatie met een verhoogd risico op het ontwikkelen van droge ogen (DED)13,14,20.

Ondanks dit bewijs blijft het monitoren van de hormonale status bij DED-patiënten een uitdaging. Specifiek is nog niet vastgesteld of systemische serumhormoonspiegels nauwkeurig de lokale hormoonspiegels in het oog^weergeven. Dit onderscheid is cruciaal omdat aangetoond is dat oculaire weefsels geslachtshormoonreceptoren en steroïdogene enzymexpressie bezitten die lokale synthese en metabolisme van geslachtssteroïden^ondersteunen. Deze intracriene capaciteit suggereert dat lokale hormoonconcentraties in de traanfilm aanzienlijk kunnen verschillen van circulerende serumniveaus¹³. Daarom is directe meting van de hormoonconcentratie in traanvloeistof noodzakelijk om lokale hormonale effecten op het oogoppervlak beter te begrijpen. Dergelijke metingen zijn echter technisch uitdagend vanwege het kleine volume traanmonsters dat beschikbaar is voor analyse. Geavanceerde analytische technieken zoals vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) zijn gebruikt om hormonen in bloed- en traanvloeistoffen met hoge gevoeligheid te kwantificeren, maar deze methode vereist gespecialiseerde instrumentatie en technische expertise die mogelijk niet voor alle onderzoekers gemakkelijk toegankelijk is^21,22.

De enzym-gekoppelde immunosorbent-assay (ELISA) is een breed gevestigde techniek voor het opsporen en kwantificeren van eiwitten, antilichamen en hormonen. Voor de analyse van kleine moleculen zoals geslachtssteroïden maakt dit protocol gebruik van een competitief bindingsformaat. In deze methode concurreert het niet-gelabelde hormoon in het traanmonster met een enzymgelabeld hormoonanalogon om een beperkt aantal antilichaambindingsplaatsen. Door deze concurrentie is de signaalintensiteit, gemeten als optische dichtheid, omgekeerd evenredig met de concentratie van het hormoon in het monster; Effectief duidt een lager signaal op een hogere concentratie van het doelhormoon^23,24.

ELISA biedt verschillende praktische voordelen voor gerichte kwantificatie. Het is kosteneffectief en technisch toegankelijk, waardoor implementatie in standaard laboratoriumomgevingen mogelijk is zonder de noodzaak van gespecialiseerde instrumentatie. Bovendien faciliteert ELISA screening met hoge doorvoer in 96-well plaatformaten met minimale monstervoorbereiding, wat zowel tijdsefficiëntie als hoge reproduceerbaarheid^biedt. Commercieel verkrijgbare ELISA-kits zijn echter doorgaans geoptimaliseerd voor biologische monsters met een groter volume zoals serum of plasma, en hun prestaties in laagvolume-scheurmonsters zijn niet goed gedefinieerd. Om deze beperking aan te pakken, bevat het protocol geoptimaliseerde methoden voor verdunning en behandeling van monsters om hormoondetectie binnen het gevoeligheidsbereik van de test mogelijk te maken.

In deze studie presenteren we een gevisualiseerd protocol dat commercieel verkrijgbare ELISA-kits aanpast voor de detectie en kwantificering van 17β-estradiol en testosteron in een klein-volume menselijke traanmonster, verzameld met behulp van glazen microcapillaire buizen. Dit protocol legt de nadruk op praktische aanpassingen in het verzamelen, hanteren en voorbereiden van de testa, zodat reproduceerbare hormoonmetingen uit beperkte traanvolumes mogelijk kunnen worden. Dit werk richt zich op het opzetten van een haalbare workflow voor het toepassen van bestaande ELISA-methodologie op de analyse van scheurvloeistof. Deze benadering kan dienen als basis voor toekomstige studies die lokale hormoonniveaus aan het oogoppervlak onderzoeken.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de Indiana University Institutional Review Board (IRB#1908362633), en er werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van alle deelnemers voorafgaand aan de monsterafname.

1. Traanfilmcollectie

1. Bereiding
   1. Bepaal het te verzamelen traanvolume, met in gedachten dat er 2 replicates nodig zijn voor de statistische betrouwbaarheid van ELISA-resultaten.
   2. Bereid een 1,5 mL microcentrifugebuis voor voor opslag van traanfilm.
   3. Kies geschikte microcapillaire buizen om tranen op te vangen. Ik raad aan te beginnen met 3,33 μL of 5 μL en dan over te schakelen naar een kleinere maat als je verzamelt van een lager volume scheuren op het oogoppervlak.
   4. Bereid een rubberen knypbol voor die bij de microcapillairbuiskit wordt geleverd, om de overdracht van traanvloeistof in een microcentrifugebuis te vergemakkelijken.
2. Traanverzameling
   1. Geef de deelnemer de instructie om recht vooruit of iets omhoog te kijken.
   2. Plaats voorzichtig de microcapillaire buisopening in de skeurmeniscus nabij de laterale canthus om basale scheuren op te vangen.
   3. Minimaliseer contact met bulbaire conjunctiva en ooglidrand om reflexscheuren zoveel mogelijk te voorkomen.
   4. Vul de tube met tranen tot de buis vol is.
   5. Als meerdere verzamelsessies nodig zijn, plan dan sessies binnen 24 uur van elkaar en op vergelijkbare tijden gedurende de dag om de variatie van hormoonspiegels te minimaliseren.
3. Traanopslag
   1. Sluit het gat bovenop de rubberen knypbol af en steek vervolgens de microcapillaire buis in de bol terwijl je direct het open uiteinde in de microcentrifugebuis plaatst zodat de tranen uit de microcapillaire buis kunnen stromen. Extra knijpen van de bol kan nodig zijn om zoveel mogelijk van het traanmonster uit de microcapillaire buis te krijgen.
   2. Sluit de condensator van de microcentrifugebuis om verdamping te voorkomen.
   3. Draai de buis naar beneden met een microcentrifugeapparaat op een laboratorium op 2.000 × g gedurende 3–5 seconden, zodat het monster op de bodem van de buis ligt vóór opslag.
   4. Bewaar in -80 °C om de stabiliteit van de analyte te behouden vóór de analyse.

2. Testosterontest

1. Bereid testosteronnormen voor, volg het protocol
   1. Volg het kitprotocol en zorg dat reagentia en apparatuur beschikbaar zijn om testosteronstandaarden, controles en monsters voor te bereiden.
   2. Reconstrueren van testosteron standaard met gedeïoniseerd of gedestilleerd water om een voorraadoplossing van 100 ng/mL te krijgen. Zorg voor volledige heropbouw en laat het minimaal 15 minuten zitten.
   3. Bereid testosteron voor op de dag van de experimentatie.
   4. Bereid 6 microcentrifugebuizen voor de standaard, met 900 μL kalibratorverdunner in de 10 ng/mL buis en 400 μL in de overige buizen.
   5. Pipette 100 μL standaardoplossing in de eerste buis (10 ng/mL buis), meng grondig en vervang de pipettip voor de volgende overdracht.
   6. Pipetteer 200 μL van de eerste buis (10 ng/mL buis) in de volgende buis (3,33 ng/mL), meng grondig, vervang de pipettip voor de volgende transfer en herhaal de stap tot de laatste buis (0,041 ng/mL).
   7. Opmerking: Na het voltooien van alle stappen zouden er 7 concentraties van standaarden moeten zijn. De kalibratorverdunder dient als nulstandaard (0 ng/mL). Elke voorbereide standaard is meer dan voldoende voor twee replicaties.
2. Bereid testosteroncontroles voor: Lage, Gemiddelde en Hoge Concentratie
   1. Elk flesje reconstrueert met het volume gedeïoniseerd of gedestilleerd water dat is aangegeven in het analysecertificaat (COA) van de controlekit
   2. Verdun elke controle in 2 keer in de kalibratorverdunder voordat je ze in de assay gebruikt
3. Bereid monsters voor
   1. Verwijder de scheurmonsters vanaf -80 °C en leg ze op ijs om te ontdooien.
   2. Zodra de monsters volledig ontdooid zijn, centrifugeer je de traanmonsters kort om ervoor te zorgen dat alle monsters 3–5 seconden op kamertemperatuur op de bodem van de buizen liggen.
   3. Meng 20 μL monster met 80 μL kalibratorverdunningsmiddel om een totaal volume van 100 μL per replica te verkrijgen.
   4. Plan voor twee replicaten voor het experiment voor betrouwbaarheid en niet-specifieke binding (NSB) putten voor achtergrondcontrole.
   5. Opmerking: Elk monster wordt geanalyseerd in dubbele putten. Daarom is 40 μL traanmonster per deelnemer nodig om de assay uit te voeren, waarbij wordt gemengd met 160 μL kalibratorverdunningsmiddel om een totaalvolume van 200 μL te verkrijgen.
4. Assayprocedure
   1. Bereid alle reagentia, werkstandaarden, scheurmonsters en controles voor.
   2. Verwijder de overtollige putten uit het microplaatframe en plaats ze terug in de droogmiddelverpakking bij 4 °C.
   3. Voeg 50 μL primaire antilichaamoplossing (blauw van kleur) toe aan elke put, exclusief putten die voor NSB-putten zijn aangewezen. Bedek het bord met aluminiumfolie.
   4. Incubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 1 uur op een horizontale orbitale microplaatshaker (0,12" baan) ingesteld op 500 ± 50 rpm of op de dichtstbijzijnde beschikbare stand.
   5. Bereid voldoende wasbuffer voor voor in totaal 8 wasbeurten, 400 μL/put/wash (4 wasbeurten voor en 4 wasbeurten na de 3 uur incubatiestap).
   6. Aspireer de inhoud van elke put en was de plaat vier keer met een wasbuffer.
   7. Voeg 100 μL kalibratorverdunner toe aan de NSB-putten en nul standaardputten.
   8. Voeg 100 μL standaard-, controle- en voorbereide traanmonsters toe aan de aangewezen putten.
   9. Voeg 50 μL van het testosteronconjugaat toe aan elke put en meng grondig door te pipetteren.
   10. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur op een horizontale orbitale microplaatshaker (0,12" baan) ingesteld op 500 ± 50 rpm of op de dichtstbijzijnde beschikbare stand.
   11. Aspireer elke put en was vier keer met wash buffer.
   12. Bereid de substraatoplossing direct voor gebruik voor door Kleurreagens A en Kleurreagens B te mengen in een verhouding van 1:1. Wees 200 μL per put toe. Volledige aspiratie van de resterende wasbuffer vóór het toevoegen van het substraat.
   13. Voeg binnen 15 minuten na voorbereiding 200 μL substraatoplossing toe aan elke put. Incubeer 30 minuten op kamertemperatuur op het aanrecht. Bescherm tegen licht door het af te dekken met aluminiumfolie.
   14. Voeg 50 μL stopoplossing toe aan elke put in dezelfde volgorde als bij substraatoplossing. Meng elke kleur goed en de kleur zou van blauw naar geel moeten veranderen.
   15. Meet de optische dichtheid op 450 nm en 560 nm binnen 30 minuten na het toevoegen van de Stop-oplossing met een microplaatlezer.
   16. Opmerking: De instructies van de fabrikant bevelen een referentiegolflengte van 540 nm of 570 nm aan. In dit protocol werd een golflengte van 560 nm gebruikt als de dichtstbijzijnde beschikbare optie op de microplaatlezer, voor achtergrondsignaalcorrectie en optische imperfecties.
5. Berekening
   1. Trek de optische dichtheid gemeten bij 560 nm (referentiegolflengte) af van de optische dichtheid gemeten bij 450 nm.
   2. Trek de gemiddelde NSB-optische dichtheid af van elke individuele meting van standaarden, monsters en controles, en bereken vervolgens het gemiddelde van dubbele metingen.
   3. Genereer een standaardcurve door de gegevens te passen met behulp van een vier-parameter logistiek (4PL) model.
   4. Bepaal testosteronconcentraties door monsterwaarden van de standaardcurve te interpoleren.
   5. Pas de berekende concentraties aan door een verdunningsfactor van 5 toe te passen om rekening te houden met de 1:5 monsterverdunning.
   6. Controleer de meting door de variatiecoëfficiënt (CV) tussen replicaten te berekenen; mag niet meer dan 20% bedragen.
      1. Opmerking: %CV = (SD/gemiddelde) × 100

3. Estradiol-assay

1. Bereid estradiolstandaarden, controles en monsters voor
   1. Volg het kitprotocol en zorg dat reagentia en apparatuur beschikbaar zijn om standaarden, controles en monsters voor te bereiden.
   2. Laat alle reagentia en materialen kamertemperatuur bereiken voordat je ze gebruikt.
   3. Bereid op de dag van het experiment verse reagens.
   4. Standaarden en controle zijn inzetklaar. Aliquot alleen de hoeveelheid die nodig is voor de huidige assay om besmetting te minimaliseren en herhaalde temperatuurveranderingen tijdens het hanteren te beperken.
   5. Zorg ervoor dat er zes standaarden (nr. 0–5) worden opgesteld, waarbij Standaard 0 0 pg/mL vertegenwoordigt, en voeg één controlemonster toe dat bij de kit wordt geleverd.
   6. Ontdooi de bevroren monsters vanaf -80 °C door ze op ijs te leggen.
   7. Draai de scheurmonsters naar beneden om ervoor te zorgen dat alle monsters onderin de buis liggen.
2. Assayprocedure
   1. Verwijder de overtollige putten uit de microplaat en plaats ze terug in de droogmiddelverpakking bij 4 °C.
   2. Voeg 20 μL aan standaarden, controles en monsters toe aan putten.
   3. Let op: elke standaard en elk monster moet worden getest met 2 replicaten.
   4. Om een homogene distributie te garanderen, moet je alle standaarden, controles en monsters grondig mengen direct voordat je in de putten wordt gepipeteerd.
   5. Voeg 160 μL van 17 beta Estradiol-HRP Conjugaat toe aan de testputten.
   6. Laat een lege put achter voor substraat.
   7. Bedek de put met aluminiumfolie voordat je het in de broedmachine plaatst. De oplossing in de putten kan verdampen tot aluminiumfolie.
   8. Broeden op 37 °C gedurende 2 uur.
   9. Bereid de wasbuffer voor met 10x wasoplossing tijdens de incubatietijd.
   10. Wanneer de incubatie is voltooid, verwijder je het aluminiumfolie en aspireer je de vloeistof uit de putten.
   11. Was elke put drie keer met Wash Buffer. Laat > 5 seconden weken in elke wascyclus.
   12. Voeg 100 μL TMB Substrate Solution toe aan alle wells.
   13. Bedek het hele bord met aluminiumfolie en laat het precies 30 minuten op kamertemperatuur incuberen.
   14. Voeg 100 μL stopoplossing toe aan alle putten in dezelfde volgorde en met dezelfde snelheid als de eerder toegevoegde TMB Substraatoplossing.
   15. Schud de microplaat voorzichtig en het reagens verandert van blauw naar geel.
   16. Meet de absorptie bij 450 nm binnen 30 minuten na het toevoegen van de Stop-oplossing.
3. Berekening
   1. Trek de absorptie van de blank put af van de metingen van alle standaarden, monsters en regelaars om achtergrondsignaal en optische imperfecties te corrigeren.
   2. Bereken het gemiddelde van dubbele metingen.
   3. Genereer een best-fit standaardcurve met behulp van vier-parameter logistiek (4PL).
   4. Bepaal de estradiolconcentratie door monsterwaarden van de standaardcurve te interpoleren...
   5. Controleer de meting door de variatiecoëfficiënt (CV) tussen replicaten te berekenen; mag niet meer dan 20% bedragen.
      1. Opmerking: %CV = (SD/gemiddelde) × 100.

4. Data-analyse met R en RStudio

1. Installeer R en RStudio, en installeer de benodigde pakketten die in de Materiaaltabel staan voordat je data-analyse uitvoert.
2. Importeer optische dichtheidsmetingen voor standaarden, controles en monsters in de analysesoftware.
3. Vooraf verwerken we de data door golflengtecorrectie toe te passen zoals gespecificeerd door de assay. Daarna worden blanco of NSB-waarden afgetrokken en het gemiddelde van dubbele metingen berekend.
4. Pas een standaardcurve aan met behulp van een logistisch (4PL) regressiemodel met vier parameters met concentratie als onafhankelijke variabele en optische dichtheid als responsvariabele.
5. Voer curve fits uit in R met behulp van de drm()-functie uit het drc-pakket, waarbij het model wordt gespecificeerd als fct = LL.4() voor 4PL-regressie, met concentratie- en optische dichtheidsdata als input.
6. Controleer de kwaliteit van de curvefit (bijv. R² > 0,99 of acceptabele goodness-of-fit) voordat je de monsterconcentraties interpreteert.
7. Bereken hormoonconcentraties door inverse voorspelling met behulp van de ED()-functie op basis van de aangepaste standaardcurve, waarbij de effectieve dosis wordt gespecificeerd die overeenkomt met de optische dichtheidswaarden van het monster gebaseerd op het aangepaste model.
8. Pas de berekende concentraties aan door de juiste verdunningsfactor toe te passen (bijvoorbeeld ×5 voor een verdunning van 1:5).
9. Rapporteer de uiteindelijke hormoonconcentraties in de juiste eenheden (bijv. ng/mL of pg/mL), zorg voor consistentie met de standaardcurve en exporteer de verwerkte gegevens voor verdere analyse of visualisatie.

Resultaten

Pilot Tear Film Studie

In totaal werden 20 vrouwen (45–63 jaar oud) in deze studie opgenomen. De DED-classificatie was gebaseerd op symptomen en ten minste één klinisch teken van DED. Specifiek hadden alle DED-deelnemers een Ocular Surface Disease Index (OSDI)-score > 12 en ten minste één oog met ofwel een fluoresceïne-traanbreuktijd (TBUT) van < 5 s, of een corneale fluoresceïnekleuringsscore (CFSS) van > 3 (NEI-schaal²⁵

Discussie

Traanverzameling en analyse maken gemakkelijke toegang mogelijk voor wetenschappelijke beoordeling van de gezondheid van het oogoppervlak en identificatie van potentiële biomarkers^10,22. Ons protocol beschrijft succesvolle aanpassing van veelgebruikte ELISA-methoden om traanfilmmonsters te analyseren op geslachtshormonen. We hebben deze methode ontwikkeld om de primaire beperking van scheuranalyse aan te pakken, namelijk het rela...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
17 beta Estradiol ELISA Kit	Abcam	ab108667
Aluminiumfolie	Reynolds Wrap	10900000154	Elke beschikbare aluminiumfolie voor de keuken om reagentia tegen licht te beschermen
Microcapillairbuis 3,33 μL	Drummond	1-000-0033	Inclusief een knijpbulb voor vloeistofoverdracht
Microcapillairbuis 5 μL	Drummond	1-000-0050	Inclusief een knijpbulb voor vloeistofoverdracht
Microcentrifuge-apparaat	Benchmark Scientific	C1012
Microcentrifugebuis 1,5 mL	Fisher	05-408-129
Microplaatlezer	Promega	GM3000
Orbitale microplaatshaker	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
R computertaal	Posit Software, PBC (voorheen RStudio Inc.)	R versie 4.5.1	Download R taal voorafgaand aan Rstudio via https://cran.r-project.org/
RStudio Software	Posit Software, PBC (voorheen RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
R-pakketten "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl"	Posit Software, PBC (voorheen RStudio Inc.)		Installeer het pakket in Rstudio
Testosteron Controle kit	R&D Parameter	QC165	Afzonderlijk verkocht van de ELISA kit (KGE010)
Testosteron ELISA kit	R&D Parameter	KGE010