Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Deze studie evalueerde NEAT1 als diagnostische marker en regulator van intestinale barrièredisfunctie bij diarree-predominant prikkelbare darm syndroom. NEAT1 was verhoogd in het serum van patiënten, bond miR-29b-3p, en de knockdown ervan verbeterde de barrière-, apoptose- en inflammatoire resultaten in lipopolysaccharide-beschadigde Caco-2-cellen.
De pathogenese van prikkelbare darm syndroom met diarree (PDS-D) is onduidelijk en de beschikbare therapieën blijven beperkt. Deze studie evalueerde de diagnostische waarde van NEAT1 bij PDS-D en onderzocht het potentiële regulatiemechanisme ervan. In totaal werden 116 patiënten met PDS-D en 116 gezonde controles opgenomen. Serumspiegels van NEAT1 en miR-29b-3p werden gedetecteerd via reverse transcriptie kwantitatieve real-time PCR (RT-qPCR), en receiver operating characteristic (ROC)-curves werden gebruikt om de diagnostische waarde te evalueren. Voor mechanistische studies werd een model van Caco-2 darmepitheelcellen behandeld met lipopolysacharide (LPS) opgezet. De cellevensvatbaarheid werd beoordeeld met een Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay, apoptose via flowcytometrie, barrièreintegriteit via transepitheliale elektrische weerstand (TEER), en de mRNA-spiegels van ZO-1, occludine en claudine-2 via RT-qPCR. Dual-luciferase reporter (DLR) en RNA-immunoprecipitatie (RIP) assays werden gebruikt om de bindingsrelatie tussen NEAT1 and miR-29b-3p te verifiëren. NEAT1 was sterk tot expressie gebracht en miR-29b-3p vertoonde een lage expressie bij patiënten met PDS-D, waarbij hun spiegels een sterke negatieve correlatie vertoonden. Knockdown van NEAT1 verhoogde de miR-29b-3p spiegels, verbeterde de cellevensvatbaarheid en TEER, verminderde apoptose, verhoogde de mRNA-spiegels van ZO-1 en occludine, verlaagde de mRNA-spiegels van claudine-2 en verlichtte de read-outs geassocieerd met barrièrebeschadiging in LPS-behandelde Caco-2 cellen. Samen wijzen deze resultaten erop dat serum NEAT1 een kandidaat-biomarker is voor PDS-D en dat de NEAT1/miR-29b-3p as betrokken kan zijn bij intestinale barrièredysfunctie.
Prikkelbare darmensyndroom met diarree (PDS-D) is een veelvoorkomende functionele gastro-intestinale aandoening die wordt gekenmerkt door buikpijn, een opgeblazen gevoel en een veranderd ontlastingspatroon1. Op dit moment is het pathofysiologische mechanisme van PDS-D nog niet volledig opgehelderd2. De behandelmethoden zijn voornamelijk gericht op symptomatische verlichting, met een beperkte effectiviteit en een hoog recidiefpercentage3. Men gaat er over het algemeen van uit dat PDS-D het resultaat is van de interactie tussen meerdere factoren, zoals ontregeling van de hersen-darm-as, viscerale hy....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Insluiting van patiënten
Alle deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming nadat zij de inhoud van het onderzoek volledig hadden begrepen. De ethische commissie van het Shanghai Pudong New Area People's Hospital heeft dit onderzoeksprotocol beoordeeld en goedgekeurd (Nr. 2024k007). De steekproefomvang werd berekend met G*Power: de geselecteerde test was een t-test, en de statistische test was ontworpen om verschillen tussen twee onafhankelijke steekproeven te detecteren. Met een effectgrootte van d = 0,5, α = 0,05 en power = 0,9 gaf de berekening aan dat er minimaal 86 proefpersonen per groep geïncludee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Expressie van NEAT1 en diagnostische waarde
Vergeleken met de gezonde controlegroep (HC) waren de expressieniveaus van NEAT1 bij IBS-D-patiënten aanzienlijk hoger (P < 0,001; Figuur 1A). De oppervlakte onder de curve (AUC) van NEAT1, zoals weergegeven door de receiver operating characteristic (ROC)-curve, was 0,867 (95% BI: 0,821–0,913). De specificiteit was 75,9%, terwijl de sensitiviteit 84,5% was (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
IBS-D is een veelvoorkomende functionele gastro-intestinale stoornis. Het pathologische mechanisme hiervan is nog niet volledig opgehelderd. In recente jaren hebben lncRNA's, als sleutelmoleculen in de epigenetische regulatie, een groot potentieel getoond op het gebied van ziektediagnostiek en -behandeling. LncRNA NEAT1 is bestudeerd bij verschillende aandoeningen, zoals colorectaal carcinoom24, glioom25 en myocardinfarct26. Diverse studies .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling om te verklaren.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24-wells platen | Corning | CLS3524 | Voor het uitplaten van cellen |
| 96-wells platen | Corning | CLS3599 | Voor het uitplaten van cellen in CCK-8 assays |
| Annexine V-FITC/PI apoptosekit | Invitrogen | V13242 | Voor het detecteren van apoptosesnelheden |
| Anti-AGO2 monoklonaal antilichaam | Proteintech | 67934-1-Ig | Voor immunoprecipitatie van Ago2-gebonden RNA-complexen |
| Anti-Claudine-2 antilichaam | Invitrogen | 32-5600 | Primair antilichaam, verdunning 1:1000 |
| Anti-GAPDH antilichaam | Cell Signaling Technology | 5174 | Primair antilichaam, verdunning 1:5000; loading control |
| Anti-humaan IgG antilichaam | Proteintech | 10284-1-AP | Gebruikt als negatieve controle voor RIP-assay |
| Anti-Occludine antilichaam | Abcam | ab31721 | Primair antilichaam, verdunning 1:500 |
| Anti-ZO-1 antilichaam | Proteintech | 21773-1-AP | Primair antilichaam, verdunning 1:1000 |
| Caco-2 cellen | SUNNCELL | SNL-068 | Voor het construeren van intestinale epitheliale barrièremodellen |
| CCK-8 kit | Solarbio | CA1210 | Kit voor celproliferatie-assay |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Voor fasescheiding bij RNA-extractie |
| DMEM-medium | Gibco | 11965092 | Voor celkweek |
| Dual-Luciferase Reporter Assay Kit | ThermoFisher | 16186 | Voor het detecteren van luciferase-activiteit |
| ELISA-kit (voor IL-1β) | R&D Systems | DY201 | Voor het detecteren van doelproteïnen in celkweeksupernatanten |
| ELISA-kit (voor IL-6) | R&D Systems | D6050B | Voor het detecteren van doelproteïnen in celkweeksupernatanten |
| ELISA-kit (voor IL-8) | R&D Systems | NBP3-28022 | Voor het detecteren van doelproteïnen in celkweeksupernatanten |
| ELISA-kit (voor TNF-α) | R&D Systems | DTA00D | Voor het detecteren van doelproteïnen in celkweeksupernatanten |
| Enhanced chemiluminescence (ECL) substraat | Thermo Fisher | 32106 | Voor het visualiseren van proteïnebanden |
| Ethanol (75%) | Sigma-Aldrich | 459844 | Voor het wassen van de RNA-pellet |
| FBS (foetaal runderserum) | Gibco | 10099141 | Voor celkweek |
| Flowcytometer | Beckman Coulter | B53002 | Voor het detecteren van apoptosesnelheden |
| HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen | Cell Signaling Technology | 7074 | Katalyseren de generatie van een chemiluminescent signaal vanuit ECL-substraten |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 1133502500 | Voor RNA-precipitatie |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | Transfectie-reagens |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L2880 | Voor het induceren van celmodelconstructie |
| Microplatenlezer | BioTek | Epoch 2 | Voor het detecteren van de absorbantie van monsters in 96-wells platen |
| Nanodrop micro-spectrofotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | Voor het bepalen van de RNA-concentratie en zuiverheid |
| Ontvatte gedroogde melk | Coolaber | CN7861 | Voor het blokkeren van membranen (5% oplossing) |
| PARIS Kit | Thermo Fisher | AM1921 | Voor nucleair-cytoplasmatische fractionering |
| Penicilline–Streptomycine | Gibco | 15140122 | Voor resistentie tegen contaminatie tijdens celgroei |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | Voor het bepalen van proteïneconcentraties |
| pmirGLO Dual-Luciferase vector | Promega | E1330 | Dual luciferase reportergen-vector |
| PrimeScript RT Reagent Kit | Takara | RR047A | Voor reverse transcriptie van RNA naar cDNA |
| PVDF-membraan | Millipore | IPVH00010 | Voor proteïne-overdracht na SDS-PAGE |
| Real-time fluorescentie kwantitatief PCR-instrument | Applied Biosystems | 4365464 | Voor het detecteren van doelgenen |
| RIPA lysebuffer (met protease-remmers) | Thermo Fisher | 89901 | Voor totale proteïne-extractie uit cellen |
| RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit | Sigma-Aldrich | 17-701 | RNA-Binding Protein Immunoprecipitatie (RIP) assay met Protein A/G magnetische beads |
| SDS-PAGE reagentia (10% gel) | TargetMol | C0189 | Voor het scheiden van proteïnen op basis van molecuulgewicht |
| SYBR Green mastermix | Thermo Fisher | 4309155 | Voor gebruik in PCR-testen |
| TEER-meter (Volt-Ohm Meter) | Millipore | MERS00002 | Transmembraanweerstandsmeting, meet de integriteit van een enkele laag |
| Transwell-kamers | Corning Costar | CLS3413 | Voor het kweken van celmonolagen en het meten van TEER |
| TRIzol-reagens | Invitrogen | 15596026CN | Voor totale RNA-extractie |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.