Mechanismen van Shengxian Quyu-aftrek bij hartfalen met behulp van een niet-gerichte metabolomica en netwerkfarmacologische benadering bij ratten

Samenvatting

Deze studie bevestigde het therapeutische effect van Shengxian Quyu Decoctie op hartfalen via dierproeven. Ultra-performance vloeistofchromatografie–massaspectrometrie en netwerkfarmacologie-analyses identificeerden potentiële therapeutische doelen en mechanismen.

Samenvatting

Shengxian Quyu-aftrek (SXQY) is voorgesteld als een mogelijke therapeutische strategie voor hartfalen (HF), maar de therapeutische mechanismen ervan zijn onduidelijk. Deze studie onderzocht de therapeutische effecten en onderliggende mechanismen van SXQY bij HF. Een rattenmodel van HF werd geïnduceerd door transversale aortaconstrictie (TAC) en behandeld met SXQY. De hartfunctie werd beoordeeld met transthoracale echocardiografie, en de myocardstructuur en fibrose werden beoordeeld met behulp van hematoxyline en eosine en Masson's tricroom kleuring. Serummonsters werden geanalyseerd met niet-gerichte metabolomics met behulp van ultra-performance vloeistofchromatografie–tandem massaspectrometrie. Bloedinflijdende componenten werden in kaart gebracht naar doelen, en overlappende HF-gerelateerde doelen werden geanalyseerd met behulp van eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkanalyse, gevolgd door Gene Ontology en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyses. SXQY verbeterde de hartfunctie significant bij TAC-ratten, zoals blijkt uit een verminderde interne diameter van de linker ventrikel in de diastole en de dikte van de linker ventrikel achterwand in de diastole en een verhoogde linker ventrikel ejectiefractie, en verlichtte myocardhypertrofie, ontsteking en fibrose. In totaal werden 563 bloedinzetverbindingen geïdentificeerd (367 prototypes en 196 metabolieten), met 5 belangrijke actieve verbindingen in de database Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology, overeenkomend met 63 doelwitten. Netwerkanalyse toonde 44 overlappende genen aan, met Formononetine, Timosaponine BII en Sinensetine als kerncomponenten, en PTGS2, PPARG en HSP90AA1 als hubdoelen. PPI-analyse identificeerde verder belangrijke genen, waaronder ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN en 15 extra genen. KEGG-analyse wees uit dat SXQY voornamelijk werkt via Ca²⁺, fosfatidylinositol 3-kinase–eiwitkinase B, cyclisch adenosine monofosfaat en ontstekings- en hormoongerelateerde routes. Samenvattend oefent SXQY beschermende effecten uit tegen HF door de hartfunctie te verbeteren en myocardremodellering te verminderen via multicomponent-, multitarget- en multipathwaymechanismen.

Inleiding

Hartfalen (HF) is een klinisch syndroom dat wordt gekenmerkt door een verminderde vulling en uitwerpcapaciteit van de ventrikel als gevolg van hartstructurele of functionele afwijkingen, wat resulteert in een reeks klinische tekenen en symptomen¹. Als eindstadium van verschillende hartziekten ondermijnt HF aanzienlijk de kwaliteit van leven van patiënten en leidt het tot hoge sterfte en frequente heropnames in het ziekenhuis, waardoor er een aanzienlijke ziektelast ontstaat voor zowel families als de samenleving ^2,3. In de klinische behandeling vormt farmacotherapie voor HF de basis en hoeksteen van de behandeling, voornamelijk bestaande uit belangrijke geneesmiddelklassen zoals diuretica, remmers van het renine-angiotensine systeem, bètablokkers, mineralocorticoïde receptorantagonisten en natrium-glucose cotransporter 2-remmers 3,4,5,6 . Hoewel deze medicijnen de prognose van patiënten met HF gedeeltelijk hebben verbeterd, hebben ze elk bepaalde beperkingen en bijwerkingen, zoals elektrolytenstoornissen, bradycardie en urineweginfecties⁷. Daarom verdienen farmacologische therapieën voor HF nog steeds nader onderzoek.

Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) heeft uitgebreide klinische ervaring opgedaan in het langetermijnbeheer van HF. Met nadruk op holistische regulatie en multitargetinterventie biedt het een onderscheidende benadering van de behandeling⁸. In de afgelopen jaren hebben een aantal gerandomiseerde gecontroleerde onderzoeken (RCT's) de therapeutische werkzaamheid aangetoond van Chinese kruidenformules voor HF 9,10,11,12,13,14,15. Shengxian Quyu Decoctie (SXQY) is al begonnen met rigoureuze RCT's om de therapeutische effectiviteit te bevestigen, maar de specifieke therapeutische mechanismen vereisen nog verder en uitgebreider onderzoek¹⁶. Netwerkfarmacologie, als opkomende discipline die systeembiologie, polyfarmacologie en computationele analyse integreert, biedt een krachtig hulpmiddel om de holistische werkingsmechanismen van Chinese kruidenformules te verduidelijken 17,18,19. Daarom hanteert deze studie een geïntegreerde strategie die ongerichte metabolomics en netwerkfarmacologie combineert om door bloed opgenomen componenten van SXQY te identificeren en de potentiële therapeutische mechanismen te verduidelijken. Dit werk heeft als doel een basis te leggen voor de verdere klinische toepassing van SXQY.

Protocol

Alle experimentele procedures werden onderzocht en goedgekeurd door het Animal Ethics and Welfare Committee van het China–Japan Vriendschapsziekenhuis (goedkeuringsnr. zryhyy21-23-01-09) en werden uitgevoerd volgens de principes van vervanging, vermindering en verfijning om het gebruik en lijden van dieren te minimaliseren. Onderzoekers die gegevensverzameling en analyse uitvoerden (inclusief echocardiografiemetingen en histologische beoordeling) waren blind voor groepstoewijzing.

Voorbereiding van SXQY-monster

SXQY bestaat uit de volgende kruidenbestanddelen: Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 g), Codonopsis pilosula (Dangshen; 20 g), Cornus officinalis (Shanyurou; 15 g), Sparganium stoloniferum (Sanleng; 12 g), Curcuma zedoaria (Erzhu; 15 g), Cimicifuga heracleifolia (Shengma; 10 g), Bupleurum chinense (Chaihu; 10 g), Platycodon grandiflorus (Jiegeng; 10 g), Anemarrhena asphodeloides (Zhimu; 15 g), en Leonurus japonicus (Yimu; 15 g), met een totaal ruwe kruidgewicht van 152 g per recept. Alle kruidenmaterialen werden gekocht bij het Department of Pharmacy van het China–Japan Friendship Hospital en geauthenticeerd door een hoofdapotheker volgens standaard farmakognostische identificatiemethoden. Klinisch wordt SXQY toegediend in een dosis van één recept (152 g) per dag. Uitgaande van een gemiddeld volwassen lichaamsgewicht van 70 kg, is de overeenkomstige menselijke dosering 2,17 g (ruwe kruid)/kg. Op basis van de normalisatie van het lichaamsoppervlak tussen mensen en ratten werd de equivalente ratdosering berekend op 13,67 g (ruwe kruid)/kg. Voor het bereiden van het dekoken werd één recept SXQY 1 uur geweekt in gedestilleerd water met een verhouding van 10 mL per gram ruwe kruiden (w/v, gebaseerd op het initiële oplosmiddelvolume zonder aanpassing na het weken), gevolgd door koken met een elektrische verwarmingsmantel en 1 uur onder continu koken op 100°C gehouden. Het extract werd vervolgens gefilterd door gaas (poriegrootte 200–300 μm). Het residu werd vervolgens nog twee keer onder identieke omstandigheden verwijderd. De gepoolde filtraten werden onder verminderde druk geconcentreerd met een roterende verdamper bij 60°C tot een eindvolume van 111 mL, wat een concentratie van 1,37 g (ruwe geneesmiddel)/mL opleverde. Het geconcentreerde skok werd opnieuw gefilterd door gaas (200–300 μm poriegrootte) en opgeslagen bij 4°C en binnen 24–48 uur gebruikt. Voor toediening werd de oplossing direct gebruikt en werd het gavagevolume berekend op basis van de concentratie van 1,37 g/mL, wat resulteerde in een toedieningsvolume van ongeveer 10 mL/kg om de streefdosis van 13,67 g/kg te bereiken.

Diermodel

Achttien mannelijke Sprague–Dawley (SD) ratten van 8 weken oud werden gehuisvest in een standaard geconditioneerde omgeving (23°C ± 2°C, 50 ± 5% relatieve luchtvochtigheid en een licht/donker cyclus van 12 uur) met vrije toegang tot voedsel en water. Dieren werden willekeurig toegewezen aan drie groepen (n = 6 per groep) met behulp van een willekeurige getalletabel: een door schijn bediende groep (Sham), een transversale aortaconstrictiegroep (TAC) en een door SXQY behandelde groep (SXQY). Ratten in de TAC- en SXQY-behandelde groepen werden verdoofd door inademing van isoflurane (inductie 4%, onderhoud 2%) en in rugligging geplaatst op een thermostatisch gecontroleerde verwarmingsmat, gehandhaafd op 37°C. Voldoende verdoving werd bevestigd door het ontbreken van reflexreacties op pootknellen, samen met een stabiele ademhalingsfrequentie en het ontbreken van spontane beweging. Oogzalf werd op beide ogen aangebracht om hoornvliesdrooging te voorkomen. Na endotracheale intubatie werden de dieren aangesloten op een beademingsapparaat voor kleine dieren met een getijdenvolume van 4–6 mL per 200 g lichaamsgewicht, een ademhalingsfrequentie van 70 ademhalingen per minuut en een inademings-ademhalingsverhouding van 1:1.

Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. Chirurgische instrumenten werden gesteriliseerd door autoclaven, en het operatiegebied werd voorbereid door scheren en desinfecteren met povidon-jodium, gevolgd door 70% ethanol. Na de voorbereiding van de chirurgische plaats werd een incisie op de linker thoracale huid gemaakt, waarbij de pectoralis major en minor spieren stomp werden ontleed om de ribben bloot te leggen. Er werd een horizontale incisie van ongeveer 1,0 cm gemaakt bij de tweede tot derde intercostale ruimte naast de linker sternale rand. Bloedvaten en fascia werden bot gescheiden en de thymus werd voorzichtig teruggetrokken om de aortaboog volledig bloot te leggen.

De aortabooglijn werd voorzichtig opgetild tussen de rechter innominata slagader en de linker arterie van de gewone halsslagader met steriele gebogen tang, en een 2-0 zijden hechting werd eronder geplaatst. Een stompe gebogen 16-gauge naald (buitendiameter 1,6 mm) werd handmatig aangepast door de punt bot te maken en deze voor gebruik tot een geschikte kromming te buigen, gevolgd door sterilisatie met autoclaven. De voorbereide stompe gebogen naald werd vervolgens parallel aan de aortaboog, waarna de hechting strak om zowel de aorta als de naald werd vastgemaakt. De naald werd onmiddellijk verwijderd om een gestandaardiseerde vernauwing te creëren, en de thymus werd opnieuw geplaatst. Na bevestiging van het ontbreken van actieve bloedingen werden de borstwand en huid in lagen gesloten. Postoperatief werd de mechanische ventilatie ongeveer 10 minuten voortgezet totdat de spontane ademhaling was hersteld, wat blijkt uit een stabiele en regelmatige ademhalingsfrequentie en het vermogen om spontane ademhaling zonder ventilatieondersteuning te behouden. Op dat moment werd de endotracheale buis verwijderd. Sham-opererende dieren ondergingen dezelfde chirurgische ingrepen, behalve dat de aortabooghoek niet werd geligeerd.

Na de operatie werd de incisieplaats gedesinfecteerd en werden de dieren in schone herstelkooien geplaatst om het infectierisico te verkleinen. Ratten werden vervolgens teruggebracht naar de dierenfaciliteit voor herstel en routinematige huisvesting. Pijn werd toegediend met buprenorfine (0,05 mg/kg, subcutaan). Ratten werden elke 12 uur gedurende de eerste 72 uur waargenomen op tekenen van pijn, stress of chirurgische complicaties, waaronder verminderde mobiliteit, piloerectie, abnormale houding, zware ademhaling of wonddehiscentie.

Drie dagen na de operatie werden ratten in de door SXQY behandelde groep oraal toegediend met 1 mL/100 g lichaamsgewicht van het SXQY-aftrek gedurende 9 weken. Ondertussen kregen ratten in de sham-bediende en TAC-groepen een gelijk volume (1 mL/100 g lichaamsgewicht) gedestilleerd water via gavage.

Transthoracale echocardiografie

Aan het einde van de behandelperiode werd in alle groepen transthoracale echocardiografie uitgevoerd. Ratten werden verdoofd door inademing van isoflurane en in rugligging geplaatst op een speciaal beeldvormingsplatform. De voorste borst werd zorgvuldig geschoren en bedekt met een royale laag ultrasone gel. Ultrasone beeldvorming werd uitgevoerd met een hoogresolutie echografiesysteem voor kleine dieren, uitgerust met een hoogfrequente transducer (18–40 MHz) in B- en M-modus. De transducer werd voorzichtig geplaatst op het met gel bedekte gebied, met een diepte-instelling van 12,29 mm en een versterking van 22 dB; De focus werd aangepast om de beeldkwaliteit te optimaliseren. Beelden en videoloops werden verzameld voor latere kwantitatieve analyse. De interne diameter van de linkerventrikel (LVIDd) en de dikte van de linker ventrikel achterwand bij de einddiastole (LVPWd) werden gemeten, en de ejectiefractie van de linkerventrikel (LVEF) werd berekend met behulp van de Teichholz-formule op basis van M-mode metingen. Voor elke parameter werden metingen gemiddeld gemaakt over 3–5 opeenvolgende hartcycli. Alle echocardiografische acquisities en analyses werden uitgevoerd door een gecertificeerde operator met formele training in echocardiografie, volgens gestandaardiseerde echocardiografische protocollen.

Monsterverzameling en verwerking

Na de echo werden ratten verdoofd met isoflurane. De dieren werden in rugligging geplaatst en de thoracale holte werd geopend om het hart bloot te leggen. Harten werden snel verwijderd, gespoeld in koude, fosfaatgevulde zoutoplossing en langs het sagittale vlak doorgesneden. Hartweefsels werden onmiddellijk vastgezet in 4% paraformaldehyde bij 4°C gedurende 24 uur, gevolgd door uitdroging via een gegradueerde ethanolreeks (70%, 80%, 90%, 95% en 100%) gedurende 1 uur bij elke stap, waarbij weefsels geleidelijk doorschijnend werden zonder merkbare krimp. Monsters werden vrijgemaakt in xyleen, geïnfiltreerd met gesmolten paraffine bij 60°C gedurende 3 uur, en bij kamertemperatuur (RT; 20°C–25°C) laten stollen. Paraffine-ingebedde hartweefselblokken werden geknipt en gesneden op een dikte van 4–6 μm met behulp van een microtoom. Secties werden drijvend in een waterbad op 45°C, gemonteerd op glazen glijbanen en 's nachts gedroogd bij 37°C–40°C. De preparaten werden opgeslagen bij RT onder lage luchtvochtigheid en binnen 1 week gebruikt voor histologisch kleuring.

Hematoxyline en eosine (HE) kleuring

Paraffine-ingebedde secties werden als volgt verwerkt. Secties werden eerst gedeparaffiniseerd door onderdompeling in xyleen I, II en III gedurende elk 5 minuten, gevolgd door hydratatie via een reeks watervrije ethanol I en II en gegradueerde ethanoloplossingen (95%, 90%, 80%, 70% en 50%) gedurende elk 5 minuten, en tenslotte afgespoeld in gedestilleerd water, zonder zichtbare wasresten. De secties werden vervolgens 5 minuten gekleurd met Harris-hematoxyline en 1–2 minuten onder stromend kraanwater afgespoeld. Differentiatie werd uitgevoerd in een zuuralcoholoplossing gedurende ongeveer 1–2 seconden, waarbij het eindpunt werd bepaald door visuele inspectie wanneer de achtergrond bleek leek terwijl de nucleaire kleuring duidelijk werd afgebakend. Daarna werd het blauw in water bij 37°C–45°C gebluerd en afgespoeld met gedestilleerd water. Vervolgens werden de secties 40 seconden gekleurd met alcohol-oplosbare eosine, gewassen met gedestilleerd water, gedehydrateerd met gegradueerd ethanol, vrijgemaakt in xyleen en uiteindelijk bevestigd met neutrale hars.

Masson-kleuring

Paraffine-ingebedde secties werden sequentieel gedeparaffiniseerd in xyleen I, II en III gedurende elk 5 minuten, gevolgd door hydratatie via watervrij ethanol I en II en gegradueerde ethanoloplossingen (95%, 90%, 80%, 70% en 50%) gedurende elk 5 minuten, en tenslotte afgespoeld in gedestilleerd water. Secties werden 1 seconde ondergedompeld in 0,5% azijnzuur (voorgekoeld tot 4°C), gevolgd door 10 minuten kleuring met de fuchsinoplossing uit een commerciële Masson's trichrome kleurset, gevolgd door 5 minuten differentiatie in fosfofolidzuur en 3 minuten tegenkleuring met anilineblauw. Alle reagentia waren onderdelen van dezelfde commerciële kit en werden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Na het kleuren werden de secties drie keer afgespoeld in azijnzuur, voorgekoeld tot 4°C (ongeveer 30 s per spoeling), gedehydrateerd met gegradueerd ethanol, gezuiverd in xyleen en gemonteerd met neutrale hars.

Serummonsterverzameling voor metabolomics-analyse

Zes mannelijke SD-ratten van 8 weken werden onder dezelfde omstandigheden gehuisvest als die in het bovenstaande in vivo-experiment. Dieren werden willekeurig toegewezen aan een door SXQY behandelde groep en een voertuigcontrolegroep (gedestilleerd water; n = 3 per groep) met behulp van een computergegenereerde randomisatie-methode. Ratten in de SXQY-groep kregen oraal SXQY toegediend met een dosis van 1 mL/100 g lichaamsgewicht, terwijl de voertuigcontrolegroep een gelijke hoeveelheid gedestilleerd water ontving. Na zeven dagen dagelijks gavage werd de laatste dosis op de zevende dag verdubbeld. Na de laatste toediening werden de dieren 12 uur vast. Ratten werden verdoofd met isoflurane totdat het verlies van de pedaalterugtrekkingsreflex werd bevestigd als een indicatie van voldoende verdoving. Bloedmonsters werden afgenomen uit de retro-orbitale veneuze plexus met behulp van steriele capillairbuizen en direct overgebracht in 1,5 mL microcentrifugebuizen zonder antistollingsmiddel. Het volbloed mocht vervolgens 1 uur op RT staan en werd 15 minuten bij 4°C gecentrifugeerd op 1000 × g om serum te verkrijgen. Wanneer er een duidelijke scheiding ontstond tussen de bovenste transparante serumlaag en het stolsel, werd het supernatant-serum zorgvuldig geaspireerd en overgebracht in schone microcentrifugebuizen. Serummonsters werden bewaard bij −80°C totdat de bloedinstromende componenten werden geanalyseerd.

Voorbeeld van voorbehandeling voor metabolomics-analyse

Serummonsters werden na verwijdering uit −80°C opslag op ijs ontdooid en kortstondig vortex-gemengd (10 s) om homogeniteit te waarborgen. Een aliquot van 100 μL serum werd overgebracht in een 1,5 mL microcentrifugebuis, gevolgd door de toevoeging van 500 μL extractie-oplosmiddel (20% acetonitril–methanol met 2-chloor-L-fenylalanine als interne standaard bij een eindconcentratie van 1 μg/mL) om eiwitprecipitatie te induceren. Het mengsel werd krachtig 3 minuten vortex en 10 minuten gecentrifugeerd op 12.000 × g bij 4°C. Een deel van 470 μL van het resulterende supernatant werd overgebracht naar een nieuwe buis en verdampte tot droogte met behulp van een stikstofverdamper onder een lage, gecontroleerde stikstofstroom. Na reconstitutie in 200 μL van 70% methanol–water en vortexen van 1 minuut, werden monsters gecentrifugeerd bij 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4°C, en 180 μL van het geklaarde supernatant werd overgebracht in autosampler-buisjes voor vloeistofchromatografie–tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) analyse.

Een aliquot van 200 μL SXQY-monster werd vervolgens overgebracht in een vooraf gelabelde centrifugebuis van 1,5 mL. De interne standaard extractieoplossing werd aan elk monster toegevoegd met een volumeverhouding van 1:1 (v/v). Het mengsel werd 15 minuten vortex-gemengd en 3 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 × g bij 4°C. Het resulterende supernatant werd zorgvuldig verzameld en gefilterd door een microporeus membraan van 0,22 μm, wat resulteerde in een transparant filtraat zonder zichtbare deeltjes. Het filtraat werd overgebracht naar autosampler-buisjes en opgeslagen bij 4°C voorafgaand aan ultra-performance LC-MS/MS (UPLC–MS/MS) analyse.

Voorbereiding van interne standaardoplossingen

De interne standaard (2-chloor-L-fenylalanine) voorraadoplossing werd bereid door 1 mg van de referentiestandaard op te lossen in 1 mL van 70% (v/v) methanol–water, wat een concentratie van 1.000 μg/mL opleverde. Deze voorraadoplossing werd verder verdund met hetzelfde oplosmiddel om een werkende interne standaardoplossing te verkrijgen met een uiteindelijke concentratie van 1 ppm, die vers werd bereid, opgeslagen bij 4°C en binnen 48–72 uur werd gebruikt.

UPLC–MS/MS-Voorwaarden

Chromatografische scheiding werd uitgevoerd met een UPLC-systeem gekoppeld aan een tandem-massaspectrometer. De scheiding werd bereikt op een C18-kolom die op 40°C werd gehouden, met een debiet van 0,35 mL/min en een injectievolume van 4 μL. De mobiele fase bestond uit ultrazuiver water met 0,1% (v/v) mierenzuur (A) en acetonitril met 0,1% (v/v) mierenzuur (B). De gradiënt-elusie werd als volgt toegepast: 5% B bij 0,0 minuten; lineair steeg het naar 25% B na 2,0 min, 35% B na 3,0 min, 60% B na 5,0 min, en 99% B na 6,0 min; 1,5 minuut op 99% B gehouden; keerde terug naar 5% B na 7,6 minuten; en evenwichtig op 5% B tot 10,0 min.

Massaspectrometrische detectie werd uitgevoerd met een hogeresolutie massaspectrometer uitgerust met een elektrospray-ionisatiebron die werkte in positieve en negatieve ionenmodi. De sproeispanningen werden ingesteld op 3500 V in positieve modus en 3200 V in negatieve modus. Het mantelgas en hulpgas werden respectievelijk ingesteld op 30 en 5 willekeurige eenheden (instrumentgedefinieerd). De temperatuur van de ionentransportbuis en de temperatuur van de verdamper werden respectievelijk op 320°C en 300°C gehandhaafd. Volledige MS-scans werden verkregen over een m/z-bereik van 84–1250 met een resolutie van 35.000 en een automatische versterkingscontrole (AGC) target van 1,0 × 10⁶, gevolgd door data-afhankelijke MS/MS-acquisitie (top 10) met een resolutie van 17.500 met een AGC-doel van 2,0 × 10⁵ en een isolatievenster van 1,0–1,5 m/z. Getrapte genormaliseerde botsingsenergieën van 30, 40 en 50 werden toegepast. De top 10 meest intense precursorionen werden geselecteerd voor fragmentatie met een dynamische uitsluitingsduur van 3 seconden.

Raw Data Processing

Ruwe massaspectrometriegegevens werden omgezet naar mzML-formaat met behulp van ProteoWizard. Om analytische betrouwbaarheid te waarborgen, werden gepoolde kwaliteitscontrolemonsters (QC) voorbereid door gelijke volumes van alle serummonsters te mengen. QC-monsters werden op regelmatige intervallen geïnjecteerd (één QC-injectie per 5–10 analytische monsters) gedurende de UPLC–MS/MS-analyse om de stabiliteit van het instrument, consistentie in retentietijd en signaalreproduceerbaarheid te monitoren. De reproduceerbaarheid werd geëvalueerd op basis van de relatieve standaardafwijking van piekintensiteiten in QC-monsters.

Piekdetectie, correctie van retentietijd en piekuitlijning werden uitgevoerd met het XCMS-pakket. Kenmerken met een ontbrekingspercentage van meer dan 50% binnen een groep werden uitgesloten van verdere analyse. Signaaldriftcorrectie werd vervolgens toegepast op piekgebieden met behulp van een op support vector regression (SVR)-gebaseerde normalisatiemethode die in de R-statistische software werd geïmplementeerd met QC-gebaseerde modellering om signaaldrift over de analytische run te corrigeren.

Metabolietidentificatie werd uitgevoerd door de gecorrigeerde kenmerken te vergelijken met een interne referentiestandaardbibliotheek (met ongeveer 5.000 verbindingen met zowel MS1- als MS2-spectrale gegevens; propriëtair en niet openbaar beschikbaar), evenals openbaar beschikbare spectrale databases zoals Human Metabolome Database (HMDB), Metabolite and Tandem Mass Spectrometry Database (METLIN), MassBank en Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS). gebaseerd op nauwkeurige massa-matching, retentietijd-uitlijning en MS/MS spectrale overeenkomst. Massa-matching werd uitgevoerd met een tolerantie van ±25 ppm voor precursor (MS1) en fragmentionen (MS2), met een retentietijdtolerantie van ±6 s. Voor bibliotheekzoekopdrachten werd een tolerantie van ±25 ppm toegepast op precursorionen (Q1) en ±50 ppm op MS/MS-fragmenten, met een minimale MS/MS-matchingscore van 0,3. Alleen metabolieten met een uitgebreide identificatiescore hoger dan 0,5 werden behouden voor niet-gerichte identificatie. De eindscore werd berekend als een gewogen som van fragment (0,1), vooruit (0,3) en omgekeerd (0,6) gelijke scores. Gegevens verkregen in positieve en negatieve ionisatiemodi werden op het niveau van de verbinding samengevoegd. Voor dubbele annotaties werd de vermelding met het hoogste identificatievertrouwen en de hoogste score geselecteerd. De definitieve annotaties werden gecompileerd in een metabolietannotatiebestand.

Criteria voor identificatie van geabsorbeerde verbindingen

Geabsorbeerde prototypebestanddelen werden gedefinieerd als verbindingen die werden gedetecteerd in het SXQY-extract en de door SXQY behandelde groep met overeenkomstige retentietijden binnen een tolerantie van ±0,1 minuten. Daarnaast moesten deze verbindingen een piekgebied vertonen in de met SXQY behandelde groep dat ten minste twee keer groter was dan dat in de voertuigcontrolegroep, of ontbreken in de voertuigcontrolemonsters.

Geabsorbeerde metabolieten werden geïdentificeerd met een andere set criteria. Deze verbindingen werden niet aangetroffen in het SXQY-extract, maar waren aanwezig in de met SXQY behandelde groep. Hun massaspectrometrische kenmerken moesten consistent zijn met karakteristieke metabole transformaties, waaronder hydroxylatie (Δm/z = +15,9949 Da) en demethylering (Δm/z = −14,0157 Da). Bovendien moest het piekgebied in de SXQY-behandelde groep minstens twee keer groter zijn dan dat in de voertuigcontrolegroep, gebaseerd op genormaliseerde piekgebieden na signaaldriftcorrectie, of moest het bijbehorende signaal ondetecteerbaar zijn in de voertuigcontrolemonsters.

Terugvinden van geabsorbeerde verbindingsgerelateerde genen

Bloedinvoerende componenten werden onderzocht in de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; geraadpleegd in januari 2026)²⁰. Verbindingen die in TCMSP zijn gedocumenteerd, werden gescreend als kandidaat-bioactieve bestanddelen op basis van vastgestelde farmacokinetische drempels van orale biobeschikbaarheid ≥ 30% en geneesmiddelgelijkheid ≥ 0,18²¹. De veronderstelde doelen die overeenkwamen met de behouden verbindingen werden vervolgens teruggevonden, en alle doelidentificaties werden gestandaardiseerd naar officiële gensymbolen met behulp van de UniProt-database²².

Terugvinden van ziektegerelateerde doelen en doorsneetgenen

HF-gerelateerde genen werden verzameld uit de GeneCards-database (https://www.genecards.org/; geraadpleegd in januari 2026) met "hartfalen" als zoekterm, en genen met een relevantiescore ≥ 10 werden geselecteerd voor verdere analyse. De HF-gerelateerde doelen werden vervolgens gekruist met samengestelde doelen die via TCMSP werden geïdentificeerd via het Weishengxin-platform (https://www.bioinformatics.com.cn; geraadpleegd in januari 2026). De overlappende genen werden gedefinieerd als snijdoelwitten en werden gebruikt voor de opbouw van eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken en functionele verrijkingsanalyses.

Netwerkconstructie en functionele verrijkingsanalyses

PPI-analyse van de geïdentificeerde doelwitten werd uitgevoerd met behulp van de STRING-database (http://cn.string-db.org/; geraadpleegd in januari 2026)²³, waarbij de soort werd ingesteld op Homo sapiens en een betrouwbaarheidsscore van ≥0,7. De interactiegegevens werden geïmporteerd in de Cytoscape-visualisatietool voor netwerkvisualisatie. Topologische analyse werd uitgevoerd met de NetworkAnalyzer-plugin in de visualisatietool, en hubgenen werden geïdentificeerd met de CytoHubba-plugin^24,25. Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyse werd uitgevoerd op de snijdoelen, waaronder biologische processen (BP), cellulaire componenten (CC) en moleculaire functie (MF) categorieën. GO-termen met een P-waarde < 0,05 werden als significant beschouwd, en de top 10 verrijkte termen uit elke categorie werden geselecteerd voor visualisatie²⁶. De snijpuntdoelen werden verder onderworpen aan de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routeverrijkingsanalyse met behulp van het clusterProfiler-pakket in de statistische software. Paden met een P-waarde < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd, en de top 20 verrijkte paden werden geselecteerd voor visualisatie. Deze paden werden vervolgens gebruikt om een doel-padinteractienetwerk²⁷ te construeren.

Statistische analyse

De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. De normaliteit van de gegevensverdeling werd beoordeeld met de Shapiro–Wilk-test, en de homogeniteit van de variantie werd vóór de analyse geëvalueerd met de Levene-test of Brown-Forsythe-test. Statistische vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met eenrichtingsanalyse van variantie, gevolgd door Tukey's post hoc-test met GraphPad Prism. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Transthoracale echocardiografie

Echocardiografische analyse toonde uitgesproken cardiale remodeling en disfunctie bij TAC-ratten aan (Figuur 1). In vergelijking met Sham-controles verhoogden TAC significant LVIDd en LVPWd, terwijl LVEF duidelijk afnam. Opvallend is dat de toediening van SXQY deze pathologische veranderingen gedeeltelijk omkeerde, wat blijkt uit een significante vermindering van LVIDd en LVPWd en e...

Discussie

SXQY wordt al meer dan twintig jaar uitgebreid gebruikt in de klinische praktijk en toont effectiviteit aan bij de behandeling van diverse cardiovasculaire aandoeningen. Recentelijk is het gebruik ervan uitgebreid naar patiënten met hartfalen met een verlaagde ejectiefractie en licht verlaagde ejectiefractie¹⁶. In de huidige studie werd een rattenmodel ontwikkeld door TAC-chirurgie om pathologische veranderingen van HF na te bootsen, en ondertussen werden sommige ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-chloro-L-phenylalanine	Aladdin	C105993-1g	Interne standaard; ≥98%
Acetonitrile (LC-MS grade)	Aladdin	A120771-1L	Extractieoplosmiddel
Azijnzuur	Solarbio	G1340	Masson-kleuring; voorgekoeld tot 4 °C
Autosampler vials	Agilent	5190-9590	Voor LC-MS/MS monsterlading
Buprenorfine	Cerilliant	B-044S	Analgeticum
C18 kolom (1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm)	Waters	176001125	ACQUITY Premier HSS T3 kolom
Capillaire buizen, steriele	Fisherbrand	22-362-566	Retro-orbitale bloedafname
Centrifuge (gekoeld)	KUBOTA	N61196-F000	Voor serum- en monsterverwerking
clusterProfiler-pakket	Bioconductor	—	R-pakket voor KEGG-verrijkingsanalyse; v4.0.2
Gebogen pincetten, steriele	HL-SQX	HL-JP	Manipulatie van de aortaboog
Cytoscape-software	NHGRI	NIH NHGRI U24 HG012107	Versie 6.4.1
Toegewijd beeldvormingsplatform	Fujifilm VisualSonics	VisualSonics Vevo 1100 echografiebeeldvormingssysteem	Dierdierpositionering tijdens echocardiografie
Gedestilleerd water	N/A	N/A	Decoctopreparatie en vehikelcontrole
Elektrisch verwarmingsmantel	Midea	WK2102	Decoctokokking
Endotracheale buis	CWE Inc., USA	SAR-1000	Endotracheale intubatie; De in dit onderzoek gebruikte endotracheale buis was geïntegreerd in de ventilatorconfiguratie en was geen afzonderlijk of op zichzelf staand apparaat
Ethanol (absoluut)	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	64-17-5	Dehydratie en sterilisatie
Mierenzuur	Aladdin	O930702	Additief voor mobiele fase
Gaas	Solarbio	YA0720	Decoctofiltratie; 200–300 μm poriëngrootte
GeneCards-database	GeneCards	—	Ziekteverwant doelwit ophalen; toegang op januari 2026
GNPS-database	University of California San Diego	—	Spectrale database; versie 1.3.16, gegevens gearchiveerd in december 2025
GraphPad Prism-software	GraphPad Software	—	Versie 10.1.2; SCR_002798
Verwarmingskussen (thermostaat)	Physitemp	HP-4M	Gehandhaafd op 37 °C
Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuringskit	Solarbio	G1120	Histologische kleuring
Hoge frequentie transducer	VisualSonics	Vevo F2	18–40 MHz
Hoge resolutie massaspectrometer	Thermo Fisher Scientific	Q Exactive	Q Exactive HF-X
Hoge resolutie klein-dier echografiesysteem	Fujifilm VisualSonics	VisualSonics Vevo 1100 echografiebeeldvormingssysteem	Vevo 2100
HMDB-database	Wishart Research Group / The Metabolomics Innovation Centre, University of Alberta	—	Spectrale database; HMDB huidige versie 5.0; release 5.0; januari 2022
Interne referentiestandaardbibliotheek	METWARE	—	Samenstelling van de interne referentiestandaardbibliotheek: De bibliotheek bevat in totaal 5.000 verbindingen en bevat zowel MS1 (precursor) informatie als MS2 (fragmentatie) spectragegevens. Beschikbaarheidsverklaring: Het bibliotheekgegevensformaat is.txt. Opslagconditie: De database wordt opgeslagen op de interne server van het bedrijf. Toegangsrechten: Deze zelfgebouwde standaardbibliotheek is een eigen spectraalbibliotheek van het bedrijf. Het wordt uitsluitend gebruikt voor metabolietenidentificatie, resultaatverificatie en kwaliteitstraceerbaarheid binnen de gecontroleerde analytische workflows van het bedrijf. De bibliotheek is niet openbaar beschikbaar voor download. Klanten kunnen annotatieresultaten, hit-informatie en noodzakelijke veldbeschrijvingen verkrijgen die op basis van deze bibliotheek zijn gegenereerd.
Isofluraan	Sigma-Aldrich	792632	Inhalatieanestheticum
Vloeistofchromatografiesysteem (UPLC)	SCIEX	ExionLC AD	ExionLC AD
MassBank-database	MassBank consortium; Mass Spectrometry Society of Japan / MassBank Europe	—	Spectrale database; versie 2024.06; gegevens gearchiveerd in december 2025
Masson’s Trichrome kleuringskit	Solarbio	G1340	Histologische kleuring
Membraanfilter (0,22 μm)	Beyotime	FF362	Polyethersulfone (PES)
METLIN-database	The Scripps Research Institute / Siuzdak Lab	RRID: SCR_010500	Spectrale database; deze database biedt geen vast jaarlijks versienummer; gegevens gedownload in 2023
Methanol (LC-MS grade)	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	67-56-1	Extractieoplosmiddel
Microcentrifugebuisjes (1,5 mL)	Corning Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd.	MCT-150-C	Monsterverwerking
Microtoom	Leica	DSC1	Weefselsnijden
Neutrale hars	Solarbio	G8590	Glijmiddelmontage
Stofzuiger/gasbron	Organomation	N-EVAP	Monsterdrogen
Oogzalf	Aladdin	08-03-8009	Oogbescherming tijdens anesthesie
Paraffine	Solarbio	YA0010	Weefselinbedding
Paraformaldehyde (4%)	Solarbio	P1110	Weefselfixatie
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	DU YOU YOU	DYP1021	Weefselwassen