Een uitgebreid rattenmodel voor het beoordelen van levertransportroutes door gelijktijdige lymfatische en bloedvaatbemonstering

Samenvatting

Dit experimentele protocol beschrijft een leverlymfebuis-gecanuleerd rattenmodel dat directe en kwantitatieve beoordeling van leverlymfatische en vaatdrainage mogelijk maakt. Het model maakt gelijktijdige bemonstering van leverlymfe en systemisch bloed mogelijk om levertransport, metabolisme en immuunsignalering te onderzoeken, ter ondersteuning van studies naar geneesmiddelfarmacokinetiek en leverspecifieke biologie.

Samenvatting

De lever is een centraal metabolisch en immunologisch knooppunt dat voedingsstoffen, xenobiotica en circulerende immuunmediatoren verwerkt. Stoffen bereiken de hepatocyten en andere levercellen via de sinusvormige haarvaten die bloed ontvangen uit de darm via de portaalader en uit de systemische circulatie via de leverslagader. Plasmafiltratie van de sinusvormige haarvaten stroomt af in de ruimte van Disse, waar het metabole transformatie kan ondergaan, kan deelnemen aan immuunsurveillance of naar lymfevaten kan stromen om leverlymfe te vormen. Het bemonsteren van leverlymfe en bloed kan helpen om gedetailleerde analyses van levertransport, metabole processen en immuunactiviteit mogelijk te maken. Een chirurgisch ratmodel dat gelijktijdige bemonstering van leverlymfe-uitstroom en systemisch bloed via drie verschillende cannulatieplaatsen mogelijk maakt: leverlymfebuis, halsslagader en jugulaire vena. Hepatische lymfe- en arteriële canules maken continue bemonstering mogelijk, terwijl de jugularavadercanule kan worden gebruikt voor continue hydratatie en vochtondersteuning of voor veneuze bloedafname, waardoor vergelijking tussen arterieel en veneus bloed mogelijk is. Succesvolle canulatie levert leverlymfeflowsnelheden van ongeveer 0,1 mL/u op bij verdoofde ratten, waardoor continue lymfebemonstering tot 8 uur mogelijk is, terwijl gelijktijdige arteriële en veneuze bloedafname wordt uitgevoerd. Deze opstelling maakt directe vergelijking mogelijk tussen systemisch arteriaal bloed en leverlymfatische uitstroming, waardoor een uitgebreide analyse van levertransport en -clearance, evenals metabole en immuunsignaalprocessen. Om het model verder uit te breiden, kan aan het einde van de procedure terminale bemonstering van de leverslagader en portaalader worden uitgevoerd om een directe vergelijking van leverinstroom, -uitstroom en lymfedrainage mogelijk te maken. Uiteindelijk bieden deze technieken een veelzijdig platform om leverprocessen te evalueren, waaronder geneesmiddelfarmacokinetiek, nutriëntenflux en metabolisme, en leverspecifieke reacties, onder verschillende pathofysiologische omstandigheden.

Inleiding

De lever is een centraal metabolisch en immunologisch orgaan dat verantwoordelijk is voor nutriëntenverwerking, xenobiotische ontgifting en immuunbewaking. De lever is het grootste lymfeproducerende orgaan in het lichaam. Studies bij grote zoogdieren suggereren dat het bijdraagt aan 25%–50% van de totale lymfestroom ^1,2. Bij knaagdieren geven canulatieonderzoeken aan dat ongeveer 10%–20% van de totale thoracale lymfestroom afkomstig is van de lever ^3,4. Hepatische lymfe ontstaat uit plasma dat wordt gefilterd over het fenestreerde endotheel van de sinusvormige haarvaten binnen het leverparenchym. Dit filtraat verzamelt zich in de ruimte van Disse, een interstitiële compartiment tussen hepatocyten en sinusvormige endotheelcellen. Het filtraat gaat vervolgens door de ruimte van Mall naar portale lymfatische haarvaten die samenkomen in verzamelvaten die afwateren richting het hepatische hilum en cisterna chyli ^5,6.

Het hepatische lymfestelsel is anatomisch onderverdeeld in portale, subcapsulaire en sublobulaire netwerken ^6,7. Recente volumetrische beeldvormingsstudies tonen aan dat leverlymfatische cellen een sterk vertakt netwerk vormen dat afhankelijk is van de Vascular Endothelial Growth Factor C (VEGF-C), grotendeels beperkt tot de portale banen. Dit netwerk bestaat voornamelijk uit lymfatische haarvaten die retrograde afwateren richting de poortader. Aan de andere kant zijn de subcapsulaire en sublobulaire lymfekaten, respectievelijk verspreid langs het leveroppervlak en in de centrale veneuze gebieden, aanvullende drainagepaden. Menselijke postmortem beeldvorming heeft verder een dicht lymfatisch vatennetwerk langs leveraders aan het licht gebracht, wat aangeeft dat periportaal en hepatisch veneus lymfeverdelaar samen de leverlymfe-uitstroom^{reguleren 8}.

Hepatische lymfe vertegenwoordigt een plasma-afgeleid ultrafiltraat dat zowel metabole als immuunprocessen^{weerspiegelt 9,10}. Biochemische analyses tonen aan dat leverlymfe albumine, lipoproteïnen, cytokines en metabolieten bevat die zijn afgeleid van leverparenchymale activiteit ^3,4,6, wat overeenkomt met het algemene proteomische profiel van lymfevocht dat in andere weefsels is gerapporteerd¹⁰. Vroege studies toonden aan dat leverlymfe verschillende lipoproteïneklassen bevat, waarbij high-density lipoproteïnen (HDL) een dominante fractie vormen, wat overeenkomt met de centrale rol van de lever in HDL-synthese en remodellering¹¹. Opmerkelijk is dat recenter onderzoek aantoonde dat leverlymfe verrijkt is met HDL- en cholesterolesters in vergelijking met mesenteriale lymfe, wat de duidelijke bijdrage aan lipidentransport en omgekeerd cholesteroltransport^benadrukt. Bovendien fungeert leverlymfe als immunologisch kanaal, waarbij immuunmediatoren, antigeen-presenterende cellen en extracellulaire blaasjes worden vervoerd die levermicroomgevingen verbinden met systemische immuniteit⁹.

Veranderingen in de vorming en drainage van leverlymfe zijn belangrijke kenmerken van leverziekte. Bij cirrose en portale hypertensie zorgt verhoogde sinusdruk voor een meervoudige toename van de lymfeproductie, wat leidt tot lymfangiectasie, fibrose en ascites zodra de drainagecapaciteit wordt overschreden. Chronische leverbeschadiging bevordert ook VEGF-C/VEGFR-3-afhankelijke lymfangiogenese, waarbij overmatige of abnormale lymfatische remodellering bijdraagt aan leverontsteking, oedeem en lipidenophoping ^9,12. Bovendien is bij metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD) en hepatocellulair carcinoom aangetoond dat verhoogde leverlymfatische dichtheid correleert met ziekteprogressie en metastase ^13,14.

Ondanks de centrale fysiologische en klinische rol van leverlymfe, blijft het onderbelicht en onderontwikkeld in experimenteel onderzoek, voornamelijk vanwege technische uitdagingen bij het isoleren van zuivere leverlymfe. Thoracale en mesenteriale lymfeverzamelingsmodellen zijn breder beschreven, maar deze geven slechts indirect inzicht in levertransportmechanismen. Een beperking in het veld werd aangepakt door het ontwikkelen van een rat leverlymfecanulatiemodel, dat directe verzameling van leverlymfe⁴ mogelijk maakte. Met deze benadering is aangetoond dat de meeste lymfatische opname van intraveneus toegediende therapeutische eiwitten plaatsvindt in de lever en het midden. Deze bevindingen benadrukken leverlymfe als een belangrijke route voor macromoleculaire uitwisseling tussen het bloed- en lymfestelsel, met belangrijke implicaties voor de farmacokinetiek en distributie van biologische therapieën⁴.

Om resterende kloven te overbruggen, beschrijft deze studie een uitgebreid rattenmodel dat gelijktijdige bemonstering van leverlymfe en systemisch bloed mogelijk maakt via canulatie van de leverlymfebuis, halsslagader en jugulaire vene. Deze aanpak maakt realtime beoordeling van het transport van opgeloste stoffen over en de uitwisseling tussen hepatische interstitiële en systemische compartimenten mogelijk, en biedt een robuust experimenteel platform voor het onderzoeken van levertransport, metabolisme, immuunsignalering en medicijnafvoer onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Het model omvat ook optionele terminale bemonstering van de leverslagader en portaalader om directe vergelijking van leverinstroom, -uitstroom en lymfedrainage mogelijk te maken.

Figuur 1. Schematisch van het multi-cannulatiemodel voor gelijktijdige lymfe- en bloedmonsters. Een uitgebreid canulatiemodel dat gelijktijdige bemonstering illustreert van de halsslagader, jugulaire vene, leverarterie, leverlymfebuis en portaalader. (A) De halsslagader wordt gecanuleerd voor intermitterende bloedafname. (B) De externe jugulaire vena wordt gecanuleerd voor continue zoutoplossingsinfusie om hydratatie te behouden en vochtverlies tijdens de bemonstering te compenseren. (C) De algemene leverarterie, die parallel loopt aan de leverlymfebuis, wordt gecanuleerd voor terminale bloedafname. (D) De leverlymfebuis wordt gecanuleerd voor continue lymfeafname. (E) De portader wordt bereikt via naaldpunctie voor terminale bloedmonsters. Procedures zoals weergegeven in (A), (B) en (D) worden uitgevoerd voorafgaand aan de terminale bemonstering, gevolgd door (C) bemonstering van de leverarterie en vervolgens (E) bemonstering van de portaalader. Afkortingen: EJV, externe halsslagader; CA, halsslagader; SVC, vena cava superior; IVC, inferieure vena cava; Ao, aorta; CHA, arteria de arteria hepatica; HL, leverlymfebuis; ML, mesenteriale lymfebuis; SMA, arteria superior mesentericus; PV, portaalader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures waarbij dieren betrokken zijn, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Monash Institute of Pharmaceutical Sciences Animal Ethics Committee (Ethiek ID #46283) en werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de Australian and New Zealand Council for the Care of Animals in Research and Teaching (ANZCCART) en de Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (National Health and Medical Research Council, Australië)¹⁵.

Diermodellen: Mannelijke of vrouwelijke albino Rattus norvegicus, of Sprague–Dawley (SD) ratten van 250–350 g werden gebruikt. De dieren werden verkregen van erkende leveranciers van laboratoriumdieren (Monash Animal Research Platform) en gehuisvest in individueel geventileerde kooien onder gecontroleerde temperatuur (22 ± 2 °C) en een licht-donkercyclus van 12 uur, met vrije toegang tot voedsel en water voorafgaand aan de experimenten. Dieren werden minstens een week voor de operatie geacklimatiseerd om de stressgerelateerde fysiologische variatie te minimaliseren.

Er wordt een model beschreven voor leverlymfebuis, halsslagader en jugulaire venuumule dat gelijktijdig bemonstering van leverlymfe en systemisch bloed mogelijk maakt. Optionele terminale bemonstering van de leverarteria en portaalader kan onder narcose worden uitgevoerd voor vergelijkende analyse van leverinstroom en lymfetoevoer. De gebruikte reagentia en apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereidingen op de dag voor de operatie

1. Leg de rat 's nachts vast als dat nodig is voor het specifieke experimentele protocol. Zorg voor altijd gratis toegang tot water.
2. Bereid steriele zoutoplossing voor intraveneuze infusie tijdens de lymfeafname. Bepaal het benodigde volume op basis van de opnameduur (meestal 3–5 uur) en een aanbevolen infusiesnelheid van 1,5–3,0 mL/u om vochtverlies door lymfe- en bloedafname te vervangen, evenals fysiologische verliezen zoals urineproductie.
3. Bereid drie polyethyleencanules voor voor de leverlymfebuis, halsslagader en jugularis venuumule als volgt:
   1. Leverlymfebuis
      1. Snijd een canule met een buitendiameter van 0,8 mm (O.D.) en 0,5 mm binnendiameter (I.D.) op 30–35 cm. Zorg ervoor dat de lengte het opvangen zonder spanning mogelijk maakt.
      2. Schuin de inzetpunt ongeveer 45° met een steriel chirurgisch mesje om het inbrengen te vergemakkelijken.
   2. Halsslagader
      1. Snijd een 0,8 mm O.D., 0,5 mm I.D. canule af tot 20–30 cm. Markeer ongeveer 2–2,5 cm vanaf het binnenste uiteinde om de inzetdiepte aan te geven.
   3. Halsslagader
      1. Knip een 0,8 mm O.D., 0,5 mm I.D. of 0,96 mm O.D., 0,58 mm I.D. canule tot 50 cm of langer. Markeer 1–1,5 cm vanaf het binnenste uiteinde voor de insteekdiepte. Zorg ervoor dat de lengte zonder spanning de infuuspomp kan bereiken.
4. Bereid een antistollingsoplossing voor die bestaat uit 0,1% EDTA in steriel water of 20 IU/mL heparine in steriele zoutoplossing.
5. Vul een 1 ml spuit met een antistollingsoplossing en bevestig een 25 g naald aan de 0,8 mm O.D. canules of een 23G naald aan de 0,96 mm O.D. canules.
6. Spoel elke canule met ongeveer drie keer het interne volume, zodat er geen luchtbellen achterblijven.
7. Houd de canules 's nachts gevuld met antistollingsmiddel en dicht met de aangesloten naald en spuit. Voorweken met een antistollingsmiddel minimaliseert de vorming van stolsels.
8. Maak verzamelbuisjes klaar voor bloed en lymfe. Voeg een antistollingsoplossing toe om een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL EDTA of 10 IU/mL heparine na monsterafname te bereiken.

2. Voorbereidingen direct voorafgaand aan de operatie

1. Spoel alle canules door met antistollingsmiddel om de openheid te bevestigen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
2. Induceer anesthesie bij de rat met 5% isoflurane in zuurstof bij 1 L/min in een inductiekamer.
3. Controleer de ademhaling en zorg dat de frequentie is vertraagd tot ongeveer 1,5 ademhalingen per seconde (ongeveer 90 ademhalingen/min), wat wijst op voldoende anesthesiediepte.
   VOORZICHTIG: Isoflurane is een vluchtig anestheticum en moet worden gebruikt in een goed geventileerd anestheticesysteem of een dampkap om beroepsmatige blootstelling te minimaliseren.
4. Breng de rat over naar een verwarmde chirurgische matte (37°C) en houd de anesthesie met 1–3% isoflurane zuurstof toegediend met 0,4–0,6 L/min via een neuskegel.
5. Bevestig voldoende verdovingsdiepte door het ontbreken van reflexen voor het hoornvlies en de teen. Houd de verdoving gedurende de operatie en de lymfeafnameperiode.
   OPMERKING: Continue verdoving is essentieel om pijn tijdens de operatie te voorkomen en het loslaten van de canule door beweging te voorkomen.
6. Scheer chirurgische gebieden, waaronder het rechter buikkwadrant (middenlijn tot rechterflank, ongeveer 2 cm onder de ribbenkast) en het rechter- of linker claviculaire gebied.
7. Desinfecteer alle chirurgische gebieden met 0,5% chloorhexidine gevolgd door 70% ethanol.

3. Canulatie van de halsslagader

OPMERKING: De carotisarterie-cannulatie kan worden uitgevoerd vóór of na de cannulatie van de halsvenader.

1. Behoud dezelfde dorsale positie en halsincisie.
2. Plaats een kleine steun (bijvoorbeeld 3 mL spuit) onder de hals om het halsslagadergebied te verhogen.
   OPMERKING: Deze stap is optioneel.
3. Scheid de nekspieren om de halsslagader ongeveer 1 cm onder het huidoppervlak bloot te leggen.
4. Isoleer de slagader met een gebogen iris-pincet. Identificeer en scheid voorzichtig de aangrenzende nervus vagus om schade aan de zenuw te voorkomen.
5. Plaats rechte Graefe-tangen onder de slagader om de bloedstroom te blokkeren en rijg er twee 4-0 zijden hechtingen onder. Bind de proximale (craniale) hechting stevig vast.
6. Maak een kleine incisie in het oppervlak van de slagader.
7. Tilt voorzichtig de vatflap op met de punt van de lenstang om het vatlumen te stabiliseren voor het inbrengen van de canule.
8. Plaats de canule op de vooraf aangegeven 2–2,5 cm diepte. Verwacht milde terugstroming; Als het te veel is, sluit dan opnieuw af en maak schoon voordat je verder gaat.
   VOORZICHTIG: Vasculaire punctie en cannulatie zijn met scherpe instrumenten bezig en moeten voorzichtig worden uitgevoerd om ongeluksletsel te voorkomen.
9. Controleer de juiste plaatsing door voorzichtig een kleine hoeveelheid bloed af te nemen en anticoagulantiumoplossing terug in de canule te brengen zonder weerstand te voelen of subcutane zwelling te observeren.
10. Zet de canule vast met hechtingen en sluit het buitenste uiteinde af met een plug.
11. De procedure kan kort worden onderbroken na de carotiscaulatie terwijl de narcose behouden blijft.
12. Sluit de wond in de nek met steriele hechtingen. Een overzicht van de isolatie van de halsslagader en succesvolle canulatie is te zien in Figuur 2.

Figuur 2: Cannulatie van de halsslagader. (A) De gekoppelde halsspieren die de halsslagader flankeren (oranje pijlen). De speekselklier (blauwe pijlen) is schedelachtig ingetrokken. (B) De blootgestelde halsslagader bevindt zich ongeveer 1 cm onder het huidoppervlak. De speekselklier (blauwe pijlen) is schedelachtig ingetrokken. (C) Chirurgische opstelling voorafgaand aan het plaatsen van de canule, waarbij de bloedtoevoer wordt afgedekt met rechte Graefe-tangen en twee zijden hechtingen die de slagader isoleren, waarbij het bovenste uiteinde is vastgebonden. (D) Ongeveer 2 cm van de canule wordt succesvol in de halsslagader ingebracht (gele pijlen). De halsslagadercanule wordt aangegeven door de groene pijlen. (E) Succesvolle canulatie van de halsslagader werd bevestigd door bloed in de canule te trekken. (F) Drie hechtingen (maat 4-0) worden rond de halsslagader en canule gebonden voor bevestiging (paarse pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Cannulatie van de halsslagader

1. Plaats de rat in dorsale liggeving met de nek uitgestrekt en het hoofd iets naar links gedraaid.
2. Identificeer de vena jugularis boven het sleutelbeen aan de hand van de locatie en zichtbare bloedtoevoer. Maak een schuine incisie van 1–1,5 cm van het sleutelbeen naar de luchtpijp.
3. Ontleed het subcutane weefsel bot om de ader bloot te leggen.
4. Scheid de ader van het omliggende bindweefsel met een gebogen irispincet. Controleer isolatie door de tang onder de ader te steken.
5. Plaats twee 4-0 zijden hechtingen onder de ader aan elk uiteinde van het blootgestelde segment. Bind de craniale (bovenste) hechting stevig vast om de bloedtoevoer te blokkeren.
6. Om terugstroom van bloed te voorkomen, plaats je rechte Graefe-tangen onder de ader en rust je de handvatten op een spuit of steun.
7. Maak een kleine (~1 mm) incisie bovenop de ader van een derde langs het geïsoleerde segment met een irisschaar.
8. Tilt voorzichtig de vatflap op met de punt van de lenstang om het vatlumen te stabiliseren voor het inbrengen van de canule.
9. Steek de canuletip in de incisie met een iristang en schuif deze naar de vooraf aangegeven diepte (1–1,5 cm).
10. Laat de occlusie los zodra de canule is gestabiliseerd om de bloedcirculatie mogelijk te maken.
    OPMERKING: Houd een stabiele grip om veneuze terugstroming te voorkomen. Als er bloeding optreedt, sluit dan onmiddellijk opnieuw af en maak het veld schoon voordat je verder gaat.
11. Controleer de juiste plaatsing door voorzichtig een kleine hoeveelheid bloed af te nemen en anticoagulantiumoplossing terug in de canule te brengen zonder weerstand te voelen of subcutane zwelling te observeren.
12. Bevestig de canule met hechtingen aan zowel het proximale als het distale uiteinde.
13. Sluit tijdelijk de externe slang af, verwijder de spuit en sluit de canule af met een prop.
14. Bedek de incisie met gaas, bevochtigd met warme zoutoplossing, totdat de carotisarterie canulatie voltooid is. Representatieve beelden van de isolatie en canulatie van de jugularvenen zijn te zien in Figuur 3.

Figuur 3: Kanulatie van de halsslagader. (A) De halsslagader (zwart gestippelde omlijning) bevindt zich net onder de huid boven het sleutelbeen. De gevestigde halsslagadercanule is nabij de vena jugularis waargenomen (groene pijlen). (B) De halsslagader wordt geïsoleerd met twee zijden hechtingen; het bovenste uiteinde wordt vastgebonden. (C) Ongeveer 1 cm van de canule wordt succesvol in de halsslagvena ingebracht (gele pijlen). De halsslagvenencanule wordt aangegeven door de blauwe pijlen; De halsslagadercanule wordt aangegeven door de groene pijlen. (D) Drie hechtingen (maat 4-0) worden rond de halsslagader en de canule gebonden voor bevestiging (paarse pijlen). Succesvolle canulatie van de vena halsslagbeurten bevestigd door een gladde zoutoplossingsinjectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Cannulatie van het leverlymfekanaal

1. Plaats de rat in dorsale ligpositie onder een chirurgische microscoop.
2. Maak een horizontale huidincisie van 4–5 cm van de middenlijn tot de rechterflank, ongeveer 1,5–2 cm onder de ribbenkast (Figuur 4A, B).
3. Trek de huid terug en maak bijpassende incisies in de externe en interne schuine buikspieren.
4. Kauterieer of ligateer grote bloedvaten die je aantreft om overmatig bloedverlies te voorkomen.
5. Herpositioneer de organen voorzichtig met behulp van zoutwaterbevochtigde wattenstaafjes: beweeg de lever naar het middenrif, maag naar links en de dunne darm naar beneden.
6. Houd organen ingetrokken met zoutwaterdoordrenkt gaas. De incisieplaats en orgaanpositie zijn geïllustreerd in Figuur 4C.
7. Identificeer de leverlymfebuis (diameter ~0,6 mm) met behulp van vastgestelde anatomische herkenningspunten. Het kanaal loopt parallel aan en licht caudaal aan de leverslagader, ligt mediaaal van de rechternier en grenzend aan de inferieure vena cava.
8. Let op het uiterlijk van de leverlymfebuis. Het lijkt doorschijnend en smal.
9. Onderscheid de hepatische lymfebuis van de mesenteriale lymfebuis, die groter is en meestal ondoorzichtig of wit lijkt door het chylomicron-gehalte. De mesenterische lymfebuis kan daarom dienen als een anatomisch herkenningspunt om te helpen bij de identificatie van de cranial gelegen leverlymfebuis.
10. Verwijder bindweefsel boven de lymfebuis en de vena cava met rechte Graefe-tangen.
11. Creëer een doorgang onder de vena cava door rechte Graefe-tangen door het vetbed onder de rechternier in te brengen. Beweeg naar voren totdat de punten aan de tegenovergestelde kant onder de vena cava naar buiten komen, parallel aan de leverlymfebuis.
12. Grijp het buitenste uiteinde van de voorbereide canule vast met de rechte Graefe-pincet en trek deze door de tunnel die onder de vena cava is gevormd totdat de punt aan de andere kant tevoorschijn komt.
13. Met behulp van de Halsted-Mosquito hemostat-pincet buig je de punt van een 25G-naald ongeveer 90°. Met de gebogen naald prikt je het leverlymfekanaal aan de rechterkant (het dichtst bij de operator).
    VOORZICHTIG: Wees voorzichtig bij het hanteren van scherpe naalden tijdens een lymfebuispunctie om onbedoeld letsel te voorkomen.
14. Zorg ervoor dat de canule gevuld is met een antistollingsoplossing zonder luchtbellen. Steek het afgeschuinde uiteinde ongeveer 2 mm in het kanaal.
15. Let op het uitwendige uiteinde van de canule voor lymfestroom (~ 100 μL/h). Als er geen stroming wordt waargenomen, stel dan de canule aan of plaats deze terug.
16. Zodra de lymfestroom is bevestigd, stop je de canule voordat je een klein druppeltje veterinaire lijm aanbrengt om de plaatsingsplaats te bevestigen. Zodra het droog is, controleer dan de lymfestroom door de slang.
17. Verwijder gaas en zet de organen terug naar hun oorspronkelijke positie.
18. Plaats de verzamelbuis met de antistollingsoplossing onder de canule-uitlaat. Controleer of lymfe druppelgewijs in de buis stroomt.
19. Sluit de buikwand door de interne schuine lag, externe schuine en huidlagen achter elkaar te hechten. Identificatie en succesvolle canulatie van de leverlymfebuis zijn weergegeven in Figuur 5.
    OPMERKING: Na succesvolle cannulatie van de leverlymfebuis kan de procedure kort worden gepauzeerd terwijl anesthesie en hydratatie worden gehandhaafd voordat de lymfeverzameling wordt gestart.

Figuur 4: Blootstelling van de leverlymfebuis. (A) Anatomisch herkenningspunt dat 1,5–2 cm onder de rechterribbenkast voor incisie aangeeft. (B) Incisie door de huid en buikspieren, waarbij de inwendige organen worden blootgelegd. (C) Organen worden verplaatst om het leverlymfekanaal bloot te leggen. De lever is verschoven naar het middenrif, de maag links van het dier, en de dunne darmen zijn naar beneden getrokken. De leverlymfebuis bevindt zich tussen de leverslagader (groene pijl) en de mesenterische slagader (blauwe pijl). L: lever; SI: dunne darm; IVC: inferieure vena cava; RK: rechter nier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Identificatie en cannulatie van leverlymfebuis. (A) De lymfe- en arteriële structuren kunnen worden waargenomen na het herpositioneren van organen en vóór het verwijderen van omliggende bindweefsel. De leverslagader (groene pijlen) bevindt zich kraniaal ten opzichte van de aangrenzende leverlymfebuis (gele pijlen). De mesenterische lymfebuis (paarse pijlen) bevindt zich boven de mesenterische arterie (zwart gestippelde omlijning). Deze structuren lopen loodrecht op de inferieure vena cava. IVC: inferieure vena cava; RK: rechter nier. (B) Het leverlymfekanaal (gele pijlen) is duidelijk zichtbaar na verwijdering van het omliggende bindweefsel. De leverlymfebuis loopt parallel aan de leverslagader (groene gestippelde omlijning) en craniaal ten opzichte van de mesenterische lymfebuis (paarse pijlen) en de mesenterische slagader (zwart gestippelde omlijning). (C) De canule (witte pijlen) wordt via de kleine perforatie in de lymfebuis van de lever (gele pijlen) ingebracht (oranje pijlen). De mesenterische lymfebuis (blauwe pijlen) is zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Postoperatieve periode

1. Direct na succesvolle leverlymfecannulatie wordt de rehydratatie gestart door steriele zoutoplossing van 1,0–2,0 mL/u via de jugularadercanule te infuseren.
2. Houd de infusie tijdens de lymfeafname in stand. Alternatief kan rehydratatie worden uitgevoerd via een maag- of duodenumcanule, waardoor de venadercanule van de jugularis indien nodig wordt gereserveerd voor veneuze bloedafname.
3. Houd het dier onder narcose op een verwarmde chirurgische matte (37°C) gedurende de hele verzamelperiode.
4. Monitor de ademhalingsfrequentie en de diepte van de anesthesie gedurende het hele experiment door ademhalingspatronen en reflexresponsen te observeren terwijl de isoflurane anesthesie via een neusconus wordt gehandhaafd.
5. De hydratatie werd gehandhaafd door continue zoutoplossingsinfusie (1,0–2,0 mL/u) via de jugularadercanule.
6. Om fysiologische verstoring te minimaliseren, werd het totale bloedvolume dat vóór terminale bemonstering werd verzameld beperkt tot <10% van het geschatte circulerende bloedvolume, in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor dierlijke ethiek.
7. Verzamel leverlymfe continu in buisjes met antistollingsmiddelen. Vervang de verzamelbuizen elk uur of wanneer nodig.
8. Verzamel arteriële bloedmonsters op aangewezen tijdstippen:
   1. Sluit tijdelijk de externe slang af en bevestig een lege spuit.
   2. Trek bloed af totdat de slang gevuld is.
   3. Vervang de spuit door een nieuwe voor monsterafname en neem ongeveer 100–200 μL arterieel bloed op elk aangewezen bemonsteringstijdstip af.
   4. Spoel de canule na elke afname door met een antistollingsoplossing.
   5. Sluit de canule af met een plug.
9. Na voltooiing van het monster wordt ofwel overgegaan tot terminale bemonstering van de leverslagader en portaalader, of de rat humane dood met natriumpentobarbiton (>100 mg/kg) via de halsslagader of jugulaire cannule.

7. Terminale bemonstering van de leverarteria en portaalader

1. Na afronding van lymfe- en bloedafname moet je diepe anesthesie behouden en zorgen voor stabiele ademhaling voordat je doorgaat met terminale vasculaire bemonstering.
2. Open de buikincisie voorzichtig opnieuw om de bovenbuikholte bloot te leggen.
3. Trek de lever voorzichtig terug richting het middenrif, de maag naar links en de dunne darm met behulp van zoutwaterbevochtigde gaas om de gecanuleerde leverlymfebuis bloot te leggen.
4. Identificeer de leverslagader, die parallel en caudaal loopt aan de leverlymfebuis.
   OPMERKING: De slagader lijkt kleiner en bleker dan de portaalader en vertoont een pulsatievere stroming.
5. Bereid een 0,61 mm O.D., 0,28 mm I.D. polyvinylcanule voor, vooraf gevuld met anticoagulantoplossing en vrij van luchtbellen.
6. Met een gebogen irispincet isoleert u een kort segment van de leverslagader en plaatst een 4-0 zijden hechting eronder.
7. Til voorzichtig de slagader op en plaats een tweede hechting distaal van de eerste. Bind de distale hechting om de terugstroom te beheersen terwijl de proximale hechting niet wordt vastgebonden voor latere sluiting.
8. Maak met fijnpuntige micro-schaar een kleine dwarsdoorsnijding (ongeveer 0,5 mm) in de slagaderwand tussen de hechtingen.
9. Tilt voorzichtig de vatflap op met de punt van de Dumont-tang om het vatlumen te stabiliseren voor het inbrengen van de canule.
10. Steek het afgeschuinde uiteinde van de polyvinylcanule in de opening en schuif ongeveer 2–3 mm vooruit.
11. Bevestig de canule door de proximale hechting rond zowel het vat als de canule vast te binden.
12. Controleer de juiste plaatsing door pulserende bloedstroom in de canule te observeren of door voorzichtig een kleine hoeveelheid felrood arterieel bloed te aspireren.
13. Verzamel 0,5–1 ml bloed in een vooraf gelabelde buis met antistollingsmiddel.
14. Na het verzamelen haal je de canule terug en bereik je hemostase door beide hechtingen strak aan te trekken. De blootstelling van de leverarterie en de cannulatieprocedure zijn geïllustreerd in Figuur 6.
15. Identificeer de portaalader, die mediaal en loodrecht op de leverslagader loopt. De portaalader heeft een grotere diameter en een donkerdere kleur vergeleken met de leverslagader.
16. Plaats een naald van 23G of 25G op een 1 ml spuit, vooraf doorspoeld met een antistollingsoplossing.
17. Steek de naald omhoog in de portaalader onder een ondiepe hoek (ongeveer 20°–30°) om te voorkomen dat het vat instort of scheurt.
18. Aspireer voorzichtig het benodigde bloedvolume.
19. Omdat portaaladerpunctie terminaal is, moet het dier onmiddellijk na het nemen van het monster humane dood worden toegediend door >100 mg/kg natrium pentobarbiton toe te dienen via de halsslagader of jugulaire canule terwijl het dier onder diepe narcose blijft. De locatie van de portaalader en de methode voor terminale bemonstering zijn weergegeven in Figuur 7.
    VOORZICHTIG: Natriumpentobarbiton is een gecontroleerde stof en moet worden behandeld en toegediend volgens de institutionele voorschriften en de juiste veiligheidsprocedures.
20. Bevestig overlijden door het stoppen van ademhaling en hartactiviteit vóór het verwijderen van het karkas, in overeenstemming met de Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NHMRC)¹⁵ en de ANZCCART-richtlijnen.

Figuur 6: Identificatie en cannulatie van de leverarterie. (A) Blootstelling van de leverslagader (groene pijlen). De leverslagader ligt naast de mesenterische lymfebuis (zwart gestippelde omlijning) en loodrecht op de inferieure vena cava. IVC: inferieure vena cava; L: lever. (B) Isolatie van de leverslagader met gebogen pincet. (C) Succesvolle inbreng (paarse pijlen) van de 0,61 mm × 0,28 mm polyvinyl canule (oranje pijlen) in de leverslagader (groene pijlen), vastgezet met 4-0 zijden hechtingen voor terminale arteriële bloedbemonstering. De mesenterische lymfebuis (zwart gestippelde omlijning) is zichtbaar. PV: portaalader. (D) Nadat de canule is vastgemaakt, wordt de openheid van de canule bevestigd door bloed in de canule te zuigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Identificatie van de portaalader en terminale bemonstering. (A) De portaalader (aangegeven door de 25G-naald) ligt tussen de leverslagader (wit gestippelde omlijning) en galgang (zwart gestippelde omlijning). De portaalader lijkt groter en donkerder dan de leverslagader en wordt onder diepe narcose benaderd voor terminale bloedafname. PV: portaalader; IVC: inferieure vena cava; L: lever; SI: dunne darm; RK: rechter nier. (B) Succesvolle inbreng van de 25G-naald in de portaalader (zwart gestippelde omlijning) voor terminale veneuze bloedbemonstering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

De chirurgische aanpak beschreven in het Protocolgedeelte maakt een duidelijke identificatie van de leverlymfebuis mogelijk, die zich mediaal van de rechternier bevindt en parallel loopt aan de coeliakie- en leverslagaders, zoals eerder gerapporteerd⁴. Representatieve anatomie en canulatie zijn weergegeven in Figuur 5. Succesvolle cannulatie wordt bevestigd door het onmiddellijke verschijnen van heldere tot licht troebel lymfevocht, vrij van melkachtige chylomicronbesmetting, wat wijst op minimale vermenging met mesenterische lymfe. Deze observatie komt overeen met de gerapporteerde kenmerken van leverlymfe³. De identificatie van leverlymfe was gebaseerd op de anatomische positie ten opzichte van de leverslagader en de inferieure vena cava, evenals op het karakteristieke heldere uiterlijk, in tegenstelling tot het typisch ondoorzichtige of melkachtige uiterlijk van mesenteriale lymfe.

De leverlymfestroom moet gedurende de verzamelperiode stabiel blijven, met een gemiddelde snelheid van ongeveer 0,1 mL/u ^3,4,11. De leverlymfestroom blijft doorgaans het meest stabiel gedurende ongeveer 2–3 uur na cannulatie onder verdoofde omstandigheden, hoewel langere verzamelperiodes (tot ~6–8 uur) mogelijk zijn onder optimale experimentele omstandigheden. Vertegenwoordigende lymfestroomwaarden die in eerdere studies^{zijn gerapporteerd 4} worden samengevat in Tabel 1. De leverlymfestroom is over het algemeen lager dan die gerapporteerd bij mesenterische en thoracale lymfebuisstromen bij verdoofde ratten.

Lymfatische plaatsen (bewuste toestand)	Gemiddelde lymfestroomsnelheid (mL/u)
Thoracale lymfe (bewust)	1,74 ± 0,33
Thoracale lymfe (onder narcothese)	0,65 ± 0,10
Mesenteriale lymfe (onder narcose gesteld)	0,45 ± 0,11
Hepatische lymfe (onder narcose)	0,12 ± 0,02

Tabel 1: Gemiddelde lymfestroomsnelheden (mL/h) door thoracale, mesenteriale en hepatische lymfebuiscanulaties bij bewuste en onder narkose ratten. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM voor n = 3–5 ratten. Aangepast uit Tabel 3 in Yadav et al. (2018)⁴.

Representatieve uitkomsten die lymfetransport van macromoleculen illustreren, zijn weergegeven in Figuur 8. Deze voorbeelden tonen aan hoe het model kan worden gebruikt om lymfatisch herstel te evalueren na intraveneuze toediening van therapeutische macromoleculen, waaronder ongeveer 60 kDa gepegyleerd interferon α2a (IFN-PEG40), ongeveer 31 kDa gepegyleerd interferon α2b (IFN-PEG12) en het monoklonale antilichaam trastuzumab, wat suggereert dat de lever een belangrijke plek is van extravasatie en lymfatische toegang voor macromoleculaire therapieën⁴.

Figuur 8: Lymfatische herstel van intraveneus toegediende macromoleculaire therapieën over thoracale, mesenteriale en hepatische lymfe. Totaal percentage van de dosis gevonden in thoracale, mesenteriale en leverlymfe na intraveneuze toediening van PEGylated interferonen van verschillende moleculaire groottes (IFN-PEG12 en IFN-PEG40) en een monoklonaal antilichaam (trastuzumab). De gegevens geven het gemiddelde ± SEM van dosisherstel over 8 uur weer. Aangepast van Yadav et al. (2018)⁴. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het model maakt ook gedetailleerde lipoproteïneprofilering van leverlymfe³ mogelijk. Representative analyses van de samenstelling van lymfelipiden zijn weergegeven in Figuur 9. In vergelijking met thoracale en mesenteriale lymfe vertoont hepatische lymfe een aanzienlijk lager totaal lipidegehalte, maar eiwitconcentraties vergelijkbaar met die van andere lymfebronnen. Lipoproteïneanalyse van leverlymfe benadrukt de unieke rol van de lever in lipidentransport en omgekeerd cholesteroltransport. Representatieve lipidensamenstellingsgegevens zijn samengevat in Tabel 2. Hepatische lymfe HDL is verrijkt met cholesterylesters, mesenterische lymfe HDL is overwegend rijk aan triglyceride, en thoracale lymfe HDL bevat relatief een hoger fosfolipidengehalte. Deze samenstellingsverschillen geven verschillende rollen aan van elke lymfatische bron in het lipidmetabolisme en -transport.

	%wt/wt
Breuken	Fosfolipide	Vrij cholesterol	Cholesterylester	Triglyceride
Mesenterische lymfe
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
Hepatische lymfe
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
Thoracale lymfe
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
Plasma
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

Tabel 2: Lipidensamenstelling van dichtheid (D-HDL) en lichte (L-HDL) hoogdichtheidslipoproteïnefracties geïsoleerd uit mesenterische, hepatische en thoracale lymfe en plasma. Waarden geven het percentage (% gewicht/gewicht) van fosfolipide, vrij cholesterol, cholesterylester en triglyceride aan ten opzichte van de totale lipidenfractie. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Aangepast uit Tabel 1 in Gracia et al. (2020)³.

Figuur 9: Eiwit- en lipidensamenstelling van mesenterische, lever- en thoracale lymfe. Proportionele eiwitinhoud en totale lipide in mesenterische, lever- en thoracale lymfe. Het lipidengehalte omvat fosfolipiden (PL), triglyceriden (TG), cholesterylesters (CE) en vrij cholesterol (FC), uitgedrukt als het percentage van het lipidengewicht ten opzichte van het totale gewicht van eiwit en lipide. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Aangepast van Gracia et al. (2020)³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Leverlymfebuiscanulatie is een technisch moeilijke procedure, zelfs voor ervaren microchirurgen. Verschillende cruciale stappen kunnen de kans vergroten om de integriteit van de lymfebuis te behouden en een stabiele lymfestroom te bereiken. Bij het identificeren en isoleren van de leverlymfebuis (protocolstappen 5.7-5.10) is de eerste stap het verwijderen van het bindweefsel en vet boven de mesenterische lymfebuis en vena cava nabij de leverlymfebuis. De leverlymfebuis is doorschijnend en fragiel in vergelijking met de dikkere en meer ondoorzichtige mesenterische lymfebuis en kan gemakkelijk scheuren als je direct wordt aangeraakt. De mesenterische lymfebuis dient als een nuttig anatomisch herkenningspunt, aangezien het opruimen van het bovenliggende weefsel de leverlymfebuis bovenaan laat liggen. Omdat het leverlymfekanaal vaak knicken of krommingen vertoont, moet de operator een canulatiepunt langs een recht segment kiezen en de canule parallel aan de natuurlijke koers van de buis oriënteren om het risico op afsluiting of scheuren te minimaliseren (stap 5.11-5.14).

De canulatie zelf is de meest cruciale factor voor succes. Na het doorboren van het kanaal (stap 5.13) kan intraluminale toegang visueel worden bevestigd door de punt van de pincet in de opening te plaatsen en ervoor te zorgen dat slechts één vatwand over het instrument ligt. Het uiterlijk van twee tegenoverliggende muren wijst op een door-en-door perforatie. Zodra intraluminale toegang is bevestigd, kan de canule soepel langs het kanaal worden verplaatst onder dezelfde hoek. Er moet voorzichtig worden geacht om schade aan aangrenzende bloedvaten te voorkomen, omdat bloedingen in het veld bloed in de lymfeverzamelingcanule kunnen brengen, waardoor het monster wordt besmet en het risico op stolselvorming aanzienlijk toeneemt. Na het vaststellen van de lymfestroom (stap 5.15) moet het verzamelende uiteinde van de canule worden afgesloten en moet veterinaire lijm voorzichtig worden aangebracht om te voorkomen dat deze het lumen binnendringt. De canule moet ook worden gecontroleerd op luchtbellen, omdat opgesloten lucht de tegendruk verhoogt en de lymfestroom kan belemmeren. Omdat leverlymfe wordt gevormd onder lage aandrijvingsdruk, moet het verzamelende uiteinde van de canule altijd onder het niveau van de operatieplaats worden geplaatst om de afvoer door de zwaartekracht te vergemakkelijken.

Succesvolle leverlymfebuis-canulatie wordt aangeduid door het onmiddellijke begin van de lymfestroom. Eenmaal gevestigd stroomt leverlymfe doorgaans met ongeveer 0,1 mL/u, met een stabiele output gedurende enkele uren. De stroomsnelheid kan variëren afhankelijk van de anatomie, fysiologie en experimentele omstandigheden van het dier. Zo werd lymfe in dit protocol onder isoflurane anesthesie verzameld. Isoflurane anesthesie kan fysiologische parameters beïnvloeden die relevant zijn voor lymfatische functie, en experimentele omstandigheden met anesthesie moeten daarom worden meegenomen bij het interpreteren van lymfevormingspercentages¹⁶. Leverlymfebuis-canulatie vereist laparotomie en delicate microchirurgische manipulatie van buiklymfevaten, waardoor lymfeafname bij bewuste ratten in dit model niet haalbaar is. Eerdere studies die lymfetransport onder verdoving en bewuste omstandigheden vergeleken of verschillende anesthesieregimes gebruikten, hebben aangetoond dat anesthesie de absolute lymfestroom bescheiden kan beïnvloeden, maar geen wezenlijk verandering in het algehele lymfatische transportpatronen⁴. Daarom moeten de in dit model verkregen lymfestroomwaarden worden geïnterpreteerd binnen de context van verdoofde experimentele omstandigheden.

Een geleidelijke vermindering of stopzetting van de stroom tijdens het verzamelen wordt meestal veroorzaakt door stolselvorming in de canule, veroorzaakt door bloedbesmetting of fibrineafzetting. De stroming kan soms worden hersteld door de canule te lokaliseren en voorzichtig te knijpen met fijne tangen om het stolsel mechanisch te fragmenteren, of door voorzichtig door het verzamelend van de canule te aspireren om de obstructie los te maken. Als de blokkade beperkt is tot het externe gedeelte, kan de canule proximaal van het stolsel worden doorgesneden en met een steriele siliconen connector weer worden aangesloten op verse slangen. Als het stolsel zich vormt op de plek van de cannulatie, is een hercannulatie meestal nodig. In dergelijke gevallen kan het verwijderen van de lijm met grote zorg worden geprobeerd om een scheur van het kanaal of aangrenzende bloedvaten te voorkomen. Hemostase moet worden bereikt voordat cannulatie opnieuw wordt geprobeerd, aangezien zelfs kleine bloedlekkage in de canule de stolling in het laagdruk-leverlymfestelsel sterk bevordert.

Fysiologische factoren beïnvloeden ook de lymfestroom en openheid. De leverlymfestroom bij ratten is van nature langzamer dan de mesenterische of thoracale buisstroming, zelfs onder basale omstandigheden^17,18. Bovendien kan algehele anesthesie de lymfestroom in andere lymfecircuits verminderen in vergelijking met bewuste, vrij bewegende ratten¹⁹. Omdat leverlymfecanulatie anesthesie en laparotomie vereist, dragen deze factoren waarschijnlijk bij aan de relatief lage debiet en de verhoogde neiging tot stolsels die tijdens langdurige inhopingen worden waargenomen. Het behouden van hydratatie via de jugulaire vena of gastro-intestinale canule tijdens het afnemen helpt de lymfestroom te stabiliseren en de vorming van stolsels te verminderen. In dit model is stabiele leverlymfestroom doorgaans 2–3 uur haalbaar, waarna de stroom kan verslechteren en stolling waarschijnlijker is. Onder optimale experimentele omstandigheden kan lymfeafname echter langer worden volgehouden, met een maximale duur van maximaal ~8 uur die⁴ uur wordt gerapporteerd.

De opname van bemonstering van de arteria leverarterie en portaalader (Figuur 6 en Figuur 7) vergroot de toepasbaarheid van het model door directe vergelijking mogelijk te maken tussen leverinstroom, lymfatische efflux en systemische circulatie. Deze terminale bemonsteringsstap maakt gelijktijdige beoordeling van hepatische microvasculaire transport en interstitiële clearance binnen één dier mogelijk. Dergelijke vergelijkingen bieden waardevolle inzichten in de verdeling van opgeloste stoffen tussen de hepatische vaat- en lymfecompartimenten, met name voor grote macromoleculen of lipofiele verbindingen die afhankelijk zijn van interstitiële diffusie.

Ondanks deze uitdagingen blijft het leverlymfecanulatiemodel een waardevolle en informatieve techniek. De lever draagt een aanzienlijk deel bij aan de totale lymfestroom van het lichaam, en leverlymfe bevat eiwitten en andere componenten die afkomstig zijn uit leverinterstitieel vocht. Door lymfe te bemonsteren die direct uit de lever afloopt, maakt dit model de analyse mogelijk van moleculen en cellen die de lever verlaten voordat ze worden verdund door mesenterische en systemische lymfe in de thoracale buis. Biochemische analyse van leverlymfe geeft inzicht in het interstitiële metabolisme van de hepatische interstitie en lipidetransportprocessen^12,20. Dit vult informatie aan die is verkregen uit het portale of systemische bloed, dat de effecten van levermetabolisme en extrahepatische uitwisseling integreert. Belangrijk is dat deze configuratie, die leverlymfe, carotisarteriële en jugulaire veneuze canulaties combineert, een dynamische beoordeling van opgeloste stoffengradiënten tussen leverefflux en vasculaire instroom mogelijk maakt, wat een meer volledig beeld geeft van levertransport en -clearance.

Eerdere studies met dit model tonen aan dat leverlymfemonsters evaluatie van lymfatisch herstel van macromoleculaire therapieën en vergelijking van het transport van opgeloste stoffen tussen leverlymfe en systemische circulatie mogelijk maken. Samen vormen leverlymfecannulatie, gelijktijdige vasculaire bemonstering en biochemische profilering een robuust experimenteel platform voor het bestuderen van hepatische microvasculaire en interstitiele dynamiek. Het model maakt gelijktijdige evaluatie van levertransport, metabolisme, lipidenverwerking en immuunsignalering mogelijk, en kan worden aangepast om veranderingen te onderzoeken onder pathofysiologische omstandigheden zoals MASLD of leverontsteking.

Samenvattend biedt dit verfijnde chirurgische model, dat hepatische lymfatische, hepatische arteriële en portale veneuze toegang integreert, een uitgebreide en reproduceerbare benadering voor het onderzoeken van levertransportroutes. Het maakt directe vergelijking mogelijk van vasculaire instroom, interstitiële efflux en lymfedrainage, wat studies ondersteunt die mechanistisch inzicht bieden in lever-specifiek transport, metabolisme en farmacokinetische processen. Daarnaast biedt het vermogen om leverlymfe te bemonsteren een unieke kans om de overdracht van immuuncellen en antigeen vanuit de lever te bestuderen, wat waardevolle inzichten biedt in lever-immuunbewaking, ontsteking en tolerantiemechanismen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anticoagulant solution (EDTA 0.1%)	Invitrogen	AM9261	Voortkomt stolselvorming in canules en verzamelde monsters
Anticoagulant solution (Heparin 20 IU/mL)	Pfizer	00409-2723-01	Voortkomt stolselvorming in canules en verzamelde monsters
Chlorhexidine (0.5%)	McFarlane Medical	12120-OR	Gebruikt voor desinfectie van de chirurgische plaats
Collection tubes (microcentrifuge)	Greiner Bio-One	616201	Gebruikt voor lymfe- en bloedverzameling
Cotton gauze	Winc Australia	18874125	Gebruikt voor orgaanmanipulatie en vochtbehoud
Cotton swabs	Pacific Laboratory	1005199	Gebruikt voor orgaanrepositionering tijdens chirurgie
Curved iris forceps	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	Gebruikt voor vaatisolatie en weefselmanipulatie
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Gebruikt om de vaatholte van de leverarterie te openen en te stabiliseren voor canule-inbrenging
Ethanol (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	Gebruikt voor desinfectie van de chirurgische plaats
Halsted-Mosquito hemostat forceps	Fine Science Tools	13009-12	Gebruikt om de 25G-naald te buigen voor punctie van de leverlymfevat
Heated surgical pad (37 °C)	Ratek	IC-WT1	Behoudt lichaamstemperatuur tijdens chirurgie
Induction chamber	Darvall	1859	Gebruikt voor initiële anesthesie-inductie
Infusion pump	Adelab Scientific	NE-300	Biedt gecontroleerde zoutoplossingsinfusie via canule
Iris scissors	Stark Medical	E-AC985-11	Gebruikt voor huid- en spiersneden
Isoflurane	Provet Pty Ltd	ISOF07	Inhalatie-anestheticum gebruikt voor inductie en onderhoud van anesthesie
Kelman-McPherson lens forceps	ProSciTech	TY-1301	Gebruikt om de vaatholte van de halsslagader en halsslagader te openen en te stabiliseren voor canule-inbrenging
Needle (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	Gebruikt voor punctie van de poortader en bloedafname
Needle (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	Gebruikt voor canule-flushing en punctie van het leverlymfevat
Nose cone anesthesia system	Darvall	7885	Behoudt anesthesie tijdens chirurgie
Oxygen supply with flowmeter	BOC	400NE	Draaggas voor isoflurane-anesthesie
Polyethylene cannula (0.8 mm O.D., 0.5 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PE8050	Gebruikt voor canule-inbrenging in de halsslagader, halsslagader en leverlymfevat
Polyvinyl cannula (0.61 mm O.D., 0.28 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PIV6128	Gebruikt voor canule-inbrenging in de leverarterie
Silk sutures (4-0)	SMI AG	SM8015	Gebruikt om vaten en canules vast te zetten
Sodium pentobarbitone	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	Gebruikt voor euthanasie (>100 mg/kg)
Sterile saline (0.9% NaCl)	FreeFlex	K690531	Gebruikt voor rehydratie en flushing
Straight Graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	Gebruikt voor delicate vaatisolatie
Surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000-CS	Gebruikt voor visualisatie tijdens canule-inbrenging in het leverlymfevat
Surgical sterile blades (for scalpel use)	Livingstone	SBLDCL15	Gebruikt voor het afvlammen van canule-tips tijdens voorbereiding
Syringe (1 mL)	Terumo	19032-TE	Gebruikt voor het flushen van canules
Syringe (3 mL)	Terumo	19048-TE	Gebruikt voor bloedafname
Syringe (30 mL)	Terumo	19034-TE	Gebruikt voor zoutoplossingsinfusie
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09	Gebruikt voor vasculaire sneden
Veterinary tissue adhesive	3M	1469SB	Gebruikt om de leverlymfevat-canule vast te zetten