Hier presenteren we een protocol voor intravitale beeldvorming van een verzwakte, door BSL-2 goedgekeurde Mycobacterium tuberculosis. Spanning in de muislong met behulp van een permanent longvenster. Deze benadering maakt longitudinale, enkelcelresolutie-analyse mogelijk van vroege interacties tussen gastheer en pathogeen, waaronder bacillaire lokalisatie, vasculaire dynamiek en opname van macrofagen binnen dezelfde longmicroomgeving.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intravitale beeldvorming van verzwakte auxotrofe mycobacterium tuberculosis in muislong tijdens vroege intravasculaire infectie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Intravitale microscopie maakt directe visualisatie mogelijk van dynamische cellulaire processen binnen intacte weefsels. De toepassing ervan op Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is echter beperkt door de containmentsvereisten van Biosafety Level 3 (BSL-3) en de technische uitdagingen bij het stabiliseren van de long voor hoge-resolutie beeldvorming. Hier presenteren we een protocol dat het thoracale venster voor hoge-resolutiebeeldvorming van de muislong (WHRIL) combineert met mc27902, een genetisch gedefinieerde drievoudig-auxotrofe Mtb-stam die is goedgekeurd voor gebruik onder BSL-2 omstandigheden. We beschrijven ook de generatie van mc28471, een tdTomaten-expressief derivaat van mc27902, de voorbereiding op intraveneuze infectie en de toepassing voor intravitale beeldvorming bij reportermuizen. Dit systeem maakt realtime visualisatie mogelijk van vroege infectiedynamiek, waaronder snelle bacillaire binnenkomst in de pulmonale vaat, aggregatie, verspreiding in het longparenchym en opname van macrofagen in dezelfde longmicro-omgeving gedurende de eerste 3 dagen na infectie. Door longitudinale beeldvorming van bacillen en gastheer-pathogeen interacties met single-cell resolutie mogelijk te maken, overwint deze aanpak belangrijke beperkingen die gepaard gaan met conventionele beeldvormings- en high-containmentmodellen. Dit protocol biedt een praktisch BSL-2-compatibel platform voor realtime intravitale beeldvorming van verzwakte mycobacteriën in de long en legt een basis voor mechanistische studies naar bacteriële fysiologie, gastheerherkenning en immuungemedieerde clearance.
Inleiding
Intravitale microscopie met hoge resolutie heeft de studie van dynamisch cellulair gedrag binnen intacte weefsels getransformeerd door directe visualisatie van celmigratie, vasculaire interacties en immuunsurveillance mogelijk te maken bij enkelcelresolutie 1,2,3,4. Hoewel deze benaderingen veel worden gebruikt in kankeronderzoek 3,5, is hun toepassing op longinfecties beperkt door ademhalingsbewegingen, weefselfragiliteit en bioveiligheidsbeperkingen. Recente ontwikkelingen in thoracale beeldvormingsplatforms, waaronder vacuümgestabiliseerde en permanent geïmplanteerde optische vensters, hebben veel van deze technische uitdagingen aangepakt door stabiele, bewegingsvrije beeldvorming van de longmicroomgeving over langere periodes te bieden 6,7,8,9,10. Permanent implanteerbare vensters zijn in het bijzonder krachtige hulpmiddelen omdat ze herhaalde visualisatie van vasculaire stroming, immuunceldynamiek en enkelcellig gedrag over uren tot weken mogelijk maken, en zijn van groot belang geweest bij het definiëren van mechanismen van kankermetastase, vasculaire permeabiliteit en immuunsurveillance11,12.
Ondanks deze vooruitgang is intravitale beeldvorming voorheen niet toegepast op Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-infectie in de in vivo zoogdierlong bij enkelcellige resolutie. De dichtstbijzijnde precedenten komen uit intravitale beeldvorming van mycobacteriële infecties in andere omgevingen. Realtime beeldvorming van Mycobacterium marinum-infectie in zebravisembryo's13 toonde vroege macrofageninteracties en granuloominitiatie, terwijl tweefotonbeeldvorming van door BCG geïnduceerde granulomen in de muizenlever14,15 macrofagen en T-celdynamiek tijdens granuloomontwikkeling aantoonde en beperkte antigeenpresentatie en T-celeffectorfunctie binnen granulomatische laesies aantoonde. Deze studies boden fundamentele inzichten in de interacties tussen mycobacteriële gastheer en pathogeen, maar boden geen toegang tot de intacte zoogdierlong 8,16.
Intravitale beeldvormingsmethoden zijn ook toegepast op de long in andere infectieuze en biologische contexten, waaronder algemene pulmonale beeldvorming8, studies waaruit blijkt dat patrouilleren van alveolaire macrofagen bacteriën voor het immuunsysteem kunnen verbergen17 en de directe myeloïde respons op SARS-CoV-2-infectie in de menselijke longkarakteriseren 16. Intravitale beeldvorming is op vergelijkbare wijze toegepast op met influenza geïnfecteerde longen, waardoor directe visualisatie van dynamisch immuuncelgedrag in geïnfecteerd longweefsel mogelijk is18,19.
Optische beeldvormingsmethoden voor het hele lichaam met behulp van fiberoptische microendoscopische excitatie20 en rapportageenzymfluorescentietechnologie 21,22 hebben gevoelige detectie van Mtb in muizenlongen mogelijk gemaakt, maar kunnen geen individuele of kleine clusters bacillen detecteren, de dynamiek van bacteriële aggregatie volgen of directe interacties tussen mycobacteriën en gastheercellen in intact longweefsel visualiseren. Intravitale beeldvormingsmethoden met hoge containment zijn toegepast voor geïnfecteerde longen in BSL-3 omgevingen, waaronder SARS-CoV-2 infectie23 en Mtb-gerichte24 multiphoton beeldvormingsplatforms. Deze studies tonen de haalbaarheid aan om geïnfecteerde longen onder afsluiting te beelden, maar dergelijke opstellingen blijven technisch veeleisend en zijn niet breed toegankelijk. Werk met virulente Mtb vereist BSL-3 containment, wat aanzienlijke technische en bioveiligheidsuitdagingen met zich meebrengt voor intravitale beeldvorming23,24. Als gevolg hiervan vertrouwen de meeste studies naar vroege Mtb-infecties op statische eindpuntassays die de ruimtelijke en temporele dynamiek van bacteriegedrag in de long niet kunnen vastleggen.
De ontwikkeling van genetisch gedefinieerde, BSL-2-goedgekeurde triple-auxotrofe Mtb-stammen biedt een unieke kans om deze beperkingen te overwinnen. De mc27902-stam, een pantothenaat-leucine-arginine Mtb auxotrof-derivaat van H37Rv, is volledig verzwakt, repliceert niet bij immuungecompromitteerde muizen, behoudt klassieke zuurvaste kleuring, vertoont normale fagengevoeligheid en kan veilig worden behandeld buiten BSL-3 faciliteiten25. Deze eigenschappen maken mc2 7902tot een ideale surrogaat voor het opzetten van intravitale beeldvormingsmethoden en het onderzoeken van vroege gastheer-pathogeen interacties onder verminderde biosafety-containment.
Hier passen we het Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL) toe met mc28471, een fluorescerende tdTomato-expressieve afgeleide van de drievoudig auxotrofe Mtb-stam mc27902, om vroege Mtb-infectie in de intacte muislong te visualiseren. Experimenten werden uitgevoerd bij immuungecompromitteerde Rag2-/- muizen26 gekruist met MacBlue-muizen27, waarbij de Csf1r-promotor de expressie van versterkt cyaanfluorescerende eiwit (ECFP) aanstuurt in monocyten, microglia en subsets van dendritische cellen en macrofagen. Het MacBlue-transgeen maakt een duidelijke visualisatie mogelijk van mononucleaire fagocytpopulaties tijdens vroege Mtb-infectie. We kozen ervoor om Rag2-deficiënte muizen te gebruiken om het systeem te richten op de vroegste interacties tussen aangeboren gastheer en pathogeen en om de extra complexiteit van adaptieve immuunresponsen tijdens het korte beeldvormingsvenster dat hier wordt onderzocht te vermijden. Belangrijk is dat deze techniek niet beperkt is tot muizen met een Rag2-deficiënt en ook kan worden toegepast bij immuuncompetente dieren.
Door een permanent longvenster te combineren met een BSL-2-compatibele fluorescerende, verzwakte Mtb-stam, maakt dit platform seriële intravitale beeldvorming mogelijk van bacillen-gastheercelinteracties in dezelfde longmicroomgeving met enkelcelresolutie over meerdere dagen. Hoewel hier aangetoond voor vroege infectie, is het platform zelf niet per definitie beperkt tot vroege tijdstippen en kan het in principe worden toegepast op latere stadia, afhankelijk van het experimentele model en het onderzoeksontwerp. Aangezien de succesvolle toepassing van dit beeldvormingsplatform afhankelijk is van het gebruik van de specifieke fluorescerende bacillaire preparaat die hier wordt beschreven, hebben we de essentiële stappen opgenomen die nodig zijn om dat reagens te genereren en te bereiden als onderdeel van het volledige protocol. Dit platform biedt directe, realtime beeldvorming van Mtb-gedrag in vivo en legt een basis voor toekomstige mechanistische studies van bacteriële fysiologie, gastheerherkenning en immuungemedieerde clearance.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor bioveiligheid en dierenzorg en werden goedgekeurd door het Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use Committee (IACUC). De stam mc28471 is een pYUB1169 transformant van mc27902, een drievoudig-auxotrofe Mtb-stam die is goedgekeurd voor BSL-2 gebruik. Al het werk met levende bacteriën werd uitgevoerd met standaardvoorzorgsmaatregelen voor het hanteren van mycobacteriën.
1. Bouw van de BSL-2 goedgekeurde tdTomaten-expressing Mtb-lijn mc28471
- Generatie van tdTomato-expressieve BSL-2-safe mc28471 door plasmidetransformatie
- Transformeer de door BSL-2 goedgekeurde triple-auxotrofe stam mc27902 met het episomale mycobacteriële plasmide pYUB1169, dat het tdTomato-gen bevat dat tot expressie komt uit de G13-promotor, om de fluorescerende derivaat mc28471 te genereren.
- Inoculeer 100 μL mc27902 (optische dichtheid bij 600 nm (OD600 nm) van 0,7-1,0) in 10 mL steriele Middlebrook 7H9 aangevuld met OADC-verrijking (10% (v/v)), glycerol (0,2% (v/v)), D-pantothenaat (24 mg/L), L-leucine (50 mg/L), L-arginine (200 mg/L), natriumpropionaat (0,1 mM) en tyloxapol (0,05% (v/v)) in een 30 mL inktpot.
- Incubeer de cultuur, schudd langzaam (100 rpm) bij 37 °C totdat het een OD600 nm van 0,7-1,0 heeft bereikt.
- Breng de cellen over in een 15 mL conische centrifugebuis en centrifugeer 10 minuten op 3.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 10 mL steriele glycerol met 10% glycerol die 0,05% (v/v) tyloxapol bevat (wash #1). Herhaal centrifugatie en was twee keer. Sussief de celpellet opnieuw in 0,175 mL glycerol met 10% glycerol dat 0,05% (v/v) tyloxapol bevat en voeg 2 μL pYUB1169 DNA toe (100-200 ng DNA).
- Zet mc27902 en pYUB1169 over in een 0,2 cm elektroporatiecuvet. Wacht 10 minuten. Tik de cuvette 2 tot 3 keer aan om luchtbellen te verwijderen en elektroporate op 2.500 mV, 1.000 Ω, 25 μF, tijdconstante 20 ms, bij kamertemperatuur.
- Voeg 1 mL steriele Middlebrook 7H9 aangevuld met OADC-verrijking (10% (v/v)), glycerol (0,2% (v/v)), D-pantotenaat (24 mg/L), L-leucine (50 mg/L), L-arginine (200 mg/L), natriumpropionaat (0,1 mM) en tyloxapol (0,05% (v/v)) toe aan de cuvette en breng de inhoud van de cuvette over in een 15 mL conische centrifugebuis. Incubeer de buis terwijl je deze 's nachts schudt op 37 °C.
- Plaat 0,1 mL van het transformatiemengsel op een Middlebrook 7H10 agarplaat aangevuld met OADC-verrijking (10% (v/v)), glycerol (0,2% (v/v)), D-pantothenaat (24 mg/L), L-leucine (50 mg/L), L-arginine (200 mg/L), natriumpropionaat (0,1 mM) en kanamycine (20 mg/L). Centrifugeer het resterende transformatiemengsel, gooi 0,9 mL van het supernatant weg en suspendeer de celpellet opnieuw in het residuele supernatant. Plak de resuspendeerde cellen op een tweede Middlebrook 7H10 agarplaat met dezelfde supplementen en antibiotica. Breng de platen 3–4 weken uit bij 37 °C. Roze kolonies duiden op succesvolle transformanten.
- Kies één geïsoleerde roze kolonie en kweek deze bij 37 °C, langzaam schudd, in 5 mL steriele Middlebrook 7H9 aangevuld met OADC-verrijking (10% (v/v)), glycerol (0,2% (v/v)), D-pantotenaat (24 mg/L), L-leucine (50 mg/L), L-arginine (200 mg/L), natriumpropionaat (0,1 mM), tyloxapol (0,05% (v/v)) en 20 mg/L kanamycine in een inktpot fles van 30 mL.
- Voorbereiding van mc28471 voor intraveneuze infectie
- Kweek 10 mL mc28471 bij 37 °C, langzaam schudd, in steriele Middlebrook 7H9 aangevuld met OADC-verrijking (10% (v/v)), glycerol (0,2% (v/v)), D-pantothenaat (24 mg/L), L-leucine (50 mg/L), L-arginine (200 mg/L), natriumpropionaat (0,1 mM), tyloxapol (0,05% (v/v)) en 20 mg/L kanamycine in een 30 mL inktpot fles tot mid-log fase (OD600 nm zou tussen 0,7 en 1,0 moeten liggen).
- Breng de cellen over in een 15 mL conische centrifugebuis en centrifugeer 10 minuten op 3.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en laat de cellen opnieuw ophangen in 10 mL steriele fosfaatgevulde zoutoplossing met 0,05% (v/v) tyloxapol (PBS-T, wash #1). Herhaal centrifugatie en was twee keer. Suspendeer de celpellet opnieuw in 4 mL PBS-T en sonicaer de cellen met een vermogen van 100 W, 2x 1.000 J.
- Meet de optische dichtheid van de cultuur en verdun deze in PBS-T voor een uiteindelijke concentratie van 5 x 106 CFU's per injectie, met de benaderende omzetting dat een OD600 nm van 1 overeenkomt met 1 x 108 CFU/mL. Omdat deze relatie kan variëren met spannings- en groeicondities, moet OD600 nm empirisch worden gekalibreerd aan de geplateerde CFU-waarden om nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te waarborgen.
2. Permanente longvensterimplantatie bij muizen voor intravitale beeldvorming
- Maak een Rag2KO MacBlue-muis klaar voor intravitale beeldvorming. In deze studie werd een mannelijke muis van 10 weken oud gebruikt die 30 g woog. Muizen van beide geslachten, 8-12 weken oud, en binnen het verwachte gewichtsbereik voor die leeftijd, zijn echter geschikt voor deze procedure. Deze stam drukt versterkt cyaanfluorescerende eiwit (ECFP) uit in macrofagen op een Rag2-knockout-achtergrond en werd gegenereerd door B6.129S6-Rag2tm1FwaN12-muizen (Rag2, Model RAGN12) te kruisen met Tg (Csf1r-GAL4/VP16, UAS-ECFP)1Hume/ J-muizen (Stock Nr. 026051).
- Implanteer het venster voor hoogresolutiebeeldvorming van de long (WHRIL) 24 uur vóór bacteriële infectie om stabiele optische toegang tot de long te bieden en herstel vóór beeldvorming mogelijk te maken.
- Induceer anesthesie met 5% isoflurane in een inductiekamer. Controleer de diepte van de anesthesie voldoende voordat u met een procedure begint en monitor het dier tijdens de operatie en beeldvorming om pijn, stress of ademhalingsproblemen te voorkomen.
- Geef preoperatieve pijn: injecteer 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfine verdund in 90 μL steriele PBS subcutaan.
- Breng oogzalf aan op beide ogen om het hornvlies tijdens de narcose te voorkomen.
- Bind een 2-0 zijden hechting rond de basis van een katheter van 22G, met ~5 cm lange uitten om de katheter vast te zetten.
- Intuber de muis met de katheter met hechtingen. Visualiseer de opening van de tracheale met transilluminatie en bevestig de plaatsing met een inflatiebol (bilaterale borstverhoging).
OPMERKING: Onjuiste intubatie kan luchtwegletsel of onvoldoende ventilatie veroorzaken. Pas doorgaan nadat de juiste plaatsing is bevestigd door bilaterale borstexpansie. - Bevestig de intubatiekatheter door na succesvolle intubatie de 2-0 zijden hechting rond de snuit te binden. Verbind de katheter met de beademingsmachine.
- Plaats de muis in rechter laterale decubitus op een verwarmd chirurgisch platform om de linker thorax bloot te leggen, en zet vervolgens de voorpoten, achterpoten en rug vast met tape om een stabiele houding gedurende de procedure te behouden.
- Verlaag isofluraan tot 3% voor de rest van de operatie. Verwijder haar van de linkerbovenborst met een ontharingscrème.
- Bereid het operatieveld voor met een antiseptische oplossing. Til de huid op en maak een cirkelvormige incisie van 5-10 mm met een biopsiepunch (33-35-SH) ongeveer 7 mm links van het borstbeen en 7 mm boven de subcostale rand, gecentreerd over de6e tot7e intercostale ruimte.
- Inspecteer het blootgestelde veld op oppervlakkige vaten. Als deling van een zichtbaar vat nodig is, cauteriseer dan beide uiteinden om de hemostase te behouden. Verwijder het bovenliggende zachte weefsel om de ribben duidelijk bloot te leggen voordat je de thoracale holte binnengaat.
- Grijp en hef de 6e of 7e rib met een tang en doorboor voorzichtig de intercostale spier ertussen met een stompe microdissectieschaar (afgeronde zijde naar de long) om de thoracale holte binnen te dringen.
OPMERKING: Betreed de thoracale holte voorzichtig en onder directe visualisatie om te voorkomen dat de long, intercostale vaten of omliggende weefsels worden opengesneden. - Breng korte, zachte stoten perslucht toe bij de intercostale opening om het aangrenzende longoppervlak tijdelijk leeg te laten lopen en te scheiden van de borstwand voordat je de raamopening creëert.
- Plaats de biopsiepons op het snijgereedschap en leid het snijgereedschap door de intercostale opening, waarbij het parallel blijft aan de borstwand. Steek een 5 mm cirkelvormig defect in de ribbenkast.
- Plaats een 5-0 zijden beurskoord van ~1 mm van de rand van het cirkelvormige defect, tussen aangrenzende ribben om de opening te omsluiten.
- Plaats het raamkozijn zodat de randen van het borstwanddefect in de groef van het kozijn passen, draai vervolgens de koordnaad vast om het kozijn vast te zetten.
- Laad cyanoacrylaatgellijm in een spuit van 1 mL. Til het frame voorzichtig op om het van de long te scheiden en breng vervolgens een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op de onderzijde van het frame.
- Droog het oppervlak van de long met een continue, zachte stroom perslucht totdat het oppervlak mat lijkt.
OPMERKING: Gebruik alleen een zachte luchtstroom en vermijd langdurige drooglegging, omdat overmatige kracht of overmatige droog het longoppervlak kan beschadigen en de hechting van het raam kan belemmeren. - Met positieve uitaddemingsdruk (PEEP) blaas je de long op en bevestig je het raam aan het kozijn. Laat de PEEP los en houd 20-30 seconden druk op het raamkozijn.
OPMERKING: Overmatige druk tijdens het opblazen of plaatsen van het frame kan de long beschadigen of de afdichting aantasten. Oefen alleen de minimale druk uit die nodig is om een zachte aposisie te bereiken. - Plaats een tweede 5-0 zijden tas-koord <1 mm van de rand van de huidincisie. Steek de huid onder het kozijn, zorg ervoor dat overtollige huid onder het raamkozijn wordt opgevangen of weggeknipt, draai dan de beurskoord strak aan en bind het stevig vast.
- Breng met een vacuümpickup een zeer dunne laag lijm aan aan de onderkant van de 5 mm deklaag, waarbij overtollige afdekking aan de rand van een rechthoekig afdekglas wordt geschraapt. Droog opnieuw het longoppervlak met een continue, zachte stroom samengeperste lucht.
- Plaats de ronde deklaag binnen de uitsparing van het raamkozijn onder een ondiepe hoek (~15°) boven het longoppervlak. Verhoog kort de luchtwegdruk om de long op te blazen, en draai vervolgens de coverslip in een parallelle positie zodat het longoppervlak tegenover de onderkant van het glas staat. Houd ongeveer 25 seconden zachte druk terwijl de lijm uithardt, en haal daarna de vacuümopzuiger los van de dekmantel.
OPMERKING: Vermijd het vasthouden van bellen of het aanbrengen van overtollige lijm tijdens het plaatsen van de dekmantel, omdat beide de beeldkwaliteit kunnen verminderen, de afdichting kunnen verstoren of het longoppervlak kunnen beschadigen. - Breng een kleine hoeveelheid vloeibare cyanoacrylaat aan op de grens tussen de deklaag en het metalen frame om de luchtdichte afdichting te versterken.
- Bevestig een steriele naald aan een 1 mL insulinespuit. Steek de naald net onder het uitsteeksel van het xiphoïd en beweeg richting de linker schouder via het middenrif in de thoracale holte. Aspireer voorzichtig om resterende intrathoracale lucht te verwijderen.
OPMERKING: Beweeg de naald voorzichtig naar voren om te voorkomen dat je de long, het hart of de grote bloedvaten doorboort. Aspireer voorzichtig en alleen totdat de restlucht is verwijderd. - Schakel isofluraan uit en ga door met ventileren met 100% zuurstof totdat een bijna normale ademhalingsfrequentie bij het wakker worden bijna is hersteld. Laat het dier niet onbeheerd tijdens het herstel. Als normale spontane ademhaling niet snel terugkeert, bied dan passende ondersteunende zorg of laat je inslapen volgens de richtlijnen van de instelling.
- Verwijder de hechtingsdraad, extubeer de muis en plaats hem in een schone, verwarmde kooi voor herstel. Houd het dier in de gaten tot het volledig loopbaar is; Muizen die hun normale ademhaling niet terugkrijgen, moeten volgens de institutionele richtlijnen worden geëuthanaseerd.
- Geef postoperatieve pijnstiller: injecteer 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfine verdund in 90 μL steriele PBS subcutaan.
3. Intravitale beeldvorming
- Laat muizen herstellen na de inplanting van het raam voordat je beeldvorming krijgt. Voer beeldvorming uit 1 tot 5 dagen na de operatie.
- Induceer anesthesie met 3% isofluraan, en houd vervolgens 1,5% gedurende de beeldvormingsduur.
- Steek de op maat gemaakte stageplate-raamframe adapter tussen de huid en de buitenrand van het longraamframe en bevestig een standaard microscooppodiumplaat met lijmtape.
- Plaats de muis met de aangepaste stageplate-raamadapter bevestigd op de microscooptranslatietrap. Houd de lichaamstemperatuur op ~37 °C met behulp van een door de lucht verwarmde kamer met een temperatuursensor-feedbacklus.
- Met de muis op de stadiumplaat wordt de huid rond het oog aan de injectiezijde voorzichtig teruggetrokken om de mediale canthus bloot te leggen en FITC-dextran (150 kDa; 20 mg/mL, 100 μL) retro-orbitaal geïnjecteerd om de bloedvaten te labelen.
- Maak snapshot-, z-stack- of timelapse-beelden van de longvaaten vóór de bacteriële injectie met behulp van de volgende parameters.
- Voor confocale microscopie-instellingen: Bitdiepte: 12-bit, Framerate: 2 fps, Beeldgrootte: 512 × 512 pixels, Pixelgrootte: 0,497 μm/pixel, 0,994 μm/pixel, Z-stapgrootte: 2 μm, Totale z-diepte: 50–70 μm, Framegemiddelde: 3, Scansnelheid: 2 μs/pixel (977 lijnen/s), Laserexcitatiegolflengten: 405 nm, 488 nm, 559 nm, Laservermogen bij het monster: 230 μW (405 nm), 75 μW (488 nm), 40 μW (559 nm), Detectiefilters: 430-470 nm (Blauw), 505-540 nm (Groen), 575-675 nm (Rood), Detectorversterkingen: 800 V voor Blauw, 650 V voor Groen, 700 V voor Rood, Gaatjesdiameter: 60 μm of 1 Airy-eenheid voor 559 nm
- Voor multifotonmicroscopie wordt dezelfde beeldparameters gebruikt als die voor confocale microscopie, behalve dat er een 920 nm excitatielaser werd gebruikt met 25 mW laservermogen op het monster.
- Injecteer retro-orbitaal 5 x 106 CFU's tdTomaten-expressie mc28471.
OPMERKING: Voer retro-orbitale injecties alleen uit met de juiste training en beheersing, aangezien een onjuiste techniek oogletsel, bloedingen of het mislukken van de inoculum kan veroorzaken. - Neem snapshot-, z-stack- en time-lapse-beelden van tuberculose- en fluorescentie-gelabelde cellen en bloedvaaten met behulp van de beeldparameters in 3.6.1 en 3.6.2. Pas de versterking van alle detectoren aan om het signaal te maximaliseren en tegelijkertijd verzadiging van de detector te vermijden.
- Na de beeldvorming zet je isofluraan uit en haal je de muis uit de microscoop. Houd de muis warm en houd de muis in de gaten tot het volledig hersteld is.
- Herhaal beeldvorming op de volgende tijdstip na MC28471-injectie: 0-60 min, 6 uur en 3 dagen. Voor elke beeldvormingssessie injecteer je FITC-dextran (100 μL, retro-orbitaal) opnieuw om de bloedvaten te visualiseren, en neem vervolgens beelden zoals beschreven in stappen 3.8-3.9.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na elektroporatie en kanamycineselectie vertoonden geïsoleerde kolonies van mc28471 felrode fluorescentie, wat een stabiele tdTomato-expressie bevestigde. MC28471 bacillen werden uitgebreid, bereid als een single-cell suspension en intraveneus toegediend aan muizen met chirurgisch geïmplanteerde WHRIL. Intravitale beeldvorming werd uitgevoerd om vroege Mtb-infectiedynamiek in de longmicro-omgeving te visualiseren. Voor deze studie werden basisbeelden van de longvaat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit platform sluit een echte kloof in tuberculoseonderzoek aan door directe visualisatie van bacillen en gastheercelinteracties in de intacte zoogdierlong onder BSL-2 omstandigheden mogelijk te maken. Eerdere in vivo beeldvormingsstrategieën, waaronder optische detectie van het hele lichaam met behulp van fiberoptische micro-endoscopische excitatie20, reporterenzymfluorescentiebeeldvorming21 en nabij-infraroodfluorescerende eiwitex...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: AI26170; De Evelyn-Lipper Family Foundation en het Gruss Lipper Biophotonics Center. Wij erkennen steun van de Analytical Imaging Facility, ondersteund door de NCI Cancer Center Grant P30 CA013330.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 ml kegelvormige buis | Corning | 430790 | |
| 2-0 zijden stropdas | Ethicon, Inc | LA55G | |
| 5 mm dekglas | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5 mm wegwerpbiopsie-pons | Integra | 33-35-SH | |
| 5-0 zijden purse-string-naad | Ethicon, Inc | 640G | |
| Blunt micro-dissectie schaar | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorfine | Hospira | 0409-2012-32 | Injectie van 10 μL buprenorfine (0,3 mg/mL stockoplossing) verdund in 90 μL steriele PBS (uiteindelijke dosis = 0,1 mg/kg) |
| Persluchtbus | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylaatlijm | Loctite | 234790 | |
| D-calcium pantothenaat | Acros | 243305000 | |
| ECM 630 Electroporation System Complete, met veiligheidsstandaard | BTX Harvard Apparatus | 45-0051 | |
| Electroporatiebel | Fisher Scientific | FB102 | |
| FITC-Dextraan | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | 150 kDa |
| Glycerol | Fisher Chemicals | G33-1 | |
| Graefe-tang | Roboz | RS-5135 | Om de rib vast te grijpen en te verhogen tijdens de longvensterimplantatieprocedure |
| Isofluraan | Pivetal | 78949580 | |
| Isofluraanverdamper | SurgiVet | VCT302 | |
| Kanamycine | Goldbio.com | K-120-25 | |
| L-arginine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | A5131-100G | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| MacBlue muizen | Jackson Labs | Strain #: 026051 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | Difco | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 bouillon | Difco | 271310 | |
| Middlebrook OADC-verrijking | Becton Dickinson | 212351 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| PETG media inktpot | Thermo Scientific | 342020 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-5623 | Om het tijdelijk volume van de muis te monitoren via intubatie tijdens de operatie |
| Plasmid pYUB1169 | Op maat gemaakt plasmide | ||
| Rag2 KO-muizen | Jackson Labs | Strain #: 008449 | |
| Buisje voor longinflatie van kleine dieren | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Natriumpropionaat | Thermo Scientific | A17440.36 | |
| Sonicator | Fisher Scientific | FB705 | |
| Sorval Centrifuge X pro-serie | Thermo Scientific | 75009020 | |
| Spectrofotometer Genesys 10 UV | Thermo Spectronic | 335903 | |
| SurgiSuite | Kent Scientific | SURGI-M02 | Multifunctioneel chirurgisch platform voor muizen, met opwarming |
| Tracheale katheter | Exelint International | 26746 | 22G |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T0307-50G | |
| Vakuumopnamesysteem metalen sonde | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
Referenties
- Scheele, C., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-26 (2022).
- Niesner, R. A., Hauser, A. E., Entenberg, D. Life Through a Lens: Technological Development and Applications in Intravital Microscopy. Cytometry A. 97 (5), 445-447 (2020).
- Perrin, L., Bayarmagnai, B., Gligorijevic, B. Frontiers in Intravital Multiphoton Microscopy of Cancer. Cancer Rep (Hoboken). 3 (1), e1192(2020).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J Vis Exp. (116), e62761(2016).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917(2014).
- Prunier, C., Chen, N., Ritsma, L., Vrisekoop, N. Procedures and applications of long-term intravital microscopy. Methods. 128, 52-64 (2017).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Magnen, M., et al. Immediate myeloid depot for SARS-CoV-2 in the human lung. Sci Adv. 10 (31), eadm8836(2024).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling Alveolar Macrophages Conceal Bacteria from the Immune System to Maintain Homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125.e11 (2020).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- van de Wall, S., et al. Dynamic landscapes and protective immunity coordinated by influenza-specific lung-resident memory CD8(+) T cells revealed by intravital imaging. Immunity. 57 (8), 1878-1892.e5 (2024).
- Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensitivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with beta-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. 10 (6-7), 821-829 (2017).
- Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J Vis Exp. (132), e56801(2018).
- Sommer, R., Cole, S. T. Monitoring Tuberculosis Drug Activity in Live Animals by Near-Infrared Fluorescence Imaging. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01280-19(2019).
- Castanheira, F. V. S., et al. Intravital imaging of three different microvascular beds in SARS-CoV-2-infected mice. Blood Adv. 7 (15), 4170-4181 (2023).
- Barlerin, D., et al. Biosafety Level 3 setup for multiphoton microscopy in vivo. Sci Rep. 7 (1), 571(2017).
- Vilcheze, C., et al. Rational Design of Biosafety Level 2-Approved, Multidrug-Resistant Strains of Mycobacterium tuberculosis through Nutrient Auxotrophy. mBio. 9 (3), e00938-18(2018).
- Shinkai, Y., et al. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell. 68 (5), 855-867 (1992).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Cohen, S. B., et al. Alveolar Macrophages Provide an Early Mycobacterium tuberculosis Niche and Initiate Dissemination. Cell Host Microbe. 24 (3), 439-446.e4 (2018).
- Pandey, A. K., Sassetti, C. M. Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (11), 4376-4380 (2008).
- Bhatt, A., et al. Deletion of kasB in Mycobacterium tuberculosis causes loss of acid-fastness and subclinical latent tuberculosis in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (12), 5157-5162 (2007).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Vilcheze, C., Porcelli, S. A., Chan, J., Jacobs, W. R. Jr Sterilization by Adaptive Immunity of a Conditionally Persistent Mutant of Mycobacterium tuberculosis. mBio. 12 (1), e02391-20(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
