Een geïntegreerde methode voor fototrombotische beroertemodellering en in vivo optroderegistratie van neuronale en astrocytische activiteit bij zich gedragende muizen

Samenvatting

Dit protocol biedt een geïntegreerde methode die virale aflevering, implantatie van optroden, fototrombotische inductie, gelijktijdige registratie van astrocyten- en neuronale activiteit, en optogenetische stimulatie van astrocyten omvat. Deze geïntegreerde methode heeft als doel gelijktijdig onderzoek te bieden naar de relatie tussen astrocyten en neuronen over de acute tot chronische stadia van ischemische beroerte.

Samenvatting

Het onderzoeken van de dynamiek tussen astrocyten en neuronen na ischemische beroerte is essentieel om herstelmechanismen na een beroerte te begrijpen. Huidige methodologieën slagen er echter vaak niet in om realtime interacties tussen neuronen en astrocyten bij dieren die specifieke gedragstaken uitvoeren vast te leggen, waardoor we in staat zijn om de acute fase van de beroertepathologie te onderzoeken worden beperkt. Dit protocol biedt een geïntegreerde methode die fototrombotische beroertemodellering combineert met gelijktijdige multikanaals elektrofysiologie-opname en vezelfotometrie in wakkere, zich gedragende muizen met behulp van een op maat gemaakte optrode. Het protocol omvat focale ischemie-inductie via fototrombose, gevolgd door gelijktijdige opname van neuronale pieken en astrocytische calciumtransiënten. De optrode maakt gelijktijdige toediening van fototrombose, calciumsignaalopname en optogenetische manipulatie mogelijk zonder aparte chirurgische ingrepen. Representatieve resultaten bevestigen het succes in gelijktijdige registratie van astrocytisch calciumsignaal en neuronale pieken. Optogenetische manipulatie van astrocyten veroorzaakt meetbare veranderingen in neuronale vuurpatronen (vermindering van de vuurfrequentie van piramideneuronen met 1,55 ± 0,45 Hz en interneuron met 3,64 ± 1,37 Hz vergeleken met pre-optogenetische stimulatie, n = 2), wat bevestigt dat het systeem in staat is astrocyt-neuroninteracties te onderzoeken. Deze geïntegreerde aanpak pakt kritieke hiaten in de beroerteonderzoeksmethodologie aan door realtime, multimodale opnames te leveren van het acute tot het chronische stadium van de beroerte bij gedragende dieren.

Inleiding

Ischemische beroerte blijft een primaire wereldwijde gezondheidsuitdaging en vormt wereldwijd een belangrijke oorzaak van zowel sterfte als langdurige verworven invaliditeit ^1,2,3. Het hoge invaliditeitspercentage dat gepaard gaat met ischemische beroerte is geassocieerd met een breed scala aan klinische symptomen, variërend van motorische verlamming en sensorisch verlies tot cognitieve stoornis ^4,5,6. Er is een dringende behoefte om een dieper begrip te krijgen van de pathologische en herstelmechanismen van ischemische beroerte tijdens de herstelfase. Naast neuronale falen^{is het} catastrofale falen van astrocyten recent benadrukt ^7,8. Astrocyten, de meest voorkomende gliacellen, zijn een essentieel onderdeel van het centrale zenuwstelsel en de tripartiete synaps. In elke fase van de ischemische cascade spelen astrocyten een onmisbare rol en beïnvloeden ze het neuronale en functionele herstel^{diepgaand 9,10,11}. In de gezonde hersenen zijn astrocyten en neuronen functioneel gekoppeld via de tripartiete synaps, waar astrocytische processen pre- en postsynaptische terminalen bedekken en actief deelnemen aan synaptische transmissie ^7,8. Astrocyten reguleren de extracellulaire glutamaatconcentraties via exciterende aminozuurtransporters, behouden de kaliumhomeostase via Kir4.1-kanalen en moduleren synaptische sterkte via gliotransmitterafgifte via calciumafhankelijke exocytose ^7,8. In deze context vertegenwoordigen astrocytische intracellulaire calciumtransiënten astrocytische activiteit en zijn ze nauw verbonden met neuronale vuurkracht⁷. Tijdens een ischemische beroerte wordt deze fijn afgestelde relatie snel verstoord. De ineenstorting van ionische gradiënten na energiefalen veroorzaakt een massale glutamaatafgifte en verspreidende depolarisatie, wat leidt tot excitotoxice neuronale schade en proliferatie van reactieve astrocyten¹². Astrocyten in en rond de infarctkern ondergaan een keten van pathologische veranderingen, waaronder calciumoverbelasting, verstoring van de glutamaatopname, verlies van synapskoppeling en falen van gliotransmitterafgifte¹³. Tegelijkertijd wordt de neuronale spikingactiviteit sterk onderdrukt doordat neuronen levensvatbaarheid verliezen en membraanpotentiaal^{integriteit 14,15}. In de peri-infarctzone nemen overlevende neuronen en reactieve astrocyten deel aan dynamische interacties die als cruciaal worden beschouwd voor het bepalen van het herstel na een beroerte; Echter, de realtime elektrofysiologische en calciumcorrelaten van deze interactie in wakkere, zich gedragende dieren blijven slecht gekarakteriseerd^13,16. Daarom wordt het begrijpen van astrocytische activiteit naast neuronale signalen beschouwd als een hoeksteen voor neurale functionele herstel na ischemische schade.

Fototrombose is een veelgebruikt ischemisch model; Het maakt gebruik van lichtgevoelige kleurstof en gelokaliseerd licht om ischemische laesies op specifieke doelgebieden te induceren¹⁷. Huidige beroertemodellering en -registratieprotocollen belemmeren het onderzoek naar de interactie tussen astrocyten en neuron na een beroerte door drie belangrijke technische knelpunten: 17,18,19. Segregatie van modellering en opname is een veelvoorkomend nadeel van de meeste huidige protocollen, wat een tijdsverschil veroorzaakt tussen het opzetten van het model en realtime signaalopname^20,21. Echter, minuten tot uren na een ischemische beroerte zijn een essentiële periode waarin zowel neuronen als astrocyten een drastische fluctuatie^{ondergaan 12,22}. Zonder gelijktijdige monitoring van astrocyt-neuroninteractie direct na het ischemische incident, zal het onderzoek naar effectieve vroege interventie bij ischemische beroerte sterk worden belemmerd. Een verdere beperking van de huidige protocollen ligt in de isolatie van opnamemodaliteiten; De meeste huidige methodologieën zijn geoptimaliseerd voor één type signaal. Zo biedt multikanaals elektrofysiologie detectie van neuronale vuurkracht en lokale veldpotentialen (LFP's), maar is blind voor signaaltoestanden van gliacellen^15,16. Omgekeerd wordt het monitoren van astrocytische dynamiek via in vivo. Calciumbeeldvorming legt astrocytische fluctuaties vast, maar mist gegevens over neuronale vuurkracht. De laatste bottleneck van de huidige protocollen lijkt de opnamestatus van het dier te zijn; In de meeste protocollen is het dier verdoofd of vrij bewegend. Motorische disfunctie wordt echter beschouwd als een van de meest lastige gevolgen van een beroerte; Het begrijpen van de relatie tussen bepaald gedrag en de gebeurtenissen tussen astrocyten en neuronen is essentieel. Daarom is er een dringende behoefte aan een geïntegreerde methode die in staat is een fototrombotisch beroertemodel uit te voeren, terwijl tegelijkertijd zowel astrocyten- als neuronale signalen worden vastgelegd bij wakkere muizen die bepaalde gedragstests uitvoeren. Bestaande methodologieën behandelen elk slechts een subset van deze eisen. Twee-foton calciumbeeldvorming biedt een uitzonderlijke ruimtelijke resolutie van de astrocytische microdomeindynamiek in de intacte hersenen, maar vereist dat dieren hoofdgefixeerd of verdoofd zijn, waardoor naturalistische gedragsbeoordeling wordt uitgesloten, en kan niet tegelijkertijd multikanaals neuronale spikegegevens¹³ vastleggen. Zelfstandige vezelfotometrie maakt astrocytische calciummonitoring mogelijk bij vrij handelende dieren, maar blijft blind voor neuronale vuurpatronen en biedt geen elektrofysiologische uitdata van circuitfunctie¹⁶. Multikanaals extracellulaire elektrofysiologie lost de piekactiviteit van neuron-eenheden en lokale veldpotentialen op met een hoge temporele resolutie, maar levert geen informatie over de signaaltoestand van astrocyten¹⁵. Geen van deze benaderingen kan echter tegelijkertijd een nauwkeurig gelokaliseerde fototrombotische beroerte induceren en multimodale opname uitvoeren vanaf dezelfde anatomische locatie zonder onderbreking.

Om de bestaande technische beperkingen aan te pakken, stellen wij dit geïntegreerde systeem voor. Dit systeem pakt alle drie de beperkingen aan binnen één chronisch geïmplanteerd apparaat, waardoor gelijktijdige inductie van fototrombose, astrocytische calciumregistratie via vezelfotometrie en multikanaals neuronale elektrofysiologie bij wakkere, vrij functionerende muizen mogelijk is—vanaf het moment van het begin van de beroerte tot aan de chronische fasen van de beroerte. De haalbaarheid van deze methode wordt gevalideerd door chronische implantatie van een op maat gemaakte optrode in de hersenen van muizen, die een astrocyt-specifieke calciumindicator en een optogenetische virale vector uitdrukt. Met deze methode worden astrocytische calciumtransiënten en neuronale vuuractiviteiten gelijktijdig geregistreerd en geanalyseerd tijdens gedragstaken en onder optogenetische modulaties.

Protocol

Dit protocol kreeg goedkeuring van de Commissie Dierverzorging en Gebruik van de Guangzhou Universiteit voor Chinese Geneeskunde (00379474) en werd uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften van de National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Alle mogelijke maatregelen werden genomen om het aantal gebruikte dieren in deze studie te minimaliseren.

1. Virale vectorlevering

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de stereotaxische injectie van astrocytenspecifieke AAV-vectoren in de motorische cortex (M1FL). Het doel is om een stabiele, astrocyt-specifieke expressie te bereiken van zowel de calciumindicator van GCaMP6 als van het opto-vTRAP optogenetische construct vóór implantatie van de optrode. Belangrijkste benodigde apparatuur: stereotaxisch frame, digitaal verniersysteem, glazen micropipet en micro-infusiepomp.

1. Plaats de muis in de inductiekamer; Begin met de inductie van anesthesie met 3%–4% isofluraan en de concentratie isofluraan kan in de eerste minuut worden verhoogd tot maximaal 5% totdat de muis niet meer reageert.
   VOORZICHTIG: Isofluraan is een vluchtig anestheticum. Voer alle procedures uit onder actieve beademing. Vermijd langdurige persoonlijke blootstelling.
2. Breng de muis over naar het stereotaxische frame dat is uitgerust met een anesthesiemasker en gebruik 1–2% isoflurane om een diep anesthesievlak te behouden.
3. Controleer elke 10 minuten de diepte van de anesthesie via het ademhalingsritme, de palpebrale reflex en de teenknijpen. Houd de lichaamstemperatuur van de muis op 36–37,5 °C met een door feedback gecontroleerde verwarmde mat.
4. Breng oogzalf aan op de ogen om hoornvliesschade tijdens de operatie te voorkomen.
5. Bevestig de muis aan een stereotacisch frame met oorbeentjes en een mondbeugel. Stel de oorbeukjes af om ervoor te zorgen dat de muiskop symmetrisch vastzit. Zorg ervoor dat het hoofd met voorzichtige sondering wordt geïmmobiliseerd.
6. Verwijder haar grondig met onthaaringscrème en maak een middenlijninsnijding met een chirurgische schaar om de schedel bloot te leggen. Maak het periosteum schoon met zoutoplossing en wattenstaafjes om Bregma en lambda bloot te leggen.
7. Laat de glazen micropipet zakken om Bregma en Lambda achtereenvolgens aan te raken; let op de Z-coördinaat op de digitale vernier. Stel de mondbeugel af om het verschil <0,04 mm te garanderen.
8. Laat de glazen micropipet zakken zodat deze Bregma raakt en zet de digitale vernier terug op nul. Beweeg de micropipet achtereenvolgens 2,3 mm naar links en rechts van Bregma; let op de Z-coördinaat op de digitale vernier. Stel de oorbeulen af om te zorgen dat de bilaterale verschillen <0,04 mm bedragen.
9. Zet de digitale vernier op nul bij Bregma en markeer de motorcortex (M1FL; AP: +1,5 mm, ML: +0,74 mm). Gebruik een microboor met 0,5 mm boorpunten (ronde punt) om een klein gat van ongeveer 0,5 mm diameter te boren op de gemarkeerde plek. Oefen voorzichtig om bloedingen en schade aan hersenweefsel te voorkomen; Leg ijskoude zoutoplossing om de warmte die tijdens het boorproces wordt opgewekt te compenseren.
10. Laat de glazen micropipet, verbonden met een micro-infusiepomp, naar de doellocatie (DV: -0,94 mm vanaf het hersenoppervlak). Voor het laden mengt u AAV9-GfaABC1D-GCaMP6s en AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP in gelijke hoeveelheden om een virale mix te bereiden. Infuseer 400 nL van het mengsel (200 nL van elke vector) met een snelheid van 50 nL/min.
    OPMERKING: De virale cocktail bevat: 200 nL van de astrocyt-specifieke calciumindicator (AAV-GfaABC1D-GCaMP6's, 1,0 × 10¹³ vg/mL) en 200 nL van de astrocyt-specifieke optogenetische virale vector (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 × 10¹³vg/mL). Succesvolle astrocyten-specifieke transductie werd bevestigd in een subset dieren door immunofluorescentiekleuring voor GFAP, waarmee co-lokalisatie van de fluorescerende reporter met GFAP-positieve cellen en de afwezigheid van expressie in GFAP-negatieve cellen werd bevestigd.
    VOORZICHTIG: AAV-vectoren zijn recombinante biologische agentia; Behandel alle virale vectoren en afval volgens de bioveiligheidsrichtlijnen van de instelling.
11. Laat de pipet 10 minuten zitten nadat de infusie is voltooid om een betere virale verspreiding te garanderen en terugstroming te voorkomen. Trek de pipet langzaam terug, hecht de hoofdhuid (4-0, 20 mm, 3/8 cirkel) en plaats de muis op een warmtekussen totdat hij volledig hersteld is.
    OPMERKING: Een periode van 3–4 weken is vereist voor optimale virale expressie. De gedetailleerde tijdlijn van het protocol is geïllustreerd in Figuur 1A.

2. Optrode-inspectie en functionele verificatie

OPMERKING: Voor implantatie moet de op maat gemaakte optrode fysiek worden geïnspecteerd en optisch getest om te bevestigen dat hij licht kan afleveren in alle drie de functionele modi (fototrombose, optogenetische stimulatie en vezelfotometrie). Belangrijkste benodigde apparatuur: microscoop, optische vermogensmeter en laserbronnen op 532 nm, 488 nm, 470 nm en 405 nm.

1. Fysieke inspectie van de optrode:
   1. Plaats de gefabriceerde optrode onder een microscoop om de indeling van de opnameplaatsen te inspecteren.
   2. Zorg ervoor dat de 16 wolfraam-microdraden gelijkmatig zijn gebundeld en de centrale optische vezel omsluiten. Controleer op verbogen of kruisende draden die kortsluitingen kunnen veroorzaken.
   3. Controleer of de punt van de optische vezel korter is dan de wolfraammicrodraden (Figuur 1B).
      OPMERKING: De optische vezeltip moet 100-200 μm van de elektrodetips²³ worden teruggezonken. Deze verplaatsing, overgenomen uit Lee et ^al.22, zorgt ervoor dat de lichtkegel het opnamegebied voldoende bedekt en tegelijkertijd overmatige foto-elektrische ruis voorkomt. Onderzoekers worden aangemoedigd empirisch de juiste offset onder hun eigen optrode te verifiëren.
2. Verbind de glasvezel met de lasermodeleringsbron en opnamebron. Gebruik een optische vermogensmeter om de uitgang aan de vezeltip te meten voor de volgende drie functionele modi (Figuur 1B):
   1. Fototrombotische modelleringsmodus: Controleer of het systeem hoogintensiteit continue-golf (CW) licht (532 nm) kan leveren.
      OPMERKING: Vezel met NA 0,22 wordt in dit experiment gebruikt. De geschatte verlichte spotdiameter op 100–200 μm onder de vezeltip is ongeveer 200–400 μm. Zorg ervoor dat het vermogen aan de punt >20 mW bereikt om een succesvolle activering en trombusvorming van Rose Bengal te garanderen.
   2. Optogenetische manipulatiemodus: Test de gepulseerde laseruitgang (bijv. 488 nm voor opto-vTrap).
      OPMERKING: Kalibreer het vermogen aan de punt op 10 mW; dit is geoptimaliseerd voor opto-vTRAP-activatie op een opnamediepte van 0,94 mm in de motorcortex. Voor andere hersengebieden wordt gedrags- of elektrofysiologische verificatie aanbevolen.
   3. Vezelfotometrie (calciumopname) modus: Test het laagvermogen-excitatielicht (bijv. 470 nm en 405 nm).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de output stabiel is en op een zeer laag niveau (<50 μW) wordt gehouden om fototoxiciteit en fotobleaching van de calciumindicator (bijv. GCaMP6's) tijdens langdurige opname te minimaliseren.

3. Chronische implantatie van de optrode

OPMERKING: Deze sectie behandelt de chirurgische procedure voor het chronisch implanteren van de optrode op de plaats van de virale injectie. Precieze locatie van de injectiecoördinaten is cruciaal om te garanderen dat de opname-elektroden en optische vezel het gebied van GCaMP6's en opto-vTRAP-expressie bemonsteren. Belangrijkste benodigde apparatuur: stereotaxisch frame, microboor, tang, cranioplastiekschroeven, agarosegel en tandcement.

1. Voor anesthesie, stereotaxische fixatie, schedelvoorbereiding en balans volgt u dezelfde procedure als beschreven in sectie 1, behalve dat tijdens de incisie op de hoofdhuid 1,5 cm × 1,5 cm van de hoofdhuid worden verwijderd, terwijl er voldoende huid rond de ogen overblijft.
2. Maak de schedel schoon met waterstofperoxide en 0,9% zoutoplossing. Identificeer Bregma en zet de digitale vernier terug op nul.
3. Gebruik de boor (0,8 mm, ronde punt) om het oppervlak van de schedel licht te ruw te maken voor een betere hechting van tandcement.
4. Markeer de motorcortex met een marker (M1FL; AP: 1,5 mm, ML: 0,74 mm), en gebruik het vervolgens als middelpunt om een 5 mm × 5 mm vierkant te tekenen (Figuur 1C).
   1. Gebruik een microboor op een geschikte snelheid (ongeveer 10.000 rpm) en volg het vierkant. Laat tijdens het boren voortdurend ijskoude zoutoplossing op het boorpad vallen om de hitte van het hogesnelheidsboren te compenseren en hersenweefselschade te voorkomen. Stop onmiddellijk als de botflap loskomt (Figuur 1C).
5. Boor drie kleine gaatjes (0,5 mm diameter) over de contralaterale hersenhelft en het cerebellum, en implanteer cranioplastiekschroeven in de gaten. Zorg ervoor dat elke schroef de dura mater bereikt, maar voorkom verdere penetratie en extra schade aan het hersenweefsel (Figuur 1C).
6. Gebruik een pincet om de botflap te verwijderen die eerder losgeraakt was. Vermijd extra neerwaartse kracht tijdens het verwijderen om schade aan hersenweefsel te voorkomen en de dura mater intact te houden.
   OPMERKING: Als er bloeding optreedt, kan een hemostatische spons worden gebruikt om het bloeden snel te stoppen.
7. Gebruik een tang met een ultrafijne tip (<0,03 mm × 0,01 mm) om de dura mater bij het schedelvenster te verwijderen. Voorkom dat de pincettpunt tijdens dit proces direct in hersenweefsel drukt.
   OPMERKING: Nadat het bot is verwijderd, is het erg belangrijk om het hersenweefsel vochtig te houden. Het wordt aanbevolen om steriele, met zoutoplossing doordrenkte wattenbolletjes te gebruiken om het raam af te dekken wanneer er geen procedure plaatsvindt, om zwelling en neuronale schade door droogte te voorkomen.
8. Bevestig de optrode aan de micromanipulatorarm van het stereotaxische frame en plaats hem boven het schedelraam. Verstrengel de zilveren massa en referentiedraden van de optrode stevig met de drie cranioplastiekschroeven (Figuur 1C).
9. Maak het schedelraamoppervlak schoon met steriele zoutoplossing om te voorkomen dat er bloedingen of bloedstolsels zijn die het plaatsen van de elektrode zouden belemmeren. Laat de optrode langzaam zakken tot de gewenste diepte (DV: -0,94 mm) met een snelheid van 1 μm/s.
   OPMERKING: Het blootgestelde corticale weefsel moet tijdens de implantatie worden bevochtigd met steriele zoutoplossing.
10. Breng na de implantatie een laag agarose aan over het schedelvenster om het corticale weefsel te beschermen tegen tandcement.
11. Breng 3–4 lagen tandcement aan om de blootgestelde schedel te bedekken, zodat de hele optrode verankerd is. Verwijder de muis uit het stereotaxische frame zodra het tandcement stijf is (Figuur 1C).
12. Geef pijn gedurende 3–5 dagen en laat de muis 1–2 weken herstellen voordat hij wordt opgenomen en gemodelleerd.

4. Fototrombotische modellering en gelijktijdige opname

OPMERKING: Deze sectie beschrijft gedragshabituatie, baseline-opname, beroerte-inductie door fototrombose en longitudinale opnameprocedures na een beroerte. De fototrombose wordt toegediend via de geïmplanteerde optrode terwijl gelijktijdige elektrofysiologie en vezelfotometrie worden vastgehouden. Belangrijkste benodigde apparatuur: rotarod-apparaat, gripsterktemeter, vezelfotometriesysteem, multikanaals neurale opnamesysteem, Rose Bengal kleurstof en laserbron op 530 nm.

1. Laat de muis gedragstraining ondergaan voordat je gaat modelleren.
   OPMERKING: Alle dieren werden gehuisvest en getest onder gestandaardiseerde laboratoriumomstandigheden. Woonomstandigheden: kamertemperatuur 20–25 °C, relatieve luchtvochtigheid 50%–60%, bij een 12 uur licht/donker cyclus (licht aan om 07:00). Dieren hadden gedurende het hele onderzoek vrije toegang tot voedsel en water. Alle tests en chirurgische ingrepen werden uitgevoerd tijdens de lichtfase. Tijdens de lichtfase werden gedragsregistratiesessies op een vast tijdstip per dag uitgevoerd om circadiane variatie in neuronale activiteit en astrocytische calciumdynamiek te minimaliseren. De opnamebehuizing werd ook gehandhaafd op een omgevingstemperatuur van 20–25 °C.
   1. Voor de rotarod-test laat je de muis continu 5 minuten op de roterende staaf lopen gedurende 3 opeenvolgende proeven, waarbij de rotarod in 5 minuten accelereert van 4 naar 40 toeren per minuut.
   2. Voor de grip strength-test laat de muis leren de teststang met zijn voorpoten te trekken en drie opeenvolgende proeven te voltooien waarbij de resultaten minder dan 10% fluctueren.
2. Stel de parameters voor de data-opname in voor vezelfotometrie.
   1. Gebruik een vezelfotometriesysteem met dubbele of drievoudige golflengte om de calciumindicator te exciteren (bijvoorbeeld GCaMP6's). Voor GCaMP6's stel je het signaalkanaal in op 470 nm en het controlekanaal op 405 nm om bewegingsartefacten en autofluorescentie te corrigeren.
      OPMERKING: Het is zeer belangrijk om het opnamevermogen van de laser opnieuw te testen om te garanderen dat de output aan de vezeltip tussen 20–40 μW ligt om fotobleaching en fototoxiciteit te voorkomen.
   2. Stel de bemonsteringssnelheid van de data-acquisitie in op 60–100 Hz, wat voldoende is om astrocytische calciumtransiënten vast te leggen.
3. Stel de parameters voor data-acquisitie in voor multikanaals elektrofysiologie.
   1. Zorg ervoor dat alle componenten in het opnamesysteem (inclusief het apparaat voor de gripsterktetest en de kooi) goed geaard zijn om ruis te verminderen. Gebruik tijdens het opnemen een gemeenschappelijke mediaanreferentie (CMR) om globale artefacten te elimineren.
      OPMERKING: Het is erg belangrijk om het signaalspectrogrambeeld in het opnamesysteem te controleren om te verzekeren dat er geen storing op de hoogspanningslijn is en dat ruis veroorzaakt door bewegingsartefacten wordt geminimaliseerd. Grote bewegingsartefacten kunnen wijzen op falen van de schroeven en de fixatie van de aarddraad tijdens de implantatie.
   2. Zorg ervoor dat breedband- en LFP-signalen in de opnamesoftware zijn geselecteerd en houd tijdens de opnamesessie in de gaten op eventuele ruis die optreedt.
4. Maak basisopnames.
   1. Kort verdoofd met isoflurane (binnen 60 seconden); Verbind de optrode met de opnamelijn via een adapter.
   2. Plaats de muis in een omgeving als een thuiskooi voor opnames, en laat de 10 minuten acclimatiseren na het ontwaken.
   3. Tegelijkertijd met de gripsterktetest moet de muis elke minuut de testbalk één keer per minuut trekken gedurende 5 minuten.
   4. Zorg ervoor dat gedragstests nauwkeurig zijn getimestamped in zowel multikanaal- als vezelfotometriesystemen om data-uitlijning mogelijk te maken (Figuur 1D).
5. Stel een fototrombotisch model op.
   1. Dien een 1,5% Rose Bengal kleurstofoplossing intraperitoneaal toe (i.p.) in een dosis van 10–20 mg/kg, wacht 5 minuten tot de kleurstof door de corticale bloedvaten circuleert.
      VOORZICHTIG: Rose Bengal is een fotosensibiliserende kleurstof. Bescherm het reagens tegen fel omgevingslicht. Draag handschoenen en oogbescherming bij het hanteren.
   2. Verdoof de muis met isofluraan volgens dezelfde inductie- en onderhoudsparameters als eerder beschreven.
   3. Wanneer de muis zich op een diep anesthesievlak bevindt en wordt onderhouden met een anesthesiemasker, verbind je de optische sonde van de optrode met de laserbron.
   4. Induceer focale ischemie door een 530 nm laserstraal van 15 mW door de geïmplanteerde optrode gedurende 5–8 minuten af te leveren.
      VOORZICHTIG: De 530 nm laser bij 15 mW is gevaarlijk. Alle onderzoekers moeten laserveiligheidsoogbescherming dragen. Kijk nooit direct in de vezeltip tijdens fototrombose.
6. Maak opnames na de beroerte.
   1. Leg de muis op een verwarmde matje voor herstel. Zodra de muis volledig wakker is (normaal gesproken binnen 10 minuten), start je de eerste acute opname na een beroerte.
   2. Herhaal elke dag de opname voor nauwkeurige monitoring van de ziekteprogressie.
7. Optogenetische manipulatie uitvoeren.
   1. Naast het opnemen van calciumsignalen en de emissie van de laserstraal voor ischemische inductie, is de optrode ook in staat optogenetische stimulatie te leveren, zoals te zien is in representatieve resultaten (Figuur 4).
   2. Verbind de optrode met een optogenetische laserstimulator met de juiste lasergolflengte en -vermogen (in dit geval is het 488 nm, 10 mW, 5 min voor opto-vTrap), en zet de stimulator in om optogenetische manipulatie uit te voeren.

5. Multimodale data-analysepijplijn

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de analyseworkflow voor het verwerken van de multikanaals elektrofysiologiegegevens (spike sorting), astrocytische calciumsignalen (ΔF/F-berekening) en de cross-modale uitlijning van de twee datastromen. Software vereist: Plexon Offline Sorter (offline spike sorteersoftware), NeuroExplorer (neurale data-analysesoftware) en RWD OFRs (vezelfotometrie) analysesoftware.

1. Neuronale spike-sortering (Plexon-systeem):
   1. Importeer de ruwe .pl2-bestanden in de offline spike sorting-software. Pas een digitaal hoogdoorlaatfilter toe (<300 Hz) om hoogfrequente piekactiviteit te isoleren.
   2. Stel een spanningsdrempel in (meestal -5 standaardafwijkingen van de ruis) om potentiële pieken te detecteren.
   3. Na handmatige screening en ongeldigverklaring van ruisgolfvormen, gebruik je de scanfunctie in de offline spike sorting-software om principal component analysis (PCA) uit te voeren, golfvormen te groeperen en te scannen op verschillende neuronclusters²⁴.
   4. Inspecteer de histogrammen van het inter-spike interval (ISI). Zorg ervoor dat elke "Single Unit" een ISI-overtredingspercentage van <1% heeft (wat de refractaire periode weerspiegelt). Het ISI-overtredingspercentage wordt linksboven weergegeven op elke eenheid in de offline spike sorteersoftware.
   5. Exporteer de gesorteerde tijdstempels naar de neurale data-analysesoftware. Gebruik de snelheidshistogram en peri-event histogrammen versus tijd functie in de neurale data-analysesoftware om snelheidshistogrammen en peristimulus tijdhistogrammen (PSTH) te genereren.
   6. Geef de gemiddelde golfvormlengte en gemiddelde vuursnelheid van elke eenheid uit het statistische gedeelte in neurale data-analysesoftware voor verdere analyse.
2. Astrocytische calciumsignaalverwerking (vezelfotometrie-analysesoftware)
   1. Open de ruwe fluorescentiegegevens (470 nm kanaal voor signaal en 410 nm kanaal voor bewegingsbesturing) in de analysesoftware.
   2. In het pre-processing gedeelte van het vezelfotometriesysteem voert u 410 nm uit als regeling voor bewegingscorrectie, zet de gladmakingscoëfficiënt op 8 en kiest u PLS Fit als basiscorrectie.
   3. Bereken de verandering in fluorescentie (ΔF/F) met behulp van de formule²⁵:
      
   4. Voer astrocytencalciumsignaalanalyse uit op basis van gebeurtenistijdstempels, extraheer peri-event data voor visualisatie (bijv. heatmaps en gemiddelde sporen) en bereken het gebied onder de curve (AUC).
3. Gesynchroniseerde astrocyt-neuron correlatie
   1. Lijn neuronale pieken en astrocytencalciumsignalen uit met behulp van de gedeelde gedragsgebeurtenis als tijd nul.
   2. Na het extraheren van peri-event gegevens, lijn je de twee datastromen uit op deze gedeelde tijdnul en visualiseer je de astrocyt-neuron correlatie (Figuur 3).

Resultaten

Experimentele tijdlijn

Figuur 1 vat de experimentele tijdlijn en belangrijke chirurgische mijlpalen samen. Een interval van drie weken tussen virale injectie en implantatie van de optrode is cruciaal voor het bereiken van een adequate expressie van GCaMP6s, en robuuste astrocytische calciumsignalen moeten worden bevestigd door vezelfotometriesporen te onderzoeken tijdens de basisopnameperiode vóór de inductie van ...

Discussie

Het hier beschreven geïntegreerde protocol vormt een belangrijke vooruitgang in de studie van astrocyt-neuroninteracties tijdens de progressie van ischemische beroerte. Door fototrombotische inductie te combineren met realtime opto-elektrofysiologische monitoring en optogenetische manipulatie, overbrugt deze methodologie effectief de kloof tussen het begin van een beroerte en de waarneming van circuit-niveau reorganisatie van neuronen en astrocyten. Recent werk van Boyce et al. toonde de...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep diameter 0,005 mm ´ 0,025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Customized	Kedou	Aangepast met 16 tungsteneedsels rond 1 optische vezel
Prism	GraphPad	5.01 versie
R studio	Posit	versie 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Astrocyte-specifiek calcium indicator
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Astrocyte-specifiek optogenetisch viraal vector
Rose Bengal Dye	Sigma-Aldrich	198250	Fotogevoelige kleurstof voor trombusinductie/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Anesthesieapparaat voor controleerbare inhalatieanesthesie voor muizen