Integratieve transcriptome-brede associatiestudie en Mendeliaanse randomisatie identificeren LYNX1 en MS4A14 als therapeutische doelwitten voor osteomyelitis

Samenvatting

Deze studie integreert transcriptoombrede associatieanalyse en Mendeliaanse randomisatie om systematisch geneesmiddeldoelen voor osteomyelitis te identificeren. Met gebruik van genetische databases identificeerden de auteurs LYNX1 en MS4A14 als belangrijke kandidaatgenen, waarbij ze kritieke moleculaire routes benadrukten en precieze therapeutische strategieën voor het beheersen van botinfecties aankondigden.

Samenvatting

Osteomyelitis is een ernstige infectieziekte die wordt gekenmerkt door een diepe ontsteking van het bot en het beenmerg en voornamelijk wordt veroorzaakt door bacteriële ziekteverwekkers zoals Staphylococcus aureus (S. aureus). De huidige behandelregimes worden echter aanzienlijk belemmerd door het ontstaan van antibioticaresistentie en terugkerende infecties, veroorzaakt door robuuste biofilmvorming en intracellulaire bacteriële persistentie. Er is dus een dringende behoefte om nieuwe therapeutische doelwitten te identificeren die verder gaan dan conventionele antimicrobiële middelen. Een integratieve computationele benadering die een transcriptome-brede associatiestudie (TWAS) combineert met samenvattingsgebaseerde Mendeliaanse randomisatieanalyse (SMR) werd toegepast om systematisch causale gevoeligheidsgenen te identificeren die aan osteomyelitis ten grondslag liggen. Grootschalige genetische varianten werden ingezet als instrumentele variabelen om genexpressie over weefsels te voorspellen, waardoor de causale verbanden tussen deze doelwitten en het ziekterisico werden onderzocht. Het integratieve kader identificeerde LYNX1 en MS4A14 als belangrijke kandidaatgenen en potentiële therapeutische doelwitten. Specifiek was LYNX1 geassocieerd met een verhoogde vatbaarheid voor osteomyelitis, terwijl MS4A14 potentiële beschermende eigenschappen vertoonde. Deze bevindingen benadrukken de regulerende rol van deze genen in de immuunrespons van de gastheer en ontstekingsmodulatie tijdens botinfectie. Deze studie overbrugt de kloof tussen genoombrede associatiebevindingen en biologische interpretatie, bevordert het begrip van de genetische basis van osteomyelitis en ondersteunt de ontwikkeling van gerichte precisiegeneeskundestrategieën om de verdediging van de gastheer te versterken en therapeutische resistentie te overwinnen.

Inleiding

Osteomyelitis is een ernstige infectieziekte die wordt gekenmerkt door een diepe ontsteking van het bot en het beenmerg. Het wordt vaak geïnitieerd door een bacteriële invasie, waarbij Staphylococcus aureus (S. aureus) een veelvoorkomend pathogeen is bij acute en chronische hematogene presentaties ^1,2. Hoewel S. aureus prominent is, is osteomyelitis vaak polymicrobieel en lost de uitroeiing van S. aureus alleen de infectie niet altijd op door het aanhouden van niet-kweekbare micro-organismen en dynamische biofilminteracties ^3,4. Bij vatbare gastheren gebruiken pathogenen ingewikkelde ontwijkingsstrategieën, waaronder intracellulaire persistentie binnen macrofagen en de vorming van dichte biofilms. Deze biofilms, bestaande uit extracellulair DNA, polysachariden en gespecialiseerde eiwitten, creëren formidabele fysieke barrières die weerstand bieden aan de immuunafweer van de gastheer en de penetratie van conventionele antimicrobiële middelen^beperken. Daarom, hoewel klinische behandeling doorgaans agressieve chirurgische debridement en langdurige antibioticatherapie inhoudt, vermindert de aanwezigheid van veerkrachtige biofilms en polymicrobiële gemeenschappen de effectiviteit van de behandeling aanzienlijk, wat leidt tot langdurige morbiditeit en terugkerende infecties ^7,8. Het ophelderen van de moleculaire architectuur achter gastheer–pathogeen interacties blijft cruciaal voor het identificeren van nieuwe therapeutische doelen⁹.

Genoombrede associatiestudies (GWAS) hebben het begrip van osteomyelitis vergroot door meerdere genetische loci te identificeren die geassocieerd zijn met ziektevatbaarheid¹⁰. Door strenge meervoudige testdrempels en beperkingen in statistische kracht en steekproefgrootte zullen veel kritieke loci die de gevoeligheid voor osteomyelitis beïnvloeden waarschijnlijk onopgemerkt blijven. Bovendien blijft de interpretatie van GWAS-bevindingen uitdagend, aangezien de meeste geïdentificeerde varianten zich bevinden in niet-coderende of intergene regio's, wat wijst op regulerende effecten op genexpressie in plaats van directe veranderingen in de eiwitstructuur¹¹. Bovendien ontbreken primaire GWAS-gegevens directe weefselspecificiteit, waardoor complementaire downstream-analyses nodig zijn om de cellulaire contexten te bepalen waarin deze varianten hun effecten uitoefenen. Transcriptome-brede associatiestudies (TWAS) pakken deze beperkingen aan door genetisch voorspelde genexpressie van referentiepanelen te integreren in bestaande GWAS-datasets, waardoor systematische identificatie van functioneel relevante ziekte-geassocieerde genen over meerdere weefsels mogelijk is¹².

Om de causale inferentie te versterken, gebruikt Mendeliaanse randomisatie (MR) genetische varianten als instrumentele variabelen, waarbij de willekeurige toewijzing van allelen bij conceptie wordt benut om confounding te verminderen en omgekeerde causaliteit te verminderen^13,14. Expression quantitative trait loci (eQTL) analyses koppelen GWAS-varianten verder aan gentranscriptie¹⁵, terwijl samenvattingsgebaseerde Mendeliaanse randomisatie (SMR) GWAS- en QTL-datasets integreert om causale genen te prioriteren en ze te onderscheiden van associaties veroorzaakt door koppelingsdisequilibrium via heterogeniteitstesten¹⁶.

Deze studie vertegenwoordigt de eerste toepassing van een integratief TWAS- en MR-kader dat zich specifiek richt op osteomyelitis, en de kloof tussen GWAS-bevindingen en klinisch toepasbare inzichten aanpakt. Door experimentele transcriptomische data te combineren met grootschalige populatiegenetische gegevens, werden ziekte-vatbaarheidsgenen systematisch in kaart gebracht en causale relaties afgeleid. Deze integratieve strategie heeft als doel eerder onbekende moleculaire routes te ontdekken die betrokken zijn bij gastheerresistentie tegen osteomyelitis en om kandidaatdoelen te identificeren voor precisietherapie ontwikkeling.

Protocol

Alle samenvattende statistieken die werden gebruikt in de Mendelian Randomization (MR) en Transcriptome-Wide Association Study (TWAS) analyses waren uitsluitend afgeleid van eerder gepubliceerde, gedeïdentificeerde datasets. Ethische goedkeuring en individuele toestemming voor de oorspronkelijke studies zijn gedocumenteerd in hun respectievelijke publicaties. Daarom werd aanvullende ethische goedkeuring voor deze data-miningstudie door de Institutional Review Board van het Tongde Ziekenhuis van de provincie Zhejiang (Zhe Tongde Lunshen 2024 [Yan] Nr. 028-Y) opgeheven. De gebruikte gereedschappen voor dit onderzoek staan vermeld in de Materiaalkundige Tabelle.

1. RNA-seq gegevensverzameling en -verwerking

Transcriptoomgegevens werden verkregen uit de Gene Expression Omnibus (GEO) database (GSE272198) om het behoud van aangeboren immuunroutes tussen zoogdiersoorten te beoordelen voor initiële validatie¹⁷. Uit het beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's) werden 1 uur geïnfecteerd met S. aureus (meervoudigheid van infectie, MOI = 10), gevolgd door behandeling met lysosaffine (20 μg/mL) en gentamicine (50 μg/mL) om extracellulaire bacteriën te verwijderen. Na drie wasbeurten met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) werden BMDM's 24 uur gekweekt, gelyseerd in een totale RNA-extractiereagens en gesequenced.

De kwaliteit van het RNA werd beoordeeld met behulp van een geautomatiseerd elektroforesesysteem om integriteit te waarborgen. Bibliotheken werden voorbereid uit drie onafhankelijke experimenten en gesequenced op een high-throughput sequencingplatform. Ruwe reads werden uitgelijnd met het muizengenoom (GRCm38, mm10) met behulp van STAR (v2.7.10a). Differentieel expressieve genen (DEGs) werden geïdentificeerd met behulp van DESeq2 (v1.38.0). Om valse positieven te beperken werd statistische significantie gedefinieerd als een aangepaste p-waarde (FDR) < 0,05 en |log₂ keer verandering| > 1. Gene Ontology (GO) analyse werd uitgevoerd met clusterProfiler (v4.6.0), en Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) werd uitgevoerd met GseaVis (v0.0.5). Heatmaps werden gegenereerd met het pheatmap-pakket (v1.0.12) in R (v4.2.0).

TWAS-analyse

Whole-blood RNA-sequencing en whole-genome sequencing (WGS) gegevens werden verkregen van het Genotype-Tissue Expression (GTEx) project (V8)¹⁸. Vooraf getrainde genexpressiemodellen werden gebruikt uit een openbaar archief (https://doi.org/10.5281/zenodo.3842289). Samenvattende statistieken over osteomyelitis voor TWAS zijn verkregen van het FinnGen-consortium, bestaande uit 2.336 gevallen en 473.264 controles¹².

TWAS werd uitgevoerd met drie algoritmen: gewrichtsweefselimputatie (JTI), PrediXcan¹⁹ en UTMOST ^12,20. JTI schat de gelijkenis in genexpressie en de toegankelijkheid van epigenetische chromatine om de voorspellingsnauwkeurigheid te optimaliseren. PrediXcan past elastische netregressie toe met vijfvoudige kruisvalidatie, terwijl UTMOST de nauwkeurigheid verbetert door multiweefselexpressiegegevens te benutten met behulp van de sparse group LASSO. Het aangepaste UTMOST-kader beschreven door Zhou et ^al.12 standaardiseert hyperparameters voor onbevooroordeelde schatting. Genen met stabiele kruisvalidatiescores—vooraf gedefinieerd als correlatiecoëfficiënt r > 0,1 en voorspellende significantie p < 0,05²¹—bleven als toeschrijvend behouden. Volbloed transcriptoommodellen werden ontwikkeld met behulp van SNP-covariantiematrices uit de 1000 Genomes referentiedataset.

Vervolgens werden verbanden tussen voorspelde genexpressie en het risico op osteomyelitis geanalyseerd. Om rekening te houden met meervoudig testen werd de statistische significantie voor TWAS voornamelijk gedefinieerd met een False Discovery Rate (FDR)-drempel van < 0,05. Gezien het hypothesegenererende karakter van deze meerfasige studie werden loci die een suggestieve (nominale) drempel van p < 0,05 bereikten, ook geprioriteerd voor downstream Mendeliaanse randomisatie (SMR) en colocalisatie-analyses. Deze integratieve strategie heeft als doel het vastleggen van potentiële regulatorische drijfveren te maximaliseren, terwijl wordt vertrouwd op multi-omic cross-validation (TWAS + SMR) om de robuustheid van de geprioriteerde kandidaten te waarborgen.

SMR-analyse

Deze studie volgde de richtlijnen Strengthening the Reporting of Observational Studies in Epidemiology (STROBE)²². Om computationeel een fenotype te definiëren dat genetische aanleg voor mitochondriale disfunctie vertegenwoordigt (hierna "mitodys" genoemd voor analysedoeleinden), werden transcripties die overeenkomen met alle bekende mitochondriale genen geëxtraheerd uit de MitoCarta3.0-database²³. Deze genenset diende als een vooraf gedefinieerde, biologisch geïnformeerde basis voor de daaropvolgende voorspelling van polygene risico's. Alle downstream functionele interpretaties met betrekking tot "mitodys" zijn afgeleid van deze computationele inferentie en moeten als voorspellend en hypothesegenererend worden beschouwd.

Expression quantitative trait loci (eQTL) instrumenten werden gegenereerd met varianten binnen 1000 kb van coderingssequenties (cis-eQTLs). Samenvattende statistieken zijn afkomstig van het eQTLGen Consortium en GTEx V8²⁴. In totaal werden 8.932.843 SNP's gekoppeld aan 1.013 mitodie-gerelateerde transcripten geselecteerd op basis van een genoom-brede significantiedrempel P < 5E-8. Basislijnstatistieken van GWAS voor osteomyelitis zijn verkregen van FinnGen²⁰.

Samenvattingsdata-gebaseerde Mendelian Randomization (SMR) analyse werd uitgevoerd met SMR (versie 1.0.3) met standaardparameters om pleiotrope associaties tussen genexpressiekenmerken en osteomyelitis-uitkomsten te schatten. Het causaal effect beta_mitodys–osteomyelitis vertegenwoordigt de geschatte log-odds effectgrootte van mitochondriale disfunctie op osteomyelitis en wordt berekend als:

Odds ratio's (OR's) geven de verandering per natuurlijke logaritmische toename van één eenheid aan in gestandaardiseerde genexpressieniveaus. Co-lokalisatie werd verder geëvalueerd met behulp van de heterogeniteit in afhankelijke instrumenten (HEIDI) test.

Resultaten

Karakterisering van bulk RNA-sequencing en functionele verrijkingen

Volgens de methodologie die werd gebruikt om niet-geïnfecteerde (controle) versus S. aureus-geïnfecteerde BMDM's te isoleren, werden 3.775 DEG's geïdentificeerd in de experimentele groep, bestaande uit 1.686 upregulated en 2.089 downregulated genen. GO-analyse toonde een netwerk aan dat sterk verrijkt is voor aangeboren immuunactivatie, inclusief positieve regulatie (...

Discussie

Door TWAS- en SMR-analyses te integreren over translationele datasets, identificeerde deze studie een kernnetwerk van genetische loci die geassocieerd zijn met osteomyelitisfenotypen. De identificatie van LYNX1 en MS4A14 als kandidaat-gendoelwitten is een belangrijke bijdrage, die mechanistisch inzicht biedt dat verder gaat dan conventionele GWAS-bevindingen door transcriptomische context te integreren. Deze integratieve aanpak benadrukt het potentieel van precisiegeneeskundestrategieën ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
clusterProfiler	Guangchuang Yu's Team (Sun Yat-sen University)	NA	Wordt gebruikt voor Gene Ontology (GO) functionele verrijkingsanalyse van differentieel tot expressie gebrachte genen.
DESeq2	Bioconductor Project (Open Source)	NA	Wordt gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) te identificeren
GSEA / GseaVis	Broad Institute / Open Source Community	NA	Wordt gebruikt voor Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) om coördinatief tot expressie gebrachte genensets te identificeren. GseaVis wordt waarschijnlijk gebruikt voor visualisatie.
HEIDI (Heterogeneity in Dependent Instruments) test	Geïntegreerde functie binnen de SMR-software	NA	Wordt gebruikt om te testen of de associatie waargenomen in SMR wordt aangedreven door linkage disequilibrium in plaats van een gedeelde causale variant. P_HEIDI > 0,05 geeft geen grote heterogeniteit aan
JTI (Joint-Tissue Imputation)	Zhou et al. (Open Source Model)	NA	Een TWAS-algoritme dat genexpressievergelijkbaarheid en epigenetische chromatinetoegankelijkheid schat om de voorspellingsnauwkeurigheid te optimaliseren.
pheatmap	Raivo Kolde (R-pakket)	NA	Wordt gebruikt om heatmaps van differentieel tot expressie gebrachte genen te genereren voor datavisualisatie.
PrediXcan	Gamazon et al. (Open Source Model)	NA	Een TWAS-algoritme dat elastische net regressie toepast met vijfvoudige cross-validatie om genexpressie te imputeren en te testen op associatie met ziekterisico.
SMR (Summary-data-based Mendelian Randomization)	Ontwikkeld door een team aan de Fudan University (Open Source Software)	NA	Wordt gebruikt om op samenvatting gebaseerde Mendeliaanse randomisatieanalyse uit te voeren om causale associaties tussen genexpressie en osteomyelitis-risico te onderzoeken. Versie 1.0.3 werd gebruikt.
STAR	Alexander Dobin (Cold Spring Harbor Laboratory)	NA	Wordt gebruikt om RNA-seq-leesreeksen uit te lijnen op het referentiegenoom (muisgenoom GRCm38/mm10).
UTMOST	Hu et al. (Open Source Model)	NA	Een TWAS-algoritme dat de voorspellingsnauwkeurigheid verbetert door gebruik te maken van multi-weefsel expressiegegevens met behulp van een schaarse groep LASSO-framework.