Een muismodel van enkelvoudig en repetitief rotatie-gesloten hoofdhersenschudding

Samenvatting

Er wordt een reproduceerbaar muismodel van rotatiehersenschudding beschreven, dat een veelzijdige methode biedt om de subtiele functionele en biologische onderliggende factoren - waaronder neurovasculaire, inflammatoire en gedragsveranderingen - te onderzoeken na een enkele of herhaalde impact zonder duidelijke structurele hersenschade.

Samenvatting

Concussief hersenletsel (CBI), het pathofysiologische substraat dat ten grondslag ligt aan klinische hersenschudding, is een veelvoorkomende maar onvoldoende begrepen aandoening met mogelijk langdurige neurologische beperking bij een subgroep patiënten. Vooral repetitieve CBI, dat wil zeggen in contactsporten, is in verband gebracht met blijvende cognitieve tekorten en progressieve neurodegeneratie (bijv. chronische traumatische encefalopathie, CTE). Om deze kenniskloof te dichten, werd een reproduceerbaar muismodel van gesloten hoofdrotatiehersenletsel opgesteld dat belangrijke biomechanische en pathologische kenmerken van CBI herhaalt. Een stereotactisch geleide elektromagnetische impactor werd gebruikt om een gestandaardiseerde slag op de intacte schedel uit te delen. Om de focale belasting op de schedel en aangrenzend hersenweefsel te verminderen, werd de impactortip voorzien van een op maat gemaakte siliconen dop. Deze configuratie veroorzaakte betrouwbaar koprotatie met een lage variabiliteit tussen dieren, terwijl schedelbreuken of microscopisch weefselletsel werden voorkomen. Om fysiologische neuronale en vasculaire activiteit te behouden en om mogelijk neuromodulerende effecten van diepe anesthesie te voorkomen, werd hersenletsel opgewekt bij bewuste muizen onder lichte sedatie met behulp van de α2-agonist medetomidine. De geïnduceerde botsingen veroorzaakten reproduceerbare rotatiebeweging van het hoofd met slechts geringe variabiliteit als gevolg van hoofdpositionering. De structurele hersenintegriteit werd beoordeeld met in vivo T2-gewogen magnetische resonantiebeeldvorming en bevestigd door ex vivo histologische analyses, die geen bewijs van weefselverstoring, kneuzing of microbloedingen toonden, maar wel een milde, wijdverspreide verstoring van de microvasculaire interface aantoonden. Dit nieuwe model van rotatie-gesloten hersenletsel biedt een robuust experimenteel platform voor longitudinale onderzoeken naar subtiele neurovasculaire, inflammatoire en veranderingen in de bloed-hersenbarrière die optreden bij afwezigheid van duidelijke structurele pathologie. De toepassing ervan maakt mechanistische inzichten mogelijk in de pathofysiologie van klinische hersenschuddingen en mogelijke neurodegeneratieve gevolgen van herhaald letsel, waardoor de ontwikkeling van dringend benodigde klinische biomarkers mogelijk wordt.

Inleiding

Traumatisch hersenletsel (TBI) blijft een belangrijke oorzaak van langdurige invaliditeit in alle leeftijdsgroepen, waarbij adolescenten en jongvolwassenen onevenredig zwaar getroffen^{zijn 1,2,3}. De overgrote meerderheid van de TBI's wordt als mild (mTBI) geclassificeerd, wat op klinisch niveau vaak een hersenschudding wordt genoemd. Hoewel een hersenschudding per definitie niet geassocieerd is met overduidelijke structurele hersenschade die met conventionele neurobeeldvorming kan worden opgespoord, suggereert het toenemende bewijs dat het onderliggende letselmechanisme—hier aangeduid als hersenschudding hersenletsel (CBI)—een aparte en klinisch relevante pathofysiologische entiteit vertegenwoordigt.

In het bijzonder is repetitieve CBI, vooral wanneer het in korte temporele opeenvolging voorkomt, zoals vaak voorkomt in contactsporten en militaire omgevingen, in verband gebracht met aanhoudende cognitieve achteruitgang, neuropsychiatrische symptomen en de ontwikkeling van chronische traumatische encefalopathie (CTE)^1,2,3. Dit schijnbare verschil tussen de milde aard van de oorspronkelijke verwonding en het potentieel voor langdurige neurologische gevolgen vormt een grote uitdaging voor zowel klinische diagnose als mechanistisch onderzoek.

Nieuw bewijs wijst erop dat subtiele maar aanhoudende veranderingen op het neurovasculaire en neurogliale grensvlak een relevant ziektemechanisme vormen⁴. Deze veranderingen omvatten de integriteit van de bloed-hersenbarrière (BBB), microvasculaire structuur, gliale activatie, neuronale prikkelbaarheid en endogene herstelprocessen, wat mogelijk cellulaire pathofysiologie koppelt aan de langetermijn functionele en gedragsmatige tekorten die worden waargenomen na, vooral repetitie, CBI ^5,6,7,8. Gezamenlijk worden dergelijke veranderingen steeds vaker erkend als mogelijke oorzaken van de vertraagde functionele en gedragsmatige tekorten na CBI. De diffuse en veelzijdige aard bemoeilijkt echter een mechanistisch begrip en heeft tot nu toe de ontwikkeling van gerichte therapeutische interventies belemmerd.

Preklinische modellen die belangrijke aspecten van de pathofysiologische cascade herhalen, zijn cruciale instrumenten om deze mechanismen te ontleden en nieuwe therapeutische wegen te identificeren. Hoewel er een breed scala aan experimentele TBI-modellen bestaat, zijn de meeste ontworpen om matige tot ernstige verwondingen na te bootsen of te vertrouwen op focale structurele schade ^9,10,11. Daarentegen is er een verbazingwekkend gebrek aan diermodellen voor het karakteristieke schademechanisme van CBI⁵. Meestal wordt een cerebraal trauma dat als "mild" wordt bestempeld veroorzaakt door een focale impact op het stard gefixeerde hoofd, of zelfs door directe corticale impact na een craniotomie, wat fundamenteel in tegenspraak is met het diffuse, door versnelling en vertraging gedreven letselmechanisme dat hersenschudding bij mensen definieert ^6,7. Hoewel dergelijke benaderingen precieze controle over blessureparameters mogelijk maken, vermindert hun beperkte vermogen om de dynamiek van echte hersenschuddingen na te bootsen hun translatie-relevantie.

Om deze beperkingen te overwinnen, bestaan er verschillende methoden om een reproduceerbaar en diffus gesloten-hersenletsel 12,13,14 te induceren. Voortbouwend op deze concepten en met het doel technische complexiteit te minimaliseren, werd een gecontroleerd rotatieletselmodel bij muizen ontwikkeld met een commercieel verkrijgbare elektromagnetische impacter die vaak in andere experimentele traumamodellen wordt gebruikt (zoals gecontroleerde corticale impact, CCI). Door een reproduceerbare impact te leveren op het vrij bewegende hoofd, behoudt deze aanpak de structurele integriteit terwijl het longitudinaal onderzoek mogelijk maakt van neurovasculaire, neurogliale en functionele veranderingen na enkele en repetitieve CBI onder omstandigheden die nauw lijken op de biomechanische kenmerken van menselijke hersenschudding.

In combinatie met longitudinale gedragsbeoordeling, in vivo beeldvorming en ex vivo histologie, biedt dit model een veelzijdig en toegankelijk platform om neurovasculaire, gliale en gedragsveranderingen te onderzoeken na enkele of herhaalde effecten. Als zodanig is het zeer geschikt voor het bestuderen van de subtiele secundaire ziektemechanismen van CBI, het identificeren van translationele surrogaatparameters en het evalueren van potentiële therapeutische interventies in een klinisch relevante experimentele omgeving.

Protocol

Alle dierlijke procedures voldeden aan de Duitse Dierenwelzijnswet en werden goedgekeurd door institutionele en overheidsinstanties (LANUV Nordrhein-Westfalen; AZ 81-02.04.2020.A058). Experimenten werden uitgevoerd volgens de ARRIVE-richtlijnen. Een schematische workflow wordt beschreven in Figuur 1. Dit protocol induceert betrouwbaar hersenschudding, zoals blijkt uit een gedefinieerd panel van structurele, gedragsmatige en neurovasculaire validatie-uitkomsten (Figuur 2). Alle materialen die in deze studie zijn gebruikt, zijn beschreven in de Materiaalbeschrijving.

1. Algemene overwegingen

OPMERKING: Muizen werden sociaal gehuisvest onder gestandaardiseerde omstandigheden (12 uur licht/donker cyclus) met ad libitum toegang tot voedsel en water. Muizen werden minstens 7 dagen gewend aan de experimentele faciliteit voor de operatie. In totaal werden 40 muizen gebruikt in deze pilotstudie, waarbij 10 dieren aan elke experimentele groep werden toegewezen (sham als controlegroep, enkele CBI-groep, repetitieve CBI bij hoge frequentie en repetitieve CBI in lage frequentiegroep). Stel een hogesnelheidscamerasysteem op ooghoogte op met de muiskop in een vaste positie voor de muis (bijvoorbeeld 10 cm). Om consistentie tussen proeven te waarborgen, houd de camerapositie en oriëntatie constant. In deze studie werd een GoPro Hero6 gebruikt bij 240 frames per seconde (fps) met een resolutie van 1080px. De open-source bewegingsanalysesoftware Kinovea (versie 2025.2.0) wordt gebruikt voor de beschreven kinematische analyses.

2. Inductie van analgesie en anesthesie

1. Bereid de opstelling voor, inclusief het stereotactische frame en de bevestiging voor de elektromagnetische impactor.
2. Dien Tramadol (1 mg/mL) toe via water twee dagen voor de trauma-inleiding en ga daarna drie dagen na de (laatste) operatie door.
3. Induceer anesthesie met isoflurane in een lachgas/zuurstofmengsel (O₂ 30%, N₂O 70%), met 4–4,5% isoflurane in een inductiekamer.
4. Beoordeel de chirurgische tolerantie met behulp van de teen-knijpreflex. Ga verder zodra er een terugtrekkingsreactie ontbreekt.
5. Haal de muis uit de inductiekamer en plaats hem op een warmtekussen binnen het stereotactische kader. Houd de kerntemperatuur op 37 ± 1,0 °C met behulp van een glasvezel-rectale sonde. Bescherm de ogen tegen uitdroging door oogzalf aan te brengen.
6. Behoud de anesthesie door isoflurane toe te dienen van 2,0–2,5% via een neuskegel die is aangesloten op de stereotactische opstelling.

3. Voorbereiding van de schedel

1. Zet de muis binnen het stereotactische frame met specifieke oorbeen.
2. Scheer de hoofdhuid en desinfecteer het operatiegebied grondig met een alcoholhoudend antisepticum.
3. Geef lokale verdoving door subcutane injectie van Bupivacaïne (0,1 mg/kg).
4. Beoordeel de teenknijpreflex opnieuw vóór de incisie van de huid. Ga alleen door als er geen terugtrekkingsrespons is om een consistente diepte van de narcose te waarborgen.
5. Maak een middenlijnincisie van ongeveer 7 mm om de schedel bloot te leggen.
6. Leg voorzichtig de schedel bloot boven het rechter pariëtale bot tussen Bregma en Lambda.
7. Zorg ervoor dat het stereotactische frame loodrecht op de schedel is georiënteerd, met de verticale as onder een hoek van 90° ten opzichte van het hoofdoppervlak.
8. Bevestig een markerpen in de stereotactische houder en centreer deze direct op Bregma.
9. Nul alle stereotactische coördinaten en verplaats de markerpin naar de vooraf gedefinieerde anteroposterior (AP) en mediolaterale (ML) coördinaat (in ons model, bij AP 0,5, ML -2,5). Markeer het doelpunt met een waterbestendige viltstift.

4. Aanpassing van analgesie

1. Laat de muis los van de oorbanden.
2. Injecteer medetomidine subcutaan (0,5 mg/kg) en verlaag geleidelijk isofluraan tot <0,5%.
3. Houd de anesthesie op < 0,5% isofluraan terwijl je continu de ademhaling en lichaamstemperatuur monitort.
4. Laat evenwicht onder deze omstandigheden gedurende 10 minuten in balans zijn om een stabiele anesthesietoestand te bereiken terwijl de activiteit van het neuronale netwerk behouden blijft. Ademhalingsfrequentie, afwezigheid van reflexresponsen en stabiele lichaamstemperatuur (37 ± 1,0 °C) werden gebruikt als gestandaardiseerde indicatoren om een vergelijkbare anesthesiediepte bij dieren te waarborgen.

5. Impactinductie

OPMERKING: Fabriceer vóór het experiment een kophouder voor het diermodel van commercieel verkrijgbare polyethyleen (PE) schuimbuisisolatie, een gesloten-cel, niet-gekruist polymeerschuim, dat neerwaartse versnelling beperkt terwijl rotatiebeweging mogelijk is. Daarnaast moet een op maat gemaakte 5 mm bolvormige slagpuntje van silpuran worden vervaardigd (verhouding 1:1; stijfheid 830 kPa).

1. Verwijder de rectale temperatuursonde en stop met de levering van isoflurane, en plaats de muis vervolgens in een buikligging op de kophouder.
2. Bevestig de op maat gemaakte siliconen dop aan de commercieel verkrijgbare slagpunt.
3. Bevestig de elektromagnetische impactor in de stereotactische houder en zorg ervoor dat het apparaat onder een hoek van 10° ten opzichte van het schedeloppervlak is gepositioneerd.
4. Lijn de impactortip uit boven het vooraf gedefinieerde doelgebied op de schedel.
5. Laat de slagpuntje in de verlengde positie zakken totdat het licht het schedeloppervlak raakt.
6. Trek de impactortip terug en breng deze naar de gewenste invaldiepte (dus 3 mm in deze experimenten) richting het schedeloppervlak. Voor controledieren laat je het verlagen weg en verhoog je in plaats daarvan de tip met hetzelfde bedrag.
7. Begin met video-opname. Een enkele roterende schokkende impact afleveren door de elektromagnetische bliksem via de bedieningsschakelaar te activeren met een snelheid van 5 mm/s en een pulsduur van 0,1 ms.
8. Trek de impactor direct in na voltooiing van de impact.
9. Antagoniseer medetomidine-anesthesie met de antagonist atipamazol (0,5 mg/kg, s.c.).

6. Beoordeling na de impact en wondsluiting

1. Draai de muis in een liggende positie.
2. Beoordeel de rechtstaande reflex door de tijd te noteren die nodig is voor het dier om terug te keren naar een buikliggende positie.
3. Induceer opnieuw anesthesie met isofluraan in een lachgas/zuurstofmengsel (O₂ 30%, N₂O 70%) bij 4% isofluran.
4. Haal de muis uit de inductiekamer en plaats hem op het verwarmingskussen bij het stereotactische frame. Houd de kerntemperatuur op 37 ± 1,0 °C met behulp van een glasvezel-rectale sonde.
5. Zet de muis vast in het stereotactische frame met oorbeen.
6. Sluit de huidincisie met onderbroken hechtingen en zelfabsorberende filamenten (bijv. Polyglactine 910, 6-0).
7. Breng de muis naar een verwarmingsbox en monitor tot het volledig bij bewustzijn is hersteld.
8. Breng het dier terug naar zijn thuiskooi.

7. Paradigma van herhaalde impact

1. Wijs muizen toe aan sham-, enkel- of herhaalde CBI-groepen volgens het experimentele ontwerp.
2. Voor groepen met herhaald letsel plant je volgende CBI-sessies op bepaalde intervallen (bijvoorbeeld elke 48 uur).
3. Voor elke volgende CBI dient preoperatieve analgesie toe via tramadol in drinkwater zoals beschreven in sectie 3.1.
4. Herhaal anesthesie, stereotactische markering en impact volgens dezelfde procedure als beschreven in secties 3–6, inclusief lokale verdoving met bupivacaïne (0,1 mg/kg, s.c.), medetomidine-toediening (0,5 mg/kg, s.c.) met behoud van isoflurane op < 0,5%, stereotactische targeting bij AP 0,5 en ML −2,5 ten opzichte van Bregma, en het toedienen van een roterende schokkende impact met een elektromagnetische impactor (indentatiediepte 3 mm, snelheid 5 mm/s, pulsduur 0,1 ms, 10° hoek ten opzichte van het schedeloppervlak).
5. Zorg voor consistente positionering (buikligging op een polyethyleenschuim hoofdhouder die rotatiebeweging mogelijk maakt), identieke impactparameters (hoek, diepte, snelheid en duur) en gestandaardiseerde peri- en postprocedurele condities, waaronder medetomidine-antagonisatie met atipamazol (0,5 mg/kg, s.c.), herinductie van anesthesie (4% isofluraan in O₂ 30%/N₂O 70%), en temperatuurregeling bij 37 ± 1,0 °C, over herhaalde sessies om reproduceerbaarheid te behouden over dieren en tijdstippen.
6. Zorg voor consistente positionering, impactparameters en herstelcondities over herhaalde sessies om reproduceerbaarheid te behouden over dieren en tijdstippen.
7. Houd dieren continu in de gaten op cumulatieve gedragsproblemen na herhaalde impact.

8. Kinematische analyse

1. Exporteer de video's in standaardformaat (bijv. MP4) voor analyse en laad ze in de Kinovea-software.
2. Navigeer naar het relevante tijdsvenster met voor- en post-impactframes (bijv. -0,025 tot 0,3 s vanaf impact). Zorg ervoor dat je een adequate framerate instelt (bijvoorbeeld 240 fps) in de software-instellingen. Definieer een schaalreferentie (bijvoorbeeld afstand tussen de ogen).
3. Gebruik de trackingtool van Kinovea om een driepuntstrackingopstelling op te zetten (bijvoorbeeld rechteroog, linkeroog, neus; Figuur 3A). Begin met het volgen van elk punt en corrigeer handmatig trackingfouten, vooral tijdens snelle beweging of occlusie.
4. Exporteer getraceerde coördinaten als CSV- of Excel-bestanden.
   OPMERKING: Verdere kinematische analyse werd uitgevoerd met een aangepast MATLAB-script. Tijdsopgeloste trackinggegevens geëxporteerd vanuit Kinovea werden geïmporteerd en vooraf verwerkt om ongeldige vermeldingen te verwijderen en consistente tijdschaling te waarborgen. Hoofdtranslatie werd gedefinieerd als het zwaartepunt van de drie gevolgde herkenningspunten (rechteroog, linkeroog en neus), waaruit lineaire verplaatsing, snelheid en versnelling werden afgeleid met numerieke differentiatie. De koprotatie werd geschat op basis van de oriëntatie van de oog-neusas, waarbij de hoekverplaatsing werd berekend ten opzichte van een pre-impact basislijn en de hoeksnelheid als eerste afgeleide werd verkregen. Om ruisversterking te verminderen, werden alle positie- en hoeksignalen gladgestoomd met een Savitzky–Golay-filter voorafgaand aan de differentiatie. De primaire uitkomstparameter was de maximale hoekverplaatsing, terwijl snelheids- en versnellingsprofielen werden geanalyseerd als relatieve metingen van de dynamiek van de hoofdbeweging tussen de proeven.

Resultaten

Algemene overwegingen:

De toepassing van dit protocol induceert herhaalbaar hersenschudding, zoals aangetoond door een gedefinieerde set structurele, gedragsmatige en neurovasculaire validatiemetingen (zie Figuur 2). De structurele integriteit bleef behouden na het letsel. Er werd geen duidelijke macroscopische weefselverstoring of bloeding vastgesteld, wat erop wijst dat het protocol een hersenschudding veroorza...

Discussie

Een nieuw muismodel van gesloten-kop CBI, gebaseerd op acceleratie-vertragingsletsel, wordt gekarakteriseerd, met een milde maar wijdverspreide inkorting van de BBB en een duidelijk neuropsychiatrisch fenotype dat doet denken aan een klinische hersenschudding. Door belangrijke kenmerken van CBI op een gecontroleerde en consistente manier te reproduceren, terwijl structurele integriteit behouden blijft, biedt het model een nuttig en goed gekarakteriseerd experimenteel kader voor het bestu...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Medicatie
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	Medetomidine antagonist (α2-adrenoceptor antagonist), subcutaan (0,5 mg/kg)
Bepanthen Ophthalmic Zalf	Bayer	11809917	Oogbescherming tijdens anesthesie, topisch
Bupivacaine	Sigma-Aldrich	B1160000	Lokaal verdovingsmiddel, subcutaan (0,1 mg/kg)
Isofluraan	CP pharma	1214CN	Anesthesie, inhalatie (inductie en onderhoud)
Medetomidine	Vetoquinol	VM 06043/4003	Sedativum/anestheticum adjuvans (α2-adrenoceptor agonist), subcutaan (0,5 mg/kg)
Tramadolhydrochloride (100 mg/mL)	Grünenthal	6867645	Pijnstiller toegediend via drinkwater, 1 mg/mL eindconcentratie voor muizen, van 2 dagen voor- tot 3 dagen na de operatie
Uitrusting
Polyethyleen nekkussen	Op maat		Ondersteuning voor rugligging tijdens impact
Stereotaxische Impactor Silupran Cover	Op maat		Verdeelt mechanische belasting, voorkomt focale schedelschade, bevestigd aan impactorpunt, 830 kPa
Stereotaxische Impactor	Leica Biosystems	39463923/IM10131	Elektromagnetisch impactapparaat voor gecontroleerde impactlevering
Hulpmiddelen
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(versie 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	NA